DE2555169A1

DE2555169A1 - Hepatitis-antigen

Info

Publication number: DE2555169A1
Application number: DE19752555169
Authority: DE
Inventors: Maurice Ralph Hilleman; Oswald Ludwig Ittensohn; Philip Joseph Provost
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1974-12-09
Filing date: 1975-12-08
Publication date: 1976-06-10
Also published as: FR2293944B1; KE3110A; US4029764A; FR2293944A1; JPS6335612B2; HK4081A; BE836390A; MY8100308A; NL189050C; NL7513816A; GB1508878A; JPS5182720A; CY1104A; DE2555169C2

Description

Hepatitis-Antigen

Die Erfindung betrifft Hepatitis Α-Antigen (das Antigen der infektiösen Hepatitis) sowie ein Verfahren zur Herstellung .desselben, die Verwendung desselben für die Untersuchung auf Hepatitis A und ein Verfahren zur Herstellung von Impfstoff gegen Hepatitis A.

Hepatitis A ist eine Leberkrankheit, die zwar gewöhnlich nicht tödlich verläuft, aber zu einer vielwöchigen schwächenden Erkrankung führen kann. Gewöhnlich verbreitet sie sich durch direkte Berührung mit infizierten Personen oder durch infiziertes Trinkwasser oder infizierte Nahrungsmittel. Die Untersuchung der Hepatitis A ist bisher dadurch behindert worden, dass es keine einfache spezifische Analysenmethode auf Antikörper gegen Hepatitis Α-Virus gab. Es war bisher nicht möglich, eine solche Analysenmethode zu entwickeln, weil keine Präparate zur Verfügung standen, die Hepatitis Α-Antigen in solchen Mengen enthielten, wie sie für die Durchführung der Komplementfixierung, der Bindung von Immunkörpern und anderer serologischer Analysen erforderlich sind. Die einzigen bisher

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zur Verfügung stehenden Prüfmethoden waren die Neutralisationsuntersuchung bei Seidenäffchen (Provost und Mitarbeiter, "Proc. Soc. Exp. Biol. Med.", Band 142, 1973, Seite 1257) und die immunologische Elektronenmikroskopie (Feinstone und Mitarbeiter, "Science" vom 8. November 1973) von Fäkalextrakten. Diese Methoden waren umständlich und kostspielig und für Routineuntersuchungen nicht anwendbar.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, eine praktische Methode zur Gewinnung von Hepatitis Α-Antigen in genügenden Mengen für die Verwendung bei der Untersuchung auf Hepatitis A zur Verfügung zu stellen. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, einen Impfstoff gegen Hepatitis A zur Verfügung zu stellen.

Hepatitis Α-Antigen (das Antigen der infektiösen Hepatitis) wird aus der Leber eines mit Hepatitis Α-Virus infizierten, nicht-menschlichen Primaten gewonnen. Rohe und gereinigte antigenhaltige Leberextrakte werden für die serologische Untersuchung auf Hepatitis Α-Antikörper und für die Herstellung eines Impfstoffs gegen Hepatitis A verwendet.

Das Hepatitis Α-Antigen (das Antigen der infektiösen Hepatitis) gemäss der Erfindung wird aus der Leber eines nicht-menschlichen Primaten, z.B. eines Seidenäffchens, wie Saguinus mystax, gewonnen, das intravenös mit Hepatitis Α-Virus infiziert wor-r den ist. Sodann wird die Leber des Primaten zu einem Zeitpunkt, zu dem der Serumspiegel an Glutamat-Oxaloacetat-Transaminaseenzym und an Isocitronensäure-Dehydrogenaseenzym erhöht ist, was gewöhnlich etwa 14 bis 40 Tage nach der Impfung der Fall ist, entfernt. Die Leber wird mit physiologischer Kochsalzlösung bei einem pH-Wert von etwa 6,0 bis 7,8, z.B. einer mit Phosphat gepufferten Kochsalzlösung, die 0,'005-molar an Natriumphosphat und 0,143-molar an Kochsalz ist und einen pH-Wert von 7,2 aufweist, perfundiert. Dann wird die Leber,

z.B. durch Mahlen, zerkleinert, um die subzellulären Bestandteile in Freiheit zu setzen, und mit physiologischer Kochsalzlösung zu einer 10-gewichtsprozentigen Suspension gemischt. · Das Antigen besteht aus der überstehenden Flüssigkeit, die man nach dem Klaren durch Zentrifugieren mit geringer Geschwindigkeit, z.B. etwa 1000 bis 2000 U/min, für einen kurzen Zeitraum, z.B. etwa 5 bis 15 Minuten, erhält. In dieser Form ist das Antigen für die Durchführung der Analysen auf Hepatitis A-Antikörper durch Komplementfixierung und Immunkörperbindung

anwendbar. Das Antigen enthält in dieser Form etwa 10 Hepatitis A-Virusteilchen je cm von einer Grosse von 27 mu.

Die antigenhaltige geklärte überstehende Flüssigkeit kann nach Dichtegradientmethoden, wie der isopyknischen und/oder der Zonenzählmethode (rate zonal method) gereinigt und fraktioniert werden. Die isopyknische oder zonale Trennung nach dem Dichtegradienten kann in an sich bekannten Medien, wie z.B. Caesiumchlorid, Natriumbromid, Natriumtartrat, Saccharose oder anderen Stoffen ähnlicher Art, durchgeführt werden. Die bei der Trennung erhaltenen verschiedenen Fraktionen werden mit Hepatitis A-Antikörper auf Hepatitis A-Antigen analysiert, und Fraktionen, die die maximale Menge an Hepatitis A-Antigen enthalten, werden ausgewählt. Wenn die Trennung nach der Auftriebsdichte unter Verwendung von CsCl als Medium erfolgt, wird das Hepatitis Α-Antigen in maximaler Menge aus der Fraktion mit einer Auftriebsdichte von etwa 1,32 bis 1,36 g/cm

gewonnen. In dieser Form enthält das Antigen etwa 10 Hepatitis A-Virus te liehen je cm von einer Grosse von 27 mu.

Das Antigen gemäss der Erfindung ist für die immunologische Analyse auf Hepatitis Α-Antikörper verwendbar. Diese Analyse ist im einzelnen in der gleichzeitig eingereichten Patentanmeldung (15 719-Y), betitelt "Immunologische Analyse", beschrieben.

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Das Hepatitis.Α-Antigen lässt sich in jeder beliebigen Form, gleich ob es aus Lebergewebe oder anderem Gewebe gewonnen worden ist, für die Verwendung als Impfstoff gegen Hepatitis A-Virus inaktivieren oder schwächen. Die Inaktivierung des Infiziervermögens kann durch Behandeln mit Formalin erfolgen. Die Menge des Formalins muss ausreichen, um das Infiziervermögen des Antigens zu inaktivieren, das Immunkörpererzeugungsvermögen jedoch zu erhalten, so dass das Material als Impfstoff wirksam ist. In typischer Weise wird Formalin, d.h. 37-prozentige Formaldehydlösung, mit etwa 1000 bis 10 000 Teilen Antigenpräparat verdünnt und etwa. 2 Stunden bis 30 Tage bei Temperaturen von etwa 4 bis 60° C gerührt; vorzugsweise wird das Formalin mit etwa 2000 bis 6000 Teilen des Viruspräparats für einen Zeitraum von etwa 2 bis 6 Tagen bei 20 bis 45° C gerührt. Besonders bevorzugt wird die Durchführung dieses Verfahrens für einen Zeitraum von 3 Tagen bei etwa 37° C.

Der Impfstoff gemäss der Erfindung kann zum Immunisieren von für Hepatitis Α-Virus empfänglichen Säugetierarten, wie z.B. Seidenäffchen und Schimpansen, verwendet werden.

Beispiel 1 Isolierung des Antigens

Menschliches Hepatitis Α-Virus wird zum intravenösen Impfen eines Seidenäffchens S. mystax nach dem Verfahren von Mascoli und Mitarbeitern, "Proc. Soc. Exp. Biol. Med.", Band 142 (1973), Seite 276, verwendet. 27 Tage nach, der Beimpfung mit dem Virus wird die Leber entfernt. Zu diesem Zeitpunkt ist der Serumspiegel an Glutamat-Oxaloacetat-Transaminaseenzym und an Isocitronensäure-Dehydrogenaseenzym erhöht. Die Leber wird mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH 7,2) perfundiert, mit einer Schere zerkleinert und im Mörser mit sterilem Aluminiumoxid vermählen und zu phosphatgepufferter Kochsalzlösung in solcher Menge zugesetzt, dass man eine 10-gewichtsprozentige

Suspension in der phosphatgepufferten Kochsalzlösung erhält. Das Antigen besteht aus 350 cm überstehender Flüssigkeit, die nach Klärung durch 10 Minuten langes Zentrifugieren mit 1500 U/min erhalten worden ist. In diesem Stadium enthält das

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Antigen mehr als 10 Hepatitis A-Virusteilchen je cm von einer Grosse von 27 mu. Das geklärte Antigen wird dann in ein Caesiumchlorid-Dichtegradientenrohr eingebracht, dessen Inhalt Dichten von 1,1 bis 1,4 g/cm umfasst, und Antigen mit einer Auftriebsdichte von 1,32 bis 1,36 g/cm wird für die Verwendung bei der in den oben genannten Patentanmeldung beschriebenen Analyse auf Hepatitis A abgetrennt. Dieses Antigen enthält

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etwa 10 Hepatitis Α-Virusteilchen je cm von einer Grosse von 27 mu.

Beispiel 2

Elektronenmikroskopie der Leber eines
infizierten Seidenäffchens

Kleine Stückchen von Seidenäffchenlebergewebe, die von mit Hepatitis A-Virus infizierten Tieren gewonnen worden sind, werden in 1 % Osmiumtetroxid fixiert, reihenweise in Äthanol dehydratisiert und in Epoxyharz ("Epon 812») eingebettet. Mit einem Mikrotom (¹¹LKB Ultramicro tome III") werden unter Verwendung eines Diamantmessers Schnitte angefertigt. Die Schnitte werden auf Kupferschirmen aufgenommen, mit Uranylacetat gefärbt, mit Bleicitrat nachgefärbt und im Elektronenmikroskop untersucht. Das Virus ähnelt in Grosse und Form stark den Enteroviren. Der Durchmesser beträgt 27 mp. Das Virus ist in dem Cytoplasma enthalten und neigt dazu, sich in kleinen Bläschen zu lokalisieren, die durch mehrschichtige Membranen gebunden werden können. Die 27 mp grossen Virusteilchen des Präparats werden nach verschiedenen Merkmalen als Hepatitis A-Virus identifiziert. Estrakte der Leber sind imstande, eine Infektion mit Hepatitis A auf andere Seidenäffchen zu übertragen. In der Leber von normalen Seidenäffchen ist das Virus

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nicht enthalten. Gleiche, 27 mu grosse Virusteilchen erhält man aus dem Blut des infizierten Seidenäffchens. Dieses Präparat von 27 mu grossen Virusteilchen wird spezifisch durch menschliches Hepatitis Α-Serum von genesenden Patienten, aber nicht durch.Serum von Patienten, die noch nicht von der Krankheit befallen worden sind, neutralisiert.

Beispiel 3

Immunologische Elektronenmikroskopie -

0,05 ml nach Beispiel 1 hergestelltes Antigen werden mit 0,02 ml einer 1:20-Verdünnung von menschlichem Hepatitis A-Serum eines von der Krankheit genesenden Patienten inkubiert. Das Gemisch wird eine Stunde bei 37° C inkubiert und dann 3 Stunden auf 4° C gehalten. Ein Tropfen des Materials wird auf einen mit Kohlenstoff überzogenen Kupferschirm (0,05 mm Maschenweite; 300 Maschen) aufgebracht und 30 Sekunden adsorbieren gelassen. Dann wird der Schirm 2 Minuten mit 2-prozentiger wässriger Phosphorwolframsäure mit einem pH-Wert von 6,0 (eingestellt mit 1n Kalilauge) gefärbt und in einem "Philipps-300"-Elektronenmikroskop bei 80 kV untersucht. Nach der Reaktion mit dem Hepatitis Α-Antikörper sind charakteristische Höfe von Antikörpermolekülen zu sehen, die die zahlreichen, 27 mu grossen Hepatitis A-Virusteilchen umgeben und sie zu einem Immunkomplex binden.

Beispiel 4 Komplementfixierungsanalyse

Nach Beispiel 1 hergestelltes, aber nicht der Auftriebsdichtegradiententrennung mit CsCl unterworfenes Antigen wird 2 Stunden auf 56° C erhitzt. Von diesem Material werden Verdünnungsreihen hergestellt und durch Standard-Blocktitration nach der Mikrotitermethode der Komplementfixierungsanalyse mit Verdünnungsreihen von menschlichem Hepatitis Α-Antikörper untersucht. Zwei Einheiten des so definierten Antigens werden ver-

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wendet, um anschliessend menschliches Serum auf Hepatitis A-Antikörper zu analysieren. Der so nachgewiesene Hepatitis A-Antikörper ist spezifisch für von Hepatitis A genesende Patienten. Die an Hepatitis B leidenden Patienten zeigen keine Reaktion auf Hepatitis A-Antikörper. Diese Komplementfixierungsanalyse unter Verwendung von aus der Leber des infizierten Seidenäffchens gewonnenem rohem Hepatitis A-Antigen ist für die Diagnose der Infektion von Menschen mit Hepatitis A anwendbar.

Beispiel 5

Man arbeitet nach Beispiel 1, verwendet jedoch anstelle von S. mystax die folgenden Genera und Spezies: S. nigricollis, S. fuscicollis, S. oedipus, Callithrix jacchus, C. argentata, Cercopithecus aethiops, Pan troglodytes und Anthropopithecus troglodytes. In jedem Falle wird das erhaltene Antigen mit Erfolg für die in der oben genannten Patentanmeldung beschriebene Hepatitis A-Analyse verwendet.

Beispiel 6

Der geklärte Extrakt und das Endprodukt des Beispiels 1, beide unter aseptischen Bedingungen hergestellt, werden 72 Stunden bei 37° C mit Formalin (Verdünnung 1:4000) behandelt. Überschüssiges restliches Formalin wird mit Natriumbisulf it neutralisiert. Alle Behandlungen werden unter aseptischen Bedingungen durchgeführt. Das Produkt wird bei 4° C gelagert. Subkutane oder intramuskuläre Injektionen von 4 Dosen zu je 1 ml, die in Zeitabständen von 2 Wochen an Seidenäff chen S. mystax und Meerschweinchen vorgenommen werden, erzeugen in diesen Tieren zirkulierenden Hepatitis A-Antikörper. Die Seidenäffchen werden durch diese Behandlung immun gegen die Infektion mit virulenten Dosen von Hepatitis A-Virus.

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Claims

Merck & Co., Inc. 8. Dezember 1975

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Patentansprüche

(1> Präparat auf der Basis einer auf einen pH-Wert von 6,0 bis etwa 7,8 gepufferten physiologischen Kochsalzlösung, dadurch gekennzeichnet, dass es Hepatitis Α-Antigen in einer Konzentration enthält, die mindestens ausreicht, um bei der serologischen Immunkörperbindungsanalyse eine messbare Reaktion mit Hepatitis A-Antikörper zu ergeben.
2. Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die physiologische Kochsalzlösung mit Phosphat auf einen pH-Wert von etwa 7,2 gepuffert ist.
3. Präparat nach Anspruch 1 zur Diagnose von infektiöser Hepatitis A, dadurch gekennzeichnet, dass das Hepatitis A-Antigen in der physiologischen Kochsalzlösung in Form einer physiologischen Suspension von Antigenkomponenten von menschlichem Hepatitis A-Virus vorliegt, die bei der Klärung eines Gemisches von zerkleinerter Leber von mit menschlichem Hepatitis Α-Virus infizierten nicht-menschlichen Primaten als Rückstand gewonnen worden sind.
4. Präparat nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die physiologische Kochsalzlösung mit Phosphat auf einen pH-Wert von etwa 7,2 gepuffert ist.
5. Präparat nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen gereinigtes Antigen ist, dessen Aktivität im wesentlichen derjenigen von geklärtem Antigen äquivalent ist, das nach der Dichtegradientenmethode mit Hilfe von Caesium-

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Chlorid abgetrennt worden ist und eine Auftriebsdichte von etwa 1,32 bis 1,36 g/cm aufweist.
6. Präparat nach Anspruch 1 in Form eines Impfstoffs gegen Hepatitis A, dadurch gekennzeichnet, dass das Hepatitis A-Antigen inaktiviert oder geschwächt worden ist und in einer zur Immunisierung gegen Hepatitis Α-Virus ausreichenden Menge vorliegt.
7« Verfahren zur Herstellung eines Präparats von Hepatitis A-Antigen nach Anspruch 1 in einer zur Komplexbildung mit Hepatitis Α-Antikörper ausreichenden Menge, dadurch gekennzeichnet, dass man einen nicht-menschlichen Primaten mit Hepatitis Α-Virus impft, sodann zu einem Zeitpunkt, zu dem ein erhöhter Serumspiegel an Glutamat-Oxaloacetat-Transaminaseenzym und an Isocitronensäure-Dehydrogenaseenzym besteht, die Leber des infizierten Primaten entfernt, die Leber mit physiologischer Kochsalzlösung perfundiert, die Leber zerkleinert und durch Zusatz von Kochsalzlösung eine etwa 5- bis 25gewichtsprozentige Lebersuspension herstellt, die Suspension klärt, die Suspension mit CsCl-Dichtegradientenlösung versetzt und das Material mit einer Auftriebsdichte von etwa 1,32 bis 1,36 g/cm auswählt.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man als nicht-menschlichen Primaten ein Seidenäffchen verwendet.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass man als Seidenäffchen S. mystax verwendet.
10. Verfahren zur Herstellung eines Präparats gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Präparat gemäss Anspruch 1 inaktiviert oder schwächt.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass man die Inaktivierung oder Schwächung mit Formalin durchführt.

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