DE1492042A1

DE1492042A1 - Antigenherstellung

Info

Publication number: DE1492042A1
Application number: DE19651492042
Authority: DE
Inventors: Irving Millman
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1964-12-11
Filing date: 1965-12-10
Publication date: 1969-05-14
Also published as: GB1108906A; NL6516118A; FR1561060A; BE673564A; FR5334M; ES320879A1; US3395219A; SE318672B; IL24715A; NO117493B; BR6575449D0; DK114572B

Description

P 14 92 042. 4
Neue unterlagen

MBRCK A CO., INC. 126 Saat Lincoln Avenue, Rahway, New Jersey 07065, V.St.A₁

Antigenhereteilung |

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Extrahieren von B.-pertussis-Antigen und die Verwendung dieses Antigene zur Herstellung von mono- oder polyvalenten Vakzinen, die von jeglichem wesentlichen Gehalt an Zellmaterial des B. pertussis frei sind.

0er Keuchhusten ist als eine akute, stark übertragbare, infektiöse Erkrankung definiert, die von B. pertussis hervorgerufen wird und bei Kindern im Alter von unter 4 Jahren gefährlich ist und wahrscheinlich unter den Ursaohen der Kindersterblichkeit an erster Stelle steht. Eine Immunisierung gegen diese Störung ist bisher durch Injektion abgetöteter Zellvakzine oder extrahierten Antigens bewirkt worden. Das häufige Auftreten von Nebenreaktionen, wie Fieber, Empfindlichkeit, Entzündungen und Nekroais, sowie die seltenen, aber entmutigenden Berlohte über B»_MphaUtl. h.b.n »it et«*·»

Q₀₉₈₂₀/mo

Neue Unterlagen (Art τ \ ι Abe. 2 Nr. 1 satz

9368 % ;;

Nachdruck Forschungen nach einer besseren Vakzine notwendig gemacht.

Die vorliegende Erfindung macht ein B.-pertussis-Antigen wesentlich verbesserter Form verfügbar, mit dem sich eine bleibende Immunität gegen Keuchhusten erreichen lässt und das nicht die unerwünschten Nebeneffekte heute bekannter Vakzinen ergibt. Sie stellt eine Vakzine zur Verfügung, die von Zellsubstanzen, die zum Teil toxisoh sind und für die bei Verabreichung im Bändel verfügbarer Vakzinen beobachteten Nebenreaktionen verantwortlieh sein können, frei 1st.

Ss wurde gefunden, dass sich eine wertvoll· Vakzine für die Immunisierung gegen Keuohhuaten durch «Ine Reihe von Arbeitasohritten erhalten lässt, bei denen nan Zellen dea B. pertuss.* mechanisch zerlegt und das Antigen aus der Zellwand ohemisch extrahiert. Es hat sieh gezeigt, das« das Sehut«antigen einen einheitlichen Teil der Zellwand (manchmal auoh als Zelleeebrar oder ZellhUlle bezeichnet) bildet) das Protoplasma der Zelle, das den Kauptanteil des stickstoffhaltigen Materials enthalt, besitzt nur eine geringe bis keine Schutzaktivität. Das Protoplasma enthält Jedoch in hoher Konzentration toxisches Protein, das bei Laboratoriumstieren zum Tode und beim Vorliegen in den klinisch verabreichten Vfekzinen zu unerwünschten Nebeneffekten führen kann.

909820/1160

BAD QWG!NAi

U92042

9568 . 3

Ein Merkmal der vorliegenden Erfindung liegt dementsprechend in der Zerlegung der intakten B.-pertussis-Zelle und Isolierung der Zellw3nde durch Schleudern oder auf anderem meohanisehen Wege. Die isolierten Zellwände werden dann in wee ent Hohen von Zellmaterial freigewaschen und mit einer Lösung eines Salzes der DesoxyoholsSure (z. B. als Alkali-, vorzugsweise Natrium· und Kaliumsalz) extrahiert, welches das Schutzantigen löslich macht und seine mechanische Abtrennung von der ZeIlwand erlaubt.

Die in dem Verfahren gemäss der Erfindung eingesetzten B.-pertueeiε-Zellen können auf jeden der bekannten» zweckentsprechenden Medien gezüchtet werden« wie dem von Powell u.a_r beschriebenen Holzkohie-Agar-Nsdlui (Public Health Report· 66, 346 (1951))» den von Verwey u. a. beschriebenen, flüssigen Medien (J. Baot. 38, 127) oder de» Kulturmedium naoh Cohen-Wheeler (Amer. J. Pub. Health, 36, 371 (19*6)). Naoh dem Wachsen werden die Zellen durch Schleudern geerntet, und |

man kann die Zellen dann In der geernteten Form bei den Verfahren genoss der Erfindung «insetsen oder die Zellpaste bis zum Bedarf gefrieren und bei -30° C aufbewahren. Wenn gewünscht, kann man die geernteten Zellen lyophilisieren und dann bis zum Bedarf aufbewahren oder die Zellen mit Merthiolate (Thlmerosal) oder nach anderen Methoden abtöten, die von einer Zerstörungswirkung auf das Sohutzantlgen des B. pertussis frei sind.

909820/1180 bad original

9568 H

Die Zelion warden In keltern, destilliertem Wasser (2 bis 5° C) wiedersuspenUert und in einer Fraktioniervorrichtung der Bauart Ribi all Fractionator (Ivan Sorvall, Inc., Norwald, Conn., V. St. A.) bei 2UO at (20 000 pci) und einer Temperatur von 20° C oder darunter einer explosiven Dekompression unterworfen. Bei einem Druck von 2110 at erhält nan gute Ergebnisse, aber es hat sioh gezeigt, dass zufriedenstellende Ergebnisse allgemein bei DrUoken im Bereich von etwa 1050-bis 3550 at (etwa 15 000 bis 50 000 psi) erhalten werden. Auch andere Mittel zur Zerlegung oder Zerreissung von Zellen und Isolierung der Zellwände können Verwendung finden, wie Schallschwingung en, mechanisches Mahlen usw., aber dl« Erfahrung zeigt, dass mit der explosiven Dekompression (in der Ribl Pressure Cell) die höchsten Auebeuten an sauberen Wandmaterial erhalten werden. Vor dem Einsäte wird die obengenannte Fraktioniervorrichtung vorteilhafterweise sterilisiert, indem man ihr gesamtes Leitungssystem 24 Std. der Einwirkung von Äthylenoxyd aussetzt und dann mit sterile« Stiokatoffgas spült. Die Druckeinheit wird 1 Std. sterilisiert, vorzugsweise durch Zusammenbringen aller ihrer Teile mit fl-Propiolacton (0,5 %) und dann Spülung mit sterilem, destilliertem Wasser. Zur Verbindung der Dckompressionskammer mit einem 8tiokstofftank dient ein mehrphasiges. Bakterien zurückhaltendes Filter oder anderes zweckentsprechendes Filter.

... i\ ..
9098 20/1160

BAD ORIGINAL

U92042

Die Suspension der B.-pertussie-Zellen wird In die Kompressionskammer der Fraktioniervorrichtung eIngeführt,und in dieser einem Druck von 1050 bis 3550 at ausgesetzt , wodurch die Zellen in die rekompresslonekamnier getrieben werden, in der sie explosiv bersten. Die Dekompressionskammer wird mit vorgekühltem Stickstoffgae, das man durch das mehrphasige Filter und in die Kammer einleitet, auf 20° C oder darunter gehalten. Dae von der DekompresslonBkammer abströmende, die Zellw^nde und Protoplasma enthaltende Gut wird in einem in ein Eisbad λ getauchten, sterilen JeMIter gesammelt.

Das abströmende, das geborstene Zellmaterial enthaltende Out wird gesohleudert und das überstehende« fliesefähige Material verworfen; das verbleibende Zellwand-Material kann mit kaltem Wasser gewaschen werden, um hoohtoxisohe, lösliche Protoplasmabestandteile zu beseitigen. Die gewaschenen oder ungowasohenen Zellwände werden in einem Puffer auf eine Konzentration von etwa 100 bis 2000 B/ml suspendiert, wobei in der Praxis im allgemeinen eine Konzentration von 200 B/ml Anwendung finden ™ wird. Der Schutzantigen wird dann extrahiert« indem man die Zellwand-Suspension mit einem Salz der DesoxycholsSure auf eine Endkonzentration von etwa 0*1 bis 10 % versetzt; zur Erzielung einer maximalen Extraktion Jedoch wird eine Endkonzentration von etwa 0,25 bis 1 % bevorzugt. Ein pH-Bereloh von etwa 8 bis 10 hat sich als für die Extraktion sehr

90982%/1ItO

BAD ORIGINAL

9368 °

zufriedenstellend erwiesen, aber man kann auch bei schwächer oder stärker alkalischen Bedingungen unter Erzielung variabler Ausbeuten an Schutzantiger arbeiten.

Das ZeHwand-Desoxyoholat-Gemiech wird kontinuierlich 18 bie 48 Std. sachte bewegt, während man die Temperatur zwischen etwa 2 und 5° C hält. Das Material wird geschleudert und das überstehende Out gegen Puffer (O,01m Phosphat-Puffer) bei einem pH im Bereich von 7 bis 7,7 dialysiert, um Deaoxyoholat zu beseitigen. Das nicht dlalysierbare Material, welches das Schutzantigen enthält, wird auf pH 7,0 eingestellt und auf eine den vorgesohriebenen Normen, wie den Nonnen der "National Institutes of Health", entsprechend· Konzentration verdünnt. Die Lösung des 3ohutzantigens kam; mit einer Wirkeenge Konservierungsmittel, wie Merthlolate, Benxethoniiohloridu», Benzylalkohol, γ-PicolinlUBOhlorld oder anderen bekannten, zweckentsprechenden Konservierungsmitteln, konserviert und auf Jede gewünschte Koncentration verdünnt werden.

Das genäse der Erfindung erhaltene Sohut»antigen kann sur Herstellung einer wässrigen Vakzine verwendet oder zunächst an Hilfsstoffen, wie Aluminiumhydroxyd oder--phosphat, adsorbiert, oder mit Aluminiumkaliumsulfat.gefällt und dann zur Vakzine zubereitet werden. Das Sohutzantlgen kann, da es mit anderen Antlgenen und bzw. oder Toxoiden verträglich 1st,

909620/11S0

BAD

• U92042

9563 *

mit diesen in herkömmliaher Weise unter Bildung einer polyvalenten Vakzine in Form einer Einzeldoois vereinigt werden..

Die vorliegende Erfindung bietet; eine ganze Reihe ausgeprägter Vorteile. Das Produkt ist von allen Protoplasmabestandteilen

frei, von denen einer, das wärmelabile Toxin, dafür bekannt ist, bei Laboratorlumstleren extrem toxisch zu sein, und ftir diese oder jene Nebenreaktion beim Menschen verantwortlich

sein kann. Das Produkt ist von Nährmedlum, Zellresten und \

ohemieohen Premdstoffen frei. Es 1st mit anderen Antlgenstoffen, die heute mit Antigen der Intakten Pertussls-Zelle kombiniert werden, vertraglich. Das Verfahren ist einfach und leicht durchführbar und unter Erzielung hoher Auebeuten an aktivem

Material reproduzierbar.

Das Verfahren ist in dem folgenden Beispiel Im einzelnen erläutert, aber Im Rahmen der Erfindung liegen auch Abänderungen der verschiedenen, bei der Durchführung des Verfahrens gerndss der Erfindung angewandten Techniken; die gründestzllohe Arbeitsweise besteht darin, das Sohutzantigen mit Desoxyoholat aus B.-pertussls-ZellwSnden zu Isolieren, die von Protoplasma wie aucli anderen Premdstoffen abgetrennt worden sind.

- 7 909820/1160

H920A2

9368 ' .

Beispiel

Die Zellen einer auf einem Cohen-Wheeler-Mediua gewachsenen 48-Std.-Kultur von B. pertussis werden geerntet, indem man das Medium mit konzentrierter Salzsäure auf pH 7*0 einstellt und auf einer Sharples-Zentrifuge schleudert. Die erhaltene Zellpaste wird in destilliertem Wasser wieder suspendiert, durch ein 200-Maschen-Nylonaieb passiert, um Qrobteilohen zu entfernen, und das Filtrat auf eine Konzentration von 500B/ml eingestellt. Die Zellkonzentration soll für die Zwecke der Erfindung vorzugsweise im Bereich von 100 bis 1000 B/ml liegen·

Das Zellkonzentrat (1600 el) wird in eine vorsterilisierte Praktioniervorriohtung der Bauart Ribl Cell Praotionator eingeführt und einem Druck von 2110 at unterworfen. Die Zellen werden unter Druck in die Dekompresslonskamner ausgepresst, die mit gekühlte« Stickstoff gas auf 20° C oder darunter gehalten wird, und unterliegen in dieser einem explosiven Bersten. Das Zellmaterial läuft von der Dekompressionskammer in einen in ein Eisbad getauchten, sterilen Behälter ab, wobei 1600 al abströmendes Out erhalten werden.

Das abströmende Out wird 3 Std. bei 16 000 U/Min, in dem Batoh-Rotorfcopf einer Zentrifuge der Bauart Splnoo 18 000 geschleudert, woboi aber auch ander« Schleudervorrichtung«, wie i.B. die Sharples-Zentrifuge, verwendbar sind. Man entfernt das überstehende Out aus den Rotorkopf durch Dekantieren und kann, wem

909820/1180

_β BAD ORIGINAL

U92042

9368 '

gewünscht, den Kopf ein- oder mehrasale wieder füllen und umlaufen lassen« ohne den Rückstand su entfernen. Das überstehende Gut, das entfernt und verworfen wird, enthält die hochtoxleche Protoplasmafraktion des Zellkonsentrates.

Der Rückstand oder das Sediment in den Rotorkopf wird vorzugsweise entfernt« indem «an an den Rotorkopf Stahlköpfe anbringt und den Kopf durch Aufbringen auf einen Rollneshanisnus sacht bewegt. Die Loslösung des Rückstandes von den Rotorkopf kann aber auch nach anderen« an sich bekannten Verfahren erfolgen.

Man wäsoht den Rüokstand aus den Rotorkopf «it kalten, destillierten Wasser (2 bis 5° Ct ungefähr 800 «1) aus, stellt das pH durch Zusatz lOjfcger natronlauge (ungefähr 1,0 nl) auf 8,5 ein und bringt das Endvolumen der Zellwand-Suspension «it kaitea, destillierte« Wasser (2 bis 3° C) auf 1600 «1. Welter stellt nan eine sterile, 2*ige Lösung des Hatriumdesoxyoholats bei pH 8,5 (Einstellung «it in Natronlauge -vor der HitsesteriIieierung) her und vereinigt 16OO nl dieser LBsung «it der Vandaaterialsuspenslon. Durch Zusatz von kalten, sterilen, destillierten Wasser (800 nl) erhält nan 4000 nl Wandnaterialsuspension nit einer 200 B/nl entsprechenden Pertussiakonsentration und einer Desoxyoholat-Konzentration von 1 ,OJf. Die Konzentration von Zellwandnaterial und Extraktionen! ttel können jedoch ebenso gut auf*eine 100 bis

9Ο9*~2()/Ί1·Ο

BAD ORIGINAL

AO

9568

2000 B/ml entsprechende Pertu3siskonzentration und eine Desoxycholat-Konzentration von 0,1 bis 10£ eingestellt werden. Die Suspension wird in einer mechanischen Schüttelvorrichtung 1,8 bis. 2h Std. bei 2 bis 5° C sacht bewegt und dann in de« Batoh-Rotorkopf einer Fraktioniervorrichtung der Bauart Spinco 18 000 (oder einer anderen Zentrifuge) 1 Std. bei 16 000 U/Min. (»100 χ Schwerkraft Durchschnitt) geschleudert. Das Überstehende Out wivd durch Dekantieren entfernt und gewonnen; der Rotorkopf kann wiederholt eingesetzt werden, üb weitere Anteile an Zellwand-Suspension zu behandeln, ohne das· aan das Sediment su entfernen braucht. *

Die erhaltenen Anteile an überstehende«, das Sehutzantigen und Natriumdesoxycholat enthaltenden Out werden vereinigt und .gegen 0,01m Phosphatpuffer, pH 7»* bis 7.7, dialyeiert, bis in den Dialysat bei Zusatz von konzentrierter Salzsäure kein Dtsoxycholat »ehr festzustellen 1st. OewOhnlioh wird der Bndpunkt der Desoxychlolat-Bestieeung bei de· vierten Wechsel des Puffer· erhalten, wobei «an bei Jede« Wechsel etwa 135 1 Puffer 48 bi· 72 Std. einwirken liest. Die Abtrennung des Desoxyoholates kann auch nach anderen, an sich bekannten Methoden erfolgen, wie durch Hindurchführen der vereinigten Anteil· de· überstee Out·· durch Sephadex-Gel oder durch Ultrafiltration, wenngleich hierbei auch eine gewisse Aktivitfttseinbuese eintreten kann.

SO

BAD OWQINAL

U92042

Der nlcht-dlalyslerbare Extrakt, der bei Verdünnung auf einen 32 B/ml entsprechenden Wert nuneehr ein Volumen von 4500 «1 hat, enthält 14,7 Schutzeliihelten/«! (das N.I.H. Nr. 6-Kontrollnaterlal sub Vergleloh 8 Sohutselnhelten/il) und kann sur Herstellung von Vakzinen auf wässriger Grundlage HUfsstoffbasls oder «ultivalenter Grundlage eingesetzt- werden.

Zur Bestimmung des WlrkungsvermBgens des Zellextraktes und des N.I.H.-Kontrollmaterials werden getrennten Oruppen von Mausen Reihenlösungen des Extraktes und des Xontrollaaterlals verabreicht und dann die Tiere intrekranlal «it 0,03 "1 einer Verdünnung von bekannte«, virulente« B. pertussis «It eine« Oehalt von 10* Organlanen/al gereizt. Ergebnisset

Verdünnung ED₁J₀ Grenzwerte Sehtttseln-

ttberlebende/geprüfte Tiere ³^ der Zuverlls- helten/«l

slgkelt, % A BC ♦)

Extrakt 0.05 0.01 0.002 0,0165 85 bis 118 14.7

genass 25732 B^ V^"

Beispiel . . (

N.X.H. 0,06 P₁Oj 0.0024 0.0»4 85 Dia 118 8

"*■) Wlrksaae Dosis zum Schute von
50 % der getesteten Tiere

Der Sohutzantlgen-Extrakt geatas de« Beispiel erweist «loh entspreohend den H.I.R.-Noraen als niohttbxlsobt diese Nomen for* dem, dass bei Intraperitonaler Injektion der Stifte der Blase!· dosis für den Mensohen bei Mausen In 3 Tagen kein Oewidhtsverlust,

9098f0Vi1l0

U92042

in 7 Tagen eine Nettozunahme von 5 g und bei nicht »ehr als 5 % der untersuchten Tiere ein Todesfall eintritt. Bei intraperitonaler Injektion von 0,25 ml des Schutzantigen-Extraktes gemBe« Beispiel bei 10 Mäusen wurde la Durchschnitt an Ende von 3 Tagen eine Gewichtszunahme von 2,1 und am Ende von 7 Tagen eine durchschnittliche Zunahme von 6,5 g beobachtet, ohne· dass am Ende der Prüfzeit ein Todesfall vorgelegen hätte.

Der Extrakt gca&ss Beispiel genügte auch dem Tier-Sicherheitstest; bei Inji2ierung von zwei 20-g-Mäueen alt jeweils der halben Einzeldosis für den- Menschen und dreimaliger Injislerung von zwei 350-g-Meeraehweinchen alt jeweils einer Einzeldosis für den Mensehen ergaben sich keine Todesfälle und keine Syeptoee.

Herkömmliche Sterilitätsprüfungen haben gezeigt, dass der Extrakt von Schixaelpilzen und Bakterien frei ist.

Die elektrophoretische Analyse und die Ouohterlony-Analyse haben ergeben, dass der Extrakt gernlss Beispiel von de« Hauptanteil der Protoplasaastoffe und Wandantigenstoffe pit Ausnahme des Schutzantigens frei war. Die Endvakzine enthielt ein Drittel oder weniger des Gesamte ti des toffs, der bei hexfeOmaliohen Vak- . zinen ermittel worden ist.

- 12 -

909820/1180 bad orjginal

U920A2

9368 . Jl

Vakzine-Herstellung Wässrige Vakzine

Das Schutzantlgen-Extrakt-Konzentrat gernäss dem Beispiel wird mit gepufferter Salzlauge (pH 7,2'), die Herthiolate la Verhältnis 1 s 10 000 enthllt, auf eine Bndkonzentration von 32 B/ml oder darunter eingestellt. Diese Vakzine bleibt bei Lagerung bei 2 bis 5° C beständig.

Vakzine mit Hllfaatoff

Man versetzt 4500 ml des Sohutzantigen-Konzentrates geadiss de* Beispiel alt 500 ml steril·», 10&gea AluainluBkaliuasulfat und stellt das pH mit kalter, lOJ&ger Katronlauge (2 bis 5° C) auf 7*3 ein. Das Material wird 24 Std. bei 2 bis 5° C aufbewahrt und dann etwa 15 Min. bei 2000 U/Min. In einer auf 2 bis 5° C gehaltenen Zentrifuge der Bauart International geschleudert. Das überstehende Out wird verworfen. Man suspendiert das Sediment wieder in gepufferter Salzlauge« pH 7,2, auf ein Endvoluaen von 3000 al

(entsprechend einer Konzentration von 267 B/al). Die Vakzine-Konzentration kann durota Zusatz von steriler Salzlauge, pH 7,2, oder 0,3a Qlyoin-Puffer auf das Xquivalent von 32 B/al oder darunter eingestellt werden. Als Konservierungsmittel wird Merthiolafce in einer genündn Meng· zugesetzt, um la verdünnten Zustand eine Konzentration von 1 s 10 000 zu erhalten. Diese Vakzine bleibt bei Aufbewahrung bei 2 bis 5° C beständig.

- 13 - '
909820/1180

9368

Multivalente Vakzinen

Durch Zusatz von Toxolden, wie Diphtherie- und Tetanustoxoiden, zu der obigen wässrigen Vakzine oder Hilfestoff-Vakzine kann eine multlvalehte Vakzine erhalten werden, in welcher die Toxolde in den normalerweise empfohlenen Konzentrationen vorliegen.

Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Extraktion von Schutzantigen aus B.-pertussis-Zellwänden unter Anwendung von Abänderungen der in dem Beispiel beschriebenen Arbeitsweisen. Insbesondere kann das Schutzantigen in für die Vakzine-Herstellung geeigneten Konzentrationen extrahiert werden, indem man bei schwach alkalischen Bedingungen und bei einer Temperatur von etwa 2 bis 5° C eine Suspension von etwa 100 bis 2000 B/ml. Zellwandmaterial des B.-pertussis und eine genügende Menge eines Salzes der Desoxyoholsäure vermischt, damit eine Endkonzentration von etwa 0,1 bis 10$ Desoxycholat erhalten wird. Die Trennung des so erhaltenen Schutzantigens von dem Desoxycholat kann durch ^ Dialyse oder durch Hindurchleiten des Schutzantigen-Desoxyoholat-Oemlsches durch Sephadex-Gel, welches das Desoxycholat entfernt, oder durch Ultrafiltration erfolgen. Das so erhaltene Konzentrat des Schutzantigens kann auf jede gewünschte Konzentration eingestellt und nach all den herkömmlicherweise zur Vakzine-Herstellung, besonders zur Herstellung von Vakzinen mit einem Gehalt an B.-pertussis-Antigen, angewandten Methoden zu einer mono- oder polyvalenten Vakzine zubereitet werden.

Claims

Ί492042 Patentansprüche

1. Verfahren zinn Herstellen eines Pertussis-Antigens, dadurch gekennzeichnet, dass man Borde tella-pertus sis-Zellen mechanisch zerreisst, die Zellwinde von dem Protoplasma abtrennt, das Zellwandmaterial, welches das Sohutzantigen enthält, mit Wasser vereint unter Bildung einer Suspension, die 100 bis 2000 B/ml des Zellwandmaterials enthält« und es dann durch Zugabe eines Alkallmetallsalzes der DesoxychollnsSure und von Alkall« \m einen JpB von 8 bis 10 einzustellen« bei einer etur von 2 bis 5 ⁰C bis zu 48 Stunden auf eine Konzentration von 0,1 bis 10 % extrahiert und die extrahierte Flüssigkeit, welche das Sohutzantigen enthalt, gewinnt« und das Desoxyoholat entfernt.

2· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet* dass

Ti

man naoh der Extraktion das Material schleudert, das überstehende Out sammelt und gegen Phosphatpuffer, pH 7,0 bis 7*7« dlalyslert, um im wesentlichen das gesamte Desoxyoholat zu entfernen·

BAD ORIGINAL

90982&/-1160

Jt

3. Vtrfihrtn naoh Anipruoh 1, dtduroh g«lewmseiota#t, dais ι Hin «It einw Koascttt^atioa d·« Z«llitandMat«ri«ie die B. ■ p#rtu*tls von »fc«· 200 B/ml arbeitet.

'j , ■■'·-. ■ · ■ '■■

OWGINAL INSPECTED

909820/ 1160