DE2408169C2

DE2408169C2 - Herstellung von Ribonucleinsäure

Info

Publication number: DE2408169C2
Application number: DE2408169A
Authority: DE
Inventors: Shunichi Suita Osaka Akiyama; Yoshiaki Neyagawa Osaka Arai; Muneharu Toyonaka Osaka Doi; Hideo Osaka Fukuda; Yoshio Ibaraki Osaka Nakao
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1973-02-22
Filing date: 1974-02-20
Publication date: 1982-11-04
Also published as: JPS49108281A; NL7402288A; NL180332C; NL180332B; BR7401263D0; AU6575174A; CA1006110A; BE811393A; GB1449534A; IT1014061B; US3909352A; FR2219223B1; JPS5344553B2; DE2408169A1; FR2219223A1; DK133830B; DK133830C

Description

20

Die Erfindung betrifft den Gegenstand des Anspruchs.

Eine erhebliche Nachfrage ist in neuerer Zeit auf den Gebieten der technischen Verwertung von Nucleinsäuren festzustellen, bei der, ausgehend von Ribonucleinsäure (nachstehend kurz als »RNA« bezeichnet), 5'-Nucleotide, z. B. 5'-lnosinsäure, S'-Adenylsäure, 5'-Guanylsäure, 5'-Cytidylsäure und 5'-Uridylsäure, die in großem Umfange als Würzen, Pharmazeutika oder ihre Zwischenprodukte verwendet werden, hergestellt werden. Eine gesteigerte Nachfrage besteht auch für die entsprechenden Nucleoside als Ausgangsmaterial für Ribonucleinsäure. Hieraus hat sich wiederum die J5 wichtige Aufgabe ergeben, RNA mit niedrigen Kosten in großen Mengen herzustellen.

Bisher wurde RNA hauptsächlich aus der Biomasse gewonnen, die durch Züchtung von Hefen, insbesondere Hefen der Gattung Candida in einem Kulturmedium, das Melasse oder Ablaugen der Zellstoffherstellung als hauptsächliche Kohlenstoffquelle enthält, erhalten wird. In diesem Zusammenhang sind mehrere Verfahren zur Herstellung einer an RNA reichen Hefebiomasse bekannt. In technischer Hinsicht können diese Verfahren in die folgenden drei Gruppen eingestuft werden:

Gruppe 1:

Verfahren zur Herstellung einer an RNA reichen Hefebiomasse, wobei Hefen unter bestimmten so Kulturbedingungen gezüchtet werden.

Gruppe 2:

Verfahren zur Herstellung von Hefebiomasse, die reich an RNA ist, wobei Hefen in einem Medium, das durch einige Mittel mit bestimmten Aktivitäten oder gewissen Vorstufen ergänzt ist, gezüchtet werden.

Gruppe 3:

Verfahren zur Herstellung von Hefebiomasse, die reich an RNA ist, wobei Hefen, denen spezielle genetische Merkmale verliehen worden sind, gezüchtet werden.

Die Verfahren der Gruppe 1 erfordern jedoch nicht nur spezielle Fermenter und Hilfseinrichtungen, son- (,s dem bieten häufig auch erhebliche Schwierigkeiten hinsichtlich der Vollendung der Fermentation. Die Verfahren der Gruppe 2 erfordern die Verwendung einiger bestimmter Mittel oder ihrer Vorprodukte, in denen meistens teure Materialien oder giftige Substanzen wie Schwermetalle verwendet werden, die zwangsläufig umständliche zusätzliche Verfahren zur Vermeidung möglicher Verunreinigungsprobieme bei der Behandlung und Aufbereitung der flüssigen Abfälle der Fermentation erfordern.

Ferner sind die Verfahren der Gruppe 2 vom Standpunkt der öffentlichen Gesundheit insofern unerwünscht, als die Ribonucleinsäure der Hefebiomasse, an der diese Schwermetalle oder andere giftige Stoffe haften oder adsorbiert sind, als Ausgangsmaterial für die Herstellung von Würzen, Pharmazeutila oder ihren Zwischenprodukten verwendet werden soll.

Als mögliche Wege zur Erzeugung von Hefebäomasse, die reich an RNA ist, sind daher die Verfahren der Gruppe 3 am meisten erwünscht. Bei dem einzigen bekannten Verfahren dieses Typs werden jedoch die polyploiden Arten der Saccharomyces-Hefen verwendet, jedoch wurden auch bei diesem Verfahren bisher keine genügend hohen Ausbeuten erzielt

Eingehende Untersuchungen der Anmelderin, Hefen zu finden, die weniger teure Kohlenstoffquellen zu verwerten vermögen und dennoch eine an RNA reiche Biomasse ergeben, führten zu der Feststellung, daß Hefen der Gattung Candida, die gegenüber Kaliumchlorid empfindlich sind, nämlich die Hefen Candida lipolytica IFO 1643, Candida tropicalis IFO 1649, Candida albicans IFO 1650, Candida guilliermondii IFO 1651, Candida intermedia IFO 1652 Candida krusei IFO 1653, Candida parapsilosis IFO 1654, Candida robusta IFO 1655 und Candida stellatoidea IFO 1656, äußerst reich an RNA sind. Diese Feststellung liegt der Erfindung zu Grunde.

Die Hefen, die in dieser Beschreibung als »empfindlich gegenüber Kaliumchlorid« bezeichnet werden, erfüllen die folgenden Voraussetzungen:

Versuchsmethode zur Bestimmung der gegenüber Kaliumchlorid empfindlichen Hefen

Eine lmpfnadeimenge der 2'ellen wird von einer Schrägkultur einer gegebenen Hefe der Gattung Candida entnommen und in ein Reagensglas geimpft, das 3 ml des Mediums A (der nachstehend genannten Zusammensetzung) enthält. Das geimpfte Medium wird 24 Std. bei 28⁰C unter Schütteln bebrütet. Von der erhaltenen Kultur werden 0,025 ml in ein Reagensglas überführt, das 3 ml des Mediums B (der nachstehend genannten Zusammensetzung) enthält, in dem die Hefe 48 Stunden bei 28° C unter Schütteln kultiviert wird. Die erhaltene Kultur wird mit Wasser auf 1/50 der Konzentration verdünnt. Eine Probe wird in eine Küvette von 16 mm Innendurchmesser gegeben. Mit einem Spektrophotometer wird die Extinktion der Probe bei 590 ιημ gemessen. Wenn der gemessene Wert nicht größer ist als 0,050, gilt die jeweilige untersuchte Hefe als empfindlich gegenüber Kaliumchlorid. Als Spektrophotometer kann für diesen Zweck beispielsweise das Gerät »Coleman Junior«, Modell 6 D₁ verwendet werden.

Medium A

3% Glucose, 0,3% Fleischextrakt,

0,3% Hefeextrakt, 0,5% Harnstoff und

0,01% FeSO₄ · 7H₂O

Es ist zu bemerken, daß in Fällen, in denen die untersuchte Hefe Glucose als Kohlenstoffquelle nicht zu verwerten vermag oder einen speziellen Nährstoff

erfordert, das Medium A' verwendet werden kann, das an Stelle der im Medium A verwendeten Glucose eine andere Kohtanstoffquelle enthält oder durch gewisse andere Nährstoffe, die die jeweilige Hefe zum Wachstum benötigt, ergänzt ist

Medium B (Medium B') Medium A (oder Medium A'), dem Kaliumchlorid

in einer molaren Konzentration von

1,5 zugesetzt worden ist

Hefen der Gattung Candida, die empfindlich gegenüber Kaliumchlorid sind, lassen sich leicht nach der sog. Replica-Plattierungsmethode auswählen, bei der jede zu untersuchende Candida-Hefe auf einem Piattenmedium Aa (A'a) und Ba (B'a) gezüchtet wird. Hierbei handelt es sich um die Medien A (oder A') und B (oder B'), denen jeweils Agar zugesetzt worden ist Die Auswahl kann auch nach der Methode erfolgen, die vorstehend als Anhaltspunkt für die Bestimmung von Hefen, die gegenüber Katiumchlorid empfindlich sind, beschrieben wurde. Hierbei ist es zweckmäßig, eine Hefe der Gattung Candida als Ursprungsstamm zu verwenden, die Hefe beispielsweise mit UV-Strahlen, Röntgenstrahlen oder Chemikalien wie N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin, Chinolin, Stickstofflost, Wasserstoffperoxyd oder Dimethylsulfoxyd zu behandeln, um Mutation zu erzeugen, und einen geeigneten Stamm, der die vorstehend genannten Bedingungen erfüllt, beispielsweise nach der vorstehend genannten Replica-Plattierungsmethode auszusondern.

Zu diesen kaliumchloridempfindlichen Stämmen gehören Hefen, deren Biomasse intrazelluläre RNA in einer Konzentration bis zu 12% enthält. Zur Messung des RNA-Gehalts der Biomasse eines solchen Stammes wird der Stamm in dem nachstehenden Medium unter den folgenden Kulturbedingungen, die als Beispiel genannt werden, gezüchtet worauf der RNA-Gehalt der erzeugten Hefe gemessen wird. In diesem Fall können durch Verwendung eines billigeren Materials als Kohlenstoffquelle im Medium, z. B. unier Verwendung von Kohlenwasserstoffen, Essigsäure und Alkoholen, gleichzeitig Stämme ausgewählt werden, die diese Kohlenstoffquellen verwerten und assimilieren. Typisch ist das folgende Auswahlverfahren:

45 Versuch

1) Zu testender Hefestamm Candida lipolytica TA -540, IFO 1657

2) Methode zur Isolierung der Stämme

Gruppe A:

Eine Zellsuspension des Testmikroorganismus (0,1 molarer Phosphatpuffer, pH 7,0) wird auf eine geeignete Konzentration verdünnt, und die verdünnte Suspension wird auf das Plattenmedium Aa

50 (der oben genannten Zusammensetzung) gestrichen. Nach einer Kultivierungsdauer von 2 Tagen bei 28° C werden 200 Stämme willkürlich aus den entwickelten Kolonien isoliert

Gruppe B:

Zu einer Zellsuspension des Testmikroorganismus (gleicner Puffer wie otien) wird N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin in einer solchen Menge gegeben, daß die Konzentration 300ü.g/ml beträgt Nach einer Kontaktzeit von 30 Minuten bei 28°C werden die Zellen zweimal mit sterilem Wasser gewaschen und auf das Plattenmedium Aa getrichen, das 2 Tage bei 2:8° C bebrütet wird. Von den gebildeten Kolonien werden willkürlich 199 Stämme isoliert

Gruppe C:

Der Testmikroorganismus wird in genau der gleichen Weise, wie vorstehend für die Gruppe B beschrieben, behandelt Mit Hilfe der vorstehend für die Auswahl von kaliumchloridempfindlichen Mikroorganismen beschriebenen Replica-Plattierungsmethode werden 210 Mutanten, die gegenüber Kaliumchlorid empfindlich sind, isoliert

3) Verfahren zur Züchtung der isolierten Stämme

Bei allen vorstehend genannten Gruppen wird jeder isolierte Stamm wie folgt kultiviert: Mit einer von einer Schrägkultur entnommenen Impfnadelmenge der Hefezellen werden 20 ml des Mediums S (siehe Beispiel 1) geimpft, das in einem 200-ml-Kolben enthalten ist Die Hefen werden dann 24 Stunden bei 28° C auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung bei 200 UpM kultiviert. Von der erhaltenen Kultur werden 0,5 ml in einen 200-ml-Kolben überführt der 10 ml des Mediums M (siehe Beispiel 1) enthält das durch 1% (Gew/Vol.) eines n-Paraffingemisches (Reinheit 98%, C₁₂-C18-Normalparaffine) und 0,8% Harnstoff ergänzt ist, und 16 bis 2ft Stunden bei 28° C auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung bei 200 UpM bebrütet. Dem hierbei erhaltenen Kulturmedium wird ein einzelner Tropfen einer oberflächenaktiven Verbindung zugesetzt.

4) Analysenmethode

a) Bestimmung der Menge der erzeugten Hefe

Zur Gewinnung der Biomasse werden 5 ml des Kulturmediums 15 Minuten bei 3000 UpM zentrifugiert Die Biomasse wird dann 24 Stunden bei 105° C getrocknet Das Trockengewicht der Biomasse gilt als Menge der erzeugten Biomasse.

b) Messung des RNA-Gehalts

Eine Probe von 1 ml wird vom Kulturmedium entnommen. Nach der Methode von G. Schmidt und S. Thannhauser (Journal of Biological Chemistry 161 (1945) 83) wird der RNA-Gehalt ermittelt. Die hierbei gefundene Menge wird in Gew.-%, bezogen auf die Biomasse, ausgedrückt.

5. Versuchsergebnis

Auffindung von Hefen, die eine RNA-reiche Biomasse ergeben.

RNA-Gehalt, %

Gruppe A Gruppe B

Gruppe C

0- 2	—	2	—	—
- 4	-	195	-	-
- 6	83	88
- 8	114	102

5	Fortsetzung	RNA-Gehalt, %	24 08 1	69	6
-10 -12 -14 -16 -18 -20 Insgesamt
Gruppe A	Gruppe B	Gruppe C
3 200 Stämme	2 199 Stämme	7 2 7 4 210 Stämme

Von der Anmelderin wurde nach dem Grund für den hohen RNA-Gehalt der für Kaliumchlorid empfindlichen Hefen gesucht, jedoch ist die Erscheinung bis heute nicht völlig geklärt worden. Es scheint jedoch, daß Kaliumchlorid eine enge Beziehung zu der intrazellulären Biosynthese von RNA oder zu den den Stoffwechsel steuernden Mechanismen bei den Candida-Hefen hat In dieser Beschreibung und in den Ansprüchen gelten als RNA-reiche Hefebiomassen solche, die wenigstens 12%, besser 14%, insbesondere 15% intrazelluläre RNA enthalten.

Die nachstehend beschriebene Methode dient als praktische Anweisung für die Bewertung, wie reich die erzeugte Hefe an RNA ist Zu 0,5 ml eines kulturmediuiTis werden 5,0 ml eines Gemisches von Äthanol und Äther (1 · 1) gegeben. Das Gemisch wird gut gerührt und dann 5 Minuten bei 2000 UpM zentrifugiert, wobei eine Fällung erhalten wird. Diese Fällung wird mit einer wäßrigen 0,2 N Perchlorsäure gewaschen und mit 1 ml einer wäßrigen 1 N Natriumhydroxydlösung gemischt. Das Gemisch wird 20 Stunden bei 37⁰C gehalten, mit 10°/oiger wäßriger Perchlorsäurelösung auf 10 ml aufgefüllt und filtriert. Das erhaltene Filtrat wird mit einer wäßrigen 0,2 N Perchlorsäurelösung auf das lOfache verdünnt. Die optische Dichte der verdünnten Lösung bei 260 φμ (c= 1,0 cm) wird gemessen und als A ausgedrückt

Andererseits werden 5 ml der genannten überstehenden Lösung unmittelbar 15 Minuten bei 3000 UpM zentrifugiert. Die erhaltene Fällung wird 24 Stunden bei 105" C getrocknet, und das Trockengewicht der Fällung in mg wird als ßbezeichnet

Wenn in der folgenden Gleichung der Wert C nicht kleiner ist als 0,12, so ist dies ein Zeichen dafür, daß die untersuchte Biomasse reich an RNA ist:

34/1
B

Gemäß der Erfindung wird einer der im Patentanspruch genannten Stämme, der also für Kaliumchlorid empfindlich ist und eine an RNA reiche Biomasse zu bilden vermag, unter aeroben Bedingungen kultiviert. Als Kohlenstoffquellen eignen sich beispielsweise verschiedene Kohlenwasserstoffe wie Decan, Undecan, Dodecan, Tridecan, Tetradecan, Pentadecan, Hexadecan, Heptadecan, Octadecan, Nonadecan, Eicosan, Kerosin, Gasöl und schweres Gasöl, Fettsäuren, z. B. Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure, Myristinsäure, Margarinsäure, Palmitinsäure und Oleinsäure, öle und Fette, z. B. Sojabohnenöl, Spermazetöl und Baumwollsaatöl, und einwertige und mehrwertige Alkohole, 7. B. Methanol, Äthanol, Propanol und Glycerin, jeweils allein oder in Mischung von zwei oder mehreren. Vom wirtschaftlichen Standpunkt ist es besonders günstig, die Kohlenstoffquellen, die billig und in großen Mengen verfügbar sind, z. B. die primären und sekundären Produkte der petrochemischen Industrie, zu verwenden.

Als Stickstoffquellen können für die Kultivierung gemäß der Erfindung vorteilhaft organische Stickstoffquellen, z. B. Maisquellwasser, Baumwollsaatkuchen, Hefeextrakt, Fischmehl und Maismehl, anorganische Ammoniumsalze und Nitrate, z. B. wäßriges Ammoniak, Ammoniakgas, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumcarbonat, Ammoniumphosphat, Natriumnitrat und Ammoniumnitrat, und entsprechende organische Verbindungen, z. B. Harnstoff und Aminosäuren, verwendet werden.

Außer diesen Kohlenstoff- und Stickstoffquellen werden dem Medium verschiedene Mineralstoffe, die dem Wachstum der zu verwendenden Hefe angemessen sind, z. B. Salze von Eisen, Mangan, Calcium, Zink, Kupfer, Aluminium usw.. Phosphorsäure usw. sowie Vitamine und Aminosäuren, die für das Wachstum erforderlich sein können, zugesetzt. Die Fermentation läßt sich leicht kontinuierlich oder chargenweise durchführen.

Der pH-Wert des zu verwendenden Mediums und des Kulturmediums im Laufe der Kultivierung wird innerhalb des für das Wachstum der verwendeten Hefe optimalen Bereichs gehalten, der im allgemeinen zwischen etwa 2 und 10, meist zwischen etwa 3 und 7,5 liegt. Hierzu kann dem Medium von Zeit zu Zeit Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, wäßriges Ammoniak, Ammoniakgas, eine wäßrige Natriumhydroxydlösung, eine wäßrige Natriumcarbonatlösung, Calciumcarbonat, Calciumhydroxyd oder dgl. oder eine organische Säure, z. B. Essigsäure, zugesetzt werden. Insbesondere dient eine Lösung, die in geeigneten Mengen Essigsäure einerseits und wäßriges Ammoniak, Ammoniakgas oder eine wäßrige Natriumhydroxydlösung andererseits enthält, nicht nur sowohl als Kohlenstoffquelle als auch als Stickstoffquelle, sondern gleichzeitig zur Regelung des pH-Wertes, so daß eine solche Lösung auch vom wirtschaftlichen Standpunkt besonders günstig für die Kultivierung dieser Hefen ist.

Die Kultivierungstemperatur, die für das Wachstum und die intrazelluläre Anhäufung von RNA bei dem jeweiligen Stamm geeignet ist, liegt im allgemeinen im Bereich von etwa 10° bis 40⁰C. Zweckmäßig wird die Kultivierung bei etwa 15° bis 28° C durchgeführt. Die Kultivierungszeit sollte so gewählt werden, daß ein hoher RNA-Gehalt wirtschaftlich erreicht wird. Diese Zeit kann natürlich in Abhängigkeit vom verwendeten Medium sowie von anderen Kulturbedingungen in weiten Grenzen liegen.

Die Isolierung der an RNA reichen Hefebiomasse aus dem in der beschriebenen Weise erhaltenen Kulturmedium, das die für Kaliumchlorid empfindlichen Hefen enthält, kann beispielsweise kontinuierlich oder chargenweise durch Zentritugieren, Filtration, Sedimentation und nach anderen Routineverfahren erfolgen, die

für die Isolierung von Biomassen aus Kulturmedien üblich sind.

Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen ausführlich beschrieben. Die zur Kennzeichnung der verwendeten Mikroorganismen in Verbindung mit der Abkürzung »IFO« gebrauchten Zahlen sind die Hinterlegungsnummern der Mikroorganismen beim Institute for Fermentation, Osaka, Japan. Die quantitativen Bestimmungen von RNA wurden nach der bereits genannten Methode von G. Schmidt und S. Thannhauser durchgeführt.

Die Isolierung der RNA aus der gezüchteten Hefe erfolgt nach üblichen Verfahren.

In den folgenden Beispielen verhalten sich Gewichtsteile zu Raumteilen wie Gramm zu Kubikzentimeter.

Beispiel 1

Candida lipolytica IFO 1657 wurde in üblicher Weise mit N-Methyl-N'-Nitro-N-nitrosoguanidin behandelt. Die Mutanten wurden nach der oben beschriebenen Replica-Plattierungsmethode ausgewählt. Der hierbei ausgewählte Mutant L-42 (IFO 1648) wurde nach der Methode, die vorstehend für die Bestimmung der Kaliumchloridempfindlichkeit beschrieben wurde, kultiviert. Die Extinktion der erhaltenen Kultur wurde gemessen. Sie betrug 0,020. Die Hefe Candida lipolytica IFO 1657, die in der gleichen Weise kultiviert wurde, hatte eine Extinktion von 0,188. Dann wurden Hefezellen von einer Schrägkultur des Stamms L-42 entnommen und in einen Fermenter geimpft, der 125 Raumteile des nachstehend beschriebenen Mediums S enthielt. Die Kultivierung wurde 24 Stunden bei 28° C durchgeführt. 20 Raumteile der erhaltenen Kultur

Tabelle 1

wurden in einen F;rmenter überführt, der 1000 Raumteile eines Mediums enthielt, das aus dem nachstehend beschriebenen Grundmedium M bestand, das durch verschiedene Kohlenstoffquellen, die in Tabelle 1 genannt sind, ergänzt war. In diesem Medium wurde der Mikroorganismus bei einer Temperatur von 28⁰C und einer Geschwindigkeit des Rührers von 1500 UpM unter Einleitung 1500 Raumteilen Luft/Minute gezüchtet. Während dieser Zeit wurde eine 25%ige wäßrige Ammoniaklösung automatisch so zugeführt, daß der pH-Wert des Mediums bei etwa 4,5 blieb. Getrennt hiervon wurden Zellen der Hefe Candida lipolytica IFO 1657 von einer Schrägkultur in der gleichen Weise entnommen und auf die vorstehend beschriebene Weise gezüchtet.

Die erzeugte Hefe und der RNA-Gehalt der Biomasse in jeder der vorstehend genannten Kulturen wurden ermittelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 genannt.

Die Isolierung der RNA von der in der beschriebenen Weise erzeugten, an RNA reichen Hefe kann nach üblichen Vei fahren erfolgen. Typisch ist das folgende Verfahren: 100 Gew.-Teile der Biomassen wurden in 1000 Raumteiler! einer 10%igen Ammoniumsultatlösung suspendiert. Die Suspension wurde 4 Stunden bei 90⁰C gehalten, um die RNA zu extrahieren. Nach der Abkühlung wurde das System zentrifugiert. Der Überstand wurde durch Zusatz von Salzsäure auf pH 2,0 eingestellt. Die hieroei ausgefällte rohe RNA wurde durch Zentrifugieren abgetrennt, mit 60%igem Äthanol gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Hierbei wurden 10,4 Gew.-Teile rohes RNA-Pulver erhalten.

KohlenstolTquelle	Candida lipolytica	Trockengewicht	RNA-	Candida lipolytica	Trockengewicht	RNA-
(Konzentration)		der Biomasse,	Gehalt,	IFO 1648 (Mutant)	der Biomasse,	Gehalt,
	IPO 1657 (Ursprungsstamm)	g/l	^%	Kiiltivierungs-	8/1	%
	Kultivie	10,0	10,0	rungszeit,	9,1	17,4
	rungszeit,	6,7	9,6	Std.	6,3	17,0
Glycerin (2%)	Std.	4,6	9,3	18	4,4	17,8
Äthanol (1%)	16	18,5	8,0	16	16,3	15,0
Essigsäure (1%)	16	21,0	9,1	18	18,1	17,5
Sojabohnenöl (2%)	18			22
n-Paraffin (2%)	20			22
(handelsübliches	20
Gemisch, C₁₂-C₁₈)

Medium S: 4,0%Glucose,l,5%(NH4)₂SO4,0,9%KH2PO4,0^%K2HPO4,03%MgSO4.7H₂O,0,003%FeSO4.7H₂O,0,3%Hefeextrakt,

0.3% Maisquellwasser. 0,5% CaC03 und 0,01% Schaumveihütungsmittel „Aciocol". Medium M: 0,3% 80%ige Phosphorsäure, 0,15% KCl, 0,1% MgSO₄. 7 H₂0,0,003% FeSO₄. 7 H₂O, 0,01% CaCl₂. 2 H₂O, 0,1% NaCl, 0,3% Hefeextrakt, 0,3% Maisquellwasser und 0,01% Schaumverhütungsmittel „Actocol".

Beispiel 2

Eine Schrägkultur des aus Candida lipolytica IFO 1657 gewonnenen, für Kaliumchlorid empfindlichen Mutanten L-42, IFO 1648, wurde zur Impfung des ersten Impf-Fermenters verwendet, der 500 Raumteile des Mediums S (siehe Beispiel 1) enthielt, und 24 Stunden bei 28° C unter Schütteln kultiviert Die gesamte Menge der erhaltenen Kultur wurde zur Impfung des zweiten Impf-Fermenters verwendet, der 25 000 Raumteile des Mediums S enthielt und 24 Stunden bei 28°C kultiviert wurde. 2000 Raumteile des hierbei erhaltenen Kulturmediums wurden in einen Hauptfennenter fiberführt, der 100 000 Raumteile eines Mediums enthielt, das aus dem in Beispiel 1 genannten Grundmedium M bestand, das durch 13% (Gew/Vol.) n-Hexadecan ergänzt war. Die Kultivierung wurde etwa 24 Stunden bei 22° C unter Belüftung durchgeführt Während der gesamten Zeit wurde 25%iges wäßriges Ammoniak automatisch so zugeführt, daß der pH-Wert des Mediums bei etwa 4,5 gehalten wurde. Getrennt hiervon wurde Candida lipolytica IFO1657 in genau der gleichen Weise kultiviert Die Menge der Biomasse und der RNA-Gehalt der beiden Kulturmedien wurden auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise ermittelt Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 genannt

230244/125

ίο

Tabelle 2

Kultivierungsdauer. Std.

U rsprungsstam m

Trockengewicht
der Biomasse

RNA-Gehalt Stamm L^2

Trockengewicht
der Biomasse

RNA-Gehall

18	10,0 g/l	11,4%	5,6 g/l	17,6°/
20	15,5 g/l	9,9%	8,9 g/l	17,5°/
22	-	-	12,7 g/l	17,9°/!
24	-	-	14,9 g/l	17,8°/

Das n-Hexadecan im Medium war beim Ursprungsstamm innerhalb von 20 Stunden und im Falle des Stamms L-42 innerhalb von 24 Stunden verbraucht.

Beispiel 3

Ein Stamm von Candida tropicalis. NH-20 IFO 1649, der von einer Bodenprobe aus dem Außengebiet von Nara, Japan, isoliert worden war, und der als Standardstamm (Typkultur) dieser Spezies bekannte Stamm IFO 1400 wurden getrennt kultiviert. Die Extinktion jeder Kultur wurde nach der oben beschrie-

Tabelle 3

2Ü benen Methode zur Ermittlung der Empfindlichkeit für Kaliumchlorid gemessen. Die Extinktion betrug 0,025 für den erstgenannten Stamm und 0,166 für den letztgenannten Stamm. Dann wurden die beiden Siämrne auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise kultiviert, wobei jedoch die Kultivierungstemperatur bei dem mit verschiedenen Kohlenstoffquellen ergänzten Grundmedium M 22°C betrug. Die Menge der erzeugten Biomasse und der Gehalt an intrazellulärer RNA bei diesen Biomassen sind in Tabelle 3 genannt.

Kohlenstofiquelle	Candida tropicalis	Trockengewicht	RNA-	Candida tropicalis	Trockengewicht	RNA-
(Konzentration)	IFO 1649	der Biomasse,	Gehalt,	IFO 1400	der Biomasse,	Gehalt,
	Kultivie-	g/l	%	Kultivie	g/l	%
	ruiigsdauer.	4,4	16,2	rungsdauer,	4,2	9,8
	Std.	9,0	16,9	Std.	8.4	9.6
Essigsäure (1%)	18	20,0	16,7	18	21,1	9,3
Glycerin (2%)	18			18
n-Paraffin (2%)	22		22
(Cu-Cig-Gemisch)

40

Beispiel 4

Die Hefe Candida albicans IFO 1650, die aus einer Bodenprobe aus dem Randgebiet von Osaka isoliert worden war, und Candida guilliermondii IFO 1651 sowie die Standardstämme (Typkulturen) dieser Spezies, nämlich Candida albicans IFO 1060 und Candida 45 Tabelle4 guilliermondii IFO 0566 wurden getrennt kultiviert Die Extinktionen der erhaltenen Kulturmedien wurden nach der Methode gemessen, die oben im Zusammenhang mit der Erklärung der Ermittlung der Kaliumchloridempfindlichkeit beschrieben wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 genannt

Anschließend wurden diese Stämme auf die in Beispiel 3 beschriebene Weise kultiviert. Die Menge der Zellen und der Gehalt an intrazellulärer RNA in den erhaltenen Kulturmedien wurden ermittelt Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 genannt.

Candida albicans IFO 1650
Candida guilliermondii IFO 1651
Candida albicans IF01060
Candida guilliermondii IFO 0566

Extinktion

0,045

0,030

0,125

0,150

Tabelle 5

Kohlenstoflquelle	Teststamm	Kultivie	Trockengewicht	RNA-Gehalt
(Konzentration)		rungszeit,	der Biomasse,	%
		Std.	g/l
Essigsäure (1%)	Candida albicans EFO 1650	20	4,0	15,3
	Candida albicans IFO 1060	20	4,3	8,3
	Candida guilliermondii IFO1651	18	4,4	15,5
	Candida guilliermondii IFO 0566	18	3,9	7,7
n-Paraffin (2%)	Candida albicans IFO 1650	26	16,9	15,8
(Cß-Cig-Gemisch)	Candida albicans DFO 1060	26	16,0	7,8
	Candida guilliermondii IFO1651	22	18,3	15,4
	Candida guilliermondii IFO 0566	22	18,9	8,5

Beispiel 5

Die Hefen Candida intermedia IFO 0761, Candida krusei IFO 0592, Candida parapsilosis IFO 0708, Candida robusta IFO 1000 und Candida stellatoidea IFO wurden getrennt mit N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin behandelt. Die Mutanten wurden nach der oben beschriebenen Replica-Plattierungsmethode ausgewählt. Die ausgewählten Mutantenstämme Candida intermedica 1-330 (IFO 1652), Candida krusei K-109 (IFO 1653), Candida parapsilosis P-74 (IFO 1654), Candida robusta R-115 (IFO 1655) und Candida stellatoidea S-541 (IFO 1656) wurden getrennt kultiviert. Die Extinktionen der erhaltenen Kulturmedien wurden nach der Methode, die im Zusammenhang mit der Bestimmung der Kaliumchloridempfindlichkeit beschrieben wurde, ermittelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 genannt. Zum Vergleich wurden die Ursprungsstämme in der gleichen Weise kultiviert. Die Extinktionen der erhaltenen Kulturmedien wurden in der gleichen Weise ermittelt. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 6 genannt.

Tabelle 7

112

Tabelle 6

Teststamm

Extinktion

Candida intermedia IFO 0761 0,115

Candida intermedia 1-330 IFO 1652 0,040

Candida krusei IFO 0592 0,220

Candida krusei K-109 IFO 1653 0,030

Candida parapsilosis IFO 0708 0,230

Candida parapsilosis P-74 IFO 1654 0,015

Candida robusta IFO 1000 0,180

Candida robusta R-115 IFO 1655 0,040

Candida stellatoidea IFO 1399 0,125

Candida stellatoidea S-541 IFO 1656 0,030

Dann wurden diese Stämme und zum Vergleich ihre Ursprungsstämme getrennt auf die in Beispiel 3 beschriebene Weise kultiviert, wobei Essigsäure und η-Paraffin als Kohlenstofl'quellen verwendet wurden. Die Menge der Biomasse und der Gehalt an intrazellulärer RNA in der Biomasse wurden gemessen. Die Ergebnirse sind in den Tabellen 7 und 8 genannt.

Teststamm

Kultivierungszeit, Std.

Trockengewicht
der Biomasse, g/l

RNA-Gehalt,

Candida intermedia IFO 0761
Candida intermedia 1-330 IFO 1652
Candida krusei IFO 0592
Candida krusei K-109 IFO 1653
Candida parapsilosis IFO 0708
Candida parapsilosis P-74 IFO 1654
Candida robusta IFO 1000
Candida robusta R-115 IFO 1655
Candida steiladoidea IFO 1399
Candida stelladoidea S-541 IFO 1656

KohlenstofTquelle : Essigsäure in einer Konzentration von 1,0% Tabelle 8

20	3,9	7,8
20	4,0	15,0
18	4,5	6,7
18	4,1	15,7
20	4,2	7,2
20	4.2	15.2
20	3,7	8,1
20	3,6	16,0
20	4,5	7,2
20	4.4	15,5

Teststamm

Kultivierungszeit. Std.

Trockengewicht
der Biomasse, g/l

RNA-Gehalt,

Candida intermedia IFO 0761
Candida intermedia 1-330 IFO 1652
Candida krusei IFO 0592
Candida krusei K-109 IFO 1653
Candida parapsilosis IFO 0708
Candida parapsilosis P-74 IFO 1654
Candida robusta IFO 1000
Candida robusta R-115 IFO 1655
Candida stelladoidea IFO 1399
Candida stelladoidea S-541 IFO 1656

Kohlenstoffquelle: η-Paraffin (C₁₂-C₁₈-Gemisch, Konzentration 2%).

25	14.0	7,9
26	13,5	15,2
22	17,9	7,7
22	16,5	15,0
24	17,8	8,3
26	18.0	15.1
26	15,3	7,9
26	15,4	15,9
22	18,3	6,4
22	17,0	15,5

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von Ribonucleinsäure durch Züchten einer Hefe, die wenigstens eine Kohlenstoffquelle aus der aus Kohlenwasserstoffen, Fettsäuren, Alkoholen, Ölen und Fetten bestehenden Gruppe zu assimilieren vermag, in einem Medium, das wenigstens eine dieser assimilierbaren Kohlenstoffquellen als hauptsächliche Kohlenstoffquelle enthält, und Isolieren der gebildeten Ribonucleinsäure, dadurch gekennzeichnet, daß man als Hefe Candida lipolytica IFO 1648, Candida tropicalis IFO 1649, Candida albicans IFO 1650, Candida guilliermondii IFO 1651, Candida intermedia IFO 1652, Candida krusei IFO 1653, Candida parapsilosis IFO 1654. Candida robusta IFO 1655 oder Candida stellatoidea IFO 1656 züchtet.