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Verfahren zur Herstellung von Impflösungen mit abgetötetem infektiösem
Hepatitisvirus Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Entwickeln von infektiösen
Hepatitisviren auf eine abgetötete infektiöse Hepatitisvirus-Impflösung und auf
ein Verfahren zur Herstellung der Impflösung.
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Infektiöse Hepatitis ist eine bekannte Krankheit, Sie stellt besonders
ein sehr akutes Problem bei Militärpersonen dar. Epidemien der Krankheit sind bei
den militärischen Streitkräften in den letzten größeren Kriegen aufgetreten. Trotz
der bekannten Natur der Krankheit ist wenig über ihre Ätiologie bekannt, außer daß
es ein Virus ist und daß die Krankheit von einem Menschen auf den anderen übertragen
wird. Wenn die Krankheit von einem Menschen auf den anderen durch Bluttransfusion
übertragen wird, wird sie im allgemeinen Serumhepatitis an Steile von infektiöser
Hepatitis genannt. Jedoch wird aus Gründen der Zweckmäßigkeit hier der Begriff infektiöse
Hepatitis verwendet, der sowohl die sogenannte Serumhepatitis als auch die sogenannte
infektiöse Hepatitis umfassen soll. Vielleicht ist der Grund, daß so wenig über
diese ernsthafte Krankheit bekannt ist, der, daß die Untersuchungen an Menschen
durchgeführt werden mußten, da der Virus nicht mit Erfolg auf Embryoeier übertragen
oder an Laboratoriumstieren, wie Nagetieren, Affen, Schimpansen, Kanarienvögeln
und Schweinen, entwickelt werden konnte. Es wurden auch Versuche angestellt, um
den Virus in Gewebekulturen zu züchten, jedoch ohne Erfolg. Das Fehlen eines Verfahrens
zur Entwicklung des Virus machte es unmöglich, eine Impflösung zu erzeugen, die
gegen diese Krankheit zu immunisieren vermag.
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Gemäß der Erfindung werden wäßrigeGewebekulturflüssigkeiten erzeugt,
die eine höhe Konzentration an lebenden infektiösen Hepatitisvi ren aufweisen, indem
man eine Gewebekultur bestimmter spezieller Zellen mit lebenden infektiösen Hepatitisviren
beimpft, die beimpfte Kultur mehrere Tage bei einer Temperatur entwickelt, die für
das Zellwachstum günstig ist, und dann die Flüssigkeit von den in der Kultur vorliegenden
Feststoffen abtrennt. Die so erzeugten Kulturflüssigkeiten können als Impfflüssigkeiten
für bestimmte diagnostische oder andere Versuche, wie sie weiter unten näher beschrieben
werden, dienen oder als Ausgangsmaterial für die Herstellung von Impflösungen und
bzw. oder immunen Seren.
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Die bei den Gewebekulturmedien verwendeten Zellen können sein, der
Detroit-6-Stamm von epithelähnlichen Zellen oder Embryonalzellen von nichtinfizierten
Menschen (vgl. Berman und Mitarbeiter, Blood, Bd. 10, S. 896 bis 911 [19551) für
die Beschreibung von Detroit-6-Stämmen von epithelähnlichen Zellen. Die embryonalen
Zellen können diejenigen sein, die man erhält aus den verschiedenen Organen des
Embryo, z. B. Testiceln, Ovarien, Lunge, Leber, Milz, Niere, Haut, Gedärme und ähnlichen,
oder es kann der ganze Embryo verwendet werden.
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Ein spezifisches Beispiel solcher verwendbarer embryonaler Zellen
ist die Art von Spindelzellen aus menschlichen embryonalen Testiceln, bekannt als
PD 39 T.
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Die Beschreibung dieser Art von Spindelzellen ist die folgende: Verfahren
der Isolierung und Entwicklung Die Testiceln, die aus 11Tage alten Kindern durch
Autopsie erhalten sind, wurden in eine abgemessene Hanksche Salzlösung 2 bis 4 Stunden
eingetaucht, in Stücke von etwa 1 bis 3 mm3 und Walzenröhrchen, hergestellt nach
dem Plasmagerinnungsverfahren, geschnitten. Jedes Röhrchen enthielt etwa 8 bis 10
Explantate mit 2 cm3 Medium, zusammengesetzt aus 750/0 Hankscher Lösung, 2O0/o gesammelten
menschlichen Serums und 5 Ola Kükenembryonalextrakt. Das Medium wurde zwei- bis
dreimal in der Woche gewechselt, indem man die Hälfte des ursprünglichen Mediums,
aus jedem Rohr herausnahm und durch ein gleiches Volumen frisches Medium ersetzte.
Das aus den primären Explantaten herausgewachsene bestand vorwiegend aus Spindelzellen,
die schnell 4 bis 8 Tage nach der Inkubation wanderten.
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Übertragung von Gewebe Nach 13 Tagen wurden die Medien von den Kulturen
abgetrennt, die Zellen mit 2 cm3 abgemessener Hankscher Salzlösung gewaschen, und
es wurden etwa 2,5 cm3 einer 0,250/oigen Trypsinlösung in jedes Rohr bei einem p-Wert
von 7,4 und 340 C gegeben.
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Man ließ die Röhrchen 45 bis 60 Minuten bei 370 C rotieren und sammelte
den Inhalt und kühlte in einem Eisbad ab. Die Suspension wurde auf 4 bis 80 C abgekiihlt
und bei 1500 bis 1800 Umdrehungen je Minute 10 bis 12 Minuten zentrifugiert, und
die überstehende Flüssigkeit wurde verworfen. Die restlichen Zellen wurden in einem
gleichen Volumen Nährmedium (das gleiche, das oben benutzt wurde) erneut suspendiert
und erneut zentrifugiert. Dieses Verfahren wurde dreimal wiederholt, und das dritte
Mal wurde nur das halbe Volumen Nährmedium für die Resuspendierung verwendet. Die
Suspension wurde auf einer Konzentration von 120000 Zellen je cm3 verdünnt. und
diese Zellsuspension wurde zur Herstellung von stationären Kulturen verwendet. 1
cm3 Suspension wurde je in ein Rohr eingebracht, und nach zweitägiger Entwicklung
bei 370 C wurde zu jedem Rohr 1 cm3 frisches Medium zugegeben. Nach 8 Tagen enthielten
die Röhrchen eine einschichtige Lage von Spindelzellen und waren geeignet für die
Verwendung bei der Durchführung der Erfindung.
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Virusspektrum der Zellen Aus den stationären Röhrchen, hergestellt
wie oben angegeben, wurden die Wachstumsmedia entfernt, und die Zellschicht wurde
mit einem Gemisch Nr. 635, das 501o Pferdeserum enthielt, gewaschen. Nach drei Waschungen
wurden 1,5 cm3 Medium (Medium Nr. 635, Healy und Mitarbeiter, Canad. J. Biochem.
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& Phvsiol., Bd. 32, S. 327 bis 337, 1954, einschließlich 100/0
Pferdeserum) in jedes Rohr gegeben. Darauf wurden 0,5 cm3 einer Lösung, die je einen
der zu untersuchenden Viren enthielt, in die verschiedenen Röhrchen gegeben, und
die Röhrchen wurden bei 370 C entwickelt. Von Zeit zu Zeit wurden die Röhrchen untersucht.
um zu bestimmen, ob die Zellen gegenüber den untersuchten Viren empfindlich waren.
Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:
| Zeit |
| Virusarten, die einen cytopathogenen bis zum Erscheinen |
| Effekt auf Zellen ausüben des Effektes |
| in Tagen |
| APC, Typ 4, RI-67 ............ 6 |
| APC, Typ 4, RN .............. 11 |
| APC, Typ 2, Ad-6 ............. 11 |
| APC, Typ 3, J. F 5 |
| Polio Typ 1, Mahoney ......... 2 |
| Polio Typ 2, MEF-1 ........... 2 |
| Polio Typ 3, Saukett .......... 2 |
| Influenza 1233 ................. 13 |
| Influenza PR8 .................. 5 |
| Tollwut CVS .................. 8 |
| Gelbes Fieber, 17 D ............ 6 |
| Üstliche Pferde-Encepholomyelitis 2 |
| Herpes HF ................... . 2 |
| Kuhpocken .................... 2 |
| Papageienkrankheit ............ 6 |
Viren, die keinen cytopathogenen Effekt auf Zellen ausüben: Influenza WS, Epidemie-Typhus,
APC, Typ 1. - Zellart: Die vorherrschende Zellart ist eine fibroplastähnliche Zelle.
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Die Gewebekulturen der Spezialzellen wurden in üblicher Weise hergestellt.
Die Zellart wird entwickelt in einem Hankschen BBS-Medium, dem gesammeltes Menschen-
oder Pferdeserum oder ein Embryonalextrakt zugegeben wurde (vgl. Stulberg und Mitarbeiter,
Proc. Soc. Exper. Biol. and Med., Bd. 89, S. 438 bis 441, 1955). Die Flüssigkeit
wird von den 3 bis 6 Tage alten Kulturen abgetrennt; die Zellen werden in einem
Nährmedium, z. B. Medium 199 mit Menschen- oder Pferdeserum, suspendiert. und die
Suspensionen werden in neue Flaschen eingebracht.
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Die Flaschen werden mit Korken verschlossen und etwa 4 Tage bei etwa
37° C entwickelt. Am Ende dieser Arbeitsweise bedeckt eine nahezu zusammenhängende
Schicht von Zellen die Seiten der Kulturflaschen. Die Flüssigkeit wird dekantiert,
und die Zellschicht wird mit steriler Hankscher Lösung mit Pferdeserum oder einer
ähnlichen physiologischen Lösung gewaschen. Die Gewebekultur ist dann für die Beimpfung
fertig. Vorzugsweise wird die Beimpfung vorgenommen, hevor man das unterstützende
Konservierungsmedium den Zellen zusetzt.
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Als Impfflüssigkeit kann man jede Flüssigkeit verwenden, die lebenden
infektiösen Hepatitisvirus enthält; z. B. kann man Serum, Plasma oder Blut. die
den Virus enthalten, in verdünnter oder unverdünnter Form oder als Gewebekulturflüssigkeit,
die den Virus enthält, verwenden. Man kann auch einen flüssigen Extrakt aus dem
Stuhl, aus der Milz, aus der Leber oder dem Knochenmark von Patienten mit infektiöser
Hepatitis als Impfmedium verwenden.
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Als wäßrige Stützmedien für die Zellen während der Entwicklung kann
man beliebige, allgemein verwendete Medien benutzen. Das Medium 199 mit 5 bis 20
01o Pferde- oder Kälberserum ergab, wie gefunden wurde, ausgezeichnete Ergebnisse.
Ebenfalls kann Hanksches BBS Medium mit nichtmenschlichem Serum und ein Embryonalextrakt
verwendet werden.
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Im allgemeinen ist es vorzuziehen, die Verwendung von Menschen serum
bei den Medien zu vermeiden.
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Nach der Beimpfung wird die beimpfte Kultur bei einer Temperatur,
die für das Zellwachstum günstig ist, entwickelt. Allgemein gesprochen geschieht
dies bei einer Temperatur zwischen 30 und 420 C, vorzugsweise zwischen 35 und 390
C. Die Entwicklungszeit ist nicht besonders kritisch; aber die Entwicklung sollte
durchgeführt werden, bis die einschichtige Zellenlage zerreißt, und man sieht, daß
sich eine Anzahl von kleinen, dunklen granulierten Zellen von unregelmäßiger Größe
und Form zu Klumpen zusammenballen mit Chromatin in einer Randstellung. Im allgemeinen
erfordert dies mehrere Tage, in den meisten Fällen wird die Entwicklung über eine
Periode von 6 bis 14 Tagen durchgeführt.
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Nach der Beendigung der Entwicklung wird die Flüssigkeit mit dem
lebenden infektiösen Hepatitisvirus von dem festen Material der Kultur abgetrennt;
dies kann durch Filtrieren durch ein Seitzfilter. ein Bakterienporzellanfilter oder
ein Bakterienglasfrittenfilter oder durch Dekantieren oder durch Zentrifugieren
geschehen. Die anfallende Gewebekulturfiüssigkeit enthält eine hohe Konzentration
an lebendem infektiösem Hepatitisvirus. Diese Fluida mit dem lebenden Virus sind
wertvoll für die Beimpfung anderer Gewebekulturen, für die Herstellung von Impflösungen.
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Um eine Impflösung aus Gewebekulturflüssigkeiten mit lebendem infektiösem
Hepatitisvirus herzustellen, behandelt man die Gewebekulturfiüssigkeit mit ultraviolettem
Licht, Chemikalien oder beiden unter solchen Bedingungen, daß die Infektionswirkung
des Virus
vollständig zerstört wird aber die Antigenwirkwlg nicht
über Gebühr beeinträchtigt wird. Als Chemikalien kann man Formaldehyd, fl-Propiolacton
Chlor oder Phenol verwenden. Da der Virus und seine Antigenwirkung gegenüber Wärme
sehr resistent sind, können erhöhte Temperaturen als gewünscht bei der Herstellung
der Impflösungen angewendet werden.
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Die optimale Temperatur hängt natürlich ab von dem speziellen Mittel,
das angewendet wird, aber im allgemeinen können Temperaturen zwischen 20 und 800
C verwendet werden. Bei Verwendung von ß-Propiolacton als Abtötungsmittel allein
oder in Kombination mit anderen Mitteln ist es vorzuziehen, eine Konzentration im
Bereich von 0,001 bis 0,0025 g je cm3 Gewebekulturflüssigkeit anzuwenden. Wenn Formaldehyd
als Abtötungsmittel verwendet wird, liegt die verwendete Konzentration im Bereich
von 1:400 bis 1:4000, und das Gemisch wird etwa 1 Stunde bei erhöhter Temperatur
entwickelt. Bei Verwendung von Phenol als Abtötungsmittel wird eine solche Menge
angewendet, daß die Endkonzentration bei etwa 0,1 bis 0,50/0 liegt. Bevorzugt wird
ultraviolettes Licht vor oder nach der Anwendung eines der chemischen Abtötungsmittel
verwendet. Die Gewebekulturflüssigkeit wird vorzugsweise erwärmt und dann in Form
eines dünnen Filmes dem ultravioletten Licht mit der Wellenlänge zwischen 2000 und
6000 Ångström-Einheiten kurze Zeit, d. h. 1 bis 2 Sekunden oder weniger. ausgesetzt.
Besonders gute Ergebnisse kann man erhalten durch die Verwendung eines Zentrifugalfilmerzeugers,
wie er in der USA.-Patentschrift 2 725 482 beschrieben ist, unter Anwendung einer
Durchsatzgeschwindigkeit von 200 bis 600 cm3 je Stunde mit einer Ultraviolettleistung
von 15 bis 22 Watt. Die anfallenden Impflösungen sind völlig frei von lebendem infektiösem
Hepatitisvirus und imstande, bei Injektion in Kaninchen und Affen ein immunes Serum
zu erzeugen. Die Impflösungen können auch für prophylaktische Zwecke verwendet werden.
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Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert: Beispiel
1 Die Herstellung von Gewebekulturflüssigkeiten mit lebendem infektiösem Hepatitisvirus
Eine Kultur aus Detroit-6-Stämmen von Zellen wird in einem Hankschen BBS-Medium
mit Menschenserum und Embryonalextrakt, wie in Proc. Soc. Exper.
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Biol. and Med., Bd. 89 (1955), S. 438 bis 441, angegeben, entwickelt.
Die 2 oder 3 Tage alte Kultur wird dreimal mit Medium Nr. 199 (Morgan und Mitarbeiter,
Proc. Soc. Exper. Biol. and Med., Bd. 73 (1950), S. 1 bis 8, mit 100/o Pferdeserum
gewaschen.
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Es wird aus dem Blut eines Patienten (mir1), der an infektiöser Hepatitis
litt, ein Serum gewonnen und mit sterilem Medium Nr. 199 mit 100/o Pferdeserum auf
das fünffache Volumen verdünnt. 0,5 cm3 des verdünnten Serums werden zu der Gewebekultur
zugefügt, und die Zellschicht mit der Impflösung benetzt.
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Es werden 1,5 cm3 Medium 199+10°/o Pferdeserum zugegeben, und die
Kultur wird etwa 7 Tage bei 370 C entwickelt. Am Ende der Entwicklungszeit war die
einschichtige Zellenlage eingerissen, und es hatte sich eine Reihe von kleinen,
dunklen Granulatzellen in Klumpen mit Chromatin in Randlage angesammelt.
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Diese Granulatzellen sind von irregulärer Größe und Form. Die Flüssigkeit
wird von der Kultur abdekantiert und durch ein Seitzfilter oder ein ultrafeines
Bakterienfilter aus einer Glasfritte filtriert. Das Filtrat enthält lebenden infektiösen
Hepatitisvirus.
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Beispiel 2 Die Herstellung von Impflösung Es wurde aus 100 Vdrratskulturen
eine Suspension von Detroit-6-Zellen hergestellt, wachsend auf Glas in Flaschen,
indem man sie mit wäßriger Lösung, die 0,020/0 Äthylendiaminotetraessigsäure enthielt,
behandelte. Die anfallende Suspension wird zu 24 1 Nährmedium (Medium Nr. 199) mit
20°/o Menschenserum zugesetzt, um eine Suspension mit 60000 Zellen je cm3 zu ergeben.
Nach gründlichem Durchmischen wird die Suspension mit Hilfe eines Eisbades auf 0
bis 5° C abgekühlt, und die Zellen wurden mit einem magnetischen Rührer in gleichmäßiger
Suspension gehalten.
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Die Suspension wurde in gleichen Teilen von 80 cm3 auf 300 sterile
Flaschen verteilt. Die Flaschen wurden dicht verschlossen und 4 Tage bei 37,50 C
entwickelt.
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In dieser Zeit hatten sich die Zellen vervielfacht, wobei sie eine
nahezu zusammenhängende Haut bildeten, die die Seite der Kulturflaschen bedeckte.
Jede Flasche enthält etwa 15 Millionen Zellen. Die Zellenhäute wurden dreimal mit
etwa 100 cm3 steriler Hankscher Lösung mit iOO/o Pferdeserum ausgewaschen, um etwaiges
Menschenserum zu entfernen, das Antihepatitisantikörper enthalten könnte. Die Kulturen
waren dann für die Impfung fertig.
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300 gewaschene Kulturen wurden durch Zugabe von 4 cm5 einer Gewebekulturflüssigkeit
mit lebendem infektiösem Virus, hergestellt nach Beispiel 1, beimpft, und das Impfmittel
wurde über die ganze Haut auf den Zellen ausgebreitet. Nach einer Entwicklung über
30 Minuten, um die Infektion in Gang zu bringen, wurden in jeden Behälter 36 cmS
eines Stabilisiermediums (Medium Nr. 199+50/o Pferdeserum) gegeben. Die Flaschen
wurden dann 6 Tage bei 37,50 C entwickelt, wobei am Ende der Zeit die Zellenhäute
gerissen waren und einige Zellen zerkleinert waren.
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Die Flüssigkeit wurde gesammelt und vereinigt. Die Gesamtausbeute
beträgt etwa 11,7 1. Die Proben der vereinigten Ernte wurden auf i'hre Lebensfähigkeit
untersucht, indem man eine Probe verdünnte und die Verdünnung bestimmte, die cytopathogene
Veränderungen in frischen Kulturen von Detroit-6-Zellen hervorruft. Die Suspension
dieses speziellen Musters war imstande, solche cytopathogenen Veränderungen bei
einer Verdünnung von 10-4 oder 1 :10000 hervorzurufen. Die Wirksamkeit der Flüssigkeit
wurde auch hinsichtlich ihrer Fähigkeit untersucht, das Komplement bei Meerschweinchen
zu fixieren. Diese spezielle Flüssigkeit war bei Verdünnung auf 1:4 imstande, eine
Einheit von Meerschweincbenkomplement in Gegenwart von zwei Einheiten an die Hepatitisantikörper,
enthalten in Affenserum, zu fixieren, (Das Verfahren zur Ausführung dieses Kompleinentfixierungsversuches
ist angegeben in dem Buch von Thomas M. Riffers, M. D. »Viral and Rickettsial Infections
of Man«, Verlag J. B. Lippincott Company, 1948, S. 72 bis 75.) 11,5 1 der rohen
Flüssigkeit mit dem Antigen werden durch die Behandlung mit einer Schüttelmaschine
oder einem Verteiler zum Aufbrechen etwaiger Klumpen homogenisiert. Die Suspension
wird dann durch Passieren durch eine Reihe von 3-Fritten-Glaskerzen mit abgestufter
Porosität geklärt, wobei die letzte jeder Kerzen einen mittleren Porendurchmesser
von etwa 0,9 Mikron aufwies. Das anfallende Filtrat ist frei von Zellklumpen und
Aggregaten, enthält aber noch den lebenden, infektiösen Hepatitisvirus. Die Versuche
mit dieser filtrierten Flüssigkeit zeigten keinen nachweisbaren Verlust an Infektionswirkung
oder an Aktivität hinsichtlich der Komplementfixierung im
Vergleich
zur rohen Flüssigkeit. Man erhielt etwa 11,2 1 klares Filtrat. Es wurde hoch gereinigtes
ß-Propiolacton langsam zu 10,5 1 filtrierter Flüssigkeit bei etwa 40 C gegeben,
bis die Endkonzentration an ß-Propiolacton 0,001 g je cm3 betrug. Der Kolben mit
der Flüssigkeit wurde in ein Wasserbad von 600 C eingebracht und die Flüssigkeit
gerührt, bis die Temperatur auf etwa 600 C anstieg. Während dieser Erwärmung wurde
tropfenweise 1/lo n-Natronlauge zugegeben, um den p-Wert im Bereich von 6,9 bis
7,1 zu halten, was angezeigt wurde durch die Farbe des Phenolrot-Indikators in dem
Medium Nr. 199. Die Flüssigkeit wurde weitere 20 Minuten auf 600 C erwärmt und dann
abgekühlt. In dieser Stufe wurde keine Restaktivität des Antigens durch den üblichen
Versuch in dem Röhrchen nachgewiesen, aber wenn große Volumina (40cm3) in je 10
Kulturflaschen untersucht wurden, verblieben Spuren einer restlichen Infektionswirkung.
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Um diese letzte Spur einer Infektionswirkung zu zerstören, wurde
die behandelte Flüssigkeit durch einen Zentrifugalverteiler (vgl. USA.-Patentschrift
2 725 482) mit einer vollen Geschwindigkeit von 500 cm3 je Stunde geleitet bei einer
Ultraviolettleistung von 20 Watt. Es wurden etwa 9,11 Impflösung erhalten.
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Nach dieser Behandlung konnte bei wiederholten Versuchen an 400-cm3-Proben
(40 cm3 von jeder der zehn Kulturflaschen) keine restliche Infektionswirkung auf
Detroit-6-Zellen nachgewiesen werden.
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Nach diesen Behandlungen kann die Flüssigkeit sicher gehandhabt werden
ohne Gefahr eines Auftretens von Hepatitis, aber die inaktivierte Flüssigkeit ist
noch im Stande, das Komplement zu fixieren, wie in der oben beschriebenen Methode
angegeben ist, bei einer Verdünnung von 1 :2. Somit ist eine große Teilmenge der
Antigenwirkung erhalten geblieben, obgleich seine Infektionswirkung vollkommen zerstört
wurde. Um zu zeigen, daß die Immunisierungswirkung erhalten geblieben ist, wurden
fünf Affen mit der Impflösung behandelt, wobei jeder Affe 1 cm3 Flüssigkeit in den
Wadenmuskeln erhielt. Nach drei solchen Impfungen mit 2 Wochen Zwischenraum wurden
Serumproben erhalten. die 10 Infektionseinheiten des MR1-Stammes von Hepatitisvirus
bei einer Verdünnung von 1 :10 bis 1:320 zu neutralisieren vermochten. Ein ähnlicher
Versuch an Kaninchen unter Verwendung der gleichen Probe Antigen, durch Ultrazentrifugieren
zehnfach konzentriert, ergab Antikörperspiegel von 1 :320 bis 1:1000.
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Beispiel 3 Herstellung von Gewebekulturflüssigkeiten mit lebendem
infektiösem Hepatitisvirus Es wurden fünf Röhrchen einer Gewebekultur von PD 39T-Zellen
hergestellt und mit 0,5 cm3 einer 1:5-Verdünnung eines Serums eines Patienten mit
infektiöser Hepatitis beimpft.
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Es wurden 1,5 cm3 Stabilisierlösung (Medium 1955 +5°/o Pferdeserum)
in jedes Röhrchen gegeben, und die Kulturen wurden 10 Tage bei 37,50 C entwickelt.
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Die Kulturflüssigkeiten wurden durch ein Bakteriumfilter mit einer
mittleren Porosität von 0,3 Mikron geleitet, wobei man ein Filtrat mit lebendem
infektiösem Hepatiti svirus erhielt.
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Beispiel 4 Herstellung einer Impflösung Es wurde hinreichend Formaldehyd
zu 1,5 1 Gewebekulturflüssigkeit mit lebendem infektiösem Hepatitisvirus nach Beispiel
2 gegeben, um eine Endkonzentration von 1:4000 zu erhalten. Das Gemisch wurde 1
Stunde auf 750 C erwärmt. Die anfallende Lösung wird durch einen Zentrifugalfilmapparat,
wie er in Bei spiel 4 angegeben ist, mit einer Geschwindigkeit von 300 cm3 je Minute
geleitet. wobei man eine Ultraviolettleistung von 20 Watt anwandte. Die anfallende
Impflösung enthält keinen lebenden infektiösen Hepatiti svirus, besitzt aber eine
Antigenwirkung.
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Beispiel 5 Herstellung einer Impflösung Man gibt hinreichend Phenol
zu 500 cm3 Gewebekulturflüssigkeit mit lebendem infektiösem Hepatitisvirus, hergestellt
nach Beispiel 2, um eine Endkonzentration von 0,50/o zu erzielen. Das Gemisch wird
auf 700 C erwärmt und dann durch einen Zentrifugalfilmapparat geleitet, wie er im
Beispiel 4 angegeben ist, mit einer Geschwindigkeit von 200 cm3 je Minute unter
Verwendung einer Ultraviolettleistung von 20 Watt. Die anfallende Impflösung enthält
keinen lebenden infektiösen Hepatitisvirus, besitzt aber eine Antigenwi rkung.