DE3000246A1

DE3000246A1 - Verfahren zur herstellung von l-(alpha)-glycerilphosphorycholin und das dabei erhaltene produkt

Info

Publication number: DE3000246A1
Application number: DE19803000246
Authority: DE
Inventors: Balsamo Cinisello; Myriam Gozzoli; Carlo Milano Scolastico
Original assignee: Lpb-Istituto Farmaceutico-Spa; Lpb Istituto Farmaceutico SpA
Current assignee: Lpb-Istituto Farmaceutico-Spa; Lpb Istituto Farmaceutico SpA
Priority date: 1979-09-17
Filing date: 1980-01-05
Publication date: 1981-04-02
Also published as: FR2464961A1; CH642083A5; JPS6341920B2; IT7925761A0; JPS5643290A; AR225159A1; ES8100307A1; FR2464961B1; ES487473A0; DE3000246C2; IT1123187B; GB2058792A; GB2058792B; MX6294E

Description

LPB Istituto Farmaceutico s.p.a.

Via dei Lavoratori, 54-

2OO92 Cinisello Balsamo (Milano) Italien

Verfahren zur Herstellung von L-a-Glycerylphosphorylcholin und das dabei erhaltene Produkt

Die Erfindung betrifft ein""neues Verfahren zur Herstellung von L-a-Glycerylphosphorylcholin der nachfolgend angegebenen Formel (i) in einem hochreinen Zustand sowie das dabei erhaltene Produkt«

Wenn L-a-Glycerylphosphorylcholin der Formel

CH₉OH S ² HO-C-H 0®

intramuskulär oder oral verabreicht wird, so schützt es, wie festgestellt wurde, das Lebergewebe gegen das Eindringen von Fett, das durch eine hyperlipoproteinhaltige Diöt oder durch eine Vergiftung durch Tetrachlorkohlenstoff hervorgerufen wird. Es wurde auch gefunden, daß die Verabreichung von L-a-Glycerylphosphorylcholin gegen Cholestase schützte

Eine wichtige Tatsache, die festgestellt wurde, ist die, daß

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das Glycerylphosphorylcholin in die Struktur der Lipoproteine eintritt. Pharmokinetische Untersuchungen haben gezeigt, daß das Glycerylphosphorylcholin von dem Intestinum oder an der Stelle der intramuskulären Inokulation schnell absorbiert wird. Es zirkuliert im Blutstrom und gelangt in die Organe, insbesondere in die Leber, die Nieren und in das Gehirn. Insbesondere in der Leber wird es in den Kreislauf zurückgeführt, wobei es in den Lipoproteinen enthalten ist. Aufgrund dieses Verhaltens wird angenommen, daß Glycerylphosphorylcholin das Serum klärt bzw. reinigt.

L-a-Glycerylphosphorylcholin der oben angegebenen Formel (I) kann hergestellt werden durch Hydrolyse von Lecithin, insbesondere von Eilecithin. Das Hauptproblem, das bei der Herstellung von L-a-Glycerylphosphorylcholin auftritt, ist seine Reinigung; die Nebenprodukte, welche das durch Hydrolyse erhaltene L-a-Glycerylphosphorylcholin (i) begleiten, verringern seinen therapeutischen Wert und führen häufig zu unerwünschten Nebenwirkungen. Es wurden jedoch einige verhältnismäßig erfolgreiche Versuche gemacht, die Verbindung (i) in besonders reiner Form herzustellen. So ist in der US-Patentschrift 2 864 848 ein Verfahren beschrieben, bei dem die Hydrolyse von Lecithin in Gegenwart von Quecksilber-(il)chlorid durchgeführt wird, das verwendet wird, um die Nebenprodukte in Form von Quecksilber(ll)salzen auszufällen; bei diesem Verfahren ist es dann erforderlich, aus dem Glycerylphosphorylcholin die überschüssigen'Quecksilber(ll)ionen zu entfernen, die bekanntlich toxisch sind, und dies wird durchgeführt unter Anwendung einer komplizierten Behandlung mit H«S und BaCO-. In dieser Patentschrift ist darüber hinaus angegeben, daß durch diese Behandlung

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nicht alle Quecksilber(ll)ionen in ausreichendem Maße entfernt werden und daß daher nachfolgende zusätzliche Reinigungsprozesse erforderlich sind. Insbesondere muß das Endprodukt durch Bildung eines Komplexes mit Cadmiumchlorid gereinigt werden₀ Der Gesamtarbeitsgang ist somit sehr kompliziert und das Endprodukt ist nicht frei von Schwermetallen,?

Ein zu dem vorstehend beschriebenen Verfahren analoges Verfahren ist in "Biochemical Preparation¹", Band 6, S₀ 16 bis 19, beschrieben* Die Entfernung des Cadmiums am Ende der Reaktion erfolgt in diesem Falle Ir- der Weise,, daß man da§ Reaktionspro« dukt über ein Gemisch von Austauscherharzen laufen lößto Dadurch wird ebenfalls das Verfahren kompliziert und dies führt darüber hinaus zu einer Abnahme der Produktausbeuteo

Als Alternative zur Hydrolyse beschreibt Brockerhoff im "Journal Li pid Research", 4, 96 (1963) die Methanolyse einer sehr verdünnten Lecithinlö'sung (etwa 21 g/l) mit Natriummethylat, das in einer Menge von 3 Hol Methylat pro Mol Phosphatid verwendet wird« Die unter diesen Bedingungen durchgeführte Methanolyse führt, wie gefunden wurde, zu einer partiellen Spaltung der P-O-Bindung unter Bildung von schädlichen Nebenprodukten sowie zu der ge« wünschten Spaltung der Aeyl-Sauerstoff-Bindung, Okui et al beschreiben in "Yakugaku Zasshi", 84 (12), 1200-1209 (1964), die ■Herstellung der Verbindung (l) aus Eilecithin durch Hydrolyse, die unter Verwendung von Erdalkalimetallhydroxiden durchgeführt wird. Das dabei erhaltene Produkt ist jedoch durch Sekundärekom=· ponenten sehr stark verunreinigt_o Brockerhoff und Yurkowski weisen in einer kurzen Notiz im "Canadian Journal of Biochemistry",

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43, 1777 (1965), darauf hin, daß die Herstellung der Verbindung (I) erfolgen kann durch Hydrolyse von Lecithin mit einer quaternären Ammoniumbase (Tetrabutylammoniumhydroxid); dabei schreitet die Hydrolyse in zufriedenstellender Weise fort, wie Chadha in "Chem. Phys. Lipids", 4, 104-108 (1970), gezeigt hat. Die Gesamt hydrolyse mit dieser Base ist jedoch kommerziell kostspielig und ~- man erhält kein Glycerylphosphorylcholin, das frei von Tetrabutylammoniumhydroxid ist, das in einem Kristallisationsgang von der Verbindung (i) abgetrennt werden muß. Darüber hinaus eignet sich dieses unbefriedigende Verfahren nicht für die Herstellung in einem großtechnischen Maßstabe, da es nicht reproduzierbar ist.

Schließlich wird von Cubero Robles und Roels in "Chem. Phys. Lipids", 6, 31-38 (1971), ein Verfahren beschrieben, bei dem L-a-Glycerylphosphorylcholin erhalten wird durch Methanolyse eines Fettextrakts, der beim Zerkleinern von Eigelb (Eidotter) erhalten wird. Das von diesen Autoren beschriebene Verfahren umfaßt die Extraktion des Pulvers mit Chloroform/Methanol, die Verdampfung dieses Lösungsmittelgemisches, die Auflösung des Rückstandes in Äther und die Behandlung der ätherischen Lösung mit Lithiummethylat. Dieses

zuletzt genannte Reagens wird in einer Menge von 1 Mol pro Mol Phosphatid verwendet. Die Behandlung mit diesem Reagens fuhrt ζυ einer Mischung aus Glycerylphosphorylcholin (GPC) und Glycerylphosphoryläthanolamin (GPE). Nach der Neutralisation dieser Mischung mit HCl werden das GCP und das GPE durch Chromatographie an Siliciumdioxid voneinander getrennt. In der Praxis wurde festgestellt, daß diese Chromatographie zu GPC führt, das durch kolloidale Kieselsäure verunreinigt ist (wie voraussehbar, wenn man Wasser als Eluierungsmittel verwendet)» Das Kieselsäure-

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Verunreinigungsmittel ist nur durch wiederholte Kristallisationen des Endproduktes entfernbar» Diese Kristallisationen sind sehr schwierig durchzuführen.

Zusammenfassend kann gesagt werden, daß die vorstehend beschriebenen Verfahren zur Herstellung von GPC mit einer zufriedenstellenden Reinheit im allgemeinen umständlich und unwirtschaftlich für die Durchführung in einem großtechnischen Maßstabe sind«

Es wurde nun überraschend gefunden, daß GPC in hoher Reinheit und in hoher Ausbeute und nach jsinern verhältnismäßig einfachen Verfahren, das ohne Schwierigkeiten in einem großtechnischen Maßstäbe durchgeführt werden kann, erhalten werden kann, wenn die Methanolyse von gereinigtem Lecithin in Gegenwart einer katalytischen Menge Natriummethylat, bezogen auf die verwendete Lecithinmenge, durchgeführt wird.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von L-a-Glycerylphosphorylcholin der Formel

. CH₀OH
I 2

HO-C-H (F . (I)

CR-O-PC

in einem reinen Zustand, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man gereinigtes Lecithin einer durch Natriummethylat katalysierten Methanolyse unterwirft.

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Gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung erhält man L-a-Glycerylphosphorylcholin in reinem Zustand, wenn man Lecithin in Gegenwart einer katalytischen Menge Natriummethylat einer Methanolyse unterwirft. Das Verfahren kann in einem großtechnischen Maßstabe wirtschaftlich durchgeführt werden,· weil das gewünschte Reakiionsprodukt leicht abgetrennt (gewonnen) werden kann.

•Das dabei erhaltene Produkt ist genügend rein, so daß es weder einer Umkristallisation, die wie oben angegeben besonders schwierig ist, noch einer Komplexbildung mit CdCl^ unterworfen werden muß, wobei diese-beiden Reinigungsverfahren für die Durchführung in einem großtechnischen Maßstabe nicht geeignet sind*

Die Methanolyse wird bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens vorzugsweise in der Weise durchgeführt, daß man eine methanolische Lösung von gereinigtem Lecithin, die vorzugsweise etwa 39 Gew„-# Lecithin und katalytische Mengen CH₀ONa enthält, etwa 60 Minuten lang bei Umgebungstemperatur stehen läßt. Das Cf^-LONa wird vorzugsweise in einer Menge von 0,01 bis 0,1, insbesondere von 0,05 Mol pro Mol Lecithin verwendet. Am Ende der Reaktion werden die Fettsäureester, die sich während der Umsetzung abgeschieden haben, entfernt und die zurückbleibende Methanollösung wird mit etwa 8 Äqaivalenten eines schwach kationischen Harzes IR-C50 (FT) pro Äquivalent Natriummethylat behandelt, um die Natriumionen zu eliminieren.

Das Eluat und die Waschwässer aus dem Harz werden durch Eindampfen unter vermindertem Druck (beispielsweise von 12 mm Hg) auf ein ge-

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ringes Volumen eingeengt und nach dem Verdünnen mit Wasser mit Chloroform extrahiert zur Entfernung der letzten Spuren der Fettsäureester, der letzten Spyren von nicht=deacyliertem oder teilweise deaeyliertem Lecithin und der Spuren von Sphingomyelin, die im allgemeinen in dem aus Eiern erhaltenen Lecithin zu finden sindo Die wäßrige Phase wird unter vermindertem Druck zur Trockne ■ ©ingedampft und dann wird gewUnschtenfalls das Produkt mit Kohle ¹SL 50 entfärbte

Das dabei erhalten© Produkt ist frei von Hydrolyseverunreinigungen, von anorganischen Salzen und von Fettsäureestern und es weist keine wesentlichen Unterschiede in bezug auf seine Eigenschaften gegenüber den Proben von GPC auf, das durch Bildung des Komplexes mit CdCl«, aufeinanderfolgende Kristallisationen, Zersetzung desselben durcH Überleiten desselben über Austauscherharze und schließlich Kristallisation des dabei erhaltenen L-a-Glyceryl= phosphoryichoiins erhalten worden war ο

Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene L=a~Glyceryi» phosphorylcholin v/eist im allgemeinen ©inen Feuchtigkeitsgehalt von etwa 15 GeWo·=^ auf ο Die Feuchtigkeit kann gewUnschtenfalls entfernt werden durch Trocknen über P₀Og unter einem Hochvakuum und onschließende wiederholte Kristallisationen aus Äthanol/Di => öthyiäther oder Äthanol/Xthylacetat; der dabei erhaltene farblose hygroskopische Feststoff schmilzt bei 130 bis 131⁰C und hat die

Summenformel C_QH,._ANOJPo *
ο 20 6

Eine solche Arbeitsweise ist nicht erforderlich, wenn es erwünscht ist, das L~a~Glyeerylphosphorylchoiin in wäßriger Lösung oder

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sonst in Verbindung mit anderen aktiven Wirkstoffen in injizierbaren lyophilisierten Arzneimitteln zu verwenden, wie dies üblicherweise der Fall ist. Es ist heute möglich, das amorphe Produkt als solches zu verwenden, ohne daß es aufeinanderfolgenden Reinigungen unterworfen v/erden muß, da die Reinheit des deacylierten Phosphatide von allen Gesichtspunkten aus betrachtet mehr als zufriedenstellendist.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein.

Beispiel I

a} Reinigung von Lecithin

Als Ausgangsmaterial wurde Lecithin aus einem rohen Ei (alkalilabilerP 2,7 bis 2,85 %, P von Glycerylphosphorylcholin 2,24 bis 2,52 %) verwendet. Eine Lösung von 0,5 kg rohem Lecithin in 1 1 Methylenchlorid wurde in 6 1 Aceton gegossen, das bei 5 C gerührt wurde₀ Nach 60 Minuten wurden die Flüssigkeiten dekantiert und die Reinigung wurde durchgeführt durch Auflösen des Rückstandes

in 1 1 Methylenehlorid und Gießen der Lösung in 6 1 Aceton wie oben angegeben. Der gebildete Niederschlag wurde abfiltriert und bei Umgebungstemperatur unter Vakuum (12 mm Hg) getrocknet (320 g)_o

Eine Lösung von 320 g Lecithin in 650 ml Ghloroform/Methanol menverhältnis IiI) wurde an 1,4 kg Al«0g ehromatographiert, wobei die Elution mit 3,5 1 Chloroform/Methanol (Volumenverhältnis lsi) durchgeführt wurde* Das Eluat wurde bei einer Temperatur von 40 C unter Vakuum (12 mm Hg) zur Trockne eingeengt und dann erneut

*tgesetzlich geschützten

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in 350 ml Methylenchlorid gelöst, zentrifugiert und bei 5 C unter Rühren in 2,4 1 Aceton gegossen»

Nach 60-minütigem Stehenlassen bei 5 C wurde der gebildete Niederschlag abfiltriert und bei Umgebungstemperatur unter Vakuum (12 mm Hg) getrocknet, wobei man 210 g reines Lecithin erhielt (alkalilabiler Ps 3,70 - 3,80 %, P von Glycerylphosphorylcholin 3,70 bis 3,80 %).

b) Herstellung von. L°«°Glycerylphosphorylcholin Eine Lösung von etwa 500 g„(0,7 Mol) des in dem obigen Abschnitt (a) erhaltenen gereinigten Lecithins in 1 1 wasserfreiem Methanol, das 0,039 Mol Natriummethylat enthielt, wurde 60 Minuten lang bei Umgebungstemperatur stehen gelassen ο Die gebildete ölige Schicht wurde abgetrennt und dann wurde die Lösung durch ein Bett aus 80 g des Harzes IR C 50 » mit einer Höhe von 50 cm filtriert, wobei das adsorbierte Material anschließend mit Methanol eluiert wurde, das jeweils in 1 !^Mengen verwendet wurdeo Das Eluat wurde bei 40 C unter Vakuum (12 mm Hg) bis auf ein Volumen von etwa 1 1 eingeengt, dann mit 550 ml Wasser verdünnt und mit 4 χ 400 ml Chloroform extrahierte

Die wäßrige Phase v/urde bei 40 C unter Vakuum (12 mm Hg) zur Trockne eingeengt, der Rückstand wurde in 410 ml Wasser gelöst, es wurden 12 g entfärbende Kohle zugegeben und die wäßrige Phase wurde 15 Minuten lang bei Umgebungstemperatur gerührte Dann wurde über Millipore filtriert und das Lösungsmittel wurde bei 40 C unter vermindertem Druck (12 mm Hg) entfernt, wobei man 165 g L-tt-Giycerylphosphorylchoiin in reiner amorpher Form erhielt.

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_m 12..

H₂O = 15,5 %

Gesamt-P =84,1 %

Phosphor nach der chromatographischen Trennung: 83,94 % Vicinales Glycol: 84,59 %

Spaltungsprodukte der P-O-Bindung wurden nicht festgestellt, was durch Durchführung einer Analyse mit der Probe gemäß Brockerhoff (vgl. "J. Lipids Research", 4, 96 (1963)) oder gemäß Dawson (vgl. "J. Biochem.", 75, 45 (i960)) überprüft wurde. Eine bei 0,05 mm Hg über Pn^ 5 getrocknete Probe wurde aus Äthanol/Athyläther (mit- 99, % Äthanol) kristallisiert, wobei man einen weißen, hygroskopischen, kristallinen Feststoff erhielt, der bei 130 bis 131°C schmolz, «_D = -2,84° (10 % in H₂O). ber.: C = 37,35, H = 7,84, N = 5,45, P = 12,04 gef.: 37,50 7,70 5,38 12,06 %

ber.: Cholinester = 47,12 %
gef.: 46,92 %

vicinales Glykol = 99,8 %.

Beispiel 2

Als Ausgangsmaterial wurde Sojalecithin (alkalilabiler Phosphor: 2 %, minimaler P von GPC: 0,5 %) verwendet. Eine Suspension von 600 g dieses Lecithins in 600 ml Methanol wurde 60 Minuten lang bei Umgebungstemperatur gerührt. Sie wurde 60 Minuten lang bei 5⁰C stehen gelassen und dann wurde das Lösungsmittel dekantiert, der Rückstand wurde mit 300 ml Methanol gewaschen. Der Methanolextrakt wurde 18 Stunden lang bei 5 C stehen gelassen, dann wurde er filtriert und bei 40 C unter vermindertem Druck (12 mm Hg) zur Trockne eingeengt (70 g) (alkalilabiler P: 3,0-3,1 %-,

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P von Glycerylphosphorylcholins 2,0 bis 2,1 %)* Nach wiederholter Reinigung des Rückstandes erhielt man 20 g reines Lecithin.

Das Lecithin wurde auf die gleiche Weise wie das in Beispiel 1

verwendete Eilecithin behandelt. Dabei wurde GPC in gleicher

Reinheit und mit praktisch identischer Ausbeute wie in Beispiel 1 erhalten.

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Claims

8900 Augsburg 22, 4.1.1980

SS S9 . TRlSt-ON 96096

AUGSBURG 22

Patentanspruch

\ 1 · J Verfahren zur Herstellung von L-a-Glycerylphosphoryl» cholin der Formel

CH₉OH .,

HO-C-H (P t r

O 0-CH₂-CH₂-W(CH₃).

in reinem Zustand, dadurch gekennzeichnet daß man gereinigtes Lecithin einer durch Natriummethylqt katalysierten Methanolyse unterwirft«
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, man pro Mol Lecithin 0,01 bis 0,1 Mol QLONg verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man pro Mol Lecithin 0,05 Mol CH-ONa verwendet«
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man es bei Umgebungstemperatur durchfuhrt.

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5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man es über einen Zeitraum von etwa Minuten durchführt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man gereinigtes Eilecithin verwendet.
7» Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man gereinigtes Sojalecithin verwendet.
8. L-a-Glycerylphosphor^lcholin, dadurch gekennzeichnet, daß es nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis hergestellt worden ist.

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