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DE102005017508A1 - Verfahren zur Gewinnung einer basischen Aminosäure aus einer Fermentationsbrühe II - Google Patents

Verfahren zur Gewinnung einer basischen Aminosäure aus einer Fermentationsbrühe II Download PDF

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DE102005017508A1
DE102005017508A1 DE102005017508A DE102005017508A DE102005017508A1 DE 102005017508 A1 DE102005017508 A1 DE 102005017508A1 DE 102005017508 A DE102005017508 A DE 102005017508A DE 102005017508 A DE102005017508 A DE 102005017508A DE 102005017508 A1 DE102005017508 A1 DE 102005017508A1
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Germany
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amino acid
basic amino
acid
broth
fermentation broth
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DE102005017508A
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English (en)
Inventor
Jong-Soo Dr. Choi
Tae-Hui Kim
Sung Hyun Kim
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BASF SE
Original Assignee
BASF SE
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Publication date
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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung einer basischen Aminosäure aus der Fermentationsbrühe eines die basische Aminosäure produzierenden Mikroorganismenstamms, bei dem man DOLLAR A a) die Fermentationsbrühe mit einer Säure, deren pK¶S¶-Wert in Wasser bei 25 DEG C im Bereich von 2 bis 5 liegt, ansäuert und DOLLAR A b) die basische Aminosäure aus der in Schritt a) erhaltenen wässrigen Brühe durch sukzessives Beladen einer einstufigen oder einer mehrstufigen, seriellen Anordnung eines stark sauren Kationenaustauschers in seiner Salzform mit der in Schritt a) erhaltenen Brühe und Eluieren der basischen Aminosäure mit einem basischen Eluens abtrennt.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung einer basischen Aminosäure aus der Fermentationsbrühe eines die basische Aminosäure produzierenden Mikroorganismenstamms.
  • Basische Aminosäuren wie L-Lysin, L-Histidin, L-Arginin und L-Ornithin werden überwiegend durch mikrobielle Fermentationsverfahren hergestellt (s. z.B. Axel Kleemann et al., „Amino acids", in „Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry", 5th Edition on CD-ROM, 1997 Wiley-VCH und dort zitierte Literatur; Th. Hermann, J. Biotechnol. 104 (2003), S. 155–172 und dort zitierte Literatur; Pfefferle et al., Adv. Biochem. Eng./Biotechnology, Vol. 79 (2003), 59–112 und dort zitierte Literatur; sowie Atkinson et al., in Biochemical Engineering and Biotechnology Handbook, 2nd ed., Stockton Press, 1991, Kapitel 20 und dort zitierte Literatur).
  • Bei derartigen Fermentationsverfahren erhält man primär eine wässrige Fermentationsbrühe, welche neben der gewünschten basischen Aminosäure und der aus den eingesetzten Mikroorganismen resultierenden Biomasse eine Vielzahl an Nebenprodukten und Verunreinigungen, z.B. andere Aminosäuren, Substratreste, Salze, Produkte der Zelllyse, und sonstige Nebenprodukte enthält.
  • Die Gewinnung basischer Aminosäuren aus der Fermentationsbrühe und ihre Aufreinigung erfolgt häufig unter Anwendung von stark sauren Kationentauschern (s. z.B. Th. Hermann, loc.cit; Atkinson et al., loc. cit.). Zu diesem Zweck wird die wässrige Fermentationsbrühe, vor oder nach Abtrennung der Mikroorganismen und sonstiger unlöslicher Bestandteile (Biomasse), mit einer starken Säure wie beispielsweise Schwefelsäure auf einen pH-Wert unterhalb 2 angesäuert, so dass die basische Aminosäure als Dikation vorliegt. Die angesäuerte wässrige Brühe wird dann über einen stark sauren Kationentauscher, dessen Säuregruppen in der Salzform vorliegen, z.B. als Natrium- oder Ammoniumsalze, geleitet, wodurch das Dikation der basischen Aminosäure auf dem Ionenaustauscherharz adsorbiert wird. Der so mit der basischen Aminosäure beladene Kationenaustauscher wird üblicherweise danach zur Entfernung von Verunreinigungen mit Wasser gewaschen. Anschließend wird die basische Aminosäure durch Behandlung mit einer verdünnten wässrigen Base, beispielsweise Natronlauge, Ammoniakwasser oder ein wässrigen Ammoniumpuffer, eluiert, wobei gleichzeitig die Salzform des Kationenaustauschers regeneriert wird. Aus dem so gewonnenen Eluat kann die basische Aminosäure, gegebenenfalls nach Ansäuern des Eluats, in üblicher Weise isoliert werden, z.B. durch Kristallisation.
  • Naturgemäß weist die beim Beladen des Kationenaustauschers mit dem Dikation der basischen Aminosäure ablaufende Flüssigkeit (Ablauf bzw. Effluent) eine hohe Salzkonzentration auf und wird daher häufig auch als "High Density Waste Water" (HDWW) bezeichnet. Auch bei dem sich gegebenenfalls anschließenden Waschschritt fallen große Abwassermengen mit Salzfracht an ("Low Density Waste Water" (LDWW)). Diese Abwässer müssen zur Verringerung der Salzfracht einer aufwändigen Abwasserbehandlung unterzogen werden. Alternativ kann man die salzhaltigen Abwässer entwässern und das dabei anfallende Konzentrat entsorgen oder einer anderen Verwendung zuführen. Beide Maßnahmen sind jedoch mit einem zusätzlichen apparativen Aufwand und einem hohen Energieaufwand verbunden und tragen daher zu einem nicht unbeträchtlichen Anteil zu den Kosten der fermentativen Aminosäureherstellung bei. Es hat daher nicht an Versuchen gefehlt, die Salzfracht und die Abwassermenge, welche bei einer Aufarbeitung von basische Aminosäure enthaltenden Fermentationsbrühen mittels Kationenaustauscher anfallen, zu reduzieren.
  • Ein weiterer Nachteil ist die beim Ansäuern auftretende Niederschlagsbildung, die zu einem Verstopfen der Kationenaustauscheranordnung führen kann. Zudem sind zusätzliche Waschschritte erforderlich, um die Verunreinigungen von den Kationenaustauschermaterialien zu entfernen.
  • Die US 4,714,767 beschreibt ein mehrstufiges Verfahren zur Abtrennung basischer Aminosäuren aus einer wässrigen Brühe mittels einer Anordnung von mehreren, in Serie geschalteten Kationenaustauschersäulen, bei dem man den letzten Teil des beim Beladen der ersten Säule anfallenden Effluenten in den Beladungsvorgang einer späteren Abtrennung zurückführt. Auch wird vorgeschlagen, den letzten Teil des Eluats der ersten Säule in den Elutionsvorgang einer späteren Abtrennung zurückzuführen. Auf diese Weise wird die Wassermenge reduziert, nicht jedoch die Salzfracht.
  • Hsiao et al., Biotechnology and Bioengineering Vol. 49 (1996) S. 341–347, schlagen zur Verringerung der Abwassermenge die Rückführung der am Kationenaustauscher anfallenden salzhaltigen Effluente in das Fermentationsmedium vor. Neben der Gefahr, dass hierdurch Fermentationsinhibitoren, welche im Metabolismus der Mikroorganismen üblicherweise als Nebenprodukte gebildet werden, im Fermentationsmedium akkumulieren, hat sich gezeigt, dass hierbei die Bindungskapazität des Kationenaustauschers herbgesetzt wird, sodass die durch die verringerte Abwassermenge erreichte Kostenersparnis durch die Kosten für eine größere Kationenaustauscheranordnung aufgezehrt werden.
  • I. Lee et al., Enzyme and Microbiol. Technol. 30 (2002) S. 798 803, schlagen zur Verringerung der Salzfracht bei der Aufarbeitung Lysin-haltiger Fermentationsbrühen den Ein satz der Ionenausschlusschromatographie anstelle des üblicherweise eingesetzten Kationenaustauschers vor. Hierzu wird zunächst der Feststoffanteil der Fermentationsbrühe mittels Mikrofiltration entfernt. Die so erhaltene wässrige, Lysin-haltige Brühe wird auf den isoelektrischen Punkt (pH 9,74) eingestellt und dann durch einen Kationentauscher geleitet. Da die ionischen Bestandteile der Brühe nicht absorbiert werden, finden sich diese im Effluenten wieder. Die Aminosäure wird anschließend mit Wasser eluiert. Es hat sich jedoch gezeigt, dass eine hohe Wiedergewinnungsrate an L-Lysin von mehr als 90% nur dann erreicht wird, wenn sowohl die Menge an Lysin-haltigem Feed als auch die Durchflussrate gering sind. Trotz der geringeren Salzfracht ist daher diese Aufarbeitungsform nicht wirtschaftlich.
    •
  • Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Gewinnung basischer Aminosäuren aus der Fermentationsbrühe eines die basische Aminosäure produzierenden Mikroorganismenstamms bereitzustellen, das die hier geschilderten Nachteile des Standes der Technik überwindet und das insbesondere die Verringerung der anfallenden Waschwasser und Salzmenge ermöglicht und gleichzeitig mit hoher Effizienz durchgeführt werden kann, d.h. eine hohe Wiedergewinnungsrate an basischer Aminosäure auch bei hohen Beladungs- und Fließraten erlaubt.
  • Es wurde überraschenderweise gefunden, dass diese Aufgabe durch ein Verfahren gelöst wird, bei dem man
    • a) die Fermentationsbrühe mit einer Säure, deren pKS-Wert in Wasser bei 25°C im Bereich von 2 bis 5 liegt, ansäuert und
    • b) die basische Aminosäure aus der in Schritt a) erhaltenen wässrigen Brühe durch sukzessives Beladen einer einstufigen oder einer mehrstufigen, seriellen Anordnung eines stark sauren Kationenaustauschers in seiner Salzform mit der in Schritt a) erhaltenen Brühe und Eluieren der basischen Aminsäure mit einem basischen Eluens abtrennt.
  • Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung das hier und in den Ansprüchen dargelegte Verfahren zur Gewinnung einer basischen Aminosäure aus der Fermentationsbrühe eines die basische Aminosäure produzierenden Mikroorganismenstamms.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren ist mit einer Reihe von Vorteilen verbunden: zum einen tritt aufgrund der gewählten pH-Werte der Brühe tritt keine nennenswerte Ausfällung von Verunreinigungen auf, welche den Kationenaustauscher blockieren können und auf diese Weise den Bedarf an Waschwasser erhöhen. Zudem ist die beim erfindungsgemäßen Verfahren anfallende Salzmenge und damit die Salzfracht des Abwassers geringer als in den Verfahren des Standes der Technik, bei denen Kationenaustauscher zur Abtrennung und Gewinnung der basischen Aminosäure aus der Fermentationsbrühe genutzt werden. Zudem erreicht man hohe Ausbeuten von in der Regel größer 95% an basischer Aminosäure auch bei hohen Beladungs- und Durchflussraten am Kationenaustauscher.
  • Erfindungsgemäß säuert man in einem ersten Schritt die Fermentationsbrühe mit einer Säure an, deren pKS-Wert bei 25°C im Bereich von 2 bis 5 und insbesondere im Bereich von 3 bis 4 liegt.
  • Beispiele für geeignete Säuren umfassen Phosphorsäure, organische Monocarbonsäuren mit vorzugsweise 1 bis 6 C-Atomen wie Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Butyrsäure und Pentansäure, Dicarbonsäuren mit vorzugsweise 2 bis 6 C-Atomen wie Oxalsäure, Malonsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Itaconsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure, Adipinsäure und Sorbinsäure, Hydroxycarbonsäuren mit vorzugsweise 1 bis 3 Carboxylgruppen sowie mit wenigstens einer, z.B. 1, 2, 3 oder 4 Hydroxylgruppen wie Zitronensäure, Glykolsäure und Milchsäure und Mischungen dieser Säuren. Bevorzugt ist die Säure aus der Gruppe der organischen Carbonsäuren und der Hydroxycarbonsäuren ausgewählt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei der Säure um Ameisensäure.
  • Die Menge an Säure wird vorzugsweise so gewählt, dass in der Brühe ein pH-Wert von 3,5 bis 6,0 und insbesondere im Bereich von pH 4,0 bis 5,5 resultiert. Vorzugsweise setzt man zum Ansäuern 0,05 bis 2 mol Säure, insbesondere 0,1 bis 1 mol Säure und speziell 0,15 bis 0,5 mol Säure pro kg Fermentationsbrühe ein.
  • Gegebenenfalls kann man vor oder nach dem Ansäuern einen Teil oder die Hauptmenge der in der Fermentationsbrühe enthaltenen Mikroorganismen und gegebenenfalls sonstige, vorhandene Feststoffe aus der Fermentationsbrühe abtrennen. Eine Abtrennung dieser Bestandteile ist prinzipiell nicht erforderlich. Daher wird in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung keine Abtrennung dieser Bestandteile vorgenommen und die Kationenaustauscheranordnung wird direkt mit der angesäuerten wässrigen Brühe beladen.
  • Das Abtrennen der Mikroorganismen und sonstiger fester Bestandteile kann, sofern gewünscht, in für die Abtrennung von Mikroorganismen üblicherweise durch Filtration einschließlich Kuchen- und Tiefenfiltration, Cross-Flow-Filtration, durch Membrantrennverfahren wie Ultra- und Mikrofiltration, durch Zentrifugation und Dekantieren, durch Einsatz von Hydrozyklonen oder in sonstiger Weise erfolgen. Es hat sich bewährt, vor der Abtrennung die Mikroorganismen in der Fermentationsbrühe zu inaktivieren (Sterilisieren der Fermentationsbrühe), beispielsweise durch übliche Pasteurisierungsverfahren wie durch Eintrag von Wärme und/oder Heißdampf. Hierzu können übliche Wärmetauscher, beispielsweise Rohrbündelwärmetauscher oder Plattenwärmetauscher eingesetzt werden.
  • Aus der in Schritt a) erhaltenen wässrigen Brühe wird anschließend in Schritt b) die basische Aminosäure mit Hilfe einer Kationenaustauscheranordnung abgetrennt. Die Abtrennung in Schritt b) umfasst erfindungsgemäß wenigstens einen Beladungsschritt, bei der die basische Aminosäure auf dem stark sauren Ionenaustauscher adsorbiert wird, und wenigstens einen Elutionschritt, durch den die basische Aminosäure vom Ionenaustauscher desorbiert wird. Diese Schritte können in der angegebenen Reihenfolge mehrfach wiederholt werden und es können zwischen den Schritten Waschschritte mit Wasser durchgeführt werden.
  • Die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Kationenaustauscheranordnung umfasst einen oder mehrere, z.B. 2, 3 oder 4, in Serie geschaltete Stufen, üblicherweise in Form von Ionenaustauschersäulen, die als stationäre Phase einen oder mehrere stark saure Kationenaustauscher enthalten.
  • Als stark saure Kationenaustauscher kommen grundsätzlich alle Ionenaustauscherharze in Betracht, die stark saure Gruppen, in der Regel Sulfonatgruppen, aufweisen. In der Regel handelt es sich um partikelförmige, mäßig oder stark vernetzte organische Polymere, häufig auf der Basis von Polystyrol, die an der Oberfläche der Polymerpartikel eine Vielzahl stark saure Gruppen aufweisen. Die durchschnittliche Anzahl der sauren Gruppen liegt üblicherweise im Bereich von 1 bis 4 meq/ml Ionentauscherharz. Die mittlere Teilchengröße der Ionentauscherpartikel liegt typischerweise im Bereich von 0,1 bis 1 mm, wobei größere als auch kleinere Teilchengrößen je nach Abmessung der Ionentauscheranordnung geeignet sein können. Die Polymerteilchen können z.B. gel-artig sein oder eine makroporöse Struktur aufweisen.
  • Derartige Ionentauscher sind bekannt und werden z.T. kommerziell für die Aufreinigung von Aminosäuren angeboten, beispielsweise unter den Handelsbezeichnungen Lewatit® K oder Lewatit® S der Fa. Bayer Aktiengesellschaft, z.B. Lewatit® K 2629, Lewatit® S110, Lewatit® S110H, Lewatit® S1467, Lewatit® S1468, Lewatit® S2568, Lewatit® S2568H, Amberjet®, Amberlyst® oder Amberlite® der Fa. Rohm & Haas, z.B. Amberjet® 1200, Amberjet® 1500, Amberlite® 200, Amberlite® 250, Amberlite® IRV120, Amberlite® IR 120, Amberlite® IR 2000, Amberlite® CG 6000, Amberlyst® 119 Wet, Dowex® der Firma Dow Chemicals, z.B. Dowex® 50X1-100, Dowex® 50X2-100, Dowex® 50X2-200, Dowex® 50X2-400, Dowex® 50X4-100, Dowex® 50X4-200, Dowex® 50X4-400, Dowex® 50X8-100, Dowex® 50X8-200, Dowex® 50X8-400, Dowex® 40X1-100, Dowex® 40X1-100, Dowex® 40X1-100, Dowex® HCR-S, Dowex® HCR-W2, Dowex® MSC-1, Dowex® 650C, Dowex® G26, Dowex® 88, Dowex® Monosphere 88, Dowex® Monosphere 99K/320, Dowex® Monosphere 99K/350, Dowex® Monosphere 99Ca/320, Dowex® Marathon C, Dowex® 032, Dowex® 406, Dowex® 437, Dowex® C500ES, Dowex® XUS 43518, Dowex® XUS 40406.00, Diaion® der Fa. Mitsubishi Corp., z.B.
  • Diaion® SK1B, Diaion® SK1BS, Diaion® SK104, Diaion® SK112, Diaion® SK116, Diaion® 1-3561, Diaion® 1-3565, Diaion® 1-3570, Diaion® 1-3573, Diaion® 1-3577, Diaion® 1-3581, Duolite® D 5427, Duolite® D 5552 (organisch basierte Kationenaustauscher), weiterhin Adsorbosphere® SCX, Bakerbond® SCX, Partisil® SCX, Spherisorb® SCX, Supelcosil® LC3-SCX, Ultralsil® SCX und Zorbax® 300 SCX (Silica-basierter Kationenaustauscher).
  • Die Kationenaustauscheranordnung kann absatzweise betrieben werden und weist dann ein oder mehrere, z.B. 2, 3 oder 4 in Serie geschaltete, stationäre Ionentauscherfestbetten auf. Sie kann auch kontinuierlich betrieben werden und weist dann in der Regel 5 bis 50 und insbesondere 15 bis 40 Ionentauscherbetten auf, die z.B. Bestandteil einer "True Moving Bed"-Anordnung (siehe K. Tekeuchi J. Chem. Eng. Japan 11 (1978 S. 216–220), einer "Continuos Circulating Annular"-Anordnung (siehe J.P. Martin, Discuss. Farraday Soc. 1949, S. 7) oder einer "Simulated Moving Bed"-Anordnung, wie beispielsweise in US 2,985,589 und WO 01/72689 sowie von G.J. Rossiter et al. Proceedings of AIChE Conference, Los Angeles, CA, Nov. 1991 oder H.J. Van Walsem et al. J. Biochtechnol. 59 (1997) S 127–123 beschrieben, sein können.
  • Vor dem Beladen des Kationenaustauschers mit der abzutrennenden basischen Aminosäure liegt das in der Ionenaustauscheranordnung enthaltene Kationenaustauschermaterial in seiner Salzform vor, d.h. die stark sauren Gruppen des Kationenaustauschers liegen in deprotonierter Form vor und koordinieren zur Ladungsneutralität eine entsprechende Anzahl an Kationen. In der Regel handelt es sich bei den Kationen um Alkalimetallkationen, insbesondere um Natriumionen oder besonders bevorzugt um Ammoniumionen (NH4 +).
  • Zum Beladen des Kationenaustauscher mit der basische Aminosäure leitet man die angesäuerte wässrige Brühe in üblicher Weise durch die Kationenaustauscheranordnung. Die Beladung kann sowohl absteigend als auch aufsteigend erfolgen, wobei ersteres bevorzugt ist. Die Beladung erfolgt vorzugsweise mit einer spezifischen Fließrate im Bereich von 0,1 h–1 bis 2 h–1. Die Beladung erfolgt vorzugsweise bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis 70°C und insbesondere im Bereich von 30 bis 60°C. Die Menge an wässriger Brühe wird üblicherweise so gewählt, dass wenigstens 35% und insbesondere wenigstens 42% der in der wässrigen Brühe enthaltenen basischen Aminosäure adsorbiert werden. Die Menge an wässriger Brühe beträgt in der Regel die 0,8-fache bis 2-fache Menge des Bettvolumens. Je nach Adsorptionsgrad kann der am Ausgang der Kationenaustauscheranordnung anfallende Effluent noch basische Aminosäure enthalten, so dass der Effluent, ggf. nach Einstellung des pH-Werts, in einer nachfolgenden Stufe auf einen Ionentauscher geleitet werden kann.
  • Dem Beladungsvorgang kann sich ein Waschschritt anschließen. Hierzu wird Wasser durch die Kationenaustauscheranordnung geleitet. Die Menge an Waschwasser beträgt auf dieser Stufe üblicherweise das 0,05- bis 0,3-fache des Bettvolumens. Die dabei anfallenden Waschwässer können geringe Mengen der basischen Aminosäure enthalten und können dann mit dem beim Beladen anfallenden Effluenten vereinigt werden. Anders als in den Verfahren des Standes der Technik ist ein solcher Waschschritt nicht erforderlich, so dass eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens keinen Waschritt umfasst und die Elution unmittelbar im Anschluß an das Beladen erfolgt.
  • Dem Beladungs- bzw. dem gegebenenfalls durchgeführten Waschschritt schließt sich die Elution der basischen Aminosäure an. Hierzu leitet man eine wässrige Lösung einer Base (Eluent) durch die Kationenaustauscheranordnung. Hierdurch wird die basische Aminosäure desorbiert und eluiert und der Kationenaustauscher regeneriert, d.h. die sauren Gruppen des Kationenaustauschers werden wieder in die Salzform überführt. Die Basenkonzentration in dem Eluenten liegt üblicherweise im Bereich von 1 bis 10 Gew.-% und insbesondere im Bereich von 2 bis 8 Gew.-%. Geeignete Basen sind beispielsweise Ammoniak, Alkalimetallhydroxide und -carbonate, wobei Natronlauge und insbesondere Ammoniak bevorzugt werden. Die Menge an wässriger Base beträgt in der Regel die 0,5- bis 3-fache Menge des Bettvolumens. Bezüglich der Temperaturen und Fließrate gilt das für das Beladen gesagte. Die Elution kann sowohl aufsteigend als auch absteigend durchgeführt werden. Die Elution kann in der gleichen Richtung wie die Beladung oder entgegengesetzt hierzu durchgeführt werden.
  • Der Elution kann sich ein weiterer Waschschritt anschließen, um gegebenenfalls vorhandene Verunreinigungen zu entfernen. Hierzu wird Wasser durch die Kationenaustauscheranordnung geleitet. Die Menge an Waschwasser beträgt auf dieser Stufe üblicherweise das 0,05- bis 0,3-fache des Bettvolumens. Der beim Waschritt anfallende Effluent wird als Abwasser mit geringer Salzfracht einer üblichen Abwasserbehandlung oder einer sonstigen Aufarbeitung zugeführt.
  • Das bei der Elution anfallende Eluat wird zur Gewinnung der Aminosäure in üblicher Weise aufgearbeitet. In der Regel wird man hierzu das Eluat aufkonzentrieren, z.B. durch Entfernen des Wasser in einer üblichen Verdampferanordnung.
  • Auf diese Weise erhält man eine konzentrierte wässrige Lösung der basischen Aminosäure, aus der diese durch Fällung oder Kristallisation, z.B. nach Zusatz von Salzsäure als Hydrochlorid, isoliert werden kann. Verfahren hierzu sind dem Fachmann bekannt und in der Literatur umfassend beschrieben (z.B. Hermann T. Industrial Production of amino acids by coryneform bacteria, J. of Biotechnology, 104(2003), 155–172).
  • Das beim Aufkonzentrieren anfallende wässrige Kondensat kann verworfen oder in den Prozess zurückgeführt werden. Beispielsweise kann das Kondensat in den Elutionsschritt der basischen Aminosäure in einer nachfolgenden Aminosäureabtrennung zurückgeführt werden. Vorzugsweise wird man hierzu das Kondensat im Anschluss an die Elution mit der wässrigen Base durch die Kationenaustauscheranordnung leiten. Der dabei anfallende Ablauf enthält häufig noch geringen Mengen an basischer Aminosäure und wird üblicherweise in die Elution einer nachfolgenden Aminosäureabtrennung zurückgeführt.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren ist grundsätzlich für die Isolierung aller basischen Aminsäuren, insbesondere natürlicher Aminosäuren wie Lysin, Ornithin, Histidin oder Arginin anwendbar und wird insbesondere zur Isolierung von fermentativ hergestelltem L-Lysin eingesetzt. Die Art des Fermentationsprozessese sowie der zur Herstellung der Aminosäure eingesetzte Mikroorganismenstamm spielen für das erfindungsgemäße Verfahren keine Rolle, so dass das erfindungsgemäße Verfahren zur Isolierung der basischen Aminosäure aus beliebigen Fermentationsbrühen geeignet ist, eingesetzt werden
  • In der Regel handelt es sich um Verfahren, bei denen man einen Mikroorganismenstamm, der die gewünschte basische Aminosäure produziert, in einem Fermentationsmedium kultiviert, das als Substrat mindestens eine Kohlenstoffquelle, z.B. Melasse und/oder Rohzucker, und eine Stickstoffquelle, z.B. Ammoniak oder Ammoniumsalze wie Ammoniumsulfat, sowie gegebenenfalls Mineralstoffe und Spurenelemente enthält. Diese Substratbestandteile können als solche oder in Form einer komplexen Mischung, z.B. als Corn-Streep-Liquor, eingesetzt werden.
  • Die Art des Mikroorganismenstamms richtet sich naturgemäß nach der Art der zu produzierenden Aminosäure. In der Regel handelt es sich um Stämme, welche die gewünschte basische Aminosäure überproduzieren. Im Falle des L-Lysins, des Ornithins und des Histidins handelt es sich in der Regel um Stämme der Gattung Corynebacterium oder Brevi bacterium, z.B der Spezies Corynebacterium glutamicum oder Brevibacterium lactofermentum, im Falle des Arginins um Stämme der Spezies Bacillus subtilis oder Brevibacterium flavum, wobei jedoch in jüngerer Zeit auch Stämme anderer Gattungen eingesetzt werden.
  • In der Regel wird man die Fermentation so weit führen, dass der Gehalt an basischer Aminosäure in der Fermentationsbrühe im Bereich von 50 bis 200 g/L und insbesondere im Bereich von 80 bis 150 g/L liegt. Der Anteil an Biomasse, d.h. Mikroorganismen (als Biotrockenmasse) und sonstige unlösliche Bestandteile biologischen Ursprungs (z.B. Zellulosefasern aus der Glukosequelle), liegt üblicherweise im Bereich von 3 bis 7 Gew.%. Daneben enthält die Fermentationsbrühe in der Regel noch Restmengen an Sub strat, z.B. nicht verbrauchter Zucker (üblicherweise weniger als 40 g/l) sowie Nebenprodukte der Fermentation, z.B. saure oder neutrale Aminosäuren oder sonstige basische Aminsäuren, Peptide und dergleichen. Der pH-Wert liegt häufig im Bereich von > 6 bis 7,5 und insbesondere im Bereich von 6,2 bis 7,2. Daneben enthält die Fermentationsbrühe in der Regel noch Restmengen an Substrat, z.B. nicht verbrauchter Zucker (üblicherweise weniger als 40 g/l) sowie Nebenprodukte der Fermentation, z.B. saure oder neutrale Aminosäuren oder sonstige basische Aminsäuren, Peptide und dergleichen.
  • Die Fermentationsverfahren können kontinuierlich oder absatzweise als Batch- oder Fed-Batch-Verfahren durchgeführt werden. In der Regel handelt es sich um eine Fermentationsbrühe, die nach einem Fed-Batch-Verfahren hergestellt wurde, d.h. die Hauptmenge der Substrate wird der Mikroorganismen-haltigen Brühe im Verlauf der Fermentation zugeführt.
  • Derartige Verfahren und geeignete Mikroorganismenstämme sind dem Fachmann bekannt, z.B. aus dem eingangs zitierten Stand der Technik (siehe insbesondere Pfefferte et al. und Th. Herrmann, loc.cit) sowie aus WO 95/16042, WO 96/06180, WO 96/16042, WO 96/41042, WO 01/09306, EP-A 175309, EP-A 327945, EP-A 551614, EP-A 837134, US 4346170 , US 5305576 , US 6025165 , US 6653454 , DE 253199 , GB 851396 , GB 849370 und GB 1118719 (Herstellung von L-Lysin), EP-A 393708, GB 1098348 , US 3668072 , US 3574061 , US 3532600 , US 2988489 , JP 2283290 , JP 57016696 (L-Ornithin), US 3902967 , US 4086137 , GB 2084566 (Arginin) US 3875001 und US 3902966 (Histidin) bekannt.
  • Die Maßnahmen zur technischen Durchführung und Steuerung derartiger Fermenationen sind dem Fachmann geläufig und kann der einschlägigigen Literatur, beispielsweise Storhas (s.o.) und J.E. Bailey et al. Biochemical Engineering Fundamentals, 2. ed. MacGraw-Hill 1986, Kapitel 9, entnommen werden.
  • Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele und Vergleichsbeispiele erläutert, die bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens darstellen und nicht einschränkend zu verstehen sind.
  • Verwendete Abkürzungen:
    • HDWW:
      Abwasser mit hoher Salzfracht
      LDWW:
      Abwasser mit geringer Salzfracht
      ID:
      Innendurchmesser
      H:
      Höhe
      Lys-HCl:
      L-Lysin-Monohydrochlorid
      BV:
      Bettvolumen (Volumen des Kationenaustauschers in der Anordnung)
      SV:
      spezifische Fließrate (Fließgeschwindigkeit in 1 BV/H)
  • Einsatzmaterialien:
  • Alle Versuche wurden mit einer L-Lysin-haltigen Fermentationsbrühe durchgeführt, die in an sich bekannter Weise durch Fermentation mit C. glutamicum hergestellt wurde. Die Fermentationsbrühe wies einen Gehalt an Lys-HCl von 110 bis 130 g/l und einen Gehalt an Biomasse (als Biotrockenmasse gerechnet) von 2,5–3,5 Gew.-% auf. Der Salzgehalt lag zwischen 3 und 5 Gew.-%.
  • Kationenaustauscheranordnung
  • In Vergleichsbeispiel 1 und den Beispielen 1 und 2 diente als Kationenaustauscheranordnung jeweils eine zylindrische Säule mit den Abmessungen 125 mm (ID) × 495 mm (H), die mit 3000 ml eines stark sauren Kationenaustauscherharzes beladen war. Als Kationenaustauscher diente ein sulfoniertes, vernetztes Polystyrol vom Geltyp mit einer mittleren Teilchengröße von etwa 0,6 mm (DIAION SK1B der Firma Samyang Co. Ltd. Korea) und einer Gesamtkapazität > 2 meq/ml. Die Kationenaustauscheranordnung wurde vor ihrer Benutzung mit 6 gew.-%igem wässrigem Ammoniak äquilibriert.
  • In Beispiel 3 diente als Kationenaustauscheranordnung eine SepTor pilot Anlage (Model 30-6, Torus Liquid Separation, Holland), die mit 22,8 L stark saurem Kationenaustauscherharz beladen war. Als Kationenaustauscher diente ein sulfoniertes, vernetztes Polystyrol vom Geltyp mit einer mittleren Teilchengröße von etwa 0.6 mm (DIAION SK1B der Firma Samyang Co. Ltd. Korea) und einer Gesamtkapazität > 2 meq/ml.
    •
  • Vergleichsbeispiel 1
  • Eine Fermentationsbrühe mit einem Lysingehalt von 12,5 Gew.-% und einem Biomasseanteil von 3 Gew.-% wurde mit 5,8 g konzentrierter Schwefelsäure je 100 g Brühe auf einen pH-Wert von 1,5 angesäuert. 5,5 L der angesäuerten Fermentationsbrühe wurden bei einer Temperatur von 45°C mit einer spezifischen Fließrate von 1 h–1 von unten nach oben durch die Kationenaustauscheranordnung geleitet. Die Lysinmenge in der durchgeleiteten Brühe enthaltene Lysinmenge entsprach 210 g Lys-HCl je l Ionenaustauscherharz. Danach wurde die Säule mit 3,4 L Wasser mit einer spezifischen Fliessrate von 2 h–1 nachgespült. Anschließend ließ man die Säule leer laufen. Der anfallende Effluent wurden aufgefangen und hierin die Menge an Lysin bestimmt. Hieraus errechnete sich eine Menge an adsorbiertem Lysin zu 95,7 g je Liter Harz.
  • Anschließend wurde zur Elution des L-Lysins 6 l einer 3 w/v-%-igen wässrigen Ammoniaklösung von oben nach unten mit einer spezifischen Fließrate von 1 h–1 durch die Kationenaustauscheranordnung geleitet.
  • Der Lysingehalt des Eluates wurde bestimmt. Hieraus errechnete man eine Wiedergewinnungsrate von 98%, bezogen auf adsorbiertes Lys-HCl.
  • Beispiel 1
  • Eine Fermentationsbrühe mit einem Lysingehalt von 12,5 Gew.-% und einem Biomasseanteil von 3 Gew.-% wurde mit 1 g 87 gew.-%iger Ameisensäure je 100 g Brühe auf einen pH-Wert von 4,1 angesäuert. 5,5 l der angesäuerten Fermentationsbrühe wurden bei einer Temperatur von 45°C mit einer spezifischen Fließrate von 1 h–1 von oben nach unten durch die Kationenaustauscheranordnung geleitet. Die Lysinmenge in der durchgeleiteten Brühe entsprach 210 g Lys-HCl je Liter Ionenaustauscherharz. Der anfallende Effluent wurden aufgefangen und hierin die Menge an Lysin bestimmt. Hieraus errechnete sich eine Menge an adsorbiertem Lysin zu 88,2 g je Liter Harz.
  • Anschließend wurde zur Elution des L-Lysins 6 L einer 3 w/v-%-igen wässrigen Ammoniaklösung von oben nach unten mit einer spezifischen Fließrate von 1 h–1 durch die Kationenaustauscheranordnung geleitet. Die Säule wurde mit 0,7 L Wasser bei einer spezifischen Fliessrate von 1 h–1 nachgespült.
  • Das Eluat wurde aufgefangen und der Lysingehalt bestimmt. Hieraus errechnete man eine Wiedergewinnungsrate von 98%, bezogen auf adsorbiertes Lys-HCl. Ein Waschschritt war nicht erforderlich.
  • Beispiel 2
  • Eine Fermentationsbrühe mit einem Lysingehalt von 12,5 Gew.-% und einem Biomasseanteil von 3 Gew.-% wurde mit 3 g 87 gew.-%iger Ameisensäure je 100 g Brühe auf einen pH von 3,6 angesäuert und die Zellmasse mittels Zentrifugation abgetrennt. Die daraus resultierende Brühe enthält < 0,5 Gew-% Zellen. 4 l dieser wässrigen Brühe wurden bei einer Temperatur von 45°C mit einer spezifischen Fließrate von 1 h–1 von oben nach unten durch die Kationenaustauscheranordnung geleitet. Die Lysinmenge in der durchgeleiteten Brühe entsprach 170 g Lys-HCl je l Ionenaustauscherharz. Der anfallende Effluent wurde aufgefangen und die Menge an Lysin bestimmt. Hieraus errechnete sich eine Menge an adsorbiertem Lysin zu 107 g je Liter Harz.
  • Anschließend wurde zur Elution des L-Lysins 6 L einer 6 w/v-%-igen wässrigen Ammoniaklösung von oben nach unten mit einer spezifischen Fließrate von 1 h–1 bei einer Temperatur von 45°C durch die Kationenaustauscheranordnung geleitet.
  • Der Lysingehalt des Eluates wurde bestimmt. Hieraus errechnete man eine Wiedergewinnungsrate von 95%, bezogen auf adsorbiertes Lys-HCl.
  • Beispiel 3
  • Eine Fermentationsbrühe mit einem Lysingehalt von 12,5 Gew.-% und einem Biomasseanteil von 3 Gew.-% wurde mit 6 g 87 gew.-%iger Ameisensäure je 100 g Brühe auf einen pH von 3,2 angesäuert und die Zellmasse mittels Zentrifugation abgetrennt. Die daraus resultierende Brühe enthält < 0,5 Gew-% Zellen. 19,1 l dieser wässrigen Brühe wurden bei einer Temperatur von 45°C mit einer spezifischen Fließrate von 0,36 h–1 von oben nach unten durch die Kationenaustauscheranordnung geleitet. Die Lysinmenge in der durchgeleiteten Brühe entsprach 105 g Lys-HCl je l Ionenaustauscherharz. Der anfallende Effluent wurde aufgefangen und die Menge an Lysin bestimmt. Hieraus errechnete sich eine Menge an adsorbiertem Lysin zu 100 g je Liter Harz.
  • Anschließend wurde zur Elution des L-Lysins 45,6 L einer 6 w/v-%-igen wässrigen Ammoniaklösung von oben nach unten mit einer spezifischen Fließrate von 0,36 h–1 bei einer Temperatur von 45°C durch die Kationenaustauscheranordnung geleitet.
  • Der Lysingehalt des Eluates wurde bestimmt. Hieraus errechnete man eine Wiedergewinnungsrate von 95%, bezogen auf adsorbiertes Lys-HCl.

Claims (9)

  1. Verfahren zur Gewinnung einer basischen Aminosäure aus der Fermentationsbrühe eines die basische Aminosäure produzierenden Mikroorganismenstamms, umfassend: a) Ansäuern der Fermentationsbrühe mit einer Säure, deren pKS-Wert in Wasser bei 25°C im Bereich von 2 bis 5 liegt, und b) Abtrennen der basischen Aminosäure aus der in Schritt a) erhaltenen wässrigen Brühe durch sukzessives Beladen einer ein- oder mehrstufigen, seriellen Anordnung eines stark sauren Kationenaustauschers in seiner Salzform mit der in Schritt a) erhaltenen Brühe und Eluieren der basischen Aminosäure mit einem basischen Eluens.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Säure aus der Gruppe der organischen Carbonsäuren und der Hydroxycarbonsäuren ausgewählt ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Säure Ameisensäure ist.
  4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei man zum Ansäuren 0,05 bis 2 mol Säure pro kg Fermentationsbrühe einsetzt.
  5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei man die Fermentationsbrühe auf einen pH-Wert im Bereich von 3,5 bis 6,0 ansäuert.
  6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüchen, wobei die sauren Gruppen des Ionenaustauschers vor dem Beladen in Form von Natrium- und/oder Ammonium-Salzgruppen vorliegen.
  7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüchen, wobei man die basische Aminosäure mit wässrigem Ammoniak oder Natronlauge oder einem Gemisch davon eluiert.
  8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die basische Aminosäure Lysin ist.
  9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend zusätzlich die Isolierung der basischen Aminosäure durch Kristallisation aus dem Eluat.
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