DE2358496A1 - Verfahren zur herstellung von l-serin - Google Patents

Description

Priorität: 24. November 1972, Nr. 117836/1972, Japan

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Serin , speziell ein Verfahren zur L-Serin-Hersteilung aus Glycin durch mikrobieile Gärung oder enzymatische Reaktion unter Verwendung von Mikrobenzellen als Enzyniquelle. -

I-Serin wird als Aminosäure, die für Ratten nicht, essentiell ist, eingestuft; es hat jedoch Verwendung als Nahrungsmittelzusatz, als Ausgangsmaterial für Kosmetika und in der Medizin Verwendung gefunden. Als Methoden zur Herstellung von L-Serin mit Hilfe von Mikroorganismen wurden Verfahren bekannt, nach denen L-Serin aus Glycerinsäure mit Hilfe eines aus Mikroorganismen erhaltenen Enzyms hergestellt werden kann (veröffentlichte japanische Patentanmeldung 17728/67) und ein Verfahren, nach dem L-Serin aus Glycin mit Hilfe eines fermentativen Verfahrens hergestellt werden kann (US-PS 3 623 952). '

Der Erfindung, liegt demgegenüber die Aufgabe zugrunde, L-Serin in einfacherer und wirtschaftlicherer V/eise herzustellen, als es bisher möglich war.

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Es konnte festgestellt werden, daß Mutanten des Genus Corynebacterium, die einen Nährstoffbedarf aufweisen, befähigt sind, größere Mengen an L-Serin aus Glycin zu bilden, als die Elternstämme, denen ein Nährstoffbedarf fehlt, wie sie in der US-PS 3 623 952 beschrieben werden. Es war bisher nicht bekannt, daß I-Serin durch einen Mikroorganismus mit einem gewissen Nährstoffbedarf gebildet werden kann und daß die Fähigkeit eines bekannten L-Serin-Bildners verbessert wird, wenn ihm gegenüber den Slternstämmen ein gewisser Nährstoffbedarf verliehen wird.

Die vorstehend angegebene Aufgabe wird erfindungsgemäß mit Hilfe von künstlich hervorgerufenen Mutanten des G-enus Corynebaeterium gelöst, die mindestens einen der Nährstoffe Leucin, Isoleucin, Methionin, Tryptophan, Serin oder Glycin benötigen und verbesserte Fähigkeit zur Bildung von L-Serin aus Glycin zeigen, insbesondere mit Hilfe von Mikroorganismen der Spezies Corynebaeterium glycinophilum.

Repräsentative Mikroorganismen, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, sind Corynebaeterium glycinophilum PERLiP 1685 (Mutante mit Leucinbedarf), Corynebaeterium glycinophilum FERMP 1686 (Mutante mit Tryptophanbedarf), Corynebaeterium glycinophilum FERMP 1687 (Mutante mit Leucin- und Methioninbedarf), Corynebaeterium glycinophilum FERMP 1688 (Mutante mit Leucin- und Isoleucinbedarf) und Corynebaeterium glycinophilum FERMP 1689 (Mutante mit Leucin- und Serinbedarf oder Leucin- und GIycinbedarf), die sich alle von Corynebaeterium glyciophilum ATCC 21341 ableiten.

Die vorstehend angegebenen 5 Stämme, die FERMP-Hinterlegungsnummern haben, wurden bei dem Fermentation Research Institute Agency of Industrial Science of Technology, the Ministry of the Industrial Trade and Industry, Japan, hinterlegt und sind bei der Hinterlegungsstelle frei erhältlich.

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Die für das erfindungsgemäße Verfahren geeigneten Mutantenstämme können mit Hilfe bekannter Selektionsmethoden, wie der Stempel-Methode (replica-plating-Methode) und anschließende Prüfung ihrer 1-Serin-Bildungsfähigkeit, aus künstlich induzierten Mutanten, die "beispielsweise durch Behandeln, der Zellen des Elternstammes mit 0,1 m Diäthylsulfafbei 30⁰C während 20 Stunden unter Schütteln erhalten wurden, hergestellt werden.

Corynebäcteriuni glycinophilum AiECC 21341 zeigt folgende taxonomische Eigenschaften: -

1 .--Vegetative Zellen:

Kurze, gewöhnlich einfache oder doppelte Stäbchen, varlieren-■ de-Form, Größe 0,6 bis 0,8 χ 1,0 bis 3,0 Mikron-aus Agar-Mhrboden "bei 30 -C während 24, Stünden, nicht beweglich, keine Spu- * renbildung, Grämr-positiv , nicht säurefest.

2. Agar-Kolonien: ' ■ ' Kreisförmig, glatt, einheitlich, konvex erhöht, opak, gräulichweiß, Medium unverändert. ■

3« Gelatine-Kolonien: · - - - ■ ■

Kreisförmig, konvex erhöht, einheitlich, keine Verflüssigung, glatt, opak.

4. Agar-Ausstrich:

Mäßiges Wachstum, fadenförmig, glänzend, gräulich-weiß-butterähnlich, Medium unverändert.

5. Nährbrühe:

■Kein Wachstum an der Oberfläche, trüb, flockiges Sediment, Menge des Sediments ist gering. '. - '

6. Temperatureinfluß: . -

Wachstum bei -20 bis-37⁰C, kein Wachstum bei 42⁰C '7. Physiologische Eigenschaften: ■

1 .·) BCP-MiIch: unverändert bis leicht alkalisch. 2.) MR-Test: negativ

3.) Voges-Proscauer-Reaktion: negativ - . "■"-■" 4.) Indolbildung: negativ · ■

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5.) Nitratreduktion: positiv
6.) Verflüssigung von Gelatine: negativ 7.) Hydrolyse von Stärke: negativ
8.) Gitratverbrauch: verbraucht citrat

9.) Keine SäureMldung und Gasbildung aus Arabinose, Xylose, Glucose, Mannose, Fructose, Galactose, Lactose, Maltose, Saccharose, Trehalose, Raffinose, Sorbit, Inosit, Glycerin, Salicin, (X-Methylglycosid, Inulin, Dextrin, Stärke und Cellulose (Pepton —Medium).

10.) Bei aerober Züchtung tritt geringe Säurebildung aus Glucose, jedoch keine Gasbildung·aus Glucose ein. Keine Säure- und Gasbildung unter anaeroben Bedingungen nach der Methode von Hugh und leifson.
11.) Katalase: positiv
12.) Aerob
13.) Wachstum auf einem aus Nährbrühe bestehenden Medium, dem

6 io Glycin zugesetzt ist.
8. Ausgangsmaterial:

Paule Früchte. . . - .

In Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 7. Auflage, kann keine Mikroorganismenspezies festgestellt werden, die als gleiche Spezies wie der erfindungsgemäß aufgefundene Mikroorganismus identifiziert werden kann. Der erfindungsgemäß verwendete Stamm ist daher als Mikroorganismus anzusehen, der einer neuen. Spezies angehört und wurde als Corynebacterium glycinophilum bezeichnet.

Das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Bildung von L-Serin verwendete Kulturmedium kann ein völlig übliches Medium sein. Es muß eine assimilierbare Kohlenstoffquelie, eine assimilierbare Stickstoffquelle, wachstumsfördernde Substanzen, spezifische .Nährstoffe, die für die erfindungsgemäß verwendeten Mutanten erforderlich sind, und anorganische Substanzen enthalten.

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. — 5 -

Die zur Verwendung für die Zwecke der Erfindung geeigneten Kohlenstoffquellen sind Glucose, Saccharose, Maltose, Fructose, Stärkehydrolysate und Melassen. Auch organische Säuren, wie Essigsäure, Propionsäure und Zitronensäure, Alkohole, wie Äthanol, und organische Verbindungen, wie Benzoesäure werden erfindungsgemäß als Kohlenstoffquellen verwendet.

Eine Stickstoffquelle kann durch Ammoniumsalze von anorganischen Säuren, wie Amraoniumsulfat und Ammoniumchlorid, oder durch Ammoniak in wäßriger Lösung oder- in Gasform eingeführt werden. Organische Verbindungen, wie Aminosäuren, Harnstoff oder Proteinhydrolysate können ebenfalls verwendet werden. Als anorganische Substanz können Phosphate, Cälciunisalze, Magnesiumsalze, Eisensalze, Mangansalze und weitere übliche Verbindungen zugesetzt werden. Zu wachstumsfördernden Mitteln und anderen Nährstoffen, welche die Ausbeute und die Bildungsrate von L-Serin verbessern, gehören Aminosäuren, verschiedene Vitamine, Sojabohnen-Proteinhydrolysat, Hefeextrakt, Maisquellflüssigkeit, Pepton und Kaseinhydrolysat. Die für die erfindungsgemäß verwendeten Stämme erforderlichen Nährstoffe werden natürlich dem Nährmedium zugesetzt, sofern nicht diese Nährstoffe bereits in den im Medium vorliegenden Bestandteilen enthalten sind. Im letzteren Fall ist es nicht erforderlich, diese Nährstoffe speziell dem Medium außerdem zuzusetzen. - '"■-■■

Das dem Medium zuzugebende Glycin kann in Form eines Glycin enthaltenden Materials oder auch als reines Glycin, das durch synthetische Methoden hergestellt wurde, zugesetzt werden. Für das Fermentationsverfahren beträgt seine Konzentration iri dem Kulturmedium vorteilhaft 0,5 bis 4»0 Gew.-%. Der Zeitpunkt der Zugabe des Glycins zu dem Medium kann so gewählt werden, daß die Gesamtmenge

oder dem Medium vor dem Beimpfen mit dem Mikroorganismus/der zu Beginn der Fermentation, zugesetzt wird. Es kann außerdem zum Teil dem Medium zu Beginn der Fermentation zugesetzt werden und der restliche Anteil kann während der Fermentation zugegeben werden. Für das enzymatische Verfahren ist es vorteilhaft, die Glycinkonzen-

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tration in der Reaktionslösung auf 0,5 bis 5,0 Gew.-$ einzustellen.

Die Fermentation wird vorzugsweise unter aeroben Bedingungen durch Schütteln oder Belüftung oder unter Bewegen des Mediums durchgeführt, d.h., das Nährmedium kann durch Schütteln, Rühren oder Durchleiten von luft durch das Medium mit Sauerstoff in Berührung gebracht werden. Zum Erzielen bester Ergebnisse sollte der pH-Wert des Kulturmeditims auf 5,0 bis 9,0 eingestellt werden. Wenn daher der pH-Wert des Mediums die Neigung zeigt, auf Werte oberhalb 9,0 anzusteigen, wird bevorzugt, ihn mit Hilfe eines Neutralisationsmittels, wie Chlorwasserstoff oder Schwefelsäure, auf einen Wert innerhalb des bevorzugten Bereiches einzustellen. Wenn dagegen der pH-Wert des Mediums die Neigung zeigt, auf Werte unter 5,0 zu fallen, wird ebenfalls bevorzugt, ihn mit Hilfe von Neutralisationsmitteln, wie Calciumcarbqnat, Ammoniak, Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid, einzustellen..

Die Suchtungstemperatur beträgt 24 bis 37⁰C. Gewöhnlich wird die Fermentation während 2 bis 5 Tagen durchgeführt.

Das enzymatische Verfahren wird vorzugsweise durchgeführt, indem die Mikrobenzellen in einer Reaktionslösung während 5 Stunden bis 48 Stunden mit Glycin in Berührung gehalten werden. Die Reaktionstemperatur beträgt 25 bis 40⁰C und der pH-V/ert der Reaktionslösung sollte im Bereich von 5,0 bis .9,0 eingestellt werden. Die verwendeten Mikrobenzellen sind die Enzymquelle für die Reaktion zur Bildung von I-Serin aus Glycin und v/erden durch Gewinnen von Zellen aus einer Kulturbrühe erhalten, nachdem die Züchtung der erfindungsgemäß verwendeten Stämme unter nahezu den gleichen Bedingungen, wie sie für die fermentative Methode gezeigt wurden, durchgeführt wurde.

Die Gewinnung des in der Fermentationsbrühe angereicherten L-Serins ist sehr einfach, weil die Anreicherung anderer Aminosäuren in der Brühe ziemlich gering ist, und kann nach bekannten Metho-

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den erfolgen. Die Bakterienzellen können durch Filtration oder. Zentrifugieren aus der Kulturbrühe oder der Reaktionslösung entfernt ,werden und !-Serin kann unter Verwendung eines Kationenaustauscherharzes in der Η-Form in Verbindung mit einem Eindampfvorgang unter vermindertem Druck und einem Fällungsvorgang, wie in den Beispielen gezeigt wird, gewonnen werden.

Das erfindungsgemäß, hergestellte Produkt wird mit Hilfe des Rf-Werts durch Papierchromatografie als 1-Serin identifiziert und die biologische Bestimmung des in der Brühe angereicherten Produkts erfolgt durch mikrobiologische Analyse unter Verwendung von Leuc'onostoc mesenteroides. · ■ ■ .

Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele näher er- _■ läutert. In diesen Beispielen bedeuten alle Prozentangaben Gewichtsprozent. _-...-

Beispiel 1 ■ -■ . . ■ ·

Ein wäßriges Kulturmedium, das 5 $ Glucose, 0,2 $ (NH₄)PSO,, -0,3 1o NH₄NO₃, "0,1 % KH₂PO₄, 0,05 f MgSO₄.7H₂O, 0,2 mg/1 Bio- . tin,- 1 mg/r Thiamin.HCi, 1 mg/1 Nikotinamid, 1 mg/1 Pyridoxal·HGl, 1 mg/1 Folsäure, 2 mg/1 Riboflavin, T'mg/l· Calciumpanthotenat, 0,2 mg/1 Pyridoxin, 1 mg/1 ParäaminObenzosäure, 0,05 i° DL-Methionin, 0,05 ίο L-Glutaminsäure, 0,05 i° I-Valin, 2 ^Glycin und den in Tabelle 1 gezeigten für jeden Stamm erforderlichen Nährstoff enthielt, wurde hergestellt und auf einen pH-Wert;,von 6,5 eingestellt. 20 ml-Änteile der Lösung wurden in 500 ml-Schüttelkolben gegeben und 5 Minuten mit Hilfe von Dampf von HO⁰C sterilisiert.

Die wäßrigen Medien wurden mit den 5 Stämmen von Gorynebäcteriun; glycinophilum und ihrem Elternstamm ATCC 2134-1 angeimpft, die in Tabelle 1 gezeigt sind. Diese Stämme waren vorher auf Bouillon-Schrägägar'40 Stunden bei 30⁰C gezüchtet worden."

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Nach 72-stündiger Züchtung unter Schütteln bei 31⁰C waren in jeder Kulturbrühe die in Tabelle 1 gezeigten Mengen an L-Serin angereichert worden.

Verwe η d e t e S tamme

!Tabelle 1

Zugesetzte Nährstoffe, Menge

angereichertes !-Serin (g/l) .

Corynebacterium glycin ophi Ium FERMP 1685

L-Leucin (0,03

10,6

FERMP	1686	!-Tryptophan	(0	,02 fo	9,7
FERMP	1687	1-leucin (0,	03	30	11,5
FERMP	1688	1-leucin (0,	03		10,2
		1-Isoleucin	(0,	03 #)
PERMP	1689	1-leucin (0,	03	JO	8,9
ATCC	21341	keiner			7,8

Die Mikrobenzellen wurden durch Filtration aus einem liter der Kulturbrühe von Corynebacterium glycinophilum I¹ERMP 1687 durch Filtration entfernt und die sellfreie lösung wurde auf einen pH-Wert von 1,0 bis 2,0 eingestellt und über ein IonehauBtauscherharz-(Dowex .5O-X4). geleitet. Das Harz wurde mit 1 1 Wasser und 0,025 η Chlorwasserstoffsäure gewaschen und die I-Serin-Fraktion wurde mit Hilfe von 0,2 η Chlorwasserstoffsäure eluiert. Das Eluat wurde unter vermindertem Druck eingedampft und. rohes kristallines !-Serin wurde durch Zugabe von kaltem Alkohol aus dem Konzentrat ausgefällt. 5,8g reines !-Serin wurden durch Umki'istallisieren gewonnen.

Beispiel 2

Ein wäßriges Kulturmedium, das 10 j£ Glucose, 0,2 % ^₂

0,3 # NH₄NO₅, 0,05 % MgSO₄·7H₂O, 0,1 Jß KH₂PO₄, 0,2 mg/1 Biotin,

1 mg/1 Thiamin«HCl, 2,5 mg/1 Nikotinamid, 1 mg/1 Polsäure, 0,3

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DL-Methionih, 0,06 ^ L-Leucin,1 % Sojabohnenproteinhydralysat (Gesamtstickstoffgehalt 2,4 #) und 3 # Glycin (gesondert sterilisiert) enthielt, wurde hergestellt und auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt. 300 ml-Proben der Lösung wurden in 1-Liter-Fermentationsflaschen gegeben.

Die wäßrigen Medien würden mit Corynebacterium glycinophilum FERMP 1687"beimpft, das vorher auf Bouillon-Schragägar 40 Stunden bei 30⁰C gezüchtet worden war. Die Züchtung wurde, bei 34⁰C unter Belüften mit 1/2 YolumteiL Luft pro Minute durchgeführt und der pH-Wert wurde mit wäßrigem Ammoniak bei 6,5 gerhalten,

Uach 56-stündiger Züchtung wurden 15»9 g/l L-Serin in der Brühe festgestellt. 4,4 g kristallines L-Serin wurden in gleicher Weise wie in Beispiel' 1 erhalten.

-Beispiel 3 . -

Mikrobenzellen jeder Kulturbrühe der 6 Stämme, die nach 48-iger Züchtung;in gleicher Weise wie in Beispiel 1 erhalten wurden, wurden durch Zentrifugieren gewonnen. Die Mikrobenzellen wurden mit einer Reaktionslösung der nachstehend angegebenen Zusammensetzung gewaschen, und danach in je 20 ml der Reaktionslösung gegeben. In dem Gemisch hatte die Konzentration der Mikrobenzellen die in Tabelle 2 gezeigten Werte.'

Die Reaktion wurde während 24 Stunden unter Schütteln bei 37⁰C durchgeführt. Die in jedem Reäktionsgefflisch gebildete Menge an L-Serin ist in Tabelle 2 gezeigt.

Zusammense. t zung de£ ,ReaktipnslBsung:; Köhlenstoffquelle (gemäß tabelle 2) 2 $ Glycin 2 f>

KH₉PO. , 0* 1 SS"

2 4 ·

MgSO. * 7HpO .- Ö|04 fo

Nikötinamid . ,' 2,5 mg/1

. 1 mg/1

(pH 7,5)

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Tabelle 2

Verwendeter Stamm Konzentration d. Kohlenstoff- gebildetes

Mikrobenzellen quelle I-Serin· (OD 562)* (g/l)

Coryne. glycinophi-	■	Glucose	3,0
lum EERMP 1685 Il	0,64	Essigsäure	1,6
HBRMP 1686	0,68	Glucose	3,6
Il		Essigsäure	1,3
FERMP 1687	0,67	Glucose	4,3
Il		Essigsäure	2,1
FERMP 1688	0,65	Glucose	3,3
		Essigsäure	1,5
FERMP 1689	0,67	Glucose	2,9
- Il		Essigsäure	1,4
ATCC 21341	0,66	Glucose	2,5
		Essigsäure	1,0
* OD 562: Diese Anee	ibe bedeutet	die optische	Dichte bei

562 mu. Die Konzentration der Mikrobenzellen zu Beginn der Reaktion wurde durch lichtabsorption bei 562 mu jeder Kulturbrühe, verdünnt mit 25 Volumteilen V/asser, gemessen.

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Claims (2)

1. PATE NTAN SP RÜCHE

   P]) Verfahren zur Her st ellung, von L-Serin mit Hilfe eines Serin, bildenden Mikroorganismus von Gorynebacterium glycinophilum, dadurch gekennzeic h-n e t , daß man einen Stamm von Corynebacterium glyeinophilum mit einem Nährstoffbedarf mindestens eines der Nährstoffe leucin, Isoleucin, Methionin, Tryptophan, Serin und Glycin verwendet und

   a) in einer Fermentationsniethode den Mikroorganismus

   bei pH 5 bis 9 in einem Kulturmedium, das eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, eine assimilierbare Stickstoff quelle, anorganische Salze, für das Wachstum erforderliche organische Spurennährstoffe und G-Iyein in einer Menge von 0,5 bis 4',Gew.-# des Kulturmediums enthält, so lange züchtet, bis L-Serin in dem Medium angereichert'ist, oder

   b) in einer enzymatischen Methode.Mikrobenzellen, die durch Züchten des Mikroorganismus in einem Kulturmedium, das eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, eine assimilierbare Stickstoffquelle, anorganische Salze und.für das Wachstum erforderliche organische Spurennährstoffe enthält, hergestellt wurden, mit einer Reaktionslösung vermischt, die Glycin in einer Menge von 0,5 bis 5 Gew.-?b, bezogen auf das Gewicht der lösung enthält und einen pH-Wert von 5 bis 9 aufweist, .-.-■.

   und das gebildete Ir-Serin gewinnt.

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2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Serin bildender Mikroorganismus Corynebacterium glycinophilum FERMP 1685, FERMP 1686, FERMP 1687, FERMP 1688 oder FERMP 1689 verwendet wird.

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