DE2459388A1

DE2459388A1 - Verfahren zur gewinnung von silybum- flavonoiden

Info

Publication number: DE2459388A1
Application number: DE19742459388
Authority: DE
Inventors: Gyula Stieber; Imre Dr Szilagyi; Jenoe Dr Toeroek
Original assignee: Institute for Drugs Research Ltd
Current assignee: Teva Hungary Pharmaceutical Marketing PLC
Priority date: 1973-12-27
Filing date: 1974-12-16
Publication date: 1975-07-10
Also published as: AT332536B; HU168223B; RO66132A; IT1050533B; ATA341074A

Description

Verfahren zur Gewinnung von Silybum-Flavonoiden Priorität: 27. Dezember 1973 - Ungarn Anmelde-Nr. Go - 1256 /1973 Die Erfindung bezieht sich auf die Gewinnung von Flavonolden aus dem gemahlenen Samen, vorzugsweise aus angereichtertem Samenschalenmahlgut, von Silybumarten oder Unterarten und deren Varianten.
Die Mariendistel (Silybum marianum L.) ist eine seit dem Altertum bekannte Heilpflanze, in der Volksheilkunde wurde sie gegen Leberübel und Gallensteine sowie zur Heilung der daraus resultierenden Krankheiten verwendet.
Bei chronischen Leberschäden wurden die Auszüge und Tinkturen der Mariendistel mit Erfolg angewendet. Die in der Pflanze enthaltenen Wirkstoffe, die Flavonolignane, sind seit einem Jahrzehnt bekannt. KlinischSpharmakologische Untersuchungen wurden bisher nur bezüglich des Flavonoidextrakt es vorgenommen, der ein Gemisch der in der Mariendistel enthaltenen biologisch aktiven Isomeren (IjealonR, sec. Madaus) darstellt. Die bisherigen chemischen und pharmakologischen Ergebnisse sind in der Monographie "Recent flavonoid research" (Akadémiai Kiadó, Budapest, S. 49-68 /1973/) zusammengefaßt.
Bezüglich der in den Oberbegriff der vorliegenden Erfindung fallenden industriell anwendbaren Verfahren wurden bisher auf Grund unterschiedlicher Überlegungen drei verschiedene Wege eingeschlagen, bisher jedoch ohne ausrteichenden Erfolg Gemäß dem in der DBR-Patentschrift Sr. 1 923 082 beschriebenen Verfahren werden von dem ungefähr 30 % betragenden Fettolgehalt des Silybumsamens zwei Drittel mittels einer Schneckenpresse unter hohem Druck ausgepreßt.
Der Preßrückstand wird einen Tag lang mit Athylacetat erschöpfend extrahiert und der durch Eindampfen im Vakuum erhaltene, klebrige Stoff in einem 95%-igen Methanol-Petroläther-Syste!r (Flavonkonzentration 20/0) durch Gegenstromextraktion weiter entfettet. Die Unterphase wird nach Klären mit AktiVkohle eingedampft, wobei ein 70 % Silymarin enthaltendes, braunes Extrakt isoliert wird, aus dem gewünschtenfalls das Silym&rin kristallisiert werden kann.
Gemäß dem in der DBR-Patentschrift Nr. 2 017 789 beschriebenen Verfahren wird der Samen 1-2 Tage lang mit Methyslenchlorid entfettet, danach 2-3 Tage lang im Gemisch mit Polyäthylenglycol und Alkoholen gerührt, eingedampft und die von dem Restölgehalt abgetrennte, polyäthylenglycolische Flavonoldlösung durch Zusatz von Wasser ausgefällt. Von dem erstarrten, amorphen Niederschlag wird die überstehende, milchartige Emulsion durch Dekantieren abgetrennt. Das rohe Extraktionsprodukt ist gelblichbraun, schmilzt bei 80-120 0 und enthält 40-6O % Silymarin.
Nach dem neuesten, in der belgischen Patentschrift Nr. 766 228 beschriebenen Verfahren wird das nicht entfettete rohe Silybum-Material zusammen mit einem 40-60 % Alkohol, 20-40 % Wasser und 10-3O'6 Ester oder Kohlenwasserstoffe enthaltenden Lösungsmittelgemisch unter normalem oder vermindertem Druck und ständigem Rühren gekocht.
Das durch einmalige oder mehrmalige Extraktion erhaltene Filtrat wird im Vakuum eingedampft und dadurch die Flavonoid-Phase von den fetten Ölen abgetrennt und erstere im Vakuum zur Trockne eingedampft. Das Sumpfprdukt enthält 40 % Silymarin, welches aus 50%-igem Methanol auskristallisiert werden kann.
Die beschriebenen Verfahren sind ausschließlich auf die Herstellung roher, silymarinhaltiger Extrakte (Gemische von Flavonisomeren) gerichtet. Ein industriell anwendbares Verfahren, welches auch zur Isolierung der zweiten Hauptkomponente, des Silydiamins, geeignet wäre, ist bis heute nicht bekannt geworden. Auch pharmakologische Angaben zu den definierten, reinen Isomeren Silymarin, Silydianin, Silykristin usw. sind bisher -nicht veröffentlicht worden.
Die beschriebenen Verfahren richten sich in ermater Linie auf die mittelbare oder unmittelbare Entfernung des enorm hohen (20-30 %) Fettölgehaltes des Silybumsamens, da die Gegenwart der lipophilen Begleitstoffe (gesättigte und ungesättigte Fettsäureester), deren Menge die Menge der Flavonoide um das 20-30fache übersteigt, die Reinigung erschwert, und die Simultanextraktion der fetten Öle mit den Flavonoiden bei einer einmaligen Abtrennung der Fette nicht zu fettfreien Rohprodukten führen kann. Die anfänglich übliche Extraktionszeit für die Flavonkomponenten (24 Stunden, Athylacetat) konnte zwar später durch diskontinuierliche Arbeitsgänge, mehrtägiges Einweichen, höhere Temperatur des verwendeten Lösungsmittelgemisches verringert werden, für Verteilung und Abtrennung der einzelnen Komponenten und der färbenden Substanzen ist jedoch keine technische Lösung bekannt. Die Jeweilige Zusammensetzung des Rohproduktes war immer von dem Plavonoidspektruz der rohen Droge (Silybum) abhängig.
Zur Herstellung eines angereicherten Extraktes aus Silybuia marianuna wurden zwar verschiedene Methoden vorgeschlagen, diese waren jedoch wegen der Langwierigkeit der Verfahren und der unbefriedigenden Verteilung des Produktes weder zweckmißig noch wirtschaftlich.
Ziel der Erfindung ist die Ausarbeitung eines Verfahrens, das die Herstellung eines fettfreien Flavonoid gemisches oder die der reinen Hauptkomponenten, zum Beispiel des Silymarins oder des Silydianins, auf wirtschaftliche Weise ermöglicht.
Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß sowohl das Silymarin wie auch das Silydianin beziehungsweise die pharmazeutisch verwertbaren Flavonoide in der Samenschale vorkommen und durch Simultanextraktion den Stärke- und Fettgehalt des Samens, in einem einzigen Schritt angereichert werden können, ferner darauf, daß die genannten Blavonoide in stark polaren Lösungsmitteln außerordentlich leicht löslich sind, wodurch sich für die Isolierung und Reinigung der pharmazeutisch verwertbaren Flavonoide neue Verteilungsmöglichkeiten eröffnen. Für die verwendbaren Lösungsmittel ist kennzeichnend, daß sie mit OH-haltigen Verbindungen Wass erst offbrückenb idnungen einzugehen vermögen, ihr DK -Wert hoch ist, und daß sie mit den mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmitteln (z. B. Butylacetat, Formamid) meistens zweiphasen-Systeme bilden.
Im Sinne der Erfindung wird so vorgegangen, daß man die gemahlenen Samen von Silybumarten oder Unterarten oder deren Varianten - gegebenenfalls, nachdem die Samenschale einer mit einem Fettlösemittel, vorzugsweiseSmit einem halogenierten Kohlenwasserstoff von über 1,35 spezifischem Gewicht durchgeführten Anreicherung durch Fett- und Stärke extrakt ion unterworfen wurde - mit einem stark polaren Lösungsmittel - wie Formamid, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxyd usw. - aufschließt und danach mit deren Gemisch mit Aceton, Methanol, oder Athylacetat erschöpfend extrahiert, dann durch in einem aus Athylacetat, einem polaren Lösungsmittel und wäßriger Natriumchloridlösung bestehenden System durchgeführte Extraktion, vorzugsweise Gegenstromextraktion, reinigt, danach die Flavonoide durch mit methanolischer CaCl2-lösung oder CaCl2-haltigem Athylenglycol und Kohlenwasserstoffen durchgeführte Verteilung extrahiert, die Flavonoide durch Dispergieren des Extraktes in Wasser in Form eines Rohproduktes niederschlägt, gewünschtenfalls die Hauptflavonoide aus wenig Methanol kristallisiert, gegebenenfalls aus einem Aceton- Methanol-Gemisch oder aus einem Gemisch von Methanol und wäßriger CaCl2-Lösung umkristallisiert und gegebenenfalls die in der Mutterlauge verbliebenen Flavonoide durch Säulenvefteilungschromatographie oder fraktionierte Extraktion auftrennt.
Es ist bekannt, daß die Flavonoidwirkstoffe der Mariendistelarten (Slybum marianum L. Gärtn., Silybum eburneum Ooss et Dur., Composites) sowie die der lila und weiß blühenden Farbvarianten von Silybum marianum L. Gärt. sich im Samen befinden (fette Öle 10-30 %, Gesamtflavon 2-4 %, Silymarin oder Silydianin 1-3 %, außerdem noch Silykristin-Taxifolin- und Quercetin-Isomere). 3ei Aufbrechen des Samens kann die außerordentlich harte, sandbraune Samenschale (peryoarpium) (MH) und der grauweiße, sich fettig anfühlende Stärkekern (cotyledones), der sogenannte geschälte Kern (Bm) unterschieden werden. Die in der folgenden Tabelle zusammengefaßten Uitersuchungsergebnisse bestätigen die Annahme, daß die Hauptkomponenten, d.h. bei S. marianum das Silymarin, bei S. eburneum das Silydianin in der Samenschale angereichert sind. Bei den weißblühenden Varianten ist Silydianin kaum mehr zu finden.

Tabelle Samenschale (MH) und Kern (Hm) mechanisch voneinander getrennt

Zusammensetzung

Silybum marianum S. eburneum

lila weiß lilablühend

MH Hm MH Hm MH Hm

Verteilung

g/g 1,6 1,6 2,0 1,7 1,7 1,8

Fettöl, % 4,4 44,1 5,8 43,3 7,8 43,6

Gesamtflavon, % 6,9 0,9 6,4 0,9 6,8 0,9

Komponenten

A 2,1 0,9 1,9 1,0 1,7 1,0

B 0,8 0,6

C 0,6 # 3,6

D 4,4 # # 0,4 #

E 4,3

Die in der Tabelle aufgeführten Komponenten A und B enthalten bislang unbekannte Flavonoide, Komponente C ist Silydianin, Komponente D Silsmarin und Komponente E das Gemisch hauptsächlich von Silymarin und einem unbekannten Blavonoid.

Bei Experimenten zum mechanischen Aufschluß der Samen wurde festgestellt, daß die Steigerung der Mehlfeinheit vom Standpunkt der Entfettung und der Flavonanreicherung nur bis zu einem gewissen Grade Nutzen bringt. Nach Erreichen einer "Mehlfeinheit" hat die Verringerung der Teilchengröße keinen Sinn mehr, weil dadurch bei der Fettextraktion Flavonverluste verursacht werden können.
Aus den gemahlenen Samen können die Samenschalenteile durch Sieben oder durch im Wirbelbett vorgenommene Fluidisationsklassifizierung nicht abgetrennt werden. Bei mit Fettlösemitteln steigender Dichte vorgenommenen systematischen Flotationsexperimenten wurde jedoch gefunden, daß sich die Samenschale aus dem Silybum-Mahlgut in Lösungsmitteln vom pentan ( γ = 0,64) bis zum Methylenchlorid ( γ= 1,34) als Bodensatz absetzt, während der Stärkeanteil in der überstehenden Flüssigkeit suspendiert bleibt. In Trichloräthy len ( γ = 1,47), Chloroform ( γ= 1 1,5) und Tetrachlorkohlenstoff ( γ= 1,59) schwimmt die Samenschale hingegen an der Oberfläche der Flüssigkeit und die verhältnismäßig stabile Stärke suspension befindet sich unten. Diese einfache Beobachtung führte zur selektiven Abtrennung der Samenschale von dem Stärketeil und dem darin befindlichen Fettöl.
Vorzugsweise wrd als Fettlösemittel Tetrachlorkohlenstoff verwendet, weil dieser nicht feuergefährlich ist und auch die aus dem Öl beim Stehen auskristallisierenden natürlichen Fettsäureester von C16-C18 (Fp. 79-84 °C) gut löst. Am Siedepunkt des Tetrachlorkohlenstoffes erleiden die Flavonoide noch keine thermische Zersetzung, auXerdem sind sie in diesem Lösungsmittel unlöslich.
Der Aufschluß mit stark polarem Lösungsmittel wird so vorgenommen, daß die gemahlenen Samen oder die entfetten Samenschalen im Verhältnis von auf die angerei- -cherten Samenschalen gerechnet 1:0,5 - 2 g/v, bei gemahlenen Samen 10:0,5-2 g/v mit dem Lösungsmittel vermischt und dann bei Zimmertemperatur 5-15 Stunden lang stehen gelassen werden.
In dieser Zeit verändert sich die Droge ganz augenscbeinlich: am Anfang schäumt sie, dann wird sie braun, quillt auf und wird durch die Wirkung des polaren Lösungsmittels eine Art glasiges Harz. Das gelartige kolloid,-disperse System kann nun von den Flavonen leicht durchwandert werden.
Die Extraktion wird durch bei Zimmertemperatur durchgeführte Drogenextraktion, zum Beispiel Perkolation, oder mittels Rückflußextraktion im Dampfraum durchgeführt.
Im Falle der bei Zimmertemperatur durchgeführten Perkolation wird auf das Gewicht des aufgeschlossenen Materials gerechnet zweckmäßig die vierfache Menge Lösungsmittel verwendet Wird die Extraktion in Dampfraum und beim Siedepunkt durchgeführt, so beträgt das Gewichtsverhältnis zwischen aufgeschlossenem Material und Lösllngsmittel zweckmäßig 1:1.
Zur Herstellung von Silymarin ist die lila- oder die weißblühende S. marianum, für die Isolierung von Silydianin, S eburneum der optimale Rohstoff. Das Wesen des Verfahrens wird von diesem Unterschied nicht berührt. Bei der Aufarbeitung muß berücksichtigt werden, ob zur Extraktion ein mit Wasser mischbares oder ein mit Wasser-nicht mischbares Lösungsmittelsystem (Athylacetat) verwendet wurde.
Um eine wirtschaftliche und kontinuierliche BetriebBweige zu erreichen, ist es angebracht, ein zweiphasiges Flüssigkeit/Flüssigkeit-System zu verwenden.
Wird die Droge bei Zimmertemperatur perkoliert, so verwendet man zweckmäßig Athylacetat. Wird dem Perkolat 2-4%ige wäßrige Natriumchloridlösung zugemischt, so bildet sich sofort das zweiphasige ternäre Lösungsmittel-System aus (Athylacetat - Formamid - Natriumchloridlösung vorzugsweise in Volumenverhältnis 50:25:25, GFl. = 1,4).
J?är die Extraktion kann jeder bekannte Flüssigkeit-Flüssigkeit-Extraktor verwendet werden. Zweckmäßig ist die Verwendung eines quasikontinuierlichen, im Gegenstrom arbeitenden Misch- und Absetzextraktors (mixer-settler). Nach dem teilweisen Eindampfen der hellgelben Äthylacetatphase werden die Flavonoide kontinuierlich in wenig mit CaC12 gesättigtes Athylenglycol übertragen, wobei unter energischem Rühren die Oberphase kontinuierlich mit einem apolaren Kohlenwasserstoff, vorzugsweise mit Petroläther gesättigt wird. In der Oberphase reichert sich die Reste des fetten Öles> das Chlorophyll und gelbe Farbstoffe, in der Unterphase die Flavonoide an. Schließlich wird die untere (äthylenglycolische) Phase unter ständigem Rühren in Wasser dispergiert (1:5 - 1:10 v/v). Das Extrakt scheidet sich in Gestalt eines feinen gelben Pulvers aus, welches gut flltrierbar ist. Die überstehende Flüssigkeit ist klar. Die Ausbeute beträgt von der Qualität der Droge ab-Hängend 1-4%,der Schmelzpunkt liegt bei 150-160 °C. Es kann auch so vorgegangen werden, daß man die Athylacetatphase im Vakuum eindampft, den Eindampfrückstand in 10%iger methanolischer CaCl2-Lösung löst, die Lösung mit einem apolaren Kohlenwasserstoff, vorzugsweise mit Petroläther erschöpfend extrahiert und das Produkt ausfällt.
Wird zur arschöphenden Extraktion Aceton oder Methanol verwendet und die Extraktion im Dampfraum'am Rückfluß durchgeführt, so sind Lösungsmittelbedarf und Zeitaufwand geringer. So reicht zum Beispiel im Falle des Acetons ein Verhältnis von 1;0,5 bis 1:1 aus, und die Extraktion kann innerhalb von 2-4 Stunden durchgeführt werden.
Durch das erfindungsgemaß'e Verfahren konnten zum ersten Male die Wlavonoidkomponenten zwischen zwei Lösungsmitteln verteilt werden. Die Verteilung wird durch Ffraktionierte Extraktion in einem System von Athylacetat, einem stark polaren Lösungsmittel und wäßriger Natriumchloridlösung vorgenommen. Als Extraktionssystem wird vorzugsweise ein Gemisch aus Äthylacetat, Formamid und 2%iger wäßriger Natriumchloridlösung im Volumenverhältnis 60:25:15 verwendet (GFl. = 0,91). Die einzelnen Komponenten werden in hochreiner-Form erhalten, ihre physikalischen Konstanten stimmen mit den in der Literatur angegebenen und den an authentischen Proben gemessenen Angaben überein.
Die Komponenten können auch mit Hilfe der ßäu Ienverteilungschromatographie voneinander getrennt werden. Dabei wird als träger eine Silikagelsäule, als stehende Phase ein stark polares Lösungsmittel, und als mobile Phase ein eluotrope Reihe verwendet, die aus mit Chloroform, n-Butylacetat und Äthylacetat bereiteten Lösungsmittelgemischen verschiedener Zusammensetzung besteht.
Zur Herstellung reinen Silydianins wird als Ausgangsstoff der Samen'von Silybum eburneum verwendet, das in Wasser ausgefällte Rohprodukt aus wenig Methanol kristalligiert und gewünschtenfalls aus einem Aceton-Methanol-Gemisch oder einem CaCl2 enthaltenden Methanol-Formamid-Wasser-System umkristallisiert. Zur Herstellung von reinem Silymarin dient als Ausgangsmaterial der Samen der lila- oder der weißblühenden Silybum marianum Varianten.
Das in Wasser gefällte Rohprodukt wird aus wenig Methanol kristallisiert und gewünschtenfalls aus einem Aceton-Methanol-Gemisch umkristallisiert.
Nach Angaben aus der Literatur die auch durch einheimische Experimente bestätigt wurden, erwiesen sich im Tieversuch das Silymarin beziehungsweise Gemische aus Flavonoidkomponenten (LegalonR) weder bei akuter noch bei chronischer Dosierung als toxisch. Die antihepatotoxische Wirkung der Flavonoide wurde an mit Tetrachlorkohlenstoff verusachten Leberschäden untersuncht Auch die α-Amintinvergiftung ist durch die Anwendung der Flavonoide abwehrbar. Im Endergebnis wurde die protektive und kurative Wirkung der Flavonolignane an verschiedenen pathophysiologißchen Betermodellen einwandfrei bewiesen. Der Wirkungsmechanismus ist neuartig Bisher wurden Angaben über einige Hundert klinische Fälle veröffentlicht, aus denen ersichtlich ist das die Wirkstoffe auch in der Humanmedizin wirksam sind, und zwar bei chronischer Hepatitis, Lebercirrhose, Leberverfettung, der Lebervergrößerung chronischer Alkoholiker usw.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert.
Beispiel 1 6 kg mehlfein gemahlener Samen von S. eburneum (26% Öl, 3% Flavon) werden im Behälter A des in Fig. 1 dargestellten sog. Simultanextraktors mit 3 x 10 Liter Tetrachlorkohlenstoff aufgeschlämmt. Nach einigen Minuten Absetzen wird die untere, aus öl- und stärkehaltigen Samenteilen bestehende Schlammphase in den Destillationsraum B überführt. Der Destillationsraum wird bis zum tberlauf mit Lösungsmittel gefüllt und dadurch das Volumenverhältnis zwischen der rostbraunan Schlammphase und dem Lösungsmittel auf 1:3 eingestellt. Durch Beheizen mittels der im oberen Drittel des Behälters A angebrachten Heizschlange wird das Lösungsmittel schwach am Sieden (77 °C? gehalten und dadurch ein konvektiver Mischeffekt erreicht. Gleichzeitig wird durch Regulieren der Heizung des Destillationsbehälters B die Zirkulationsgeschwindigkeit des Systems auf 7 kg CCl4 pro kg Samenmaterial und Stunde eingestellt.
Nach fünfstündiger -Extraktion, wenn sich die Lösungsmittelphase unter den Samenschalen klärt, kann der Vorgang als beendet betrachtet werden. Die festen Phasen werden abfiltriert und getrocknet Der Tetrachlorkohlenstoff wird durch Abdestillieren von dem Fettöl befreit und auf diese Weise regeneriert. Folgende Produkte werden erhalten: Angereicherte Samenschale 3,5 kg (58,5%); Flavon 5,5% Stärke Q,94 kg(15,8%); wertloses Flavon 0,7% fettes Öl 1,54 kg (25,7%) Die 3,5 kg getrocknete Samenschalen werden mit Formamid im Verhältnis von 1:1 g/v 15 Minuten lang homogenisiert und eine Nacht lang (15 Stunden) stehen gelassen.
Die braun gewordene und gequollene Masse wird in einer terkoliervorrichtung mit 24 Liter Xthylacetat aufgefüllt, schnell abgelassen und das dunkelrote Vorextrakt zur Homogenisierung zurückgeführt. Danach werden mit einer Geschwindigkeit von 2 Liter pro Stunde 24 Liter erstes Perkolat zur Weiterverarbeitung abgenommen. Mit den bei Fortsetzen des Prozesses gewonnenen weiteren 14 Liter Perkolat wird die Extraktion der folgenden Drogencharge begonnen (erstes Perkolat" der zweiten Charge). Aus der lt Droge wird das Athylacetat durch Wasserdampf regeneriert.
Das erste Perkolat wird in den in Fig. 2 dargestellten, aus einer vierstufigen Einheit bestehenden sog.
quasikontinuierlichen Flüssigkeit/Flüssigkeit-Extraktor (mixer-settler) eingespeist. Der Extraktor arbeitet im Gegenstromprinzip, Mischraum und Absetzraum haben Volumina von Je 280 ml. Das erste Perkolat wird mit 3%iger wäßriger Natriumchloridlösung verteilt. Der Gehalt der salzigen Extraktflüsigkeit an verwetbaren Flavonen wird in wei-.
teren zwei Stufen mit reinem Athylacetat nachextrahiert.
Bei dem kontinuierlichen Prozeß werden 0,6 Liter Salzlösung pro Liter Perkolat, bei der Nachextraktion 0,4 Liter Äthylacetat pro Liter Perkolat verwendet, die Verweilzeit beträgt 3,5 Minuten. Das rot-braune salzige Raffinat wird verworfen, Die hellgelbs, formamidfreie Äthylacetatlösung wird im Vakuum eingedampft. 250 g eines gelbbraunen amorphen Rückstandes werden erhalten. Der Rückstand wird in 1 Liter 10%iger methanolischer CaCl2-Lösdng aufgenommen und mit 3x100 ml Petroläther (Kp.: =0-40 0C bis zur Fettreiheit ausgeschüttelt. Die CaCl2-haltige untere Phase wird schließlich unter ständigem Rühren innerhalb einer Wunde in Wasser eingetropft, wo sich das Plavonoidgemiech in Form eines gelben Niederschlages. abscheidet.Die übe-stehende Flüssigkeit ist durchsichtig und klar. Der Niederschlag wird im Vakuum abgesaugt, durch Suspendieren in Wasser gewaschen und dann aufgearbeitet. 130 g (auf das Gewicht des eingesetzten Samenmehles bezogen 2,2% ) hellgelbes Rohprodukt werden erhalten. Fp.: 155-180 °C.
130 g des 60 °/0 bilydianin enthaltenden Rohproduktes werden in 384 ml Methanol gelöst. Die Lösung wird durch Eintropfen von 15 ml Wasser gesättigt, geimpft und- dann für 2-3 Tage in den Kühlschrank gestellt. Das kristalline Produkt wird abfiltriert, mit wenig Methanol gewaschen und dann getrocknet. 39,2 g (auf das Gewicht des eingesetzten Samenmehles bezogen 0,6%) eines kaum gefärbten Produktes mit dem Schmelzpunkt 165-171 0C werden erhalten. Dieses wird in 196 ml kochendem Aceton gelöst, die Lösung wird filtriert und mit 98 ml Methanol gesättigt.
Auf diese Weise wird das kristalline Methanolat (Fp.: 172-176)°C) erhalten. 34 g des weißen Produktes werden bei 50 0C in einem Gemisch aus 340 ml 10%iger methanolischer CaCl2-Lösung und 24Q ml destilliertem Formamid gelöst, die Lösung filtriert und unter Rühren in 6000 ml destilliertes Wasser eingetropft. Nach 15stündigem Stehen bei +4 °C scheidet sich Silydianin-hydrat in Form flockiger Nadeln aus. Ausbeute 31,6 g, Fp.: 189-191°C, (α)D20 = +214° (c = 0,25; 95%iges Athanol). Das Produkt zeigt mit einem authentischen Muster keine Schmelzpunktsdepression.
Beispiel 2 3 kg fein gemahlene Samen von S. marianum (Öl: 10,6%, Flavon: 2,3%) werden in 300 ml Dimethylformamid eini ge Minuten lang homogenisiert und dani 15 Stunden lang stehen gelassen. Die aufgeschlossene, in einem Leinwandsack eingebrachte Droge wird, nachdem di Flüssigkeit durch den Kühler hindurch mit 3 Liter Aceton aufgefüllt wurde, im Dampfraum am Rückfluß 4 Stunden lang gekocht.
Das gelb gründe zweiphasige Extrakt wird auf dem Wasserbad (50 °C) unter vermindertem Druck (60 Torr) eingedampft, bis es kein Lösungsmittel mehr enthält. Die Oberphase der erhaltenen zweiphasigen Emulsion besteht aus 302 g Öl, die Unterphase aus 330 ml einer Lösung von Flavon in Dimethylformamidw Diese Unterphase wird abgetrennt und mit einem Gemisch von 400 ml Athylacetat und 330 ml 2%iger Waßriger Natriumchloridlösung ausgerührt. Die untere, rote, wäßrige Phase, die das NaCl enthält, wird noch zweimal mit je 200 ml Äthylacetat ausgeschüttelt, die verinigten, ungefähr 900 ml ausmachenden Phasen werden in vergleichbarer Weise mit 3 x 150 ml 2%iger wäßriger Natriumchloridlösung ausgeschüttelt, d. h. die Flavonoide werden verteilt.
Das 900 ml hellgelbes Athylacetatextrakt wird im Vakuum bei 50 °C auf ein Drittel ihres Volumens eingedampft. Das auf diese Weise aufkonzentrierte Extrakt wird mit 75 ml 5% CaCl2 enthaltendem Äthylenglycol unter energischem mechanischem Rühren homogenisiert und während des Rührens durch Zutropfen von 300 ml Petroläther (Kp.: 30-40 0C)-ge sättigt. Der Restölgehalt der oberen Phase beträgt 5,5*.
Die erhaltenen 100 ml Athylenglycolphase von rotbrauner Farbe werden anschließend in 1000 ml destilliertes Wasser eingegossen. Der gebildete Niederschlag setzt sich gut ab, die überstehende Flüssigkeit ist klar. Der abfiltrierte und mit Wasser gewaschene Niederschlag wird im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 57,3 g (1,9%), Fp.: 153-159 °C.
4Q g des 50% Silymarin enthaltenden Rohproduktes werden staubfein zerkleinert und durch schnelles Einrühren in 70 ml warmes Methanol gelöst. Der ohne Filtrieren spontan kristallisierende rotbraun Sirup wird bei +4°C 4-5 Tage stehen gelassen. Die Kristalle werden abzentrifugiert, 2-3 mal in wenig Methanol suspendiert, abfiltriert und im Vakuum getrocknet. 14 g (auf die Ausgangsmenge Samenmehl bezogen 1,1%) eines kaum gefärbten Produktes werden gewonnen, das bei 158-162 °C schmilzt Das Produkt wird durch Heißlösen in 300 ml eines Aceton Methanol-Gemisches (1:1) und Eindampfen der Lösung auf die Hälfte ihres Volumens umkristallisiert, 9,9 g eines wei-Ben Produktes werden erhalten. Fp.: 163-168 °C (α)D20 - +10,80 (c = 0,25; 95%iges Äthanol). lius der Mutterlauge kann durch Eindampfen eine weitere Fraktion gewonnen werden. -Das Produkt zeigt mit authentischen Silymarinmustern keine Schmelzpunktsdepression.

Claims

PATENTANSPR3CHE

1. Verfahren zur Gewinnung von Flavonoiden aus dem gemahlenen Samen, vorzugsweise aus dem angereicherten Samenschalenmahlgut von Slybumarten oder Unterarten und deren Varianten, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß man die gemahlenen Samen von Silybumarten oder Unterarten und deren Varianten - gegebenenfalls, nachdem die Samenschale einer mit einem Fettlösemittel, vorzugsweise mit einem halogenierten Kohlenwasserstoff von über 1,35 spezifischen Gewicht durchgeführten Anreicherung durch Fett- und Stärkeextraktion unterworfen wurde - mit einem stark polaren Lösungsmittel aufschließt, danach mit Aceton, Methanol oder Äthylacetat erschöpfend extrahiert, dann durch in einem 1t aus Athylacetat, einem polaren Lösungsmittel und wäßriger Natriumchloridlösung bestehendem System durchgeführte Extraktion, vorzugsweise Gegenstromextraktion, reinigt, danach die Flavonoide einer mit methynolischer CaCl2-Lösung oder CaCl2-haltigem Äthylenglycol und Kohlenwasserstoffen durchgeführten Verteilungsextraktion unterwirft, die Flavonoide durch Dispergieren des Extraktes in Wasser in Form eines Rohproduktes niederschlägt, gewünschtenfalls die Hauptflavonoide aus wenig Methanol kristallisiert, gegebenen falls aus einem Aceton-Methanol-Gemisch oder einem Gemisch aus methanolischer CaCl2-Lösung und Wasser umkristallisiert und gegebenenfalls die in der Mutterlauge verbliebenen Flavonoide durch Säulenchromatographie oder fraktionierte Extraktion auftrennt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, - dadurch g e -k e n n z e i c h n e t , daß zu der der Anreicherung der Samenschalen dienenden Extraktion von Stärke und Fett als Fettlösemittel Tetrachlorkohlenstoff verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e -k e n n z e i c h n e t , daß zum Aufschließen als stark polares Lösungsmittel Formamid, Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxyd in einem Verhältnis von auf das Gewicht der angereicherten Samenschalen gerechnet 1:0,5 - 2 g/v, auf das Gewicht des gemahlenen Samens gerechnet 10:0,5 - 2 g/v verwendet wird und das aufzuschlißende Material zu sammen mit dem zum Aufschluß verwendeten stark polaren Lösungsmittel wenigstens 5 Stunden lang stehen gelassen wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e -k e n n z e i c h n e t , daß die erschöpfende Extraktion bei Zimmertemperatur oder am Siedepunkt des Gemisches durchgeführt wird, wobei im Falle der Extraktion bei Zijiirnertemperatur das Verhältnis zwischen aufgeschlossenem Material und Lösungsmittel zweckmäßig 1:4 g/v beträgt, während bei am Siedepunkt im Dampfraum durchgeführter Extraktion das Verhältnis zwischen aufgeschlossenem Material und Lösungsmittel zweckmäßig 1:1 g/v beträgt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e -k e n n z e i c h n e t , daß bei dem nach der erschöpfenden Extraktion zur Anwendung kommenden Verteilungssystem aus Athylacetat, einem polaren Lösungsmittel und verdünner wäßriger Natriumchloridlösuflg das VolumenverhäLtnis der Lösungsmittelkomponenten zueinander vorzugsweise 50:25:25 ist und die verdünnte wäßrige Natriumchloridlösung 2-5%ig, vorzugsweise 3%Ig ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch g e -k e n n z e i c h n e t , daß das bei der erschöpfenden Extraktion erhaltene acetonische oder methanolische Extrakt eingedampft und die untere, stark polare Phase des Rüchstandes unter Versetzen mit Xthylacetat und wäßriger Natriumchloridlösung extrahiert wird.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e -k e n n z e i c h n e t , daß die bei der Extraktion mit dem aus Xthylacetat, polarem Lösungsmittel und wäßriger Natriumchloridlösung bestehenden System erhaltene, die Blavonoide zweckmäßig in Äthylacetat gelöst enthaltende Phase partiell, vorzugsweise auf ein Drittel bis ein Zehntel ihres Volumens eingedampft und der darin enthaltene Restölgehalt entfernt wird, indem während der mit CaCl2-haltigem Äthylenglycol vorgenommenen Extraktion die obere Phase vorzugsweise unter energischem Rühren mit einem unpolaren KohlenwasSerstoff5r, zweckmäßig mit Petroläther gesättigt und die untere Phase abgetrennt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch g e -k e n n z e i c h n e t , daß den Eindaphrückstand des die VI Flavonoide enthaltenden Athylacetates in 10iger methanolischer CaCl2-Lösung gelöst und die Lösung mit einem unpolaren Kohlenwasserstoff, zwechmäßig mit Petroläther, erschöpfend extrahiert wird.

9. Verfahren nach Anspruch 1 dadurch g e -k e n n z e i c h n e t , daß die in CaCl2-haltigem Bthylenglycol oder in methanolischer CaCl2-Lösung gelösten, vom Fett befreiten Flavonoide unter Rühren zweckmäßig in der fünf- bis zehnfachen Menge Wasser dispergiert, die erhaltenen pulverförmigen, therapeutisch wirksamen Flavonolde zweckmäßig im Vakuum abfiltriert oder zentrifugiert, zweckmäßig durch Suspendieren gewaschen und dann getro.cknet werden.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e -k e n n z e i c h n e t 1 daß als Ausgangsstoff der Samen von Silybum eburneum verwendet wird und das in Wasser ausgefällte Rohprodukt aus wenig Methanol kristallisiert und gewünschtenfalls aus einem Aceton-Methanol-Gemisch oder einem System, bestehend aus methanolischer OaOl2-Lösung, Formamid und Wasser, umkristallisiert wird.

11. Verfahren nach Anspruch 1 dadurch g e -k e n n z e i c h n e t , daß als Ausgangsstoff der Samen der lila- oder der weißblühenden Farbvariante von Silybum marianum verwendet wirds und das in Wasser ausgefällte Roh~ produkt aus wenig Methanol kristallisiert und gewünschtenfalls aus einem Aceton-Methanol-Gemisch umkristallisiert wird.

12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e -k e n n z e i c h n e t , daß die einzelnen Flavonoidkomponenten durch Säulenverteilungschromatographie aus dem Wlavonoidgemisch abgetrennt werden, wobei als Träger silikagel als stehende Phase ein stark polares Lösungsmittel, vorzugsweise Formamid und als mobile Phase eine eluotrope Reihe aus Chloroform, Butylacetat und Äthylacetat enthaltenden Gemischen verwendet wird.

13. Verfahren nach Anspruch 6t, dadurch g ek e n n z e i c h n e t X daß die einzelnen Flavonoidkomponenten durch fraktionierte Flü8sigkeit;/Flüssigkeit-Extraktion aus dem Flavonoidgemisch abgetrennt werden, wobei zweckmäßig ein ternäres System aus Chloroform, " Äthylacetat oder Butylacetat, einem stark polaren Lösungsmittel und verdünnter wäßriger Natriumchloridlösung verwendet wird.