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DE2438031A1 - Verfahren zur biotechnischen herstellung von l-lysin - Google Patents

Verfahren zur biotechnischen herstellung von l-lysin

Info

Publication number
DE2438031A1
DE2438031A1 DE2438031A DE2438031A DE2438031A1 DE 2438031 A1 DE2438031 A1 DE 2438031A1 DE 2438031 A DE2438031 A DE 2438031A DE 2438031 A DE2438031 A DE 2438031A DE 2438031 A1 DE2438031 A1 DE 2438031A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
acinetobacter
lysine
atcc
cultivation
mutant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
DE2438031A
Other languages
English (en)
Inventor
Tamotsu Hirakawa
Kenji Takahara
Tutomu Tanaka
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Original Assignee
Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd filed Critical Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Publication of DE2438031A1 publication Critical patent/DE2438031A1/de
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales

Landscapes

  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
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  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

KANEGAFUCHI CHEMICAL INDUSTRIES CO., LTD,, Osaka, Japan
l! Verfahren zur biotechnischen-Herstellung von L-Lysin ■" Priorität: 7-. August 1973, Japan, Nr. 89 155/73
Bekanntlich ist L-Lysin ein wertvoller Zusatzstoff für Nahrungsund Futtermittel sowie ein Zwischenprodukt zur Herstellung von Arzneistoffen. Es besteht daher ein Bedarf an einem technisch leistungsfähigen Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Lysin aus billigen assimilierbaren Kohlenstoffquellen. ■-.■■■■
Es sind bereits verschiedene.Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Lysin bekannt, bei denen Kohlenwasserstoffe als assimilierbare Kohlenstoffquellen eingesetzt werden; vgl. japanische PatentveröffentlichungenNr. 875/1965, 14 789/1969, 2.5 711/1972 und 43 073/1972. Die bei diesen Verfahren eingesetzten Stämme gehören zur Gattung Corynebacterium, Brevibacterium, Arthx-obacter, Micrococcus, Mycobacterium und Nocardia.
50 9808/103 4
Γ
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein neues, leistungsfähiges Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Lysin zu schaffen. Die Lösung dieser Aufgabe beruht auf dem überraschenden Befund, daß Mikroorganismen, die zur Gattung Acinetobacter gehören, und deren Mutanten die Fähigkeit haben, L-Lysin in hoher Ausbeute zu bilden.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Lysin, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine aus einem Mikroorganismus der Gattung Acinetobacter hergestellte, L-Lysin produzierende Mutante in einem assimilierbare Kohlenstoffquellen enthaltenden Nährmedium unter aeroben Bedingungen züchtet und aus der Gärmaische das entstandene L-Lysin isoliert.
Vorzugsweise wird als assimilierbare Kohlenstoffquelle eine unverzweigte aliphatische Kohlenwasserstoffe enthaltende •Erdölfraktion bzw. ein Erdölprodukt verwendet, das derartige unverzweigte aliphatische Kohlemvasse.rstoffe enthält.
Auf der Suche nach Kohlenwasserstoffe assimilierenden Mikro^- organismen aus Bodenproben, die L-Lysin in hoher Ausbeute bilden, wurde überraschenderweise festgestellt, daß Mutanten von Mikroorganismen der Gattung Acinetobacter die Fähigkeit haben, L-Lysin in hoher Ausbeute aus Kohl env/a ss er st of fen zu bilden.
"Ein typisches Beispiel eines Mikroorganismus der Gattung Acinetoba'cter ist die neue Art Nr. 38, die bei der American Type Culture Collection unter der Nummer ATCC 31023 hinterlegt ,
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wurde. Dieser Stamm bildet nur eine geringe Menge an L-Lysin in einem unverzweigte Paraffine enthaltenden Nährmedium.- Überraschenderweise wurde festgestellt, daß verschiedene Mutanten · mit verbesserter L-Lysinproduktivität aus dieser Art hergestellt werden können, wenn man diese Art einer üblichen, Mutation auslösenden Behandlung, beispielsweise durch Bestrahlen mit UV-Licht oder mit chemischen mutagenen Verbindungen,
(Stickstoff-Lost) / ■ wie Nitrosoguanidin oder Stickstofß-Senfgas7,unterwirft. Einige dieser neuen Mutanten wurden unter der Bezeichnung Nr. 38-15 (ATCC 31024), Nr. 38-1.9 (ATCC 31025) und Nr. 38-20 (ATCC 31038) bei der American Type Culture Collection hinterlegt.
Die neu isolierte Acinetobacter-Art Nr. 38, die als Elternstamm dient, hat folgende Eigenschaften:
I. Morpho 1 off_isehe Eigenachaften ·
1) In der logarithmischen Wachstumsphase entstehen einfache oder Zwillingszellen mit den Abmessungen 0,7 bis 1,0 χ 1,5 bis 2,0 Mikron in Form von kurzen Stäbchen, die an beiden Enden abgerundet sind. In der stationären Phase sind die Zellen etwas kleiner als in der logarithmi-
. sehen Wachstumsphasej und es werden einige-einzelne oder Zwillingszellen in Kugelform beobachtet. Bei fortgesetzter
•Züchtung treten große, kugelförmige«Zellen auf.
2) Bewegung: keine ■ · "
3) Gram-Färbung, modifiziert nach Hucker:' negativ, Entfärbung mit 95prozentigem Äthanol manchmal schwierig.
<r 4) Sporenbildung: keine. - .."·".
l_ 5) Färbung zur Bestimmung säurefester Bakterien: negativ. ,_j
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II. Kultureigenschaften;
1.) Neue Agarplatte: Wachstum in runden Kolonien. Vollständige Kante, graustichig weiß, glänzende und glatte Oberfläche, keine Pigmentbildung.
2) Nähragar-Schrägröhrchen: Wachstum in linearen Kolonien, graustichig weiß, glänzende und glatte Oberfläche, keine Pigmentbildung.
3) Nährbrühe: gleichmäßig trübe, Bildung einer Fällung.
4) Nährgelatine-Stichkultur: Keine Verflüssigung, Bildung geringer Mengen eines braunen, löslichen Pigments, Oberflächenwachstum.
5) Lackmusmilch: Säurebildung und Koagulierung.
III. Physiologische Eigenschaften:
1) Nitratreduktion: negativ
2) Voges-Proskauer-Reaktion: negativ
3) Indolbildung: "' negativ
4) Schwefelwasserstoffbildung: negativ bis schwach positiv
5) Stärkehydrolyse: negativ
6) Citronensäureverwertung: positiv
7) Urease: positiv
8) Katalase: positiv
9) Oxidase: negativ
10) Säurebildung aus Kohlenhydraten: Säurebildung aus Xylose, Glucose, Mannose und Galactose. Säurebildung aus Lactose nach einiger Zeit. Schwache Säurebildung aus Arabinose und Fructose. Keine Säurebildung aus Maltose, Rohrzucker, Trehalose, Sorbit, inosit, Glycerin und Stärke.
J 50 9808/1034
11) Verwertung von kohlenstoffquellen: ' -
Positive Verwertung von C10 - C20 n-Paraffineri, Essigsäure, Citronensäure, Bernsteinsäure und Äthanol.:
12) Nährstoffbedarf:. keiner
13) Oxidations-Fermentations-Test (Ö.P.-Test): :
• Oxidativer Abbau ■
14) Optimale Wachstumsteinperatur? 30 bis 6ÖÖC. -
15) Wachstum im pH-Bereich: 5,5 bis 9,0
16) Sauerstoffbedarf: aerob ■ .
IV. Herkunft: . aus Bodenproben,
Aus den vorgenannten Eigenschaften ergibt sich mit Ausnahme der Bildung einer geringen Menge eines bräunen Pigments in Nährgelatine die Zugehörigkeit der Art zur" Gattung Acinetobacter, deren Eigenschaften von P. Baumann und Mitarbeiter in Journal of Bacteriology, 1968,.S. 152Ο, angegeben sind. Es gibt jedoch keine identische Art in der Gattung Acinetobacter. Deshalb wurde diese Art als Acinetobacter sp./Nr. 38 bezeichnet.
Im erfindungsgemäßen Verfahren werden L-Lysin produzierende Mutanten von Acinetobacter sp. Nr. 38 eingesetzt. Diese Mutanten können in an sich bekannter Weise hergestellt werden. Eintypisches Verfahren zur Herstellung von Mutanten ist nachstehend näher beschrieben. Es können jedoch auch andere Verfahren zur Herstellung von Mutanten aus Acinetobacter sp. Nr. 38 angewendet werden. Die Mutantenstämme mit hoher L-Lysin-Produktivität können aus dem Elternstamm durch mutagene Behandlung oder
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durch Adaption unter Verwendung mindestens einer Aminosäure oder Aminosäure-Analogen hergestellt werden. Beispielsweise kann eine Kultur von Acineiobacter sp. Nr. 38 mit einer Mutationsauslösenden Verbindungen, wie Nitrosoguanidin (N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin) oder Stickstoff-Senfgas, oder mit UV-Licht behandelt oder einer Adaptionsbehandlung unterworfen werden. Die Adaption kann durch Züchten des Elternstammes in einem Nährmedium durchgeführt werden, das eine bestimmte Aminosäure oder ein Aminosäuie-Analoges oder deren Kombination enthält, beispielsweise eine Aminosäure, wie Threonin, Valin, Methionin, Lysin oder Serin, Aminosäure-Analoga, wie Norvalin, ß-Hydroxynorvalin, α-Aminobuttersäure, a-Amino-ßchlorbuttersäure, S-Aminoäthylcystein, Lysin-hydroxid, Serin» hydroxid, Methionin-hydroxid oder Valin-hydroxid. Vorzugsweise wird die Aminosäure oder das Aminosäure-Analoge cder deren Kombination in einer Konzentration von mindestens etwa 0,5 g/Liter Nährmedium verwendet. Der Mutantenstamm wird durch Verdünnen der erhaltenen Kultur und aufstreichen der verdünnten Kultur auf eine Minimum-Agarplatte, welche die gleichen Aminosäuren oder Aminosäuren-Analoga oder die gleiche Kombination dieser Verbindungen enthält, und 3- bis 5-tägiges Inkubieren, bis sich Kolonien gebildet haben. Beispiele für verwendbare Kohlenstoffquellen für das Minimum-Agarmedium sind η-Paraffine, Carbonsäuren und Äthanol.
Sobald der Stamm gegenüber der zur Adaption verwendeten speziel-' len Aminosäure oder dem Analogen der Aminosäure resistent ist, wird der erhaltene resistente Stamm einer mutagenen Behandlung oder einer Adaptionsbehandlung unter Verwendung anderer Aaino-
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Γ ■ ■ -7- ""
säuren oder Analogen von Aminosäuren oder deren Kombination unterworfen, um den Stamm gegenüber den Aminosäuren oder den Analogen der Aminosäuren oder der Kombination dieser Verbindungen resistent zu machen. Der auf diese Weise erhaltene.. Stamm wird wiederholt der vorgenannten Behandlung unter Verwendung einer anderen Aminosäure oder eines Analogen dieser Aminosäure oder deren Kombination unterworfen,. um einen Stamm zu erhalten, der gegenüber verschiedenen Aminosäuren oder Analogen von Aminosäuren oder deren Kombination resistent ist. Der erhaltene resistente Stamm zeichnet sich durch eine, ausgezeichnete Fähigkeit zur Bildung von L-Lysin bei der aeroben Züchtung unter Verwendung von η-Paraffinen aus.
Als Kohlenstoffquellen können im erfindungsgemäßen Verfahren beliebige, assimilierbare Kohlenstoffquellen verwendet werden. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren läßt sich L-Lysin in hoher Ausbeute unter Verwendung von Erdölprodukten oder -fraktionen herstellen, die unverzweigte aliphatisch^ Kohlenwasserstoffe mit 10 bis. 20 Kohlenstoffatomen enthalten, ferner aus Kerosin oder Gasöl, sowie aus Alkoholen und Carbonsäuren. Diese Kohlenstoff quellen können entweder allein oder im. Gemisch miteinander verwendet werden. Besonders günstige Ergebnisse werden erhalten, wenn diese Kohlenstoffquellen dem Nährmedium während der Züchtung zugeführt werden. -.'■■.
Als Stickstoffquellen können im erfindungsgemäßen Verfahren organische oder anorganische Ammoniums.alze, wie Ammoniumsulfat, ■ >:. Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat, Ammoniumacetat, Ammoniumsucci-■ nat, Harnstoff und Ammoniak eingesetzt werden.'- ■
Als anorganische Salze können im erfindungsgemäßen Verfahren beispielsweise Kaliumphosphat, Natriumphosphat, Magnesiumsulfat, Calciumcarbdnat, Eisen(ll)-sulfat, Mangansulfat und Zink-. sulfat verwendet v/erden. Diese anorganischen Salze werden in den bei biotechnischen Verfahren üblichen Mengen eingesetzt.
Vorzugsweise wird dem Nährmedium auch eine grenzflächenaktive Verbindung einverleibt. Besonders bevorzugt ist Polyoxyäthylensorbitantrioleat (Tween 85), das in einer Menge von 0,01 bis 0,5 Gewichtsprozent, bezogen auf die Gesamtmenge des Kulturmediums, verwendet wird.
Der pH-Wert des Kulturmediums wird im Bereich von etwa 5,5 bis 9,0, vorzugsweise 6,0 bis 8,0; während der gesamten Züchtung ■ eingestellt. Vorzugsweise wird dies durch Zugabe von Ammoniumionen erreicht. Die Züchtung wird bei Temperaturen von etwa 25 bis 4O0C, vorzugsweise 30 bis 370C,durchgeführt. Die Züchtung muß unter aeroben Bedingungen, beispielsweise durch Rühren . unter Belüften oder durch Schütteln erfolgen. Nach beendeter Züchtung werden die Zellen in an sich bekannter Weise aus der Gärmaische abgetrennt, beispielsweise abfiltriert oder abgeschleudert. Aus dem Filtrat oder dem Überstand wird das L-Lysin in an sich bekannter Weise isoliert, beispielsweise unter Verwendung von Ionenaustauscherharzen, wie Amber\Lite IRC-84, IRC-120 und IRC-50. Das Ionenaustauscherharz wird sodann mit wäßriger Ammoniaklösung eluiert und das erhaltene Eluat eingedampft und mit konzentrierter Salzsäure neutralisiert. Das entstandene L-Lysin-hydrochlorid wird getrocknet. Man erhält, ein Produkt in einer Reinheit von mindestens 98 Prozent.
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Die Beispiele erläutern die Erfindung. Proζentangaben, Teile und Mengenverhältnisse beziehen sich auf-das Gewicht, sofern, nichts anderes angegeben ist. ' ' · .
Bei spiel.1
In große Reagenzgläser, die 10 ml eines Nährmediums mit 1 Prozent Pepton, 1 Prozent Fleischextrakt und 0,5 Prozent Hefeextrakt, werden je\veils eine Platinöse Impfmaterial von Acinetobacter sp. Nr. 38 (ATCC 31023) bzw. der von diesem Elternstamm hergestellten Mutant ens tämme Acinetobacter sp..· Nr. 38-15 (ATCC 31024), Acinetobacter sp. Nr. 38-19 (ATCC 31025) und Acinetobacter sp. Nr. 38-20 (ATCC 31038) überimpft. Das Kulturmedium wurde vorher 15 Minuten bei 12O0C sterilisiert. Die beimpften Kulturen v/erden 24 Stunden bei 33 C inkubiert. 2 Tropfen der erhaltenen Saatkultur werden hierauf in große Reagenzgläser überimpft, die 10 ml des nachstehend genannten Nährmediums enthalten ,und bei 330C inkurbiert. ;
(a) Nährmedium (Kontrollmedium)
Äthanol . 15 ml (nach dem- Sterilisieren
zugesetzt)
75prozentige Phosphorsäure 12 ml '
Ammoniumsulfat 6g
MgSO4.7H2O . 200 mg
FeSO4.7H2O 100 mg
CaCl2.2H2O 100 mg .
ZnSO4.7H2O 30 mg '
MnSO4.4H2O 2 mg ■'■*''"
CuSO4.5H2O - 0,5 mg ' '
NaOH 10 g··
Leitungswasser 1 Liter
-J 50980 8/1034
(b) Threonin enthaltendes Nährmedium Kontrollmedium + 0,5 g/Liter Threonin
(c) Valin enthaltendes Nährmedium Kontrollmedium + 0,5 g/Liter Valin.
Die Nährmedien werden vor dem Beimpfen 15 Minuten bei 12O0C sterilisiert.
In Tabelle I ist das Wachstum der Stämme in den Nährmedien zusammengefaßt .
Tabelle I Züchtung s- Stamm
dauer, Nährmedium Nr< 38 -Nr. 38.15 Nr. 38-19 Nr.38-20
Kontroll- + + + + medium
Kontrollmedium
PQ · + - ■ + Threonin
Kontrollmedium
Valin
Kontrollmedium
Threonin 48
.Kontrollmedium
Valin
Aus Tabelle I ist ersichtlich, daß bei 20stündiger Züchtung der Stamm Nr. 38-15 resistent gegenüber Threonin und Valin ist, ■ und die Stämme Nr. 38-19 und Nr. 38-20 resistent gegenüber Valin \ l_sind. _j
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Γ · - ιι -
Die erhaltenen vier Stämme werden in Schrägröhrchen überimpft "und 2 Tage bei 33°C inkubiert. Die Schrägröhrchen enthielten ein Nährmedium folgender Zusammensetzung:
η-Paraffin (C13-C18) 0,8 %
Ammoniumsulfat · 0,6%-
K2HPO4 ' '· 1,0 %
KH2PO4 1,0 %
MgSO4.7H2O 0,02 %
NaCl . 0,1 .%
'PeSO4.7H2O ' 0,01 %
CaCl2.2H2O . ■ 0,01 %
ZnSO4,7H2O ' . 0,003%
MnSO4.4H2O · 0,0003%-
Agar ■ ' ' : 2 % · '" ··
Vor dem Beimpfen wird das Nährmedium auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt und 15 Minuten bei 12O0C sterilisiert. :
Sodann wird eine Platinöse der erhaltenen Kulturen in 500 ml fassende Sakagucbi-Flaschen überimpft, die jeweils 20 ml eines Nährmediums folgender Zusammensetzung enthalten. Die Züchtung wird 10 Tage unter Schütteln bei '330C durchgeführt. L-Lysin-Produktionsmedium:
η-Paraffin (C12-C18) . ■ 10 %
K0HPO, ' ' . · 0,05 % . -
KH2PO4 0,05 % '
MgSO4.7H2O . ■ '0,05 %
FeSO4.7H2O 0,001%
. ZnSO4.7H2O ' 0,001% /
MnSO4.4H2O . 0,001% Polyoxyäthylensorbitantrioleat ""0,1· %
CaCO3 3 % · ■
(NH4)2SO4 .-■■"■. 3,5 %
Vor dem Beimpfen wird das Produktionsmedium 15 Minuten bei
1- . ■■:■■■■ ' j
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1200C sterilisiert.
Nach beendeter Züchtung wird der Gehalt an L-Lysin-hydrochlorid in der Kulturbrühe mit einem biochemischen Mikrotest bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengefaßt.
Tabelle II
eingesetzter Stamm L-Lysin-HCl g/Liter
Acinetobacter sp. Nr. 38 0,4
Acinetobacter sp. Nr. 38-15 20,2
Acinetobacter sp. Nr. 38-19 · 21,4 '
Acinetobacter sp. Nr. 38-20 1,1
-Beispiel 2
Gemäß Beispiel 1 wird Acinetobacter sp. Nr. 38-15 in dem in Beispiel 1 verwendeten C^-C^g-n-Paraffine und anorganische Salze enthaltenden Nährmedium in Schrägröhrchen 2 Tage bei 330C gezüchtet. Eine Platinöse der erhaltenen Kultur wird sodann in 500 ml fassende Sakaguchi-Flaschen überimpft, die 30 ml eines Saatkulturnährmediums enthalten., und 24 Stunden bei 33 C inkubiert.
Saatkulturnährmedium
I8) 2 %
Vol.-%
η-Paraffin (C12-C18) 2
75 % Phosphorsäure 1,2
(NH4)2S04 0,6
NaCl 0,1
MgSO4.7H2O 0,02
CaCl2.2H2O 0,01
■ FeSO4.7H2O 0,01
ZnSO4.7H2O 0,003
MnSO4.4H2O 0,0002
Polyoxyäthylensorbitantrioleat 0,05
■ KOH 1,4
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Das Nährmedium wird vor dem Beimpfen 15 Minuten bei 1200C sterilisiert.
5 ml der erhaltenen Saatkultur werden sodann in .2 Liter fassende Sakaguchi-Flaschen überimpft, die 200 ml des vorgenannten Saatkulturmediums enthalten. Die Züchtung wird Zk Stunden bei 330C unter Schütteln durchgeführt. 600 ml der erhaltenen Saatkultur werden sodann in einen 30 Liter fassenden Fermenter überimpft,, der 19 Liter eines L-Lysin-Produktionsmediums enthält, und 72 Stunden bei 33°C, einer Belüftungsgeschwindigkeit von 27 Liter/min, einer Rührgeschwindigkeit von 500 U/min und bei einem pH-Wert der·Kulturflüssigkeit von 6 bis 8 (durch Zusatz von wäßriger Ammoniaklösung eingestellt) gezüchtet.
L-^Lysin-Produktionsm.edium
η-Paraffin (C12-C18) 10 %
K2HPO4 ·. 0,05 · %
KH2PO4 ' Q, 05 %
MgSO4.7H2O .: 0,05 %
FeSO4.7H2O 0,001 %
ZnSO4.7H2O 0,001 %
MnSO4.4H2O 0,001 %
Polyoxyäthylensorbitantrioleat . 0,1 %
(NH4)2S04 2,0 q/
/Q
CaCO, 1,0 Si
Vor dem Beimpfen wird das Produktionsmedium 15 Minuten bei 1200C sterilisiert.
Die Kulturflüssigkeit enthält 22 g L-Lysin-hydrochlorid pro Liter. 2 Liter der erhaltenen Kulturflüssigkeit werden zur Abtrennung der Zellmasse zentrifugiert, und der Überstand wird
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auf eine mit dem Ionenaustauscher Amberlite IRC-84 gefüllte Säule gegeben. An dem Ionenaustauscherharz wird L-Lysin adsorbiert. Sodann wird die Säule mit Wasser gewaschen und das L-Lysin mit verdünnter wäßriger Ammoniaklösung eluiert. Das Eluat v/ird eingedampft, mit konzentrierter Salzsäure auf einen pH-Wert von 5,5 eingestellt und getrocknet. Ausbeute 37,9 g L-Lysin-hydrochlorid mit einer Reinheit von mindestens 98 Prozent.
Beispiel 3
Acinetobacter sp. Nr. 38-15 wird 2 Tage bei 33°C in einer Bouillon-Schrägkultur gezüchtet. Eine Platinöse der Kultur wird zum Beimpfen von 20 ml eines L-Lysin-Produktionsnährmediums verwendet, das in einer 500 ml fassenden Sakaguchi-Flasche enthalten ist. Der Stamm wird 4 Tage bei 33 C unter Schütteln gezüchtet. Das Nährmedium hat folgende Zusammensetzung:
Äthanol (in Anteilen eingespeist) 5 % ■
0,1 %
0,1 %
0,05 %
0,001 %
0,001 %
0,001 %
0,1 %
1 %
1 %
Vor dem Beimpfen wird das Produktionsmedium 15 Minuten bei 1200C sterilisiert.
K2HPO4
KH2PO4
MgSO4.
FeSO4.		 7H2 0
0		 SO4
ZnSO4. 7H2 0
MnSO4. 4H2 0
Polyoxyäthylensorbitantrioleat
CaCO3
(NH4)2
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Nach beendeter Züchtung ·enthält die Kulturflüssigkeit 4,1 g L-Lysin/Liter. ■ .
Beispiel 4 ' , . ■.
Ein Stamm von Acinetobacter sp. Nr. 38-15 wird gemäß Beispiel. 3 gezüchtet, anstelle von Äthanol wird jedoch Essigsäure als Kohlenstoffquelle im L-Lysin-Produktionsnährmedium verwendet. Nach beendeter Züchtung wird der L-Lysingehalt biochemisch nach einem Mikrotest bestimmt. Die Ausbeute beträgt 3,7 g/Liter L-Lysin-hydrochlorid.
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Claims (16)

  1. Patentansprüche
    j). Verfahren zur biotechnischen Herstellung von L-Lysin, dadurch gekennzeichnet, daß man eine aus einem Mikroorganismus der Gattung Acinetobacter hergestellte, L-Lysin produzierende Mutante in einem assimilierbare Kohlenstoff quellen enthaltenden Nährmedium unter aeroben Bedingungen züchtet und aus der Gärmaische das entstandene L-Lysin isoliert.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kohlenstoffquelle eine unverzweigte aliphatische Kohlenwasserstoffe enthaltende Erdölfraktion verwendet.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als·Erdölfraktion Kerosin, ein Gemisch von n-Paraffinen mit 10 bis 25 Kohlenstoffatomen oder ein unverzweigte aliphatische Kohlenwasserstoffe mit 10 bis 25 Kohlenstoffatomen enthaltendes Gasöl verwendet. , ■ "
  4. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kohlenstoffquelle einen Alkohol verwendet.
  5. 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Alkohol Äthanol verwendet.
  6. 6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kohlenstoffquelle eine Carbonsäure verwendet.
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    1"
  7. 7. Verfahren.nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß
    man als Carbonsäure Essigsäure verwendet.
  8. 8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung mit einer Mutante durchführt, die aus der Art Acinetobacter sp. Nr. 38 ATCC 31023 erhalten worden ist.
  9. 9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung mit einer Mutante durchführt, die gegenüber· einer Aminosäure oder einem Analogen derselben, einer Kombination von Aminosäuren oder einer Kombination von Aminosäure-Analogen oder einer Kombination von Aminosäuren und ihren Analogen resistent ist. .
  10. 10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man die.Züchtung mit einer Mutante durchführt, die gegenüber L-Threonin in einer Konzentration von mindestens 0,05 Prozent und L-Valin in einer Konzentration von mindestens 0,05 Prozent resistent ist.
  11. 11. Verfahren nach Anspruch TO, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung mit Acinetobacter sp. Nr. 38-15 ATCC 31024, Acinetobacter sp.. Nr. 38-19 ATCC 31025 oder Acinetobacter sp. Nr. 38-20 ATCC 31038 durchführt.
  12. 12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß /man die Züchtung bei Temperaturen von 25 bis 400C und einem
    pH-Wert von 5,5 bis 9 durchführt.
    509808/1034 ■ ·
    - 1β -
  13. 13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Einstellung des pH-Werts während der Züchtung Ammoniumionen zugibt.
  14. 14. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung in Gegenwart einer grenzflächenaktiven Verbindung durchführt.
  15. 15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß man als grenzflächenaktive Verbindung Polyoxyäthylensorbitantrioleat verwendet.
  16. 16. Acinetobacter sp. Nr. 38-15 ATCC 31024, Acinetobacter sp. Nr. 38-19 ATCC 31025 oder Acinetobacter sp, Nr. 38-20 ATCC 31038 zur Durchführung des Verfahrens gemäß Anspruch 1 bis 15. .
    509808/1034
DE2438031A 1973-08-07 1974-08-07 Verfahren zur biotechnischen herstellung von l-lysin Pending DE2438031A1 (de)

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