DE2326033C2

DE2326033C2 - Peptide und deren Derivate sowie diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel mit psychopharmakologischer Wirkung

Info

Publication number: DE2326033C2
Application number: DE2326033A
Authority: DE
Inventors: Hendrik Marie Heesch Greven
Original assignee: Akzo NV
Current assignee: Akzo NV
Priority date: 1972-05-24
Filing date: 1973-05-22
Publication date: 1983-10-27
Also published as: AU5575073A; CA1030954A; NL175988C; HU169159B; JPS4948666A; US3850904A; JPS5747667B2; SE407215B; GB1435384A; NL7206941A; NL175988B; ZA733211B; FR2185412A1; FR2185412B1; BE799939A; CH587229A5; DE2326033A1; AU470908B2

Description

A Methionyl,

Methionylsulfoxid,

Methionylsulfon,

Desaminomethionyl,

Desaminomethionylsulfoxid,

Desaminomethionylsulfon oder

eine Gruppe H₂N—B—CG—, in der
B eine verzweigte oder nicht verzweigte Alkylen-

gruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeutet, GIx Glutamyl oder Glutaminyl,

Z Hydroxyl,
Tryptophyl,
Phenylalanyl,
Tryptophylglycyl,
Phenylalanylglycyl,
N-(^-Indolyläthyl)-amino oder

eine Gruppe —NH--Alkin der

Alk

CH₂-CH₂-,
-CH₂-CH₂-CH₂-
oder
-CH-CH₂-

CH₃

bedeutet sowie deren pharmakologisch geeignete Säureadditionssalze, Zinkkomplexe, an der Carbonamidgruppe nicht oder durch Alkylgruppen mil I bis 6 Kohlenstoffatomen substituierte Amide und Ester, die von aliphatischen Alkoholen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen abgeleitet sind.

2. Peptide nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Glutamyl bzw. Glutaminyl in der L-Konfiguration und Histidyl in der D-Konfiguration vorliegt.

3. Peptide nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß B —CH₂—CH₂— bedeutet.

4. Peptide nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß A Methionylsulfon oder Desaminomethionylsulfon bedeutet.

5. Arzneimittel mit psychopharmakologischer, insbesondere antidepressiver Wirkung, enthaltend als Wirkstoff ein Pentapeptid nach Anspruch 1.

Peptide und deren Derivate sowie diese
Verbindungen enthaltende Arzneimittel mit psychopharmakologischer Wirkung

Aus European Journal of Pharmacology 2, 14 (1967) ist bekannt, daß bestimmte Peptidfragmente von natürlichen adrenocorticotropen Hormonen (ACTH) die Auslöschung der erworbenen Ausweichreaktion hemmen. Besonders das Peptid mit der Aminosäuresequenz

ίο 1-10 des ACTH erwies sich in dieser Beziehung als wirksam. Darüberhinaus hat es sich gezeigt, daß die drei ersten Aminosäuren (Ser-Tyr-Ser) sogar vollständig weggelassen werden konnten ohne daß eine wesentliche Einbuße an Aktivität auftrat. Der Artikel endet mit der Schlußfolgerung, daß das Peptid mit der Aminosäuresequenz 4-10 des ACTH, nämlich H-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-OH, das kürzeste Peptid ist und vielleicht die Schlüsselsequenz für die erwähnte Aktivität.

Das Peptid mil der Aminosäuresequenz 4-10 des ACTH zeigt nicht nur die oben erwähnte psychopharmakologische Aktivität, sondern auch eine leichte MSH-Aktivität, wie sie bei derartigen Fragmenten von ACTH üblich ist. Obwohl die Wirkung einer niedrigen Dosis eines MSH-aktiven Peptids beim Menschen noch nicht bekannt ist, wurden Untersuchungen angestellt, um Peptide zu finden, die mindestens die gleiche psychopharmakologische Aktivität besitzen, aber keine oder nur eine verminderte MSH-Aktivität.

Einem älteren Vorschlag (DE-OS 23 15 826) ist zu entnehmen, daß eine wesentliche Zunahme der psychopharmakologischen Aktivität erzielt werden kann durch Ersatz der Aminosäure L-Arginin oder L-Lysin des ursprünglichen 4-10 ACTH-Peptids durch die entsprechende D-Aminosäure.

Überraschenderweise hat es sich nun gezeigt, daß eine Zunahme der psychopharmakologischen Aktivität auch erreicht werden kann durch Ersatz des Aminosäurerestes L-GIu (Q) oder L-His des ursprünglichen 4-10 ACTH-Peptids oder eines der modifizierten Peptide durch den entsprechenden D-Aminosäurerest.

Die Erfindung betrifft daher die im Hauptanspruch nähergekennzeichneten Peptide und Peptidderivate sowie die in Anspruch 5 angegebenen Arzneimittel.

Durch Ersatz eines der Aminosäurereste L-GIu oder L-His des ursprünglichen 4-10 ACTH-Peptids durch den entsprechenden D-GIu- oder D-His-Aminosäurerest steigt die beobachtete psychopharmakologische Aktivität im allgemeinen um den Faktor 3.

Wenn diese Modifikation an einem der in dem oben erwähnten älteren Vorschlag angegebenen Peptide durchgeführt wird, führt das zu einem weiteren Ansteigen der Aktivität.
Besonders bevorzugt sind erfindungsgemiiße Peptide, bei denen die Aminosäure Histidin in der D-Form vorliegt.

Besonders hat es sich gezeigt, daß die folgenden Polypeptide starke psychopharmakologische Aktivitäten besitzen.

H-L-Met-L-Glu-D-His-L-Phe-L-Arg (oder L-Lys)-L-Phe-Oh,

Desamino-Met-L-Glu-D-His-L-Phe-L-Arg (oder
L-Lys)-L-Phe-OH,

μ H-L-Met (—> O^-L-GIu-D-His-L-Phe-L-Arg (oder L-Lys)-Tra,

H-L-Met-L-Glu-D-His-L-Phe-L-Arg (oder L-Lyst-Tra.

H-L-Met-L-Glu-D-His-L-Phe-L-Ajg (oder

PPA, V ::: .-:

H-L-Met (—+ΟΗ,-Glu-D-Hjs-L-Phe-L-Arg (pder L-Lys)-L-Phe-OH,

H-L-Met-D-Glu-L-His-L-Phe-L-Arg (oder L-Lys)-L-Phe-OH,

H-jS-Ala-L-Glu-D-His-L-Phe-L-Arg (oder L-Lys)-L-Phe-OH,

Desamino-Met-L-Glu-D-His-L-Phe-L-Arg (oder L-Lys)-Tra und das entsprechende Sulfoxid und Sulfon,

H-L-Met-L-Glu-D-His-L-Phe-p-Lys-L-Phe-OH

und das entsprechende Sulfoxid und Sulfon.

Die erfindungsgemäßen Peptide und Peptidderivatc werden nach einem Verfahren hergestellt wie es üblicherweise in der Peptidchemie angewandt wird.

Die Aktivierung der Carboxylgruppe kann erreicht werden z. B. durch Umwandlung der Carboxylgruppe in ein Säurehalogenid, ein Azid, Anhydrid, Imidazolid oder einen aktivierten Ester wie den N-Hydroxysuccinimidoester oder den p-Nitrophenylester.

Die Aminogruppe kann aktiviert werden durch Umwandlung in ein Phosphitamid oder nach dem Phosphorazo-Verfahren.

Verfahren, die üblicherweise für die oben angegebenen Kondensationsreaktionen angewandt werden, sind: Das Carbodiimid-Verfahren, das Azid-Verfahren, das gemischte Anhydrid-Verfahren und das Verfahren der aktivierten Ester wie sie in »The Peptides«, Bd. 1, 1965 (Acad. Press) von E. Schröder und K. Lübke beschrieben sind. Außerdem kann Merrifield's sogenanntes Festphasenverfahren (J. Am. Chem. Soc. 85, 2149 [1963]) zur Herstellung der erfindungsgemäßen Peptide und Peptidderivate angewandt werden.

Die reaktionsfähigen Gruppen, die an der Kondensationsreaktion nicht teilnehmen dürfen, werden durch Schutzgruppen geschützt, die leicht wieder z. B. durch Hydrolyse oder durch Reduktion entfernt werden können. So kann z. B. eine Carboxylgruppe geschützt werden durch Veresterung mit Methanol, Äthanol, tert.-Butanol, Benzylalkohol oder p-Nitrobenzylalkohol oder durch Umwandlung in ein Amid. Diese zuletzt genannte Schutzgruppe ist jedoch sehr schwer zu entfernen, so daß es zu empfehlen ist, diese Gruppe nur anzuwenden, um die Carboxylgruppe der Aminosäure mit endständigem C-Atom in dem letzten Peptid oder die y-Carboxylgruppe von Glutaminsäure zu schützen. In diesem Fall führt die Peptidsynthese direkt zu dem Amid eines Peptids der Formel I.

Gruppen, die zum Schutz der Aminogruppe geeignet sind, sind üblicherweise Säuregruppen, z. B. eine Säuregruppe, die abgeleitet ist von einer aliphatischen, aromatischen, araliphatischen oder heterocyclischen Carbonsäure wie Essigsäure, Benzoesäure oder Pyridincarbonsäure, oder eine saure Gruppe, die abgeleitet ist von Kohlensäure wie die Gruppe Äthoxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl, tert.-Butyloxycarbonyl oder p-Methyloxybenzyloxycarbonyl, oder eine saure Gruppe, die abgeleitet ist von einer Sulfonsäure wie die Gruppe Benzolsulfonyl oder p-Toluolsulfonyl. Es können jedoch auch andere Gruppen angewandt werden wie substituierte oder unsubstituierte Aryl- oder Aralkylgruppen, z.B. die Benzyl- und Triphenylmethylgruppe, oder Gruppen wie o-Nitrophenylsulfenyl- und 2-Benzoyl-l-methylvinylgruppe.

Es ist besonders zu empfehlen, auch die Guanidingruppe von Arginin, die f-Aminogruppe von Lysin und die Imidazolgruppe von Histidin zu schützen, aber dieser Schutz ist nicht unbedingt notwendig. Übliche ;, Schutzgruppen in diesem Zusammenhang sind die tert.-Butyloxycarbonyl- oder eine Tosylgruppe für die ε-Aminogmppe von Lysin, eine Nitrogruppe für die Guanidingruppe von Arginin und eine Benzyl-, Dinitropnenyl- oder eine Tritylgruppe für die Imidazolgruppe von Histidin.
Die Schutzgruppen können nach verschiedenen übliehen Verfahren je nach der Art der Gruppe abgespalten werden, z.B. mit Trifluoressigsäure oder durch milde Reduktion, z. B. mit Wasserstoff und einem Katalysator wie Palladium oder mit HBr in Eisessig.
Erfindungsgemäße Peptide, die als Gruppe mit endständigem Stickstoffatom eine Methionylsulfoxid- oder Desaminomethionylsulfoxidgruppe besitzen, können aus dem entsprechenden Methionyl oder Desaminomethionyl-Peptid hergestellt werden mit Hilfe einer an sich bekannten milden Oxidation, z. B. mit verdünntem Wasserstoffperoxid oder einer Persäure. Diese Oxidation führt zu einem Gemisch des S- und R-Sulfoxids (d- oder 1-Sulfoxid), das auf übliche Weise in die einzelnen diastereomeren Verbindungen aufgespalten werden kann. Durch Kupplung des S- oder R-Sulfoxids (d- oder 1-Sulfoxid) von Methionin oder Desaminomethionin mit dem Peptid H-Glx-His-X, in dem GIx oder His in der D-Form vorliegt und X die oben angegebene Bedeutung hat, können die einzelnen Enantiomere auch auf direktem Weg erhalten werden.

Die erfindungsgemäßen Peptide, die als Rest mit endständigem Stickstoffatom eine Methionylsulfon- oder Desaminomethionylsulfon-Gruppe besitzen, können am bequemsten hergestellt werden durch eine an sich bekannte Oxidation des entsprechenden Methionyl- oder Desaminomethionyl-Peptids, z.B. mit H₂O₂ oder einer Persäure.

Die Säureadditionssalze werden erhalten durch Umsetzung der erfindungsgemäßen Verbindungen mit einer pharmazeutisch verträglichen organischen oder anorganischen Säure wie HCl, Phosphorsäure, Essigsäure, Maleinsäure, Weinsäure oder Zitronensäure.

Die erfindungsgemäßen Peptide und Peptidderivate besitzen wertvolle psychopharmakologische Aktivitäten. Die erfindungsgemäßen Verbindungen hemmen die Auslöschung der erworbenen Ausweichreaktion, d. h. sie können im allgemeinen als antidepressive Mittel angewandt werden. Besonders können sie angewandt werden zur Behandlung bestimmter Geistesstörungen, bei denen eine Stimulation der geistigen Reaktion erwünscht ist, wie bei bestimmten Arten von Neurose und bei Altersschwäche (Senilität).

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können parenteral, oral, sublingual, rektal oder intranasal verabreicht werden. Vorzugsweise werden die Peptide in einer Form zubereitet, die zur parenteralen Verabreichung geeignet ist. Zu diesem Zweck werden sie in einer geeigneten Flüssigkeit gelöst, suspendiert oder emulgiert. Im Gemisch mit geeigneten Hilfsmitteln und/ oder Füllstoffen können die Peptide auch in einer Form zubereitet werden, die geeignet ist zur oralen, sublingualen, rektalen oder intranasalen Verabreichung.

Die erfindungsgemäßen Peptide oder Peptidderivate werden vorzugsweise parenteral in einer täglichen Dosis von 0,01 ,ugbis 100 μg pro Kilogramm Körpergewicht je nach der Aktivität des Peptids verabreicht. Zur oralen, sublingualen, rektalen oder intranasalen Verabreichung kann die tägliche Dosis wesentlich höher sein, vorzugsweise 0,1 bis 100 mg pro Kilogramm Körperge-

wicht betragen.

Besonders wertvolle Zubereitungen werden erhalten, wenn die erfindungsgemäßen Peptide in einer Form zubereitet werden, in der sie eine verlängerte Wirksamkeit besitzen, z.B. eingebaut in Gelatine, Polyphloretinphosphat oder Polyglutaminsäure oder vorzugsweise als Zinkkomplexe. Diese Zinkkomplexe können erhalten werden durch Zusammenbringen der Peptide mit schwer löslichen Zinksalzen, Zinkhydroxid oder Zinkoxid. Als schwer lösliche Zinksalze werden üblicherweise isie Phosphate, Pyrophosphate und Polyphosphate verwendet.

Die Herstellung dieser Zinkkomplexe findet auf übliche Weise statt.

Zum Beispiel kann ein Zinkkomplex erhalten werden durch Zugabe des Peptids und eines schwer löslichen Zinksalzes, Zinkhydroxids oder Zinkoxids zu einem wäßrigen Medium. Der Zinkkomplex kann auch erhalten werden durch Zugabe eines alkalischen Mediums zu einer wäßrigen Lösung des Peptids und eines unlöslichen Zinksalzes zur Bildung des unlöslichen Peptid/ Zinkhydroxid-Komplexes.

Außerdem kann der Zinkkomplex erhalten werden durch Zugabe des Peptids, eines löslichen Zinksalzes und eines löslichen Salzes zu einem wäßrigen, vorzugsweise alkalischen Medium unter Bildung eines unlöslichen Peptid/Zinksalz-Komplexes in situ. Die Zinkkomplexe können sofort als Suspensionen angewandt werden oder sie können ,?. B. lyophilisiert und anschließend erneut suspendiert werden.

Biologische Wirksamkeit
Auslöschung der erworbenen Ausweichreaktion

Männliche weiße Ratten, die jeweils ungefähr 150 g wogen, wurden mit Hilfe des sogenannten Polsprungtests konditioniert. Der konditionierte Stimulus war ein

ίο Licht, das 5 Sekunden lang über dem Käfig erschien, woraufhin der nichtkonditionierte Stimulus eines Schocks durch den Gitterboden des Käfigs erfolgte.

An drei aufeinanderfolgenden Tagen wurden jeden Tag 10 Versuche mit einem mittleren Interval von 60 Sekünden durchgeführt. Am Tag nach dieser Lernperiode ■wurde die Auslöschung in Untersuchungen von 10 Einzelversuchen untersucht. Alle Tiere, die bei dem ersten Auslöschungsversuch acht oder mehrmals positiv reagierten, wurden mit der zu untersuchenden Substanz oder mit einem Placebo behandelt. Anschließend wurden Auslöschungsversuche von jeweils 10 Einzel versuchen 2 und 4 Stunden nach der Behandlung des Tiers mit der zu untersuchenden Substanz durchgeführt.
In der folgenden Tabelle sind die mit dem bekannten Peptid 4-10 ACTH erhaltenen Ergebnisse mit denjenigen für einige der erfindungsgemäßen Peptide erhaltenen Ergebnissen verglichen.

Peptid	Dosis in ug	Erste Unter-	Zweite	Dritte	Errechnetes
	pro Tier s. c.	suchg.	Unter-	Unter-	Verhältnis
		Oh	suchg.	suchg.	der Wirksam
			2 h	4 h	keit
					(4-10
					ACTl -I = 1)

H-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-OH (4-10 ACTH)

H-Met-Glu-D-Häs-Phe-OH

H-Met-Glu-D-His-Phe-Lys-Phe-OH

H-Met-Glu-D-His-Phe-Lys-Tra

H-Met-D-Gln-His-Phe-Lys-Phe-OH

H-Met-Glu-D-His-Phe-Lys-PPA

H-Met (—>· O)-Glu-D-His-Phe-Lys-Phe-OH

H-jS-Ala-Glu-D-His-Phe-Lys-Phe-OH

H-Met-Glu-D-His-Phe-Lys-Trp-OH

H-Met-D-Glu-His-Phe-Lys-Trp-OH

H-Met-D-Glu-His-Phe-D-Lys-Phe-OH H-Met-Glu-D-His-Phe-D-Lys-Phe-OH Η-Met _vC₂)-D-Glu-His-Phe-D-Lys-Phe-OH Η-Met (O₂)-Glu-D-His^Phe-D-Lys-Phe-OH

100 30 10

10
9

9 9

7
5
3

7 4

>3

50

100

50

1-3

30

100

3000

Für die Beschreibung, die Beispiele und die Ansprüche gilt das folgende:

Wenn keine optische Konfiguration angegeben ist, ist die L-Form gemeint.

Die folgenden Abkürzungen werden für die Schutzgruppen oder Aktivierungsgruppen verwendet.

Boc

ONB

tBu

BzI

Me

ONP

Su

= Benzyloxy-carbonyl

= tert.-Butyloxy-carbonyl

= Nitrobenzyloxy

= tert-Butyl

= Benzyl

= Methyl

= p-Nitrophenyloxy

= Succinimid

Für die Lösungsmittel oder Reagenzien werden die folgenden Abkürzungen verwendet.

Bz	= Benzol
To	= Toluol
EtOH	= Äthanol
Bu	= Butanol
Py	= Pyridin
Ac or Hac	= Essigsäure
Fo	= Ameisensäure
Am	= Amylalkohol
iPro	= Isopropanol
DMF	= Dimethylfomamid
THF	= Tetrahydrofuran
DCCI	= Dicyclohexyl-carbo-
	diimid
DCHU	= Dicyclohexylharnstoff
TAA	= Triäthylamin
TFA	= Trifluoressigsäure
Wa	= Wasser

Für die Aminosäuren werden die folgenden Ab kürzungen verwendet.

-

Met	= Methionyl
Met (—»Oj	= Methionylsulfoxid
	(Rac.)
Met (d, —> O)	= Methionyl(d)sulfoxid
Met (1, —» O)	= Methionyl(l)sulfoxid
Met (—»Oj)	= Methionylsulfon
GIu (Q) oder GIu	= Glutamyl (Q = OH)
GIu (Q) oder GIn	= Glutaminyl (Q = NH·,)
His	= Histidyl
Phe	= Phenylalanyl
Arg	= Arginyl
Lys	= Lysyl
GIy	= Glycyl
VaI	= Vaiyl
AIa	= Alanyl
/?-Ala	= jS-Alanyl
(α-Mel AIa	= ff-Methylalanyl

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Abkürzungen, die für andere Reste angewandt werden

Tra

PEA

PPA

Desamino-Met

Desamino-Met (—>Ό)
Desamino-Met (—>0₂)

= (N-jS-Indolyläthyl)-

aminogruppe

(abgeleitet von Trypt-

amin)
= (N-Phenyläthyl)amino-

gruppe
= (N-Phenylpropyi)-

aminogruppe
= Desaminomethionyl

(oder y-Methylthio-

butyryl)
= Desaminothionylsulf-

oxid
= Desaminomethionyl-

sulfon.

Amf

= (N-1-Phenylisopropyl)-aminogruppe (abgeleitet von Amphetamin)

Herstellung der Ausgangssubstanzen

A. Synthese von Boc-Met-D-Glu (OtBu)-HiS-N₂H₃
1) Z-D-GIu (OtBu)-His-OMe

6,62 g Z-D-GIu (OtBu)-OH wurden in 30 cm³ Acetonitril gelöst. Diese Lösung wurde auf O⁰C abgekühlt, anschließend wurden 5,32 g H-His-OMe. 2 HCl in 30 cm³ gekühltem Acetonitril und 2 Aquiv. TAA zugegeben und anschließend bei 0⁰C 4,62 g DCCI in 15 cm³ Acetonitril. Das Gemisch wurde 2 h bei 0⁰C gerührt und 20 h bei 0⁰C stehen gelassen und anschließend der entstandene Niederschlag abfiltriert und das Filtrat im Vakuum eingedampft.

Der Rückstand wurde in Äthylacetat gelöst, mit Natriumbicarbonat und salzhaltigem Wasser gewaschen und getrocknet. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum abdestilliert. Das entstehende Öl wurde über SiO₂ Chromatographien (Lösungsmittelgemisch Bz: EtOH = 8:2).

Ausbeute: 3,5 g Ol (Schaum).

Rf in Bz: EtOH (8:2) = 0,57 auf SiO₂.

2) H-D-GIu (OtBu)-His-OMe · 2 HCl

2,9 g des oben erhaltenen Öls wurden in 50 cm³ Methanol gelöst. Nach der Zugabe von 3,25 cm³ 4 η HCl und 600 mg Pd/C 10 % wurde Wasserstoff durch das Gemisch geleitet. Nach 2,5 h wurde das Gemisch filtriert und das Filtrat eingedampft.

Ausbeute: 2,35 g.

Rf in Am : Fo : Wa (7 : 2 :1) = 0,33 auf SiO₂.

3) Boc-Met-D-Glu (OtBu)-His-OMe

1,59 g Boc-MetN,H, wurden in 15 cm³ DMF gelöst. Diese Lösung wurde auf 0⁰C abgekühlt und anschließend 2,6 cm³ 4,85 η HCl/THF zugegeben und bei -20⁰C 0,82 cm³ Isoamylnitrit. Das Gemisch wurde 5 min bei -20°C gerührt und anschließend das entstandene Azid zu einer Lösung von 2,35 g H-D-GIu (OtBu)-His-OMe · 2 HCl (A. 2) in 20 cm³ DMF gegeben. Dann wurde TAA bis zu einem pH-Wert von 7,2 zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 70 h gerührt, anschließend filtriert und das Filtrat zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde in wäßrigem Äthylacetat gelöst und mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet und anschließend das Äthylacetat auf 15 cm³ eingedampft und mit 60 cm³ Petroläther verdünnt. Nach einem Tag wurde die klare Lösung zur Trockene eingedampft.
Ausbeute: 2,63 g Öl (Schaum).
Rf in Bu : Ac : Wa (4 :1 :1) = 0,76 auf SiO,.

4) Boc-Met-D-Glu (OtBu)-HiS-N₂H₃

2,6 g des Esters (A. 3) wurden in 50 cm³ Methanol gelöst und anschließend 2,6 cm³ Hydrazinhydrat zugegeben.

Das Reaktionsgemisch wurde 5 h gerührt, anschließend eingedampft und unter Äther bei 0⁰C zur Seite gestellt. Nach 24stündigem Stehen des Gemisches wurde der entstandene Niederschlag abfiltriert.

Ausbeute: 2,1 g.

Rf in Am : iPro : Wa (10 :4 :5) = 0,36 auf SiO₂.

B. Auf die gleiche Weise wie unter A beschrieben wurden hergestellt:

Boc-Ala-D-Glu (OtBu)-HiS-N₂H₃

Rf* = 0,31
Boc-jß-Ala-D-Glu (OtBu)-HiS-N₂H,

Rf = 0,36
Desamino-Met-D-Glu (OtBu)-HiS-N₂H₃

Rf = 0,47
Boc-Val-D-Glu (OtBu)-HiS-N₂H₃

Rf = 0,33
Boc-(ff-Me)Ala-D-Glu (OtBu)-HiS-N₂H₃

Rf = 0,32
Boc-Gly-D-Glu (OtBu)-HiS-N₂H₃

Rf = 0,30

Rf* in Am:iPro:Wa (10:4:5) auf SiO₂.

3) H-GIu (OtBu)-D-His-OMe · 2 HCl

Beim Hydrieren von 5,8 g des Dipeptids (C. 1), wie unter A. 2 beschrieben, erhielt man das Dipeptid H-GIu (OtBu)-D-His-OMe ■ 2 HCl in 94%iger Ausbeute. Rf in Am : Fo : Wa (7 : 2 : 1) = 0,32 auf SiO₂.

4) Boc-Met-Glu (OtBu)-D-His-OMe

1,59 g Boc-Met-N₂H₃ wurden, wie unter A. 3 beschrieben, in das Azid umgewandelt und gekuppelt mit 2,35 g H-GIu (OtBu)-D-His-OMe · 2 HCl (C. 3).

Das Reaktionsgemisch wurde 86 h gerührt und anschließend zur Trockene eingedampft.

Der Rückstand wurde in wäßrigem Athylacetat aufgenommen und 4mal mit Wasser gewaschen. Der Rückstand wurde getrocknet und anschließend das Athylacetat zur Trockene abgedampft. Der ölige Rückstand wog 2,4 g.

Rf in Bu : Ac : Wa (4 : 1 : 1) = 0,74 auf SiO₂.

5) Boc-Met-Glu (OtBu)-D-HiS-N₂H₃

Das Tripeptid (C. 1) wurde auf die oben beschriebene Weise in das Hydrazid umgewandelt. Das erhaltene Hydrazid wurde in Methanol gelöst und in die zehnfache Menge Wasser gegossen.

Ausbeute: 1,3 g.

Rf in Am : iPro : Wa (10 : 4 : 5) = 0,35 auf SiO₂.

C. Synthese von Boc-Met-Glu (OtBu)-D-HiS-N₂H₃
1) Z-GIu (OtBu)-D-His-OMe

66,2 g Z-GIu (OtBu)-OH wurden in 115 cm³ Acetonitril gelöst. Nach Zugabe von 50 g H-D-His-OMe · 2 HCl in 115 cm³ Acetonitril wurde die Lösung auf O⁰C abgekühlt und anschließend 58 cm³ TAA zugegeben und bei O⁰C 38,8 g DCCI.

Das Gemisch wurde 22 h bei 0°C gerührt, anschließend filtriert und das Filtrat im Vakuum eingedampft und anschließend der Rückstand in Athylacetat aufgenommen. Die organische Phase wurde mit einer 5 %igen Natriumbicarbonatlösung in Wasser und mit Wasser gewaschen. Nach Zugabe von 575 cm³ Äther und 115 cm³ Petroläther wurde das Gemisch 4mal mit 100 cm³ 1 η HCl extrahiert. Nach dem Neutralisieren des sauren wäßrigen Auszuges mit 1 η Natriumhydroxid (End-pH-Wert 8,5) wurde das Gemisch emeut mit Athylacetat extrahiert.

Die organische Schicht wurde 3mai mii saizhaitigem Wasser gewaschen, getrocknet und auf 400 cm³ eingedampft. Nach Zugabe von 575 cm³ Äther und 116 cm³ Petroläther kristallisierte das Dipeptid aus.

Fp 73-76°C.

Rf in Am : Py : Wa (5 : 3 : 2) = 0,60 auf SiO₂.

2) Z-GIu (OtBu)-D-HiS-N₂H₃

47,7 g des Esters nach 1) in 336 cm³ Methanol wurden durch Zugabe von 12,5 cm³ Hydrazinhydrat in das Hydrazid umgewandelt und anschließend das Gemisch 48 h bei 0⁰C gerührt. Das Gemisch wurde anschließend auf 100 cm³ eingedampft und daraufhin 475 cm³ destilliertes kaltes Wasser zugegeben. Nach dem Filtrieren erhielt man das angegeben Peptid.

Fp 178-181°C.

D. Andere D-His-Peptide

1) BoC-A-GIu(OtBu)-D-HiS-N₂H₃ (A =>Ala, Desamino-Met, GIy, (a-Me)Ala, VaI oder AIa)

a) Boc-jö-Ala-Glu (OtBu)-D-His-OMe

0,61 g Boc-jS-Ala-N₂H₃ wurden in 10 cm³ DMF gelöst und anschließend die Lösung auf 0⁰C abgekühlt und 1,3 cm³ 4,85 η HC1/THF zugegeben. Das Gemisch wurde auf - 21°C abgekühlt und anschließend 0,41 cm³ Isoamylnitrit zugegeben. Das Gemisch wurde 7 min gerührt, worauf sich das Azid gebildet hatte. Die Azidlösung wurde zu einer vorgekühlten Lösung von 1,2 g H-GIu (OtBu)-D-His-OMe · 2 HCl in 10 cm³ DMF gegeben.
Das Reaktionsgemisch wurde mit TAA auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt, 86 h bei 0⁰C gerührt und zur Trockene eingedampft. Der ölige Rückstand wurde über SiO₂ chromatographiert.'
Ausbeute: 0,9 g.
Rf in Bu : Ac : Wa (4 :1 :1) = 0,73 auf SiO₂.

b) Boc-jß-Ala-Glu (OtBu)-D-HiS-N₂H₃

Die umwandlung von 0,75 g des Esiers in das Hydrazid wurde auf die unter A.4 beschriebene Weise durchgeführt.
Ausbeute: 0,7 g.

Rf in Am : iPro : Wa (10 :4 : 5) = 0,29 auf SiO₂.

2) Boc-Met-Gln-D-His-N₂H₃

Auf die unter C beschriebene Weise wurde das Aminosäurederivat Boc-Met-N₂H₃ gekuppelt an H-Gln-D-His-OMe, das erhalten worden ist aus dem entsprechenden Z-geschützten Peptid durch Hydrierung mit 10% Palladium auf Kohle, wobei man den geschützten Peptidester Boc-Met-Gln-D-His-OMe erhielt, der unmittelbar zu dem entsprechenden Hydrazid verarbeitet wurde.
Rf in Am : iPro : Wa (10 :4 : 5) = 0.27 auf SiO₁.

E.

l)Z-Phe^p-Ajrgl

Eine Lösung von 12,8^gH-D-Argi^^i^iACli 200 cm³ DMF wurde auf +""5⁰C abf ββΒηΤΓύηΤΙΐKsthliS-'^: ßend 4,8 g TAA zugegeben. Das entstehende Triäthylamin · HCl wurde abfiltriert und anschließend 20 g Z-Phe-ONP zugegeben. Das Gemisch wurde 4 Tage bei Raumtemperatur gerührt, anschließend ein Teil des DMF abdestilliert und der Rückstand mit 400 cm³ Äthylacetat/Wasser verdünnt. Die organische Phase wurde mit Zitronensäure, Ammoniumhydroxid und Wasser gewaschen und anschließend die Äthylacetatschicht getrocknet und eingedampft.

Nach dem Umkristallisieren aus Äthylacetat/Petro'-äther betrug der erhaltene Schmelzpunkt 89-93°C.

Rf in Bz : EtOH (8 : 2) = 0,62 auf SiO₂.

2) Z-Phe-D-Arg (NO₂)-OH

5 g des oben angegebenen Dipeptide wurden in Dioxan gelöst und dann mit 1,1 Äquiv. Natriumhydroxid verseift. Nach zweistündigem Rühren wurde diese Lösung mit 1 η Salzsäure (pH = 2) angesäuert und mit der zehnfachen Menge Wasser verdünnt. Der entstehende Niederschlag wurde 3 h bei 0°C gerührt und abfiltriert.

Ausbeute: 3,1 g. Fp 118-121⁰C. (Zers.).

Rf in Bz : EtOH (8 : 2) = 0,11 auf SiO₂.

3) H-Phe-D-Arg-OH · acetat

1 g Z-Phe-D-Arg (NO₂)-OH (2) wurde in 20 cm³ 90%iger Essigsäure gelöst und anschließend 100 mg Palladium 10% auf Kohle zugegeben. Nach dem Durchleiten von Wasserstoff wurde das schwarze Reaktionsgemisch über Hyflo filtriert, das Filtrat zur Trockene eingedampft und der Rückstand in tert.-Butanol/Wasser (1 :1) gelöst und lyophilisiert.

Ausbeute: 0,4 g Dipeptid-Acetat.

Rf in Bu : Py : Ac : Wa (4 : 3/4.: 1/4 :1) = 0,21 auf SiO₂.

20

30

35

40

4) Auf die unter 3) beschriebene Weise wurde das Z-Phe-D-Arg (N0₂)-0Me (1) umgewandelt in das H-Phe-D-Arg-OMe · acetat.

Rf in Bu : Py : Ac : Wa (4 : 3/4 :1/4 :1) = 0,40 auf SiO₂.

F. H-Phe-Lys (Boc)-OtBu

Kupplung von 4,2 g Z-Phe-ONP mit H-Lys (Boc)-OtBu auf die unter E. 1) beschriebene Weise ergab das so Dipeptid Z-Phe-Lys (Boc)-OtBu als viskoses Öl.

Rf in Bz ■ EtOH '9 · 1^Λ = 0 57 auf SiO

Ausbeute: 79 %.

Das Dipeptid H-Phe-Lys (Boc)-OtBu wurde in 95 %iger Ausbeute erhalten durch Hydrierung des Peptids Z-Phe-Lys (Boc)-OtBu in Methanol mit 10% Palladium auf Kohle.

Rf in Bu : Ac : Wa (4 :1 :5) = 0,41 auf SiO₂.

G. H-Phe-D-Lys (Boc)-OH
1) Z-Phe-D-Lys (BoC)-OBz!

Ausgehend von 17,7 g H-D-Lys (Boc)-OBzl · HCl wurde das Dipeptid Z-Phe-D-Lys (Boc)-OBzl auf die unter E. 1) beschriebene Weise hergestellt.

Ausbeute nach Verdampfen des Äthylacetats: 72%

Rf in Bz: EtOH (9:1) = 0,54 auf SiO₂.

-Ph

2) H-Phe-D-Lys (Boc)-OH

»Ly&(Boc)-OBzl wurden in 50 cm³ MethajJSjq'anschließend 0,4g 10% Palladium auf Kohle zugegeben und Wasserstoff durch das Gemisch geleitet. Nach 5 h wurde filtriert und das Filtrat zur Trockene eingedampft.

Rf in Bu: Py: Ac: Wa (4:3/4:1/4:1) = 0,31 auf SiO₂.

H. H-Phe-N-(CH₂)₅-N-Boc
H H

60 Kondensation von Z-Phe-ONP und Boc-N-(CH₂)₅-NH₂ in Äthylacetat ergab Z-Phe-N-(CH₂)₅-N-Boc.

H H

Fp 131-133°C.

Nach Hydrieren in Methanol erhielt man H-Phe-N-(CH₂)J-N-BoC. H

H
Rf in Bu : Ac : Wa (4 : 1 : 5) = 0,23.

K. H-Phe-Lys (Boc)-Trp-OH und Derivate
1) Z-Phe-Lys (Boc)-Trp-OH

4,6 g Z-Phe-ONP wurden in 60 cm³ DMF gelöst. 4,4 g H-Lys (Boc)-Trp-OMe wurden zugegeben und anschließend das Gemisch 20 h bei 20°C gerührt. Dann wurden 0,2 g 2-Dimethylaminoäthylamin zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde weitere 2 h gerührt und dann eingedampft. Der Rückstand wurde in 250 cm³ Äthylacetat/Wasser gelöst. Die Lösung wurde nacheinander mit einer Lösung von 5 % Kaliumcarbonat in Wasser, 0,5 η Salzsäure und Wasser gewaschen und anschließend die organische Phase über Natriumsulfat getrocknet.

Nach Filtrieren wurde das Filtrat zur Trockene eingedampft und der ölartige Rückstand sofort mit Dioxan verseift. Zu diesem Zweck wurden 6,54 g Ester in 100 cm³ Dioxan gelöst und anschließend 11,8 cm³ 1,5 η NaOH zugegeben. Nach 2stündigem Rühren wurde das entstehende Reaktionsgemisch mit 1,5 η Salzsäure auf einen pH-Wert von 7 angesäuert und anschließend das Dioxan im Vakuum abgedampft.

Zu dem Rückstand wurde Äthylacetat/Wasser zugegeben und die wäßrige Schicht auf einen pH-Wert von 2 mit verdünnter Salzsäure eingestellt ohne daß die Schichten getrennt wurden. Die organische Phase wurde mit Wasser gewaschen und dann getrocknet. Das Äthylacetat wurde im Vakuum abdestilliert, wobei man ein Öl erhielt, das nach dem Rühren in Äther fest wurde.

Rf in Am : Py : Wa (5 : 3 :2) = 0,82 auf SiO₂.

2) H-Phe-Lys (Boc)-Trp-OH ■ HCl

1,85 g des Tripeptids nach 1) wurden in 40 cm³ DMF und 1 Äquiv. Salzsäure gelöst. Es wurden 350 mg 10% Palladium auf Kohle zugegeben und anschließend Wasserstoff 6 h durch das Gemisch geleitet. Nach der Reduktion wurde der Katalysator abfiltriert und das Filtrat sofort weiterverarbeitet.

Rf in Am : Pa : Wa (5 : 3 :2) = 0,72 auf SiO₂.

3) Z-Phe-Lys (Boc)-Trp-NH₂ oder Z-Phe-Lys (Boc)-Trp-N(CH₃)₂

2 g des rohen Esters (1) wurden zu 25 cm³ einer 10 η Ammoniaklösung oder Dimethylaminlösung in Methanol gegeben. Das Gemisch wurde 2 Tage gerührt und anschließend zur Trockene eingedampft und der Rückstand aus Methanol umkristallisiert.

Rf in Bz : EtOH (8:2) = 0,35 auf SiO₂ Tür das Amid und 0,43 für das Dimethylamid.

4) Auf die unter K. 2) beschriebene Weise wurde 1 g des Tripeptids entsprechend 3) und 4) hydriert.

Auf diese Weise erhielt man die Hydrochloride von

H-Phe-Lys (Boc)-Trp-NH₂

Rf* = 0,76 auf SiO₂
H-Phe-Lys (Boc)-Trp-N(CH₃)₂ ι ο

Rf* = 0,77 auf SiO₂

* Rf in Am : Py : Wa (5 : 3 : 2)

L. H-Phe-Arg-Trp-OH
1) Boc-Arg(NO₂)-Trp-ONB

5,76 g Boc-Arg(NO₂)-OH wurden in 70 cm³ DMF und 2,52 cm³ Triäthylamin gelöst. Diese Lösung wurde auf - 10⁰C abgekühlt und anschließend 2,38 cm³ Isobutylchlorformiat zugegeben und das Gemisch 10 min bei -10⁰C gerührt. Zu dieser Lösung wurde eine Lösung von 6,14 g H-Trp-ONB · HCl in 40 cm³ gekühltem DMF und 3,01 cm³ Triäthylamin zugegeben. Das Gemisch wurde 30 min bei - 10⁰C, 3 h bei 0⁰C und 20 h bei 2O⁰C gerührt und anschließend das Lösungsmittel im Vakuum abgedampft und der Rückstand in Äthylacetat/ Wasser (10:1) aufgenommen. Die organische Phase wurde mit Wasser, 5%igem Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen, getrocknet und zur Trockene im Vakuum eingedampft.

Ausbeute: 8,5 g Öl.

Rf in Bz : EtOH (8:2) = 0,79 auf SiO₂.

2) H-Arg(NO₂)-Trp-ONB

1 g des entsprechend 1) hergestellten Peptids wurde in 20 cm³ Methylenchlorid gelöst und anschließend Chlorwasserstoffgas unter Kühlen durch die Lösung geleitet. Nach einstündigem Rühren wurde der Nieder- «0 schlag abfiltriert und gründlich mit trockenem Methylenchlorid gewaschen. Der Niederschlag wurde unmittelbar weiterverarbeitet.

Rf in Am : Py : Wa (5 : 3 : 2) = 0,66 auf SiO₂.

(Rf Ausgangs-Substanz 0,93). «

3) Z-Phe-Arg(NO₂)-Trp-ONB

3 g des Dipeptids nach 2) wurden in 20 cm³ DMF gelöst. Nach dem Kühlen dieser Lösung auf 0⁰C wurden 1,12 cm³ TAA und 2,12 g Z-Phe-ONP zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 2 h bei 0°C und 20 h bei 20⁰C gerührt und dann im Vakuum eingedampft. Der ölartige Rückstand wurde in Äthylacetat/Wasser (10 : 1) gelöst und wie unter 1) beschrieben weiterverarbeitet. Die organische Phase wurde eingedampft und der Rückstand in 5 cm³ Methanol gelöst und vorsichtig zu 100 cm³ trockenem Äther gegeben, wobei das Peptid ausfiel.

Ausbeute: 2,9 g.

Rf in Bz : EtOH (8:2) = 0,48 auf SiO₂.

JO

35

60

4) H-Phe-Arg-Trp-OH

2 g des oben erwähnten Peptids nach 3) wurden in 40 cm³ Essigsäure gelöst und anschließend 400 mg 10% Palladium auf Kohle zugegeben und das Gemisch 2 Tage hydriert (Parr.).

Nach dem Filtrieren wurde die Essigsäure im Vakuum abgedampft und der Rückstand in trockenem Äther ge-

65 rührt. Ausbeute 98%. Der rötliche Schaum wurde über festem Kaliumhydroxid getrocknet. Die Substanz enthielt 1,1 Mol Essigsäure.
Rf in Am : Py : Wa (5 : 3 : 2) = 0,17 auf SiO₂.

M. H-Phe-Arg-Tra 1) Boc-Arg(N0₂)-Tra

5,76 g Boc-Arg(NO₂)-OH wurden in 70 cm³ DMF und 2,52 cm³ TAA gelöst. Die Lösung wurde auf - 10°C abgekühlt und anschließend 2,38 cm³ Isobutylchlorformiat zugegeben und das Gemisch weitere 10min bei -10⁰C gerührt. Zu dieser Lösung wurde eine Lösung von 2,9 g Tryptamin in 10 cm³ DMFgegeben, wobei die Temperatur auf ungefähr -10⁰C gehalten wurde.

Das Gemisch wurde 30 min bei -1O⁰C, 2 h bei O⁰C und 18 h bei 20⁰C gerührt und anschließend das Lösungsmittel im Vakuum abgedampft und der Rückstand in Äthylacetat/Wasser aufgenommen. Die organische Phase wurde mit Wasser, 5 % Bicarbonat und Wasser gewaschen, anschließend getrocknet und eingedampft.

Ausbeute: 7,4 g Öl.

Rf in Bz : EtOH (8:2) = 0,54 auf SiO₂.

2) Z-Phe-Arg(NO₂)-Tra und H-Phe-Arg-Tra

2.1 g Z-Phe-ONP wurden in 10 cm³ DMF und 10 cm³ Äthylacetat gelöst. Dann wurden 1,81 g H-Arg(NO₂)-Tra (erhalten durch Entfernung der Schutzgruppe des Amids nach 1) zugegeben und anschließend das Gemisch 30 min bei - 10⁰C und 20 min bei 20⁰C gerührt.

Das Reaktionsgemisch wurde wie unter L. 3) beschrieben weiterverarbeitet.

Ausbeute: 1,3 g; Fp 131-133°C.

Rf in Bz : EtOH (8:2)= 0,47 auf SiO₂.

1,3 g der Verbindung wurden mit Hilfe von 10% Palladium auf Kohle und Wasserstoff (Parr.) umgewandelt in H-Phe-Arg-Tra.

Ausbeute 72 %.

N. H-Phe-Lys (Boc)-Tra 1) Z-Phe-Lys (Boc)-Tra

Ausgehend von 3,4g Z-Phe-ONP und 3g H-Lys(Boc)-Tra (aus Z-Lys (Boc)-Tra; Fp 77-80⁰C) erhielt man Z-Phe-Lys (Boc)-Tra auf die unter E. 1) beschriebene Weise.

Ausbeute: 65%. Fp 125-129°C.

Rf in Bz: EtOH (8:2) = 0,70 auf SiO₂.

H-Phe-Lys (Boc)-Tra

2 g des Peptids nach 1) wurden in 25 cm³ Methanol gelöst und mit Wasserstoff in Gegenwart von 10% Palladium auf Kohle auf die übliche Weise hydriert. Nach Eindampfen zur Trockene erhielt man einen Schaum.

Ausbeute: 95%.

Rf in Bu : Ac : Wa (4 :1 :1) = 0,80 auf SiO₂.

O. H-Phe-Lys (Boc)-Phe-Derivate 1) Z-Phe-Lys (Boc)-Phe-OMe

4,24 g H-Lys (Boc)-Phe-OMe wurden in 25 cm³ Dimethylformamid gelöst und anschließend 4,77 g (ll,4mMol) Z-Phe-ONP zu dieser Lösung gegeben. Das Gemisch wurde ungefähr 24 h gerührt und anschließend das Lösungsmittel im Vakuum abgedampft. Der Rückstand wurde in einem Gemisch von 120 cm³ Äthylacetat und 30 cm³ Wasser gelöst und anschließend die Äthylacetatphase nacheinander mit 0,1 η HCl, Was-

ser, einer Natriumcarbonatlösung (5 %) und Wasser gewaschen. Das Äthylaeetat wyrde abdjstüliert und der Rückstand aus ÄthyläcVafr umkristallisiert. zu dem etwas Petroläther zugegäbejryQj
Rf in Bz : EtOH (8 : 2f = Ö;76"au?

2) H-Phe-Lys (Boc)-Phe-OMe

1,9 g des Peptids nach 1) wurden in 50 cm³ Methanol gelöst. Zu dieser Lösung wurden 0,5 g 10% Palladium auf Kohle zugegeben und anschließend Wasserstoffgas durch das Gemisch geleitet, der Katalysator abfiltriert und das Filtrat zur Trockene eingedampft.

Rf in Am : Py : Wa (5 : 3 :2) = 0,35 auf SiO₂.

3) H-Phe-Lys (Boc)-Phe-NH₂

500 mg des Esters nach 1) wurden in Methanol gelöst und anschließend die Lösung mit Ammoniak gesättigt. Das Gemisch wurde 24 h gerührt Das Amid kristallisierte aus der Lösung aus.

In der unter 2) beschriebenen Weise wurde die Schutzgruppe Z von dem Amid entfernt.

Rf in Am : Py : Wa (5 : 3 :2) = 0,23 auf SiO₂.

4) H-Phe-Lys (Boc)-Phe-OH

0,5 g des nach 2) erhaltenen Peptidesters wurden in 6 cm³ Methanol gelöst und anschließend 1 Äquiv. NaOH zugegeben. Das Gemisch wurde 1 h gerührt und anschließend leicht angesäuert, um die Tripeptidsäure auszufällen.

Rf in Am : Py : Wa (5 :3 : 2) = 0,18 auf SiO₂.

P. H-Phe-D-Lys (Boc)-Phe-OtBu

1) Z-D-Lys (Boc)-Phe-OtBu

10,03 g Z-D-Lys (Boc)-ONP wurden in 50 cm³ DMF gelöst. Diese Lösung wurde auf -20⁰C abgekühlt und zu einer Lösung von 4,1 g H-Phe-OtBu in 75 cm³ DMF gegeben.

Das Reaktionsgemisch wurde 1 h bei 0⁰C und 20 h bei 20°C gerührt und anschließend zur Trockene eingedampft. Der gelbe Rückstand wurde in Äthylaeetat/ Wasser gelöst und mit 5 % Kaliumcarbonat, Wasser, 5 % Zitronensäure und Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet und zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde in Äthylaeetat gelöst und anschließend ausreichend Petroläther (40/60) zugegeben, daß eine Trübung auftrat. Dann wurde der entstehende Niederschlag abfiltriert.

Rf in Bz : EtOH (9:1)= 0,64 auf SiO₂.

2) H-D-Lys (Boc)-Phe-OtBu

3 g des Tripeptids wurden in 60 cm³ Methanol gelöst. Dann wurde 10% Palladium auf Kohle zugegeben und anschließend Wasserstoff durch das Gemisch geleitet, bis kein CO₂ mehr entwich (2 h). Nach Filtrieren über Hyflo wurde das Filtrat zur Trockene eingedampft, wobei man einen Schaum erhielt.

Rf in To : EtOH (9:1)= 0,21 auf SiO₂.

3) Z-Phe-D-Lys (Boc)-Phe-OtBu

2,18 g Z-Phe-ONP wurden in 15 cm³ DMF gelöst und anschließend eine Lösung von 2,24 g H-D-Lys (Boc)-Pne-OtBu (2) in 30 cm³ DMF zugegeben und das Gemisch 15 h bei 20°C gerührt. Nach dem Eindampfen der gelben Lösung wurde der Rückstand in 15 cm³ Äthylacetat gelöst und 50 cm³ Petroläther zugegeben. Dann wurde das Gemisch 8 h bei 0⁰C stehen gelassen und der entstandene Niederschlag abfiltriert.

Fp 135-138°C.

Rf in To : EtOH (9 :1) = 0,60 auf SiO₂.

4) H-Phe-D-Lys (Boc)-Phe-OtBu

2,5 g des Tripeptids nach 3) wurden auf die unter 2) beschriebene Weise hydriert.
Rf in To : EtOH (8:2) = 0,43 auf SiO₂.

Q. H-Phe-Lys (Boc)-phenylalkylamid

1) Z-Lys (Boc)-PPA

10,33 g (20,6 mMol) Z-Lys (Boc)-ONP wurden ii

.5 80 cm³ Methylenchlorid bei ungefähr 0⁰C gelöst. Dam wurden 2,7 g 3-Phenylenpropylamin zu der Lösung zu gegeben und anschließend das Gemisch 1,5 h bei 0°C und dann 18 h bei Raumtemperatur gerührt. Das Lö sungsmittel wurde abgedampft und der Rückstand ir

200 cm³ Äthylaeetat gelöst. Dann wurde die Äthylace tatlösung nacheinander mit 10% Natriumcarbonat^ sung, einer 30%igen NaCl-Lösung, 0,1 η HCl und einei 30%igec NaCl-Lösung gewaschen. Die Äthylaeetat schicht wurde getr >cknet und auf ein Volumen von un gefahr 80 cm³ eingedampft. Anschließend wurde aus reichend Äther zugegeben, bis eine Trübung entstand und das Gemisch in den Kühlschrank gestellt. Nach 2 r wurde der entstandene Niederschlag abfiltriert.
Fp 78-79°C.

Rf in Bz : EtOH (9:1) = 0,53 auf SiO₂.

2) H-Lys (Boc)-PPA

8,75 g der nach 1) erhaltenen Verbindung wurden in 120 cm³ Methanol gelöst, zu dem 1,2 g 10% Palladium auf Kohle zugegeben worden waren. Unter Rührer wurde Wasserstoff 3,5 h durch das Gemisch geleitet und anschließend der Katalysator abfiltriert. Das Filtrat wurde zur Trockene eingedampft, wobei man ein praktisch farbloses Öl erhielt, das direkt zu weiteren Um-Setzungen verwendet wurde.

Rf in Am : Fo : Wa (7 : 2 : 1) = 0,58 auf SiO₂.

3) Z-Phe-Lys (Boc)-PPA

6,39 g des geschützten Aminosäurederivats nach 2) wurden in 68 cm³ Dimethylformamid gelöst und anschließend eine Lösung von 7,61 g Z-Phe-ONP in 20 cm³ DMF zugegeben. Das Gemisch wurde 20 h bei Raumtemperatur gerührt, dann das Lösungsmittel im Vakuum abgedampft, der Rückstand in 170 cm³ Äthylacetat gelöst und nacheinander mit einer 5 %igen Kaliumcarbonatlösung, einer 30 %igen NaCl-Lösung, 0,1 η HCl und einer 30%igen NaCl-Lösung gewaschen. Die Äthylacetatschicht wurde dann über Na₂SO₄ getrocknet und auf ungefähr 100 cm³ eingedampft. Die Lösung wurde 3 Tage in den Kühlschrank gestellt, wobei das Peptid vollständig auskristallisierte.

Fp 134-136°C.

Rl" in Bz : EtOH (8:2)= 0,72 auf SiO₂.

4) H-Phe-Lys (Boc)-PPA

9,07 g des nach 3) erhaltenen Peptid-Derivate wurden in 300 cm³ DMF gelöst, zu dem 4 cm³ 4 η HCl und 1,5 g 10% Palladium auf Kohle zugegeben worden waren. Unter Rühren wurde Wasserstoff, 3,5 h durch das Gemisch geleitet, anschließend der Katalysator abfiltriert und das Filtrat zur Trockene eingedampft, wobei man ein praktisch farbloses Öl erhielt.

Rf in Bu : Ac : Wa (4:1:1)= 0,63 auf SiO₂.

308 143/80

5) Auf die gleiche Weise wurden hergestellt: Ό
2)

H-Phe-Lys (Boc)-L-Amf Rf in Bu: Ac:Wa(4:l:l) H-Phe-Lys (Boc) ?EA

Rf in Bu : Ac : Wa (4 :1 :1) = 0,65 auf SiO₂.

0,60 auf SiO₂

R. H-Phe-Lys (Boc)-Phe-Gly-Derivate l)Z-Phe-Lys (BoC)-N₂H₃

12,0 g Z-Phe-Lys (Boc)-OMe wurden in 30 cm³ Methanol und 6 cm³ Hydrazinhydrat gelöst. Das Gemisch wurde 24 h stehen gelassen und 2 h bei 0⁰C gerührt. Der entstehende Niederschlag wurde abfiltriert, mit kaltem Methanol gewaschen und getrocknet. Rf in Bz: EtOH (8:2) = 0,12 auf SiO₂.

2) Z-Phe-Lys (Boc)-Phe-Gly-OBzl

5,42 g des oben angegebenen Hydrazids wurden in 20 cm³ DMF gelöst. Die Lösung wurde auf 0⁰C abgekühlt und anschließend 2 Äquiv. Salzsäure/THF zugegeben und das Gemisch auf -2O⁰C abgekühlt. Dann wurden 1,35 cm³ Isoamylnitrit zugegeben und das Gemisch 7 min bei -2O⁰C gerührt. Dieses Gemisch wurde zu einer Lösung von 3,5 g H-Phe-Gly-OBzl ■ HCl und 4,2 cm³ Triäthylamin (pH 7) gegeben. Das Gemisch wurde 70 h bei O⁰C stehen gelassen, anschließend das Lösungsmittel abgedampft und der Rückstand in Äthylacetat/Wasser aufgenommen, die organische Phase mit 0,1 η HCl, Natriumbicarbonat (5%) und Wasser gewaschen. Die Äthylacetatschicht wurde über Natriumsulfat getrocknet und anschließend das Äthylacetat im Vakuum abgedampft.

Rf in Bz : EtOH (8:2) = 0,71 auf SiO₂.

3) H-Phe-Lys (Boc)-Phe-Gly-OH

1 g des entsprechend 2) erhaltenen Peptids wurde in Methanol/Wasser 1 : 1 (20 cm³) gelöst. Dann wurden 10% Palladium auf Kohle zugegeben und anschließend 5 h Wasserstoff durch das Gemisch geleitet. Nach dem Filtrieren über Hyflo wurde das Filtrat eingedampft und in trockenen Äther gerührt.

Rf in Bu : Ac : Wa (4 :1 : 1) = 0,43 auf SiO₂.

S. H-Phe-D-Lys (Boc)-Phe-Gly-OtBu

1) Z-D-Lys (Boc)-Phe-Gly-OtBu

10,03 g Z-D-Lys (Boc)-ONP wurden mit einer Lösung von 5,1 g H-Phe-GIy-OtBu in 20 cm³ DMF gekuppelt und dann eingedampft. Der entstehende Rückstand wurde in Äthylacetat wieder auf die beschriebene Weise gelöst, gewaschen und zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde direkt weiterverarbeitet. Rf in To : EtOH (9:1)= 0,63 auf SiO₂.

2) H-D-Lys (Boc)-Phe-Gly-OtBu

Beim Hydrieren erhielt man das Tripeptid in praktisch quantitativer Ausbeute als Schaum. Rf in To : EtOH (9:1)= 0,24 auf SiO₂.

3) Z-Phe-D-Lys (Boc)-Phe-Gly-OtBu

Die Reaktion von 2,18 g Z-Phe-ONP mit 2,6 g H-D-Lys (Boc)-Phe-Gly-OtBu in 30 cm³ DMF ergab innerhalb von 24 h das Tetrapeptid in 75 %iger Ausbeute nach Umkristallisieren aus Äthylacetat/Petroläther. Vor dem Kristallisieren wurde die Äthylacetatschicht mit Zitronensäure und einer 5%igen Natriumbicarbonatlösung gewaschen.

Fp 78-80⁰C.

Rf in To : EtOH (8:2) = 0,85 auf SiO₂.

4) H-Phe-D-Lys (Boc)-Phe-Gly-OtBu

Beim Hydrieren des Tetrapeptide nach 3) erhielt man H-Phe-D-Lys (Boc)-Phe-Gly-OtBu als Schaum.
Rf in Bu : Py : Ac : Wa (4 :3/4 :1/4 :1) = 0,57 auf SiO₂.

T. H-Met-D-Glu-His-OH
1. Boc-Met-D-Glu (OtBu)-His-OH

2,34 g Boc-Met-D-Glu (OtBu)-His-OMe (A. 3) wurden in 50 cm³ 50 %igem Dioxan gelöst. Zu dieser Lösung wurden 2,5 cm³ 2 η Natriumhydroxid gegeben und anschließend das Gemisch 30 min bei 20⁰C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde auf einen pH-Wert von 7 neutralisiert und anschließend im Vakuum zur Trokkene eingedampft und der Rückstand in Äthylacetat/ Wasser aufgenommen. Anschließend wurde der pH-Wert der wäßrigen Schicht mit 2 η Salzsäure auf 4 eingestellt. Die wäßrige Schicht wurde zur Trockene eingedampft und der Rückstand in 25 cm³ abs. Methanol gerührt und der Niederschlag abfiltriert. Das Filtrat wurde zur Trockene eingedampft.

2. H-Met-D-Glu-His-OH

1 g des Tripeptide nach 1) wurde in 10 cm³ 90%iger Trifluoressigsäure gelöst und das Gemisch 30 min gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde zu peroxidfreiem Äther getropft und anschließend der Niederschlag abfiltriert und mit Äther verrieben. Der Rückstand wurde über festem Kaliumhydroxid getrocknet. Nach dem Lösen in 25 cm³ tert.-Butanol/Wasser (1 : 1) wurde Dowex X-8 in der Acetatform zugegeben, um die Trifluoressigsäure durch d'e Essigsäuregruppe (End-pH-Wert 5 bis 5,4) auszutauschen. Der Ionenaustauscher wurde abfiltriert und das Filtrat lyophilisiert.

Rf in Bu : Py : Ac : Wa (4 :3/4 :1/4 : i) = 0,13 auf SiO₂.

U. H-A-D-Glu-His-(N-phenylalkyl)amide (A = Met,
Desamino-Met,jß-Ala oder VaI)

1. Boc-Met-D-Glu (OtBu)-His-PEA

1,87 g des Tripeptids Boc-Met-D-Glu (OtBu)-His-N₂H₃ (A.4) wurden in 20 cm³ DMF gelöst. Die Lösung wurde auf 0⁰C abgekühlt und anschließend 5,94 cm³ 1,56 η HCl in THF zugegeben und bei -20⁰C 0,42 cm³ Isoamylnitrit, woraufhin sich das Azid bildete. Dieses Azid wurde zu 3,2 mMol Phenyläthylamin zugegeben und anschließend der pH-Wert mit TAA auf 7,2 eingestellt.

Nach 70stündigem Rühren bei O⁰C wurde das Reaktionsgemisch im Vakuum eingedampft und der Rückstand in Äthylacetat aufgenommen. Die organische Phase wurde mit Wasser, einer 5 %igen Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen, anschließend getrokknet und im Vakuum eingedampft.

Ausbeute: 1,9 g Öl.

Rf in Ez : EtOH (8:2)= 0,51 auf SiO₂.

2. Auf die gleiche Weise wurden hergestellt:

Boc-Met-D-Glu (OtBu)-His-Amf
Rf in Bz : EtOH (8 : 2) = 0,49 auf SiO₂

Boc-Met-D-Glu (OtBu)-His-PPA
Rf in Bz : EtOH (8:2) = 0.51 auf SiO,.

3. H-Met-D-Glu-His-(N-phenylalkyl)amid

Auf die in unter T. 2 beschriebene Weise wurde 1 g des Peptids nach 1 oder 2 behandelt mit TFA und das erhaltene Trifluoracetat in das Acetat umgewandelt.

Ausbeute: 70 bis 75%.

Man erhielt die Acetate von:

H-Met-D-Glu-His-PEA

Rl* = 0,39 ίο

H-Met-D-Glu-His-Amf

Rf= = 0,36
H-Met-D-Glu-His-PPA

Rf* = 0,38

i 5

* Rf in Bu: Py: Ac: Wa (4:3/4:1/4:1) auf Si(X

4. Auf die unter 1 beschriebene Weise wurden einige Hydrazide, die nach B hergestellt worden waren, in das Azid umgewandelt und mit Phenyläthylamin gekuppelt, anschließend die Schutzgruppen mit Trifluoressigsäure (Beispiel 2.3) entfernt und die Trifluoressigsäure durch Essigsäure ausgetauscht. Man erhielt die Acetate von

H-jS-Ala-D-Glu-His-PEA

Rf* = 0,34
H-Val-D-Glu-His-PEA

Rf* = 0,37
Desamino-Met-D-Glu-His-PEA

Rf* = 0,44

• Rf in Bu:Py: Ac:Wa (4:3/4:1/4:".) auf SiO₂.

V. H-A-Glu-D-His-Phe-OH, H-Met-Glu-D-His-PPA und Derivate davon

1. Boc-Met-Glu (OtBu)-D-His-Phe-OtBu

1,87 g Boc-Met-Glu (OtBu)-D-HiS-N₂H₃ (C. 5)

werden unter U. 1 beschrieben, in das Azid

umgewandelt.

Das Azid wurde zu einer Lösung von 0,52 g H-Phe-OtBu in 10 cm³ DMF, die auf O⁰C abgekühlt war (EndpH-Wert 7,2 mit Hilfe von TAA), gegeben und das Reaktionsgemisch 71h bei 0⁰C gerührt. Nach dem Eindampfen des Reaktionsgemisches wurde der Rückstand in wäßrigem Äthylacetat gelöst, anschließend die Äthylacetatschicht zwei mal mit salzhaltigem Wasser gewaschen und getrocknet. Die organische Phase wurde eingedampft und der Rückstand getrocknet.

Ausbeute: 1,9 g.

Rf in Bz : EtOH (8:2) = 0,90 auf SiO₂.

2. H-Met-Glu-D-His-Phe-OH

0,5 g des Tetrapeptids (V. 1) wurden in 20 cm³ 90 %iger Trifluoressigsäure, wie unter T. 2 beschrieben, behandelt.

Rf in Bu : Py : Ac : Wa (4 : 3/4 :1/4 : 1) = 0,26 auf SiO₂.

3. Ausgehend von den Hydraziden nach D wurden auf die unter 1 und 2 beschriebene Weise die Acetate hergestellt von

H-Gly-Glu-D-His-Phc-OH

Rf* = 0.21

H-Ala-Glu-D-His-Phe-OH

Rf* = 0,22
H-jS-Ala-Glu-D-His-Phe-OH

Rf* = 0,20
H-(u-Me)Ala-Glu-D-His-Phe-OH

Rf* = 0,24
Desamino-Met-Glu-D-His-Phe-OH

Rf* = 0,32
H-Met-Gln-D-His-Phe-OH

Rf* = 0,30

* Rf in Bu:Py: Ac: Wa (4:3/4:1/4:1) auf SiO₂.

20

25

Beispiel 1

H-A-Glu-D-His-Phe-L (oder D)-Lys-OH
(A = Met, ß-AIa oder Desamino-Met)

1. Boc-Met-Glu (OtBu)-D-His-Phe-Lys (Boc)-OtBu

1,87 g Boc-Met-Glu (OtBu)-D-HiS-N₂H₃ (C. 5) wurden in 20 cm³ DMF gelöst. Die Lösung wurde auf O⁰C abgekühlt und anschließend 5,94 cm³ 1,56 η HCl in THF zugegeben und bei -20°C 0,42 cm³ Isoair.ylnitrit, woraufhin sich das Azid bildete.

Die Azidlösung wurde zu 3,2 mMol H-Phe-Lys (Boc)-OtBu (F) in 10 cm³ DMF gegeben und anschließend der pH-Wert des Reaktionsgemisches mit TAA auf 7,2 eingestellt. Nach 70stündigem Stehen bei 0⁰C wurde das Reaktionsgemisch im Vakuum zur Trockene eingedampft und der Rückstand in wäßrigem Äthylacetat aufgenommen. Das Äthylacetat wurde dreimal mit Wasser gewaschen, getrocknet und im Vakuum abdestilliert, wobei ein Öl verblieb.

Rf in Bz : EtOH (9:1)= 0,30 auf SiO₂.

2. Boc-Met-Glu (OtBu)-D-His-Phe-D-Lys (Boc)-OH

Wenn das in Beispiel 1.1 hergestellte Azid zu 3,2 mMol H-Phe-D-Lys (Boc)-OH (G. 2) und 0,45 cm³ TAA in 10 cm³ DMF gegeben wurde, erhielt man 1,7 g Öl, nachdem das Gemisch, wie oben angegeben, weiterverarbeitet und mit salzhaltigem Wasser extrahiert worden war.

Rf in Bz : EtOH (8:2)= 0,21 auf SiO₂.

35

50

55

3. Entfernung der Schutzgruppen

0,5 g der Peptide nach 1.1 oder 1.2 wurden auf die oben beschriebene Weise behandelt. Bei dem Produkt wurde die Acetatgruppe ausgetauscht, wobei man die folgenden Peptide als Acetat erhielt.

H-Met-Glu-D-His-Phe-Lys-OH

Rf* = 0,20 auf SiO₂
H-Met-Glu-D-His-Phe-D-Lys-OH

Rf* =0,18 auf SiO₂

60

4. Auf die gleiche Weise wurden hergestellt

H-jS-Ala-Glu-D-His-Phe-Lys-OH ausgehend von dem Hydrazid nach D. 1. b; Rf in Bu : Py : Ac : Wa (4 : 3/4 :1/4 :1) = 0,16 auf SiO₂, und Desamino-Met-Glu-D-His-Phe-Lys-OH ausgehend von dem Hydrazid nach D. I.e. Rf = 0,28 auf SiO₂.

Beispiel 2

H-Met-D-Glu-His-Phe-(N-aininopentyl)amid
1. Boc-Met-D-Glu (OtBu)-His-Phe-N-(CH₂)5-NH-Boc

3,2mMol H-Phe-N-(CH₂)₅-N-Boc, hergestellt ent-

sprechend H, wurden gekuppelt an Boc-Met-D-GIu(OtBu)-HiS-N₃, (U. 1). Nach 70stündigem Rühren wurde das Kondensationsprodukt auf die in Beispiel 1.1 beschriebene Weise weiterverarbeitet und die Äthylacetatschicht zu Petroläther getropft, wobei man einen Niederschlag erhielt.

Rf in Bu : Ac Wa (4 :1 : 5) = 0,63 auf SiO₂.

2. Entfernung der Schutzgruppen

Auf die übliche Weise wurde das Tetrapeptid mit TFA behandelt und das erhaltene Trifluoracetat in das Acetat umgewandelt.

Rf in Bu : Py : Ac : Wa (4 : 3/4 :1/4 :1) = 0,25 auf SiO₂.

Beispiel 3

H-Met-D-Glu-His-Phe-D-Arg-OH und Methylester 1. Boc-Met-D-Glu (OtBu)-His-Phe-D-Arg-OH

Kupplung von Boc-Met-D-Glu (OtBu)-HiS-N, (U. 1) und H-Phe-D-Arg-OH · acetat (E. 3) auf die In Beispiel 1.1 beschriebene Weise ergab das oben angegebene Pentapeptid als amorphe Substanz in 62%iger Ausbeute.

Rf in Bz: Et: OH (8:2) = 0,16 auf SiO₂ und in Bu : Py : Ac : Wa (2 : 3/4 : 1/4 : 1) = 0,53.

2. Auf die gleiche Weise wurden die Azide Boc-Met-D-Glu (Ot3u)-His-N₃ und Desamino-Met-D-GIu (OtBu)-HiS-N₃ kondensiert mit H-Phe-D-Arg-OMe (E. 4).

3. Entfernung der Schutzgruppen

0,5 g des Peptids nach 1 (oder 2) wurden in 15 cm³Trifluoressigsäure/Wasser (9:1) gelöst und anschließend das Gemisch 30 min gerührt. Das entstehende TFA-SaIz wurde in das Acetat umgewandelt und über festem Kaliumhydroxid gelagert. Man erhielt die Acetate von

H-Met-D-Glu-His-Phe-D-Arg-OH

Rf* = 0,17
H-Met-D-Glu-His-Phe-D-Arg-OMe

Rf* = 0,29
Desamino-Met-D-Glu-His-Phe-D-Arg-OMe

Rf* = 0,34

* Rf in Bu .Py: Ac: Wa (4:3/4:1/4: 1) auf SiO₂.
Beispiel 4

H-Met-D-Glu-His-Phe-Lys-Trp-OH und dessen
Derivate

1. Boc-Met-D-Glu (OtBu)-His-Phe-Lys (Boc)-Trp-OH

1,87 g des Tripeptidhydrazids Boc-Met-D-Glu :OtBu)-His-N₂H₃ (A. 4) wurden in 20 cm³ DMF gelöst. Die Lösung wurde auf 0⁰C abgekühlt und anschließend 5,94 cm³ 1,566 η HCl/THF zugegeben und bei -20⁰C 3,42 cm³ Isoamylnitrit, wobei sich das Azid bildete. Dieses Azid wurde zu einer Lösung von 1,45 g H Phe-Lys (Boc)-Trp-OH · HCl (K. 2) in 15 cm³ DMF gegeben und anschließend der pH-Wert mit TAA auf 7,2 eingestellt.

Nach 70stündigem Rühren bei 0⁰C wurde das Reaktionsgemisch eingedampft und der Rückstand in wäßrigem Äthylacetat aufgenommen und mit salzhaltigem Wasser gewaschen. Die organische Schicht wurde getrocknet und eingedampft. Dann wurde Petroläther zugegeben, wobei man eine feste Substanz erhielt.
ίο Ausbeute: 1,66 g.

Rf in Bu : Py : Ac : Wa (4 :3/4 : 1/4 : 1) = 0,85 auf SiO₂.

2. H-Met-D-Glu-His-Phe-Lys-Trp-OH

1,6 g des oben angegebenen Peptids wurden in 25 cm³ 90 %iger Trifluoressigsäure gelöst. Die hellrote Lösung wurde 30 min stehen gelassen und anschließend in 400 cm³ trockenen peroxidfreien Äther gegossen. Die feste Substanz wurde abfiltriert und getrocknet. Das erhaltene Salz wurde in 70 cm³ tert.-BuOH/Wasser 1 : 1 gelöst. Anschließend wurde das Gemisch mit Dowex X-8 in der Acetatform gerührt, wobei man einen EndpH-Wert von 5 bis 5,5 erhielt. Das Gemisch wurde 1 h gerührt. Nach dem Filtrieren wurde das Filtrat lyophilisiert. Man erhielt das Acetat von H-Met-D-Glu-His-Phe-Lys-Trp-OH.

Rf in Bu: Py: Ac: Wa (2:3/4 : 1/4: 1) = 0,17 auf SiO,.

Beispiel 5

H-A-Glu-D-His-Phe-Lys-Trp-OH
1. Z-GIu (OtBu)-D-His-Phe-Lys (Boc)-Trp-OH

4,1g Z-GIu(OtBu)-D-HiS-N₂H₃ (C. 2) wurden in 60 cm³ DMF gelöst. Die Lösung wurde auf 0⁰C abgekühlt und anschließend 5,5 cm³ 1 η THF/HC1 zugegeben und bei -20⁰C 1,35 cm³ Isoamylnitrit. Das während lOminütigem Rühren bei - 2O°C entstandene Azid wurde zugegeben zu einer Lösung von 8,4 mMol H-Phe-Lys (Boc)-Trp-OH · HCl (K 2) in 20 cm³ DMF und anschließend der pH-Wert des Reaktionsgemisches auf 7,2 eingestellt. Das Gemisch wurde 100 h bei 0⁰C gerührt und anschließend filtriert und das Filtrat im Vakuum zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde in Äthylacetat gelöst, nacheinander mit Wasser, einer 10%igen Zitronensäurelösung, Wasser und salzhaltigem Wasser gewaschen und getrocknet. Das Äthylacetat wurde abdestilliert und anschließend der Rückstand in 25 cm³ DMF aufgenommen und zu 600 cm³ Äthylacetat/Äther (1:2) zugetropft.
Ausbeute: 5,3 g.

Rf in Bu : Py : Ac : Wa (4 : 3/4 : 1/4 : 1) = 0,73 auf SiO₂.

2. H-GIu (OtBu)-D-His-Phe-Lys (Boc)-Trp-OH ■ HCI

5 g des oben angegebenen Peptids 1 wurden in 100 cm' DMF und 2,2 cm³ 4 η HCl gelöst. Nach Zugabe von 1 g Palladium 10% auf Kohle wurde Wasserstoff durch das Gemisch geleitet. Nach 24 h wurde das Gemisch filtriert und das Filtrat im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wurde aus Methanol/Äther umkristallisiert.

Ausbeute: 4,5 g.
Rf in Am : Fo : Wa (7 : 2 : 1) = 0.68 auf SiO,.

3. Boc-Met-Glu (OtBu)-D-His-Phe-Lys (Boc)-Trp-OH

0,982 g (3,73 mMol) Boc-Met-N₂H₃ wurden in 20 cm³ DMF gelöst. Die Lösung wurde auf 0⁰C abgekühlt und anschließend 3,8 cm³ 2 η HC1/THF zugegeben und bei -2O⁰C 0,5 cm³ Isoamylnitrit und anschließend das Gemisch bei -20⁰C 10 min gerührt.

Das Azid wurde zugegeben zu 3,2 g H-GIu (OtBu)-D-His-Phe-Lys (Boc)-Trp-OH · HCl (Beispiel 5.2) und anschließend der pH-Wert mit TAA auf 7,1 eingestellt.

Das Gemisch wurde 71,5 h bei O⁰C gerührt, anschließend das Filtrat zur Trockene ejngedampft und der Rückstand in 100 cm³ trockenes Äthylacetat gerührt.

Ausbeute: 3,05 g.

Rf in Bu : Py : Ac : Wa (4 :3/4 : 1/4 :1) = 0,83 auf SiO₂.

4. Durch Kupplung des erforderlichen Boc-Aminosäureazids mit H-GIu (OtBu)-D-His-Phe-Lys (Boc)-Trp-OH · HCl erhielt man auf die gleiche Weise, wie unter 3 beschrieben, die folgenden Peptide:

Boc->Ala-GIu (OtBu)-D-His-Phe-Lys (Boc)-Trp-OH

Boc-Val-Glu (OtBu)-D-His-Phe-Lys (Boc)-Trp-OH

Boc-(a-Me)-Ala-Glu(OtBu)-D-His-Phe-Lys (Boc)-Trp-OH

Boc-Gly-Glu (OtBu)-D-His-Phe-Lys (Boc)-Trp-OH

Desamino-Met-Glu (OtBu)-D-His-Phe-Lys (Boc)-Trp-OH.

5. H-A-Glu-D-His-Phe-Lys-Trp-OH

2 g eines der in Beispiel 5.3 oder 5.4 beschriebenen Peptide wurden gelöst in 45 cm³ 90%iger Trifluoressigsäure und wie oben beschrieben behandelt.

Durch Austausch des Trifluoracetats durch das Acetat mit Dowex X-8 erhielt man das Hexapeptid als Acetat in 85 bis 92%iger Ausbeute.

H-Met-Glu-D-His-Phe-Lys-Trp-OH

Rf* 0,32
H-jS-Ala-Glu-D-His-Phe-Lys-Trp-OH

Rf* 0,25
H-Val-Glu-D-His-Phe-Lys-Trp-OH

Rf* 0,31
H-(a-Me)Ala-Glu-D-His-Phe-Lys-Trp-OH

Rf* 0,30
H-Gly-Glu-D-His-Phe-Lys-Trp-OH

Rf* 0,27
Desärnino-Met-Glu-D-His-Phe-Lys-Trp-OH Rf* 0,37

- Rf in Bu: Py: Ac: Wa (2:3/4:1/4:1) auf SiO₂. Beispiel 6

H-Met-Giu-D-His-Phe-Lys-Trp-OH und Derivate 1. Boc-Met-Glu (OtBu)-D-His-Phe-Lys (Boc)-Trp-Y

9,35 g Boc-Met-Glu (OtBu)-D-HiS-N₂H₃ wurden auf übliche Weise in das Azid umgewandelt (Beispiel 1.1) und anschließend das Lösungsmittel zugegeben, um das Volumen der Lösung auf genau 50 cm³ zu bringen. Von dieser Lösung wurde Vs zugegeben zu 3,2 mMol K-Phe-Lys (Boc)-Trp-OH ■ HCl (K. 2) in 10 cm³ DMF bei O⁰C; Vf zu 3,2 mMol H-Phe-Lys (Boc)-Trp-NH₂ · HCl (K. 5) in 10 cm bei O⁰C; und '/> zu 3,2 mMol H-Phe-Lys (BoC)-TrP-N(CHj)₂ · HCl (K. 5) in 10 cm^J DMF be O⁰C und anschließend der pH-Wert jedes Gemische: mit TAA auf 7,2 bis 7,3 eingestellt. Die Gemische wur den 70 h bei O⁰C gerührt und anschließend jede; Gemisch im Vakuum (Badtemperatur 40⁰C) einge dampft und der Rückstand in wäßrigem Äthylacetat auf genommen. Diese Schicht wurde dreimal mit Wasse: gewaschen, anschließend das Äthylacetat im Vakuurr abgedampft, der Rückstand in Alkohol aufgenommer und die Lösung mit peroxidfreiem Äther verdünnt wobei man einen Niederschlag erhielt. Ausbeute;

71% Hexapeptidsäure;

Rf in Bz : EtOH (8:2) = 0,25 auf SiO₂
'5 57% Hexapeptidamid;

Rf in Bz : EtOH (8:2) = 0,38 auf SiO₂
50% Hexapeptiddimethylamid;

Rf in Bz : EtOH (8:2) = 0,45 auf SiO₂.

2. Entfernung der Schutzgruppen

0,5 g des Hexapeptids, das wie oben hergestellt wor·

den war, wurden gelöst in 25 cm³ 90 %iger Trifluoressigsäure und 1 h bei 20⁰C gerührt. Das Gemisch wurde in

300 cm³ trockenen peroxidfreien Äther gegossen und anschließend der Niederschlag abfiltriert und übei festem KOH getrocknet. 250 mg der Substanz wurden in 30 cm³ tert.-Butanol/Wasser (1:1) gelöst und mil Dowex X-8 in der Acetatform gerührt, wobei man einen End-pHWert von 5,2 erhielt.

Nach dem Filtrieren wurden 20 cm³ tert.-Butanol-Wasser zugegeben und das gesamte Filtrat zur Trockene eingedampft.

Auf diese Weise erhielt man die Acetate von

H-Met-Glu-D-His-Phe-Lys-Trp-OH

Rf* = 0,32 auf SiO₂
H-Met-Glu-D-His-Phe-Lys-Trp-NH₂

Rf* = 0,37 auf SiO₂
H-Met-Glu-D-His-Phe-Lys-Trp-N(CH₃)₂

Rf* = 0,42 auf SiO₂

* Rf in Bu:Py: Ac: Wa (2:3/4:1/4:1).

Beispiel 7

H-Met-Glu-D-His-Phe-Arg-Trp-OH

Ausgehend von Boc-Met-Glu (OtBu)-D-HiS-N₃, her gestellt entsprechend V. 1 und H-Phe-Arg-Trp-OH nacl so L. 4 erhielt man das Hexapeptid nach 70stündigen Rühren bei 0⁰C.

Der nach dem Eindampfen des Reaktionsgemische: im Vakuum erhaltene Rückstand wurde in DMFaufge nommen und in die zehnfache Menge Wasser gegossen Der entstehende Niederschlag wurde getrocknet um auf die oben beschriebene Weise behandelt.
Rf in Bu : Py : Ac : Wa (4 : 3/4 :1/4 :1) = 0,17 au SiO₂.

Das amorphe Produkt, das schwach rosa war, wurde weiter durch Gegenstromverteilung gereinigt; System Bu : Ac : Wa (4 : 1 : 5).

Beispiel 8

H-Met-D-Glu-His-Phe-Arg-Tra, H-Met-D-Glu-His-Phe-Lys-Phe-OH

1. Ausgehend von 1,87 g Boc-Met-D-GIu (OtBu)-His N₂H₃ und 3,2 mMol H-Phe-Arg-Tra (M. 2) wurde da;

23 2b 0 33

Pentapeptidamid nach dem in Beispiel 2.1 beschriebenen Verfahren hergestellt. Das Reaktionsgemisch wurde 84 h bei 0⁰C stehen gelassen, zur Trockene eingedampft und nahm es in wäßrigem Äthylacetat auf.

Das Reaktionsgemisch wurde dreimal mit Wasser extrahiert, anschließend das Äthylacetat getrocknet und im Vakuum abdestilliert. Der Rückstand wurde in DMF aufgenommen und zu Äthylacetat/Petroläther (1:1) getropft, wobei man einen Niederschlag erhielt.

Ausbeute: 1,72 g.

Rf in Bu : Py : Ac : Wa (4 : 3/4 :1/4 : 1) = 0,51 auf SiO₂.

Bei der wie oben beschriebenen Behandlung mit Tnfluoressigsäure und Austausch der Trifluoressigsäuregruppe durch die Essigsäuregruppe erhielt man die Acetate von H-Met-D-Glu-His-Phe-Arg-Tra in 82 %iger Ausbeute.

Rf in Bu : Py : Ac : Wa (4 : 3/4 :1/4 : 1) = 0,17 auf SiO₂.

2. Auf die gleiche Weise wie unter 1 beschrieben, wurde das Peptid H-Met-D-Glu-His-Phe-Lys-Phe-OH · acetat, ausgehend von Boc-Met-D-Glu (OtBu)-HiS-N₂H₃ und H-Phe-Lys (Boc)-Phe-OH (0.4), hergestellt.

Rf in Bu : Py : Ac : Wa (4 :3/4 :1/4 : 1) = 0,19 auf SiO₂.

Beispiel 9

H-A-Glu-D-His-Phe-Lys-Tra
1. Boc-Met-Glu (OtBu)-D-His-Phe-Lys (Boc)-Tra

1,87 g Boc-Met-Glu (OtBu)-D-HiS-N₂H₃ wurden in 20 cm³ DMF gelöst und entsprechend 1.1 in das Azid umgewandelt und mit H-Phe-Lys (Boc)-Tra (N. 2) gekuppelt. Der pH-Wert wurde mit TAA auf 7,2 eingestellt und anschließend das Reaktionsgemisch 70 h bei 0⁰C gerührt und filtriert. Das DMF wurde im Vakuum abfiltriert und der Rückstand in Äthylacetat aufgenommen, mit Wasser, einer 5%igen Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen und anschließend die Äthylacetatschicht getrocknet. Die organische Phase wurde abdestilliert, der Rückstand in Alkohol aufgenommen und zu peroxidfreiem Äther getropft. Der gebildete Niederschlag wurde abfiltriert; Fp 203⁰C (Zers.).

2. Entfernung der Schutzgruppen

0,5 g des Peptids nach 1 wurden in 25 cm³ 90%iger Trifluoressigsäure gelöst und das Gemisch 30 min gerührt. Auf die oben beschriebene Weise wurde die Trifiuuressigsäure isoliert, getrocknet und in das Acetat übergeführt, wobei man das Acetat H-Met-Glu-D-His-Phe-Lys-Tra durch Lyophilisieren des Filtrats erhielt.

Rf in Bu : Py : Ac : Wa (4 : 3/4 :1/4 :1) = 0,22 auf SiO₂.

Beispiel 10

H-Met-Glu-D-His-Phe-Lys-Phe-OH und Derivate
1. Boc-Met-Glu (OtBu)-D-His-Phe-Lys (Boc)-Phe-OH

Ausgehend von Boc-Met-Glu (OtBu)-D-HiS-N₃ (6.1) (9,35 g Hydrazid wurden in das Azid umgewandelt und mit DMF-Lösung auf 50 cm³ verdünnt) wurde Vs gekuppelt mit 3,2 mMol H-Phe-Lys (Boc)-Phe-OH (0.4). Das Reaktionsgemisch wurde mit TAA auf einen pH-Wert von 7,3 eingestellt und 70 h bei 0⁰C gerührt. Nach dem Ansäuern auf einen pH-Wert von 4 wurde die DMF-Suspension in die achtfache Menge Wasser gegossen. Der entstehende Niederschlag wurde 3 h bei 0°C gerührt und filtriert.
Ausbeute: 1,63 g Peptid, Fp 188° (Zers.)

2. Boc-Met-Glu (OtBu)-D-His-Phe-Lys (Boc)-Phe-NH₂

Das Azid (Vs der unter 1 erwähnten Lösung) wurde gekuppelt mit 3,2 mMol H-Phe-Lys (Boc)-Phe-NH₂ (0.3) und auf die unter 1 beschriebene Weise weiterverarbei-'< > tet, jedoch ohne Ansäuern.

Fp 204° (Zers.) Braunfärbung.

3. Boc-Met-Glu (OtBu)-D-His-Phe-Lys (Boc)-Phe-OMe

Vs der nach 1 hergestellten Azidlösung wurde gekuppelt mit 3,2 mMol H-Phe-Lys (Boc)-Phe-OMe (0.2) und auf die unter 1 beschriebene Weise ohne Ansäuern weiterverarbeitet.

Rf in Bu : Py : Ac : Wa (4 :3/4 :1/4 :1) = 0,61 auf SiO₂.

4. Boc-Met-Glu (OtBu)-D-His-Phe-D-Lys (Boc)-Phe-OtBu

Vs der nach 1 hergestellten Azidlösung wurde zugegeben zu einer Lösung von 3,2 mMol H-Phe-D-Lys (Boc)-Phe-OtBu in 10 cm³ DMF (P. 4). Der pH-Wert wurde mit TAA auf 7,3 eingestellt und anschließend das Reaktionsgemisch 70 h bei 0°C gerührt und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wurde in wäßrigem Äthylacetat aufgenommen und dreimal mit Wasser gewaschen, anschließend die Äthylacetatschicht getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde aus Alkohol/Äther/Petroläther (1:1) umkristallisiert.

J5 Ausbeute: 2,1 g.

Rf in Bu : Py : Ac : Wa (4 :3/4 :1/4 :1) = 0,73 auf SiO₂.

5. Boc-Met-Glu (OtBu)-D-His-Phe-Lys (Boc)-PPA

« Vs der nach 1 hergestellten Lösung wurde zu einer gekühlten Lösung von 3,3 mMol H-Phe-Lys (Boc)-PPA (Q. 4) in 10 cm³ DMF gegeben. Der pH-Wert wurde auf 7,2 eingestellt und anschließend das Reaktionsgemisch 70 h gerührt und dann auf übliche Weise weiterverar-

beitet. Das PPA-Peptid wurde aus trockenem Äthylacetat umkristallisiert.
Rf in To : EtOH (8:2) = 0,35 auf SiO₂.

6. Behandlung der nach 1 bis 5 erhaltenen Peptide

0,5 g der oben beschriebenen Peptide wurden in 25 cm³ 90%iger TFA gelöst, 1 h gerührt und dann auf übliche Weise weiterverarbeitet. Anschließend wurde durch Austausch in 50 cm³ tert.-BuOH: H₂O (1:1) die Acetatgruppe eingeführt.

Man erhielt auf diese Weise die Acetate von

H-Met-Glu-D-His-Phe-Lys-Phe-OH Rf* = 0,18

H-Met-Glu-D-His-Phe-Lys-Phe-OMe Rf* = 0,27

H-Met-Glu-D-His-Phe-Lys-Phe-NH₂

Rf* = 0,23
H-Met-Glu-D-His-Phe-D-Lys-Phe-OH Rf* = 0,17

H-Met-Glu-D-His-Phe-Lys-PPA Rf* = 0,30

* Rf in Bn · Py: Ac: Wa (4 :3/4 :1 /4 :1) auf SiO₉.

23 2b

Beispiel 11 H-Met-Glu-D-His-Phe-Lys-Phe-Gly-OH

3,74 g Boc-Met-Glu (OtBu)-D-HiS-N₂H₃ wurden in das Azid umgewandelt (siehe Beispiel 6.1) und gekuppelt mit 6,4 mMol H-Phe-Lys (Boc)-Phe-Gly-OH (R. 3) auf die in Beispiel 10.1 beschriebene Weise.

Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde in Wasser gegossen und der entstehende Niederschlag abfiltriert.

Rf in Bu : Py : Ac : Wa (4 :3/4 :1/4 : 1) = 0,50 auf SiO₂.

Bei Behandlung entsprechend Beispiel 1.2 erhielt man das Heptapeptidacetat.

Rf in Bu : Py : Ac : Wa (2 :3/4 : 1/4 : 1) = 0,25 auf

SiO₂. i-j

Beispiel 12 Sulfoxide von Met- und Desamino-Met-Peptiden

0,06 mMol des (Met-haltigen) Peptids wurden in 5 cm³ Essigsäure gelöst und anschließend 15 μΐ 30 % Wasserstoffperoxid zugegeben. Das Gemisch wurde 1 h bei 20⁰C gerührt und anschließend eine Suspension von 20 mg Platin (schwarz) in 2,5 cm³ Eisessig zugegeben. Dann wurde das Reaktionsgemisch 30 min gerührt und filtriert und das Lösungsmittel im Vakuum abgedampft. Der Rückstand wurde in 10 cm³ tert.-Butanol/Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Auf diese Weise erhielt

Met (—> O)-Glu-D-His-Phe-OH

Rf* = 0,22
Met (—> O)-Glu-D-His-Phe-Lys-Phe-OH

Rf* = 0,15
Met (—> O)-Glu-D-His-Phe-D-Lys-Phe-OH

Rf* = 0,14
Met (—> O)-Glu-D-His-Phe-Lys-Tra

Rf* = 0,15
Met (—»O)-D-Glu-His-Phe-Lys-Trp-OH Rf* = 0,17

Desamino-Met (—► O)-Glu-D-His-Phe-Lys-Phe-OH

Rf* = 0,22
Desamino-Met (—»O)-Glu-D-His-Phe-Lys-Tra Rf* = 0,22

' Rf in Bu: Py: Ac: Wa (4:3/4:1/4:1).

Beispiel 13

anschließend 0,06 cm^J 30 %iges Wasserstoffperoxid zugegeben. Das Gemisch wurde 2 h bei einer Temperatur von ungefähr 10 bis 15⁰C gerührt und dann mit 25 cm³ tert.-Butanol/Wasser verdünnt. Anschließend wurde Dowex X-8 in der Acetatform zugegeben. Das Gemisch wurde 30 min gerührt, anschließend filtriert und das entstehende Filtrat lyophilisiert.
Man erhielt auf diese Weise die Acetate von

Met (—> O₂)-Glu-D-His-Phe-Lys-Tra

Rf* = 0,20
Met (—> O₂)-Glu-D-His-Phe-Lys-Phe-OH

Rf* = 0,16
Met (—> O₂)-Glu-D-His-Phe-D-Lys-Phe-OH

Rf** = 0,25
Met (—> O₂)-Glu-D-His-Phe-Lys-Phe-Gly-OH

Rf** = 0,22

Desamino-Met (—> O₂)-Glu-D-His-Phe-Lys-Phe-OH

Rf** = 0,32
Desamino-Met (—► O₂)-Glu-D-His-Phe-Lys-Tra

Rf** = 0,36
H-Met (—»O₂)-D-Glu-His-Phe-Lys-Trp-OH

Rf* = 0,22
H-Met (—> O₂)-D-Glu-His-Phe-Arg-Tra

Rf* = 0,16

* Rf in Bu: Py: Ac: Wa (4:3/4:1/4:1) auf SiO₂
** Rf in Bu: Ac:Wa (4:1 :1) auf SiO₂.

30

35

40

45

50

0,2 mMol des (Met-haltigen) Peptids wurden gelöst in einem Gemisch von 0,5 cm³ Wasser, 0,1 cm³ 4 η Perchlorsäure, 0,02 cm³ 0,5 m Ammoniummolybdat und Beispiel 14
Zinkkomplexe

Von einer Lösung von Zinkchlorid, enthaltend 50 mg Zink pro cm³ wurden 1,5 cm³ zu einer Lösung von 31,5 mg Na₂HPO₄ · 2 H₂O in 30 cm³ destilliertem Wasser gegeben. Der Niederschlag von Zinkphosphat wurde wieder durch Zugabe von 4 η HCl gelöst. Dann wurden 175 mg NaCl und 0,5 g Benzylalkohol zu dem Gemisch gegeben. Dann wurden 1,5 mg des Hexapeptids H-L-Met-L-Glu-D-His-L-Phe-L-Lys-L-Phe-OH (5.5) in dem Gemisch gelöst und dann ausreichend 1 η Natriumhydroxid zugegeben, um den pH-Wert des Gemisches auf 8,5 einzustellen. Anschließend wurde das Volumen mit destilliertem Wasser auf 50 cm³ aufgefüllt.

1 cm³ Suspension enthielt:

30 μg Hexapeptid

1,5 mg Zink

0,63 mg Na₂HPO₄ ■ 2 H₂O

3,5 mg NaCl

10 mg Benzylalkohol.

Claims

Patentansprüche:

1. Peptide der allgemeinen Formel
A-Glx-His-Phe-Lys oder Arg-Z,

wobei entweder Glutamyl, Glutaminyl oderHistidyl nur in der D-Konfiguration, Lysyl und Arginyl in der L- oder in der D-Konfiguration und sämtliche sonstigen von Aminosäuren abgeleiteten Reste nur in der L-Konfiguration vorliegen und die Substituenten folgende Bedeutungen haben: