DE69626507T2

DE69626507T2 - Lhrh-antagonisten

Info

Publication number: DE69626507T2
Application number: DE69626507T
Authority: DE
Inventors: Y. Bowers; A. Folkers; Anna Janecka
Original assignee: Tulane University; University of Texas System; University of Texas at Austin
Current assignee: Tulane University; University of Texas System; University of Texas at Austin
Priority date: 1995-04-28
Filing date: 1996-04-26
Publication date: 2003-11-13
Anticipated expiration: 2016-04-27
Also published as: WO1996033729A1; PT822827E; CA2219263A1; AU703400B2; US5656727A; DE69626507D1; ES2191753T3; EP0822827B1; EP0822827A1; AU5667096A; JPH11504335A; ATE233567T1; EP0822827A4

Description

Hintergrund der Erfindung

Viele wirksame LHRH-Analoga (das Luteinisierungshormon-Freisetzungshormon, pGlu¹, His², Trp³, Ser&sup4;, Tyr&sup5; Gly&sup6;, Leu&sup7;, Arg&sup8;, Pro&sup9;, Gly¹&sup0;-NH&sub2;) weisen strukturelle Merkmale auf, die die Histaminfreisetzung aus Mastzellen bewirken (Karten et all, 1986). Diese Merkmaie schließen eine Gruppe hydrophober Aminosäuren am N-Terminus und stark basische Reste an den Positionen 6 und 8, vor allem D- Arg&sup6;, Arg&sup8;, ein. Ein Musterbeispiel für diese Klasse von Analoga ist (N-Ac-D-2- Nal1, D-4F-Phe²D-Trp³, D-Arg&sup6;-LHRH (Schmidt et al.). Einige Analoga binden an peritoneale Mastzellen der Ratte und an Membranpräparationen, und diese Bindung wurde mit der Histaminfreisetzung in Zusammenhang gebracht (Sundaram et al.). Für einen aktuellen Übersichtsartikel zu LHRH-Analoga siehe Janecka, et al. (1994).
Abkürzungen für die hier erwähnten nicht-natürlichen Aminosäuren sind in der folgenden Liste eingeschlossen:
AABLys N&epsi;-(4-Acetylaminobenzoyl)lysin
AALys N&epsi;-Anisinoyl-Lysin
AAPhe 3-(4-Acetylaminophenyl)lysin
Abu 2-Aminobuttersäure
ACLys N&epsi;-(6-Aminocaproyl)lysin
ACyh 1-Aminocyclohexancarbonsäure
ACyp 1-Aminocyclopentancarbonsäure
Aile Alloisoleucin
Ala Alanin
AnGlu 4-(4-Methoxy-phenylcarbamoyl)-2-aminobuttersäure
2ANic 2-Aminonikotinsäure
6ANic 6-Aminonikotinsäure
APic 6-Aminopicolinsäure
APh 4-Aminobenzoesäure
APhe 4-Aminophenylalanin
APz 3-Amino-2-pyrazincarbonsäure
Aze Azetidin-2-carbonsäure
Bim 5-Benzimidazolcarbonsäure
BzLys N&epsi;-Benzoyllysin
Cit Citrullin
Cl&sub2;Phe 3-(3,4-Dichlorphenyl)alanin
Cpa 3-(4-Chlorphenyl)alanin
cPzACAla cis-3-(4-Pyrazinylcarbonylaminocyclohexyl)alanin
cPmACAla cis-3-(4-(4-Pyrimidylcarbonyl)aminocyclohexyl)alanin
Dbf 3-(2-Dibenzofuranyl)alanin
DMGLys N&epsi;-(N,N-Dimethylglycyl)lysin
Dpo N&epsi;-(4,6-Dimethyl-1-pyrimidyl)-ornithin
F&sub2;Ala 3,3-Difluoralanin
hNal 4-(2-Naphthyl)-2-aminobuttersäure
HOBLys N&epsi;-(4-Hydroxybenzoyl)lysin
hpClPhe 4-(4-Chlorphenyl)-2-aminobuttersäure
Hse Homoserin (2-Amino-4-hydroxybutansäure)
ICapLys N&epsi;-(6-Isopropylaminocaproyl)lysin
ILys N&epsi;-Isopropyllysin
Ind Indolin-2-carbonsäure
INicLys N&epsi;-Isonicotinoyllysin
IOrn Nδ-Isopropylornithin
Me&sub3;Arg NG,NG,NG-Trimethylarginin
Me&sub2;Lys N&epsi;,N&epsi;-Dimethyllysin
MNal 3-((6-Methyl)2-naphthyl)alanin
MNicLys N&epsi;-(6-Methylpicolinoyl)lysin
MOB 4-Methoxybenzoyl
MpClPhe N-Methyl-3-(4-chlorphenyl)lysin
MPZGlu Glutaminsäure, γ-4-Methylpiperazin
NAcDNal N-Acetyl-3-(12-naphthyl)alanin
NacDQal N-Acetyl-3-(3-quinolyl)alanin
Nal 3-(2-Naphthyl)alanin
Nap 2-Naphthalincarbonsäure
NapDThr N-Naphthoyl-D-threonin
NicLys N&epsi;-Nicotinoyllysin
NO&sub2;B 4-Nitrobenzoyl
NO&sub2;Phe 3-(4-Nitrophenyl)alanin
oClPhe 3-(2-Chlorphenyl)alanin
Opt O-Phenyltyrosin
Orn Ornithin
Pal 3-(3-Pyridyl)alanin
21Pal 3-(2-Pyridyl)alanin
2PALys N&epsi;-(3-Pyridylacetyl)lysin
pCapLys N&epsi;-(5-Picolinoylaminocaproyl)lysin
pClPhe 3-(4-Chlorphenyl)alanin
pFPhe 3-(4-Fluorphenyl)alanin
Pic Picolinsäure [???]
PicLys N&epsi;-Picolinoyllysin
PicSar N-Picolinoylsarcosinyl
Pip Piperidin-2-carbonsäure
PmcLys N&epsi;-(4-Pyrimidylcarbonyl)lysin
Ptf 3-(4-Trifluormethyl)phenylalanin
Pz Pyrazincarbonsäure
PzAla 3-Pyrazinylalanin
PzAPhe 3-(4-Pyrazinylcarbonylaminophenyl)alanin
Qal 3-(3-Quinolyl)alanin
Qnd-Lys N&epsi;-Quinaldoyllysin
Qui 3-Quinolincarbonsäure
2-Quinoxalincarbonsäure
Tic 1,2,3,4-Tetrahydroisoquinolin-3-carbonsäure
TinGly 2-Thienylglycin
tNACAla trans-3-(4-Nicotinoylaminocyclohexyl)alanin
tPACAla trans-3-(4-Picolinoylaminocyclohexyl)alanin

Zusammenfassung der Erfindung

LHRH-Analoga mit den folgenden Formeln wurden hergestellt und getestet.
(NAcDQal¹, DPtf², DPal³, cisPzACAla&sup5;, DPicLys&sup6;, DAla¹&sup0;)LHRH
(NAcDNal¹, DpClPhe², DPal³cisPzACAla&sup5;, DNicLys&sup6;, ILys&sup8;, DAla¹&sup0;)LHRH
(NAcDNal¹, DpClPhe², DPal³, Thr&sup4;, PicLys&sup5;, DPicLys&sup6;, ILys&sup8;, DAla¹&sup0;)LHRH
(NAcDNal¹, DpClPhe², DPal³, PicLys&sup5;, DPicLys&sup6;, Thr&sup7;, ILys&sup8;, DAla¹&sup0;)LHRH
(NapDThr¹, DpClPhe², DPal³, PicLys&sup5;, DPicLys&sup6;, ILys&sup8;, DAla¹&sup0;)LHRH
(NAcDNal¹, DpClPhe², DPal³, NicLys&sup5;, DNicLys&sup6;, Thr&sup7;, Lys&sup8;, DAla¹&sup0;)LHRH
(NAcDNal¹, DpClPhe², DPal³, Thr&sup4;, NicLys&sup5;, DNicLys&sup6;, Thr&sup7;, ILys&sup8;, DAla¹&sup0;)LHRH
(NAcDNal¹, DpClPhe², DPal³, PicLys&sup5;, D(PicSar)Lys&sup6;, ILys&sup8;, DAla¹&sup0;)LHRH
(NAcDNal¹, DpClPhe², DPal³, D(PicSar)Lys&sup6;, ILys&sup8;, DAla¹&sup0;)LHRH
(NAcDNal¹, DpClPhe², DPal³, PicLys&sup5;, D(6ANic)Lys&sup6;, ILys&sup8;, DAla¹&sup0;)LHRH
(NAcDNal¹, DpClPhe², DPal³, PicLys&sup5;, D(6ANic)Orn&sup6;, ILys&sup8;, DAla¹&sup0;)LHRH
(NAcDQal¹, DCpa², DPal³ cisPzACAla&sup5;, DPicLys&sup6;, NLeu&sup7;, ILys&sup8;, DAla¹&sup0;)LHRH
(NAcDNal¹, DCpa², DPal³, DPicLys&sup5;, DAPhe(PicSar)&sup6;, ILys&sup8;, DAla¹&sup0;)LHRH
(NAcDQal¹, DCPa², DPal³, PicLys&sup5;, DPal&sup6;, ILys&sup8;, DAla¹&sup0;)LHRH
(NAcDNal¹, DCPa², DPal³, PicLys&sup5;, DOrn(ACyp)&sup6;, ILys&sup8;, DAla¹&sup0;)LHRH

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

LHRH-Analoga und Gattungsverwandte mit hoher Wasserlöslichkeit wurden synthetisiert. Diese neuen Analoga hatten 0%-100% andovulierende Aktivität bei einer Dosierung von 0,5 ug und 0%-80% bei 0,25 ug. Die ED&sub5;&sub0; für die Histaminfreisetzung war 30,5 ug/ml -> 300 ug/ml.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind wasserlöslich und einige davon, wie unten aufgeführt, sind auch in physiologischer Salzlösung löslich, ohne zu gelieren. Die bevorzugten Analoga zeigen vorteilhafte Wirksamkeit und Histaminwerte. Diese sind für die klinische Verwendung wichtig und nicht leicht zu erreichen.
Ein wichtiger letzter Punkt besteht darin, dass viele LHRH-Analoga der vorliegenden Erfindung die PzACAla-Substitution nicht enthalten und dennoch vorteilhafte Wirksamkeit, Histaminfreisetzungsefekte und Wasserlöslichkeit sowie Löslichkeit in physiologischer Salzlösung ohne zu gelieren aufweisen, außer wie unten aufgeführt. Der Grund, warum das wichtig ist, besteht darin, dass PzACAla wegen der stereochemischen Anforderungen schwierig zu synthetisieren ist, was bei großen Mengen erheblich zu den Synthesekosten beiträgt. Aus genau diesem Grund wurde eine konzertierte Anstrengung unternommen, um PzACAla zu eliminieren. Wie man weiß, ist eine Betonung der Kosten von Arzneimitteln dieser Tage ein Hauptthema.
Die Analoga 27316, 27345, 27234, 27459 und 27490 waren bei 1 mg/ml in der physiologischen Pufferlösung PIPES-AC löslich. Das Analog 27249 (1 mg/ml) und das Analog 27355 (0,3 mg/ml) waren leicht trübe. Das Analog 27274 gelierte etwas bei 1 mg/ml und das Analog 27163 gelierte etwas bei 1 mg/ml. Zum Vergleich gelierte Antide bei 1 mg/ml völlig, während Lystide das nicht tat.
Die folgenden Beispiele sind eingeschlossen, um die beste Ausführungsart der vorliegenden Erfindung zu zeigen und nicht, um die Erfindung zu begrenzen, es sei denn, dies wird spezifisch zum Ausdruck gebracht.

BEISPIEL 1

Entwurf, Synthese und biologische Evaluierung von LHRH-Analoga anhand der Kriterien der Wirksamkeit, Sicherheit und Löslichkeit

Experimenteller Teil

Materialien

BOC-Ser(OBzl), BOC-Pro, BOC-Leu und BOC-D-Ala wurden von Peninsula Laboratories, Belmont, CA, erhalten. Abu wurde von der Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, erhalten und es wurde unter Verwendung von Standardverfahren in das BOC-Derivat umgewandelt (Moroder et al.).
BOC-D-2-Nal, BOC-D-pClPhe, BOC-D- und L-3-Pal, BOC-ILys(Z) Dicyclohexylaminsalz, BOC-D- und L-NicLys und BOC-D-3-Qal wurden alle von Dr. Narasimha Rao der Southwest Foundation for Biomedical Research, San Antonio, TX, zur Verfügung gestellt. BOC-D- und L-PzAla wurden mit Literaturverfahren synthetisiert (Peterman et al).
BOC-AOPP wurde freundlicherweise von Dr. R. M. Freidinger, Merck, Sharp &. Dohme, West Point, PA zur Verfügung gestellt (Freidinger et al., 1980 und 1982). α-BOC-cis-D- und L-4-Amino-Cyclohexylalanin wurden von Dr. Narasimha Rao zur Verfügung gestellt und wurden zu den entsprechenden BOC-cis-D- und L- PzACAla-Derivaten durch Acylierung mit dem p-Nitrophenylester (Folkers et al., 1990) der Pyrazincarbonsäure, erhalten von der Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI, in DMF umgewandelt.
BOC-D- und L-PicLys wurden auf ähnliche Weise aus α-BOC-D- und L-Lys und Picolinsäure p-Nitrophenylester (Ljungqvist et al.) in DMF hergestellt. α-BOC-D- und L-(DSer)Lys, an dem D-Ser-Rest durch die Z-Gruppe an der Aminogruppe und durch die Benzylgruppe an der Hydroxylfunktion geschützt, wurden durch Acylierung von BOC-D- und L-Lys in DMF mit Z-D-Ser(OBzl)-ONp in Gegenwart von 1-Hydroxybenzotriazol synthetisiert. BOC-D-(AcDSer)Lys, geschützt als das Benzylderivat am D-Ser-Hydroxy, wurde auf ähnliche Weise durch die Reaktion zwischen AcD-Ser(OBzl)ONp und BOC-D-Lys hergestellt.
Alle synthetisierten Aminosäuren und Intermediate wurden mit NMR charakterisiert und waren auf TLC homogen.
Das Benzhydrylamin-Hydrochlorid-Harz wurde von Beckman Bioproducts, Palo Alto, CA, erworben. Das Dicyclohexylcarbodiimid stammte von Aldrich und wurde vor Gebrauch in vacuo destilliert. Das Dichlormethan wurde über Natriumcarbonat destilliert. Alle anderen Lösungsmittel und Reagenzien waren analysenrein (engl. "reagent grade").

Synthese

Die Peptide wurden nach der Festphasenmethode unter Verwendung eines Beckman Automated 990 Peptide Synthesizers synthetisiert. Die Details des verwendeten Protokolls waren im Wesentlichen wie beschrieben (Folkers et al., 1984). Das Peptid wurde vom Harz unter gleichzeitiger Entfernung von allen Schutzgruppen durch Behandlung mit doppelt destilliertem HF bei 0ºC 1 h lang in der Gegenwart von etwa 10% Anisol in p-Cresol gespalten. Das HF wurde dann verdampft, in vacuo, zuerst mit einer Wasserstrahlpumpe und dann über Nacht mit Pumpenvakuum. Der Rückstand wurde dann 2-3 Mal mit Äther extrahiert, um nicht- peptidisches Material zu entfernen. Das rohe Peptid wurde nachfolgend mit wässriger Essigsäure extrahiert und der Extrakt wurde lyophilisiert.

Reinigung und Charakterisierung

Die Reinigung wurde durch Chromatographie auf SiO&sub2; (EM, 230-400 Maschen- weite (engl. mesh)) mit dem Lösungsmittelsystem n-Butanol : Essigsäure : Wasser 4 : 1 : 2 oder 4 : 1 : 5 (obere Phase), gefolgt von Gelfiltration auf Sephadex G 25 mit 6% wässriger Essigsäure als Eluent erreicht. Eine alternative Reinigungsmethode war Gelfiltration wie oben, gefolgt von Chromatographie auf Sephadex LH 20 mit dem Lösungsmittelsystem Wasser : Butanol : Essigsäure : Methanol 90 : 10 : 10 : 8.
Die Reinheit wurde mit TLC, Aminosäureanalyse und HPLC überprüft.
Aminosäureanalysen wurden auf einem Beckman 118 CL Aminosäureanalysator nach Hydrolyse in konstant kochendem HCl 24 h lang unter Verwendung von Standardverfahren durchgeführt (Folkers et al., 1984). Die nicht-natürlichen Aminosäuren wurden qualitativ bestimmt mit Ausnahme von 3-Pal, welches quantifiziert wurde.
Die Reinheit wurde weiter mit HPLC unter Verwendung eines Waters- Instruments mit einem 660 Lösungsmittelprogrammierer und einer Vydac C&sub1;&sub8;- Säule überprüft. Die Durchflussrate war 1,5 ml/min und die Absorption wurde bei 210 nm aufgezeichnet. Verschiedene Gradienten von ansteigenden Konzentrationen an Acetonitril in 0,01 M KH&sub2;PO&sub4;, eingestellt auf pH 3 mit H&sub3;PO&sub4;, wurden verwendet. Es wurde geschätzt, dass in diesem System alle Peptide 97-99% rein sind (Daten nicht gezeigt).

Biologische Assays

AOA in Ratten wurde bestimmt, wie berichtet (Humphries et al.). Die Histaminfreisetzung wurde in Mastzellen der Ratte wie berichtet untersucht (Hook et al., Karten et al., 1987). Der berichtete ED&sub5;&sub0;-Wert ist die Konzentration, in ug/ml, die 50% des insgesamt freisetzbaren Histamins freisetzt. Die biologischen Daten sind in der folgenden Tabelle. Diese sind im US-Patent Nr. 4,935,491 genauer erklärt. LHRH-ANALOGA, STRUKTUR UND BIOLOGISCHE AKTIVITÄT
* Nicht-spezifizierte Positionen sind von LHRH (pGlu¹, His², Trp³, Ser&sup4;, Tyr&sup5;, Gly&sup6;, Leu&sup7;, Arg&sup8;, Pro&sup9;, Gly¹&sup0;·NH&sub2;)
Die am meisten bevorzugten LHRH-Analoga der Tabelle haben eine hohe antiovulierende Aktivität und auch einen hohen effektiven Dosierungsspiegel für die Histaminfreisetzung.

Literaturverzeichnis

Folkers et al, (19. Juni 1990) US-Patent 4,935,491.
Folkers et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 123, 1221 (1984).
Freidinger et al, Science 210, 656 (1980).
Freidinger et al., J. Org. Chem. 47,104 (1982).
Humphries et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. (1976) 72, 939-944.
Humphries et al., (1987) J. Med. Chem. 21, 120-123.
Janecka et al, (1994) Amino Acids 6, 111-130.
Karten et al., (1986) Endocr. Rev. 7: 44-66
Karten et. al., in: LHRH and its Analogs: Contraceptive and Therapeutic Applications II, S. 179-190, MTP Press LTD, Lancaster, England (1987).
Ljungqvist et al., (1988) Acta Chem. Scand. 842: 408-410.
Ljungqvist et al., (1987) Biochem. Biophys. Res. Comm. 148: 849-856.
Ljunqvist et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8236 (1988).
Moroder et al., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 357, 1651 (1976).
Peterman et al., Helv. Chim. Acta 66, 1513 (1983).
Rao et al., (1987) Int. J. Peptide Protein Res. 29: 118-125.
Schmidt et al., (1984) Contraception 29: 283-289.
Sundaram et al., Agents and Actions 25, 307 (1988).

Claims

1. Ein LHRH Analog mit der Formel

(NAcDNal¹, DpClPhe², DPal³, Thr&sup4;, PicLys&sup5;, DPicLys&sup6;, ILys&sup8;, DAla¹&sup0;)LHRH.

2. Ein LHRH Analog mit der Formel

(NAcDNal¹, DpClPhe², DPal³, PicLys&sup5;, DPicLys&sup6;, Thr&sup7;, ILys&sup8;, DAla¹&sup0;)LHRH.

3. Ein LHRH Analog mit der Formel

(NAcDNal¹, DpClPhe², DPal³, D(PicSar)Lys&sup6;, ILys&sup8;, DAla¹&sup0;)LHRH.

4. Ein LHRH Analog mit der Formel

(NAcDNal¹, DpClPhe², DPal³, PicLys&sup5;, D(6ANic)Orn&sup6;, ILys&sup8;, DAla¹&sup0;)LHRH.

5. Ein LHRH Analog mit der Formel

(NAcDQal¹, DCpa², DPal³, cisPzACAla&sup5;, DPicLys&sup6;, NLeu&sup7;, ILys&sup8;, DAla¹&sup0;) LHRH.

6. Ein LHRH Analog mit der Formel

(NAcDNal¹, DCpa², DPal³, DPicLys&sup5;, DAPhe(PicSar)&sup6;, ILys&sup8;, DAla¹&sup0;)LHRH.

7. Ein LHRH Analog mit der Formel

(NAcDQal¹, DCpa², DPal³, PicLys&sup5;, DPal&sup6;, ILys&sup8;, DAla¹&sup0;)LHRH.

8. Ein LHRH Analog mit der Formel

(NAcDNal¹, DCpa², DPal³, PicLys&sup5;, DOrn(ACyp)&sup6;, ILys&sup8;, DAla¹&sup0;)LHRH.