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Verfahren zur Gewinnung von Mannit, Phosphatiden und Sterinen aus
verfetteten mycelbildenden Mikroorganismen Es wurde gefunden, daß man in
guter Ausbeute Mannit, Phosphatide und Sterine aus verfetteten mycelbildenden Mikroorganismen
erhalten kann, wenn man durch Abpressen oder Zentrifugieren teilweise entwässerte
Mycelien drei aufeinanderfolgenden, bis zu 24 Stunden dauernden Extraktionen mit
der 2- bis 3fachen Menge an niedermolekularen aliphatischen Alkoholen, insbesondere
Methanol, unterwirft, wobei der Wassergehalt der Mycelien in den aufeinanderfolgenden
Extraktionsstufen herabgesetzt wird, und zwar so, daß er in der dritten Stufe I
bis 40/0 beträgt, wobei man aus dem Extrakt der ersten Stufe das Extraktionsmittel
vorzugsweise im Vakuum abdestilliert, die zurückbleibende wässerige Lösung filtriert
und aus dem beim Eindampfen anfallenden Rückstand durch Umkristallisieren Mannit
gewinnt, aus demExtrakt der zweiten Stufe das Extraktionsmittel und das Wasser vorzugsweise
im Vakuum abdestilliert, aus dem Rückstand durch Reinigung mit Wasser und Aceton
sowie durch Umfällung die Phosphatide erhält und schließlich aus dem Extrakt der
dritten Stufe die Hauptmenge des Extraktionsmittels abdestilliert und aus dem dabei
erhaltenen Rückstand
durch Behandlung mit verseifenden Mitteln und
Extrahieren des Seifengemisches mit Lösungsmitteln die Sterine gewinnt.
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Ausgangsstoffe des Verfahrens sind allgemein verfettete mycelbildende
Mikroorganismen, d. h. mycelbildende Mikroorganismen, die unter solchen Bedingungen
gezüchtet worden sind, daß eine erhöhte Fettbildung stattgefunden hat. Sie 'können
dabei nach beliebigen Verfahren, z. B. auf Oberflächen, in Schalen oder submers
gezüchtet sein.
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Verwendbare Mikroorganismen sind z. B. Askomyceten und Phykomyceten,
wie Rhizopus oligosporus, Mucor racemosus, Mortierella pusilla, ferner Penicillium-
und Aspergillusarten, Endomvces vernalis und Oidium lactis, ferner Fusarie#, Fungi
imperfecti u. dgl. m.
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Für die Extraktion der Zellinhaltsstoffe werden niedrigmolekulare
aliphatischeAlkohole, wieÄthyl-, Isopropyl-, n- oder iso-Butylalkohol u. dgl., verwendet.
Ganz besonders hat sich die Behandlung mit Methanol bewährt. Die Lösungsmittel können
für sich oder miteinander oder auch im Gemisch mit anderen Lösungsmitteln zur Anwendung
gelangen.
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Die stufenweise Einwirkung der Alkohole erfolgt zweckmäßig, um eine*
spätere Fettextraktion durch schädliche Veränderung der Ausgangsstoffe nicht zu
stören, bei Temperaturen unterhalb 40', zweckmäßig bei Zimmertemperatur. Zur Behandlung
gelangen frisch abgepreßte oder zentrifugierte Mycelien, die auf einen Wassergehalt
von 2o bis 35 gebracht worden sind. Nach beendeter stufenweiser Extraktion
empfiehlt es sich, das Eindampfen der Extrakte unter Anwendung besonderer Vorsichtsmaßnahmen,
insbesondere unter vermindertem Druck oder unterFüllung derApparatur mit inerten
Gasen, vorzunehmen.
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Der erste Alkoholextrakt, welcher nach mindestens 8stündiger Vorbehandlung
des zentrifugierten und zermahlenen Mycels mit der 2- bis Yachen Alkoholmenge
je nach Wassergehalt des Ausgangsmaterials zwischen 20 und 350/0 Wasser
in der mycelfreien Lösung enthalten soll, wird im Stickstoffstrom vorsichtig abdestilliert,
und zwar bis zur beginnenden Trübung. Man läßt erkalten, wobei sich auf der Oberfläche
Fetttropfen abscheiden. Diese werden durch Filtration oder mittels Fettlösungsmittel,
wie Äther, Benzin oder chlorierte Kohlenwasserstoffe, entfernt. Hierbei handelt
es sich um ein Gemisch aus Fett und freien, hochmolekularen Fettsäuren, deren Verwendung
für die Seifenherstellung besonders naheliegt. Nach Entfernung der Fettsäuren wird
im Vakuum das Wasser weitgehend, d.h. bis zur beginnenden Kristallisation des Rückstandes,
verdampft. Der erkaltete Rückstand'ist gelbbraun gefärbt. Zwecks Entfernung der
alköhollöslichen Zucker wird in hochprozentigem Äthylalkohol gelöst und kalt filtriert.
Dann löst man den Rückstand in 8o%igem Alkohol in der Wärme, filtriert und läßt
24 Stunden kristallisieren. Die nadelförmigen Kristalle werden abgesaugt, in möglichst
wenig Wasser gelöst, durch kurzes Aufkochen mit Tierkohle entfärbt und durch Zusatz
von Alkohol erneut kristallisiert. Man erhält Mannit.
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In der zweiten Stufe werden die Schimmelpilzphosphatide isoliert.
Der aus der Mannitgewinnung anfallende Mycelrückstand wird zu diesem Zweck abermals
mit der doppelten bis 3fachen Menge des Ausgangsgewichtes an hochprozentigem Alkohol
verrührt und mehrere Stunden sich selbst überlassen. Das Arbeiten geschieht wie
in der ersten Stufe in Behältern unter Luft- und Lichtausschluß; man füllt, sofern
größere Gasräume verbleiben, dieselben mit Stickstoff.
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Nach 8 bis 24 Stunden preßt man den Rückstand scharf ab. Die
goldgelb gefärbte Methanollösung enthält noch 4 bis io% Wasser. Sie wird in eine
mit Stickstoff gefüllte Vakuumdestillationsapparatur gegeben. Zuerst wird, immer
unter 35' bleibend, der Alkohol, dann bei etwa 10 bis 20 MM Vakuum das Wasser
abdestilliert. Es bleibt ein öliger, goldbrauner Rückstand, der viskos erstarrt.
Er besteht hauptsächlich aus einem Gemisch von Glyceriden und Phosphatiden. Um Reste
wasserlöslicher Bestandteile, wie Kohlenhydrate, zu entfernen, wird der Rückstand
mit kochsalzhaltigem Wasser bei 35' behandelt, hierbei scheidet sich eine
butterartige Masse mit angenehmem Nußgeruch ab, welche aus der Hydratform des Phosphatidgemisches
besteht und durch Filtration über Leinen gut abgetrennt werden kann. Diese wird
dann mit Aceton ausgeknetet, um möglichst hierbei den Hauptteil Wasser sowie Fett
und Sterine zu entfernen. Schließlich nimmt man in wasser- und peroxydfreiem Äther
auf und fällt durch Eintropfen in gekühltes Aceton um. Dabei entstehen schwachgell)-graue
Fällungen, die nach der Trocknung im Hochvakuum über Phosphorpentoxyd wasserfreie,
honiggelbe Phosphatide liefern. Durch weitere Reinigungsmethoden lassen sich analysenreine
Gemische aus Lecithin und Kephalin hieraus gewinnen.
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Eine weitere Gruppe von Stoffen, deren Isolierungen aus anderen Pilzarten
an sich bekannt sind, konnte durch eine weitere Behandlung des Restmycels mit der
2- bis 3fachen Menge an hochprozentigem Methanol erhalten werden.
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Man saugt, nachdem das Restmycel bereits eine erhöhte Quellfähigkeit
in absolutem Alkohol erreicht hat, unter Abpressen ab und wäscht auf der Nutsche
mit Alkohol i- bis 2mal nach. Das Filtrat ist rötlichgelb gefärbt und enthält neben
Fett (Triglyceriden) in der Hauptsache ein Steringemisch.
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Man gewinnt dieses Gemisch durch teilweises Abdestillieren des Alkohols.
Der Rückstand ist ein Gemisch aus etwa 12 bis 30010 Sterinen und Fett. Man
trennt die Sterine ab durch Verseifen des Gesamtrückstandes mit alkoholischer Kalilauge
und extrahiert die Seifenlösung oder die trockenen Seifen mit Benzol, Chloroform,
Benzin oder Äther. Man gewinnt einen kristallisierten, unverseifbaren Rückstand,
der ein Gemisch von Mycosterinen und dessen Hauptbestandteil Ergosterin darstellt.
Auf dieseWeise und durch weitereReinigung, z. B. Kristallisation aus Alkohol, durch
Fällung der Digitonide, Kristallisation der Acetvl- oder Benzoylderivate
sowie
mittels Adsorptionsmittel gelingt die Gewinnung des bisher hauptsächlich aus Hefe
hergestellten Provitamins D, des Ergosterins. Hiermit ist eine neue Quelle
für das antirachitisch wirksame Provitamin erschlossen. Beispiel i 3o kg verfettetes
Fusariummycel, dessen Wassergelialt mit 630/0 und dessen Fettgehalt nach
Schmid-Bondzynski mit 17,0% bestimmt wurde, wird nach Zermahlen des Naßmycels in
einem Fleischwolf direkt in 7o kg 98- bis 991/oiges Methanol eingerührt.
Nachdem gute Zerteilung erreicht ist, wird das abgedeckte Material 24 Stunden sich
selbst überlassen, schließlich abermals i bis 2 Stunden gerührt und auf der Nutsche
abgepreßt. Das Filtrat, welches vollkommen klar und tiefgelb gefärbt ist, wird in
eine Vakuumapparatur gegeben und eingeengt bis zur beginnenden Trübung. Dann läßt
man erkalten und filtriert das ausgeschiedene Gemisch aus Fett und Fettsäuren oder
löst dieselben mittels Fettlösungsmittel. Anschließend destilliert man bei gutem
Vakuum bis zur beginnenden Kristallisation des gelbbraunen Rückstandes. Den Rückstand
behandelt man mit 98%igem Äthylalkohol, filtriert kalt und nimmt den kristallinen
Anteil in möglichst wenig 8o%igem heißem Alkohol auf und kühlt auf o bis io' ab.
Nach etwa 24 Stunden scheiden sich gelbgefärbte nadelförmige Kristalle ab. Diese
werden abgesaugt und in wenig Wasser gelöst, mit Aktivkohle entfärbt und direkt
durch Einengen aus Wasser oder durch Zugabe von Alkohol umkristallisiert. Man erhält
auf letztere Weise von Kristallisationszentren aus wachsende, feinste, weiße Kristalle,
welche unter dem Mikroskop wie Ilaarbüschel aussehen. Es handelt sich um Maimit
(F. der Hexaacetylverbindung = 120').
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Die Ausbeute betriigt nach beschriebenem Verfahren
99,8 g =
o,9 1/o, bezogen auf Trockenmycel. Beispiel 2 Die Aufarbeitung des Alkoliolextraktes
nach den Angaben von F i n
k und J u s t (Biochern. Ztschr., Bd. 216, S.
311 ff.) ergab folgendes Resultat: Der Methanolextrakt aus 2,6i5kg Naßmycel (verfettetes
Fusarium) mit 549
g Trockenmasse wurde aufgearbeitet, wie im Beispieli beschrieben,
bis zur ersten Kristallisation des Rückstandes. Dieser wurde in Wasser gelöst über
Aktivkohle filtriert, mit Schwefelsäure angesi
. tuert und mit Quecksilbersulfat
gef;illt. Die Fällutig wird abgesaugt, abgepreßt, das Filtrat mittels Schwefelwasserstoff
von Ouecksilber befreit, die schwefelwasserstofffreie Lösung mittels Bariumhydroxyd
neutralisiert, das Bariumsulfat abfiltriert, die Lösung eingeengt und direkt kristallisiert.
Ausbeute
6,6 g = 1,2 0/0 Mannit, F.
= io4#'. Beispiel
3
2217 g Nat.ii-n#,cel (verf ettetes Fusarium)
= 750
-Trockenmycel geben 6200CM' Methanolwässer; deren Zusammensetzung ist 34.00/0 Wasser,
8,20/0
Gesaintfeststil)stanz, -57,#S'/o Methanol. Nach dein Abdestillieren
des Methanols wurden isoliert 4,52
g
= o,6% Fett-Fettsäure-Gemisch. Die Kennzahlen
desselben sind
| Sz. Vz. EZ. Jz. |
| 112,0 204,2 92,6 122,3 |
Nach F i n
k und J u s t aufgearbeitet wurden erhalten
27,6 g Rohprodukt
= 3,71/o Rohmannit. Dieser ist jedoch nicht rein, er enthält noch gegen Fehlingsche
Lösung reduzierende Substanzen sowie
0,17 0/0 N.
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Nach dem Verfahren des Beispiels i wurden 2,7010 Rohmannit
erhalten. Beispiel 4 Der Mycelrückstand aus Beispiel i wird abermals mit 7o kg Methanol
98- bis 99%ig versetzt und mehrere Stunden kalt gerührt. Dann wird abgesaugt und
der Alkoholextrakt schnellstens in eine Vakuumdestillationsapparatur gebracht, welche
mit Stickstoff gefüllt ist und mittels Wasserdampfmantel erwärmt wird. Die Destillation
wird stets unter 35' gehalten, das Vakuum langsam gesteigert. Schließlich
erhält man einen öligen, goldbraunen Rückstand, der in der Kälte erstarrt. Nach
Behandeln mit kaltem, kochsalzhaltigem Wasser erhält man butterartige, angenehm
nußartig riechende Massen, die durch Dekantation oder Absaugen auf Leinenfilter
gewonnen werden. Die weitere Reinigung (Befreiung von Fetten und Sterinen) vollzieht
sich, wie es bei Pflanzenphosphatiden bekannt ist. Die Ausbeute an Rohphosphatiden
ist stark schwankend, man erhält je nach Ausgangsmaterial 0,4 bis 2,oO/o,
bezogen auf Trockensubstanz.
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Die Untersuchung der Reinphosphatide ergab, daß das Gemisch keine
Phosphatidsäuren oder Diaminophosphatide enthält. Es besteht beispielsweise aus
etwa io% Lecithin und go% Kephalin. Die Fettsäuren sind fast ausschließlich ungesättigter
Natur. Sie unterliegen außerordentlich leicht der Autoxydation durch Einfluß von
Luft und Licht, was eine erhöhte Empfindlichkeit zur Folge hat. Die auf diese Weise
gewonnenen Phosphatide sind vielfach technisch verwertbar. Beispiel 5
Der
nach Beispie14 gewonnene Mycelrückstand ist in seinem Wassergehalt bereits so weit
heruntergesetzt, daß er mühelos in der 2- bis 3fachen Menge Methanol (98- bis 99%ig)
verteilt werden kann. Er besitzt bereits eine auffallend hohe Saugfähigkeit für
Alkohol und andere wasserfreie, organische Lösungsmittel. Dies begünstigt die weitere
Behandlungsweise. Nach etwa 8 bis 24 Stunden wird abermals abgesaugt. Der
Rückstand ist jetzt so weit entwässert, daß er höchstens noch i bis 40/0 Wasser
im Rückstand enthält und für die eigentliche Fettextraktion geeignet ist. Der hochprozentige
Alkohol wird zum größten Teil abdestilliert und der stark eingeengte Rückstand nach
Bestimmung seiner Verseifungszahl direkt mit alkoholischer Kalilauge oder anderen
geeigneten Verseifungsmitteln verseift.
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Z,
Die Abtrennung des Unverseifbaren wird wie
üblich vorgenommen, am günstigsten durch Ausschütteln des wässerig-alkoholischen
Verseifungsproduktes oder durch Extraktion der trockenen Seifen mittels Äther, Benzin,
Benzol, Essigester oder ähnlicher Lösungsmittel.
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Man erhält nach Trocknen und Verdunsten derselben schwachgelb gefärbte
kristalline Rohmycosterine in Ausbeuten von oj bis ö,8%, bezogen auf Trockensubstanz.
Man kristallisiert um aus Alkohol, Benzolalkohol oder Essigesteralkohol und erhält
fast weiße Blättchen oder Nadeln.
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Bei der Untersuchung der Sterine zeigt sich, daß alle für Pilzsterine
verlangten Reaktionen eintreten, so die Liebermann-Burchardsche Probe und die umgekehrte
Salkowskische Reaktion. An speziellen Reaktionen auf Ergosterin sind positiv die
Reaktionen nach Tortelli-Jaff#, nach Rosenheim sowie nach Räussler und Brauchli
sowie Heilbron und Spring.