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DE2358312A1 - Verfahren zur gewinnung diploider staemme candida lipolytica und verwendung dieser staemme zur herstellung von alphaketo-glutarsaeure durch fermentation - Google Patents

Verfahren zur gewinnung diploider staemme candida lipolytica und verwendung dieser staemme zur herstellung von alphaketo-glutarsaeure durch fermentation

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Publication number
DE2358312A1
DE2358312A1 DE2358312A DE2358312A DE2358312A1 DE 2358312 A1 DE2358312 A1 DE 2358312A1 DE 2358312 A DE2358312 A DE 2358312A DE 2358312 A DE2358312 A DE 2358312A DE 2358312 A1 DE2358312 A1 DE 2358312A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
strains
assimilable
glutaric acid
nutrient medium
substrate
Prior art date
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Withdrawn
Application number
DE2358312A
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English (en)
Inventor
Daniel Binet
Jean-Pierre Desmarquest
Claude Gaillardin
Paul Maldonado
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
ERAP
IFP Energies Nouvelles IFPEN
Original Assignee
ERAP
IFP Energies Nouvelles IFPEN
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Filing date
Publication date
Application filed by ERAP, IFP Energies Nouvelles IFPEN filed Critical ERAP
Publication of DE2358312A1 publication Critical patent/DE2358312A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/44—Polycarboxylic acids
    • C12P7/50—Polycarboxylic acids having keto groups, e.g. 2-ketoglutaric acid
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/911—Microorganisms using fungi
    • Y10S435/921—Candida
    • Y10S435/923—Candida lipolytica

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  • Engineering & Computer Science (AREA)
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  • Chemical & Material Sciences (AREA)
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  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Anmelder: Entreprise de Recherches et d'Activites Petrolleres S.R.A.P. und
Institut Francais du Petröle, des Carburants et Lubrifiants
Verfahren zur Gewinnung diploider Stämme. Candida lipolytica und Verwendung dieser Stämme zur Herstellung von G\ -Keto-Glutarsäure durch Fermentation
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Gewinnung von neuen Hefestämmen und deren Verwendung zur Herstellung von CÄ -Keto-Glutarsäure durch Fermentation.
Die Verwendung von Hefen zum Fermentieren ist bekannt, sei es zur Gewinnung einer Biomasse für Nahrungsmittel, sei es zur Gewinnung, zusammen mit einer Biomasse, von Ausscheidungsprodukten, wie beispielsweise c/\ -Keto-Glutarsäure*
Die verschiedenen Fermentierverfahren verwenden als Wachstums-Substrat Kohlenhydrate oder aber auch Fettsäuren, Alkohole oder Kohlenwasserstoffe.
Für die verschiedenen Fermentierverfahren werden möglichst die besten Hefestämme ausgesucht. Diese werden aus Erd-
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oder Wasserproben isoliert und anschliessend verschiedenen Versuchen unterworfen, um gleichzeitig ihre Assimilationsfähigkeit für das gewählte Substrat, ihre Wachstumsgeschwindigkeit sowie ihre Fähigkeit zum Ausscheiden des gewählten Stoffwechselproduktes zu beurteilen..
Beim eingehenden Studium bestimmter Hefen, insbesondere diejenigen der Candida lipolytica-Gattung, deren Verwendung zum Fermentieren auf Kohlenwasserstoff-Substraten bereits beschrieben worden ist, wurde nach WICKERHAM und Kollegen (Science 167, 1141 (197O))die Möglichkeit genetischer Kombinationen zwischen haploiden Stämmen entgegengesetzter Vorzeichen festgestellt, Kombinationen, die zumindest vorübergehend die Bildung einer diploiden Stufe umfassen.
Im Gegensatz zu WICKERHAM und Kollegen, die ausschliesslich die Sporenbildung dieser Kombinationen beobachtet haben, die die Bildung haploider Abkömmlinge zur Folge haben, ist es erfindungsgemäss gelungen, diese Diploide zu isolieren und sie zu stabilisieren.
Aufgabe der Erfindung ist, ein Verfahren zur Gewinnung von stabilen Diploiden, ausgehend von verwandten haploiden Stämmen mit entgegengesetzten genetischen Vorzeichen, zu schaffen.
Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, dass in einer ersten Stufe getrennt zwei Stämme der Gattung Candida lipolyticä mit entgegengesetzten Vorzeichen, nämlich Haploide, auf einem an assimilierbarem kohlenstoffhaltigem Substrat reichen Nährboden gezüchtet werden, in einer zweiten Stufe, nach ausreichendem Wachstum der beiden Stämme, diese auf einen an assimilierbarem kohlenstoffhaltigem Substrat armen Nährboden gegeben werden und in einer dritten Stufe, nach Auftreten
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diploider Kolonien diese mit einem Mutagen stabilisiert werden.
Für die Kultur der haploiden oder diploiden Candida lipolytica-Stämme werden klassische Nährböden verwendet. Diese enthalten ein assimilierbares kohlenstoffhaltiges Substrat, das entweder ein Kohlenwasserstoff oder ein Gemisch aus Kohlenwasserstoffen, wie ein Kohlenhydrat, Melasse oder Zucker, beispielsweise Glucose, sein kann.
Die Nährböden enthalten auch eine Stickstoffquelle, gewöhnlieh ein Ammoniumsalz, und zwar ein Sulfat, Chlorid oder ein Nitrat. Dieses sind lediglich Beispiele und es können auch andere Stickstoff-Verbindungen verwendet werden. Ausserdem enthält der Nährboden auch eine wesentliche Menge Hefeextrakt oder getrocknete Hefen, d.h. eine Quelle von Nebenfaktoren, wie Vitamine, Mineralsalze oder Aminosäuren, die für das Wachstum der Stämme sehr vorteilhaft sind. Die Min-eralsalze sind üblicherweise Eisen-, Kupfer-, Magnesiumsalze und dergleichen.
Unter einem reich an kohlenstoffhaltigem Substrat Nährboden wird ein Nährboden verstanden, der mindestens 10 g/l assimilierbares kohlenstoffhaltiges Substrat enthält, während der arme Nährboden etwa 20-mal weniger des Substrats enthält als der reiche Nährboden. Die genannten relativen Werte sind Näherungswerte, je nach-dem wie die Konzentration des Substrats kontinuierlich variiert, während die Hefen die vorhandene Kohlenstoffquelle assimilieren. Bei einer bevorzugten Ausführungsform kann zu Beginn eine Konzentration an Substrat von 20 g/l verwendet werden, die während der Bildung der Hefen durch Verbrauch geringer wird.
Der arme Nährboden hat dann eine Substratkonzentration, die beispielsweise zwischen 2 und 0,5 g/1 variiert.
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Die beiden ersten Stufen des Verfahrens werden bei einer Temperatur im wesentlichen zwischen 5 und 35 C durchgeführt, die zur Begünstigung des Wachstums vorzugsweise zwischen 20 und 35° liegt. Die zweite Stufe wird indessen zweckraässig bei einer tieferen Temperatur durchgeführt als die erste Stufe. Die bevorzugten Temperaturbereiche liegen bei etwa 25 bis 35 C (erste Stufe) und 20 bis 25° C (zweite Stufe).
Der Nährboden weist in den beiden Stufen im allgemeinen einen leicht sauren pH-Wert, d.h. zwischen 2 und 7, vorzugsweise zwischen 5 und 7', auf. Wenn während der Reaktion der pH-Wert zu sauer wird, reicht es aus, die erforderliche Menge eines basischen Mittels, beispielsweise Kaliumhydroxyd, zuzugeben, um den ursprünglichen pH-Wert wieder einzustellen.
Die beiden ersten Stufen des Verfahrens können in einem flüssigen oder einem festen Nährboden durchgeführt werden. Die Zusammensetzungen des flüssigen und des festen Nährbodens sind ähnlich. Der einzige (wichtige) Unterschied besteht darin, dass beim festen Nährboden ein Verfestigungsmittel, wie beispielsweise das bakteriologische Hilfsmittel Bacto Agar Difco, zugegeben wird.
Während der dri-tten Stufe werden die Diploide durch Mutagenase stabilisiert. Diese kann durch ein chemisches Mutagen oder durch Energie, wie Bestrahlung erfolgen. Chemische Mutagene sind beispielsweise NMU (Nitrosomethylurethan) oder NMG (Nitrosomethylguanidin). Physikalische Mittel bzw. Energie-, einwirkungen sind beispielsweise Röntgenstrahlen oder Ultraviolettstrahlen.
Eine Variante des erfindungsgemässen Verfahrens besteht darin, dass am Ende der zweiten Stufe die Produkte der Kultur herausgenommen und in einen reichen Nährboden gegeben werden, wo-
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durch das Wachstum der vor dem Stabilisieren durch Mutagenase vorhandenen haploiden und diploiden Stämme erleichtert wird.
Diese Variante ermöglicht auch, die Sporenbildung der erhaltenen Diploide zu vermeiden- Eine andere Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens besteht darin, die Kolonien der diploiden Zellen vor dem Stabilisieren von den anderen Kolonien zu trennen, wodurch am Ende eine wesentliche zellulare Dichte an diploiden Candida lipolytica erhalten werden kann und sie bietet grosse Vorteile während deren Verwendung beim Fermentieren.
Die so gewonnenen Diploide weisen einen höheren Gehalt an ADN auf als die parentalen Stämme und sie haben einen grösseren Wuchs, was beim Sammeln der Zellen und ihrer Abtrennung aus dem Nährboden vorteilhaft sein kann.
Es wurde ebenfalls gefunden, dass die diploiden Stämme leistungsfähiger sind als die parentalen Stämme, und zwar sowohl hinsichtlich der Wachstumsgeschx^indigkeit als auch hinsichtlich der Fähigkeit des Ausscheidens der Produkte. Durch diese Diploide wird auch das Fermentieren verbessert, wobei nicht nur das Sammeln der Zellen aufgrund ihres■ grösseren Wuchses eingeschlossen ist, sondern auch die deutlich grössere Mengen des ausgeschiedenen Produktes gegenüber der mit haploiden Stämmen durchgeführten Fermentation.
Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zur Herstellung von C^-Keto-Glutarsäure durch Fermentieren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass in einen Nährboden, der mindestens einen Kohlenwasserstoff als assimilierbares, kohlenstoffhaltiges Substrat enthält, ein Diploid-Stamm eingebracht wird, der durch Kreuzung zweier Stämme der Gattung Candida lipolytica entgegengesetzter Vorzeichen,
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d.h. Haploide, gewonnen wurde, die nach dem Assimilieren des kohlenstoffhaltigen Substrats C{ -Keto-Glutarsäure ausscheidet.
Das beim Fermentieren verwendete assimilierbare, kohlenstoffhaltige Substrat kann, wie bei der oben beschriebenen Gewinnung der Diploide, zwischen den Kohlenhydraten und den Kohlenwasserstoffen gewählt werden. Ein Vorteil des erfindungsgemässen Verfahrens ist darin zu sehen, dass es möglich ist, den Stamm auf einem Kohlenwasserstoff-Substrat zu fermentieren. Dieses Substrat besteht vorzugsweise aus Paraffinkohlenwasserstoffen, beispielsweise ein n-Paraffin allein oder eine n-paraffinisehe Quelle. Obwohl die Verwendung eines einzigen n~Paraffins bessere Resultate ergbfc.t, wird - insbesondere wegen der Kostenfrage - eine n-Paraffinquelle verwendet, die im allgemeinen 9 his 22 Kohlenstoffatome im Molekül aufweist.
Der Nährboden enthält neben dem assimilierbaren, kohlenstoffhaltigen Substrat übliche, für das Fermentieren und Absondern der <Ä -Keto-Glutarsäure erforderliche Stoffe, das heisst eine Stickstoffquelle ähnlich derjenigen, die bei der Gewinnung der Diploide verwendet werden, und verschiedene Metallsalze wie Eisen-, Magnesium-, Zink-, Kalium-, Natriumsalze und dergleichen.
Die Fermentation wird bei einer Temperatur zwischen etwa 25 bis 35° C und einem pH-Wert zwischen 2 bis 7, vorzugsweise 2,5 bis 5, durchgeführt. Beim Auftreten von organischen Säuren im Inneren der Kultur sinkt der pH-Wert ab und wird durch Zugabe einer Base, beispielsweise Ammoniak, auf dem gewählten optimalen Wert gehalten.
Die Fermentation wird kontinuierlich in Gegenwart von Luft durchgeführt und der Nährboden der Kultur wird mit irgendwelchen entsprechenden Mitteln heftig gerührt, um das kohlenhydrathaltige Substrat weitmöglichst zu dispergieren.
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Vor dem Beginn des eigentlichen Permentierens werden die ausgewählten Stämme der diploiden Candida lipolytica einer Vorkultur unterworfen, um die Hefen zum Wachsen zu. bringen. Dadurch ist es möglich., den Permenter bei guten Bedingungen der Zellenkonzentration (beispielsweise 10' Zellen/ml) anzulegen. Der Nährboden der Vorkultur enthält Bestandteile des Nährbodens der Fermentation, denen vorzugsweise eine geringe Menge Thiaminchlorhydrat (Vitamin B1) zugegeben wird. Diese Verbindung ist nur in der Vorkultur vorhanden, sofern er das Wachstum der Hefen begünstigt. Beim Absondern bzw. Ausscheiden der Wirkstoffe dagegen wirkt sie sich ungünstig aus.
Die Erfindung wird anhand einiger Ausführungsbeispiele näher erläutert: . . ■
Beispiel 1: Gewinnung der Diploide und Beschreibung der Stämme
Es wurden, zwei Stämme von Candida lipolytica untersucht, die aus einer Erdprobe isoliert waren, und zwar ein Haploid mit Vorzeichen A (IPP 29) und ein anderes Haploid mit dem Vorzeichen B (EEP 30).
lr_Stufe. - Diese Stämme wurden getrennt gezüchtet, und zwar während 2.K Stunden bei 25° C auf dem Nährboden der'Vorsporenbildung A (reicher Nährboden) der wie folgt zusammengesetzt war:
Glucose 20 g
(NHi, )oSOii 2 g·
KH2PO4 2 g"
Hefeextrakt 10 g
bakterioligisches
Hilfsmittel:
Bacto Agar Difco		 20
destilliertes
Wasser		 1000 ml
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2. Stufe - Aus jedem Stamm wurde eine Suspension von 10' __
bis 10° Zellen/ml in destilliertem V/asser hergestellt. Aus jeder Suspension wurde ImI entnommen, heftig gemischt und dann 0,1 ml in eine schräg angelegte Agar-Agar-Kultur eines Nährbodens der Sporenbildung B aus Gemüsesaft gebracht. Dieser Nährboden wurde wie folgt hergestellt: 350 ml einer Bouillon aus acht verschiedenen Gemüsearten, die etwa ein Energie-Äquivalent von 2 g/l Glucose aufwies, wurden mit In-KOH auf einen pH-Wert von 6,8 eingestellt und mit 7 g trockener Hefe IPP 29 versetzt. Die Probe wurde 20 Min. auf dem Wasserbad bei 100 C gehalten und dann über Papier filtriert. Das Piltrat wurde wie oben auf den pH-Wert 6,8 eingestellt und sein Volumen durch Zugabe der gleichen Menge Stadtwasser verdoppelt. Wach der Zugabe des bakteriologischen Hifsmittels Bacto Agar Difco 2 % wurde der Nährboden in Röhren von 10 cnr 15 Min. bei 110° C sterilisiert.
/bildende
Die Kultur auf dem Nährboden B, wo einige sporen/ Champignons (asques) in Bildung sind, wurde in 10 ml destilliertem, natronhaltigem Wasser 3 Min. bei 0 C (Desintegrator Mullard MSE) suspendiert und auf dem Nährboden B in einer Petrischale in entsprechender Verdünnung ausgebreitet. Nach 7 bis 15 Tagen erschienen -einige Kolonien der Diploide auf dem Nährboden. Diese Kolonien waren sehr reich an sporenbildenden Champignons (asques) (etwa 50 % bezogen auf die vegetative Cellulose). Sie werden gesammelt und aussortiert auf einem an Hefeextrakt reichen Nährboden. (Hefeextrakt 0>5 c/o, Glucose 2 %, Agar Dif co 2 %). Die starken ausgesuchten Kolonien sind Diploide, züchtbar als solche, ohne dass sie während häufigem Versetzen auf dem vollständigen oder reichen Nährboden Sporen bilden. Der so erhaltene Diploid-Stamm wurde D1O genannt.
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Ausgehend vom Diploid D1Q (IPP 29, ELF 30) wurde eine Serie von Kolonien nach der UV-Mutagenase isoliert (10 Zellen von O1Q3 bestrahlt 1 Min. mit 2000 Erg/mm2/Min.). Alle diese Kolonien hatten eine sehr verminderte Fruchtbarkeit. Ausgehend von diesen Kolonien wurden abgeleitet von D-,η vier Stämme ausgesucht, die nach I5 Tagen und drei Wochen auf dem armen Nährboden B keine sporenbildenden Champignons (asques) mehr bildeten (Fehlen von Sporenbildung). Diese Stämme wurden entsprechend mit D 1802, D I805, D Ι8θ6 und D I8O7 bezeichnet.
Durch Dosieren von ADN gemäss der Methode von Burton (Biochemical Journal 62, 315-323., 1956) und Messen des Zellenwuchses mit dem Mikrometer wurde gefunden, dass die Stämme nahe bei D1O bleiben.
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- ίο -
Merkmale der erhaltenen Diploid-Stämme
Stamm /ug von Desoxyadenosin (pro)
IQ8 Zellen
0,58 0,65 0,89 0,88 1,05 1,27 1,26
Die Zellen waren ellipsenformig und zeigten folgende Merkmale:
Stamm grösste Achse ( /u) kleinste Achse
IFP 29
ELF 30
D 18
D 1802
D 1805
D 1806
D 1807
Zellenwuchs
IPF 29 4,5 2,7
ELF 30 4,6 2,9
D 18 7,7 4,2
D 18O2 7,8 2,9
D I8O5 12,1 6,3
D I8O6 8,3 4,4
D I8O7 ii,3 5,0
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Form der Kolonien auf kohlenwasserstoffhaltig!!! Agar-Agar-Nährboden
Rund, bauchig, granuliert, glänzend, blassgelb.
Assimilation der Substrate (identisch für die verschieden-
nen Stämme)'
Saccharose - negativ
Maltose .- negativ
Galaktose· - negativ
Glucose + positiv
Raffinose schwach
Paraffine mit
C9 bis C22 + positiv
Beispiel 2: Herstellung von C\ -Keto-Glutarsäure
Jeder der obengenannten Stämme wurde umgesetzt und 15 Stunden bei·30° C gebrütet, und zwar in sterilen Röhren, die einen Agar-Agar-Nährboden folgender Zusammensetzung enthielten:
Hefeextrakt o, 05 g
n-Paraffinquelle aus
Γ1 V\"i er Γ* 		0, 05 ml
bakteriologisches Hilfs
mittel: Bacto Agar Difco		 0, 15 g
destilliertes Wasser 10 ml
Jeder Komplex diente zum Anlegen einer Kultur in FERNBACH Phiolen, die 100 ml eines Vorkultur-Nährbodens folgender Zusammensetzung enthielten*:
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n-Paraffinquelle aus C1
bis C1Q D 2,0
D 20 %
Ammoniumnitrat 1,8 fo
primäres Kaliumphosphat 0,2 fo
MgSO^. 7K2O 0,1 %
-THpO 0,01 fo
ZnSOj+.7H„0 0,002 fo
CuSO2+.5H2O 0,002 %
Thiaminchlorhydrat β /ug
Thiamin 6 7ug
CaCO, 1 <fo
destilliertes Wasser 100 ml
Nach einer Inkubationszeit von 48 Stunden bei 30° C auf einem mit I70 U/Min, drehenden Tisch wurde jede Vorkultur dazu verwendet, um einen 4-Liter fassenden Fermenter, der Liter eines sterilen Nährbodens enthielt, zu beschicken. Der sterile Nährboden war wie folgt zusammengesetzt:
Ammoniumni trat, primäres Kaliumphosphat
CuSOj+. 5H2O
destilliertes Wasser
8 fo
0, 2 -%
0, 1 %
0, 01 fo
0, 002 fo
0, 002 %
2000 ml
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Das Paraffin-Substrat (aus C-,-, - C-,ο) wurde mit einer Stundenleistung von 2,5 ml in den Fermenter gegeben, während der Nährboden für die Fermentation mit l800 U/Min. bei einer Temperatur von 31 j 5'° C mechanisch gerührt wurde. Es wurde mit 0,2 Liter steriler Luft. Min...-1 des Nährbodens belüftet und sein pH-Wert wurde durch kontrollierte Zugabe einer wässrigen 2,5n-Ammoniaklösung auf 3.5 gehalten. Die Gesamtmenge des während der Züchtung zugegebenen Kohlenwasserstoffes betrug 208 ml (8 Gewichts-;^). Entnahmen von 10 ml des Nährbodens in bestimmten Zeitintervallen ermöglichten die Bestimmung der Konzentration der ausgeschiedenen o\ -Keto- Glutarsäure nach der FRIEDMANN-Methode (Enzymology Band III, 414- 418, Acad. Press 1957).
Die folgende Tabelle zeigt die Ergebnisse, die nach 110 Stunden der Züchtung erhalten wurden und gestattet den Vergleich der Leistungen der nicht sporenbildenden diploiden Stämme D l802, D I805, D I806, und D I807 mit den ursprünglichen haploiden Stämmen IFP 29 und ELF 30.
Beispiel Stamm o\ -Keto-Glutarsäure* (g/l)
3 4
5 6
Die Analyse der in der obigen Tabelle angeführten Daten zeigt, dass die Ausbeuten an θζ -Keto-Glutarsäure bei Verwendung der erfindungsgemässen Diploide zum Fermentieren wesentlich sind, und zwar nicht nur verglichen mit den ursprünglichen Stämmen, sondern sie sind auch wesentlich höher als diejenigen, die durch Fermentieren der anderen Stämme der gleichen Gattung erhalten werden.
D I8O2 64,5
D I8O5 66,5
D I8O6 52,3
D I8O7 - 52,5
IFP 29 29
ELF 30 31,5
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Ausserdem wurde die-Bildung von(X -Keto-Glutarsäure mit Hilfe des diploiden Stammes D I805 bei mehr als 110 Stunden untersucht. Die ausgeschiedenen Mengen an C?f-Keto-Glutarsäure und die augenblickliche Geschwindigkeit der Bildung dieser Säure wurden für verschiedene Zeitspannen der Züchtung ermittelt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle verzeichnet.
Betriebs
stunden		 ausgeschiedene
O\-Ke to-Glutar
säure (g/l)		 Ausscheidungs
geschwindigkeit
(g/l/h)
110
160
240		 63
113"
I85		 1,0
0,96
0,9
Ss ist ersichtlich, dass die Momentangeschwindigkeit der" Ausscheidung im Augenblick des Stillstandes der Fermentation in der 240. Stunde nur sehr wenig niedriger ist als die in der 110. Stunde gemessenen Geschwindigkeit. Andererseits ist die Ausbeute in Bezug auf den verbrauchten Kohlenwasserstoff immer sehr hoch. Diese Beispiele zeigen, dass die Bildung von O\ -Keto-Glutarsäure nach dem erfindungsgemässen "Verfahren mit günstigen Aus s ehe i dungs be dingungen verlängert werden kann.
Am Ende der Züchtigung wird die Biomasse zentrifugiert. Durch Zugabe von pulverförmigem Natronkalk (chaux sod§) wird die oben schwimmende Masse auf einen pH-Wert von 8,5 eingestellt, wobei das Calciumsalz der o{ -Keto-Glutarsäure ausfällt, das durch Filtrieren gewonnen werden kann.
Die O\ -Keto-Glutarsäure selbst wird durch Zersetzen des CaI-ciumsalzes in einer wässrigen Schwefelsäure, Filtrieren des gebildeten Calciumsulfats und durch Vakuumkonzentration des Filtrats aus diesem auskristallisiert.
409822/088U

Claims (7)

  1. Patentanwalt x ->
    βΐ,ϋ.-lng, Walter Jackisch - .,
    f Jtyitgari N, MenzeJstraße 40 . ■ 4 Cx K 0.. 1973
    Patentansprüche
    Verfahren zur Gewinnung von stabilen Diploiden der Gattung Candida lipolytiea,
    dadurch gekennzeichnet, dass in einer ersten Stufe getrennt zwei Stämme der Gattung Candida lipolytica mit entgegengesetzten Vorzeichen, nämlich Haploide/ auf einem Nährboden gezüchtet werden, der reich ist an assimilierbarem, kohlenstoffhaltigem Substrat, diese Stämme nach einem ausreichenden Wachstum, in einer zweiten Stufe zusammen auf einen Nährboden gebracht werden, der arm ist an assimilierbarem, kohlenstoffhaltigem Substrat und anschliessend nach Auftreten von Diploid-Kolonien, diese in einer dritten Stufe mit einem Mutagen stabilisiert werden.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein reicher Nährboden mit mindestens 10 g/l des assimilierbaren kohlenstoffhaltigen Substrats.verwendet wird.
  3. 3· Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis reicher Nährboden zu armem Nährboden im assimilierbaren, kohlenstoffhaltigen Substrat' etwa 20 beträgt.
  4. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Nährboden Hefeextrakt oder Hefe enthält.
  5. 5. Verfahren zur Gex^innung von O\ -Keto-Glutarsäure durch Fermen tieren der diploiden Stämme gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass-in'einen Nährboden, der^mindestens einen Kohlenwasserstoff als assimilierbares kohlenstoffhaltiges Substrat enthält, ein aus -zwei Stämmen entgegengesetzter Vorzeichen der Gattung Candida lipolytica also Haploiden, erhaltener diploider Stamm eingebracht wird, der nach dem
    AO9822/0 884
    ORIGINAL INSPECTED
    Assimilieren des kohlenstoffhaltigen Substrats (p( -Keto-Glutarsäure ausscheidet.
  6. 6. Verfahren nach Anspruch 5j dadurch gekennzeichnet, dass dasDiploid Candida lipolytica gemäss dem Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4 hergestellt wird.
  7. 7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass ein kohlenstoffhaltiges Substrat mit mindestens einem η-Paraffin mit Cq- Cp2 verwendet wird.
    409822/0884
DE2358312A 1972-11-24 1973-11-23 Verfahren zur gewinnung diploider staemme candida lipolytica und verwendung dieser staemme zur herstellung von alphaketo-glutarsaeure durch fermentation Withdrawn DE2358312A1 (de)

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GB (1) GB1427605A (de)
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