DE1643345A1 - Verfahren zur Herstellung von Glucagon - Google Patents

Description

FARBWERKE HOECHSl

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pr.Hg/te *iif Patenten meldung

Frankfurt (M)-Hoedut

Verfahren zur Heratiailung von

Dag ProtTeohQiTBieai Glucagon konjitt bisher 3ynth*i±ech nicht h«rg«fSLt.ellt vreir<l«n, 3ond«rn itnrde aus Panltree« Eine chei»i3ch0 Vollsyntheae des Glucagone,

das Irieul.inss_t ist von greßetir Jnt«reese. Sie ist attch ,von großer prektisoher Bedisutxuig, da «ji« au3 PanJfcrea« s<$vrinnbaren Mengen an Glucagon sehr, gering sind. Fite* eine therprpeutiaohc .Verwendrangcies Glucagone

anißt eei solche Ken g.en . an Pankreas ",bea^beXtAt wer den⁷, wi-e ~

si.e praktisch gar nipht zvir Verfügung stehen, Somit ist eine chemische Glucegon-eynth*«« .trotte der zfthlr<aich«n Syn.thesfeetufen jgeseniifaer uer Qevinnunf »us Bankrees vorteilhafter, siß;be4e«t«t für dia fechnik iiin«nE'jf«»*»tiloh«n

Fortschritt. * J₁

Bs wurde .nun gefunden; d«ß «inn Qlucagon aynthetiieh 'herstellen k^uini in dem !fan Uasi Peptid der talucagon^Ä^uaina 7 bis 29 dsr Forrael .<

1 BAD ORIGINAL

- 2 - Fw 5^73 A

H-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Lys(BOC)-7 8 9 10 11 12

Tyr(tBu)-Leu-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp(OtBu) 13 Ik 15 16 17 18 19 20 21

Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr(tBuKOtBu (I) 22 23 24 25 26 27 28 29

mit einem Überschuß an dem Peptid der Glucagon-sequenz 1-6 der Formel

-Hirf^iAdOC)-Ser(tBu)-Gln-Gly-Thr(tBu)-Phe-OH (II) l^w 2 3 k 5 6

mittels Carbodiimiden in Gegenwart von N-Hydroxysuccinfcnid oder von N-Hydroxyphtalimid kondensiert und aus dem so erhaltenen geschützten Glucagon der Formel

AdOC-His-(AdOC)-Ser(tDu)-Cln-Gly-Thr(tBu)-Ph_e-Thr(tBu)-Ser(tBu) 1 2 3 ^li 5 67 8

Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Lys(BOC)-Tyr(tBu)-Leu-Asp(OtBu) Ä 9 10 11 12 13 Ik 15

Ser(tBu)-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27

Thr(tBu)(OtBu) (III)

29

die Schutzgruppen anschließend mittels Trifluoressigsäure abspaltet.

Die Herstellung der als Ausgangsstoffe benötigten Glucagonpeptide der Sequenzen 1-6 sowie 7-29 wird im Anschluß an die Ausführungsbeispiele beschrieben.

/3 109828/1833

BAD ORIGINAL

- 3 - Fw 5**73 A

Bei der Kondensation der beiden geschilderten Bruchstücke nach dem erfindungsgemäßen Verfahren werden Carbodiimide verwendet, vorzugsweise benutzt man das Dicyclohexylcarbodiimid. Das Kondensationsverfahren wird in üblicher Weise durchgeführt. Als Lösungsmittel werden vorzugsweise Dirnethylacetamid, Phosphorsäure-trisdimethylamid oder N-Methylpyrrolidon oder auch ein Gemisch dieser Lösungsmittel verwendet. Man beginnt bei tiefen Temperaturen, etwa -20 bis -10 , und läßt im Verlauf der Reaktion unter Rühren langsam auf Zimmertemperatur kommen. ^

Aus dem erhaltenen Reaktionsgemisch wird das Reaktionsprodukt durch teilweises Abdestillieren des oder der Lösungsmittel und Fällen mit Äther/Petroläther erhalten. Die im Überschuß eingesetzte Peptidkomponente der Sequenz 1-6 läßt sich überraschenderweise selektiv mit Tetrahydrofuran aus dem amorphen Reaktionsprodukt extrahieren. Diese vorteilhafte Reinigungsmethode, die wesentlich zum Gelingen einer technisch verwertbaren Glucagon-synthese beiträgt, war nicht zu erwarten, da alle anderen in der Peptidchemie verwendeten Lösungsmittel für diese spezielle Reinigung versagten.

Die zweite Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens, die "

Abspaltung der Schutzgruppen, erfolgt mittels Trifluoreösigsäure unter den üblichen Reaktionsbedingungen.

Die Kondensation zur Synthese eines biologisch aktiven Glucagons kann nicht mit beliebig gewählten Peptidbruchstücken durchgeführt werden; z.B. ist es nicht möglich, die Glucagon-sequenz durch Kondensation der Peptidbruchstücke 1-8 + 9-29 nach der Azidmethode aufzubauen, obwohl sich dieses Kondensationsschema nach den in der Peptidchemie vorliegenden Erfahrungen wegen des carboxylendständigen Serins als besonders geeignet anbot. Auch bei der erfindungsgemäß gewählten Kondensation aus den Bruchstücken

/k

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BAD" fö

- 4 - Fw 5^73 A

1-6 + 7-29 lassen sich die sonst in der Peptidcheiuie üblichen Kondensationsverfahren nicht anwenden, lediglich die geschilderte Kondensationsmethode führte zum Ziel.

Aufgrund der Bedeutung de^s Glucagons bei der Regulierung des Blutzuckerspiegels kann dieses Peptid in der Therapie Verwendung finden.

In den nachstehenden Beispielen werden die Aminosäuren in der üblichen Weise abgekürzt. Die Schutzgruppen bedeuten:

BOC » CH-C-O-CO-

ί^Ι13
tBu » CH-C-

Au₃

CH_n-O-CO-

NPS =

NO

-ONP « -0^y ^NV-N0_o

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BAD ORIGINAL

^r5

- 5 - Fw 5^73 A

Hinter den Verbindungen ist in Klammern die Position der Peptide in der Glucagon-Sequenz angegeben.

/6

109826/1833

-6- Fvr 3^73 A

Beispiel

a) Geschütztes Glucagon (Sequenz 1-29)J

Noi.NdmJ-Di-adamantyloxycarbonyl-L-histidyl-O-tert.-butyl-L-seryl-L-glutaminyl-glycyl-O-tert.-butyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-O-tert.-butyl-L-threonyl-O-tert.-butyl-L-eeryl-L-asparagyl(ß-tert.-butylester)-O-tert.-butyl-L-tyrosyl-O-tert.-butyl-L-seryl-N^-tert.-butyl-oxycarbonyl-L-lysyl-O-tert.-butyl-L-tyrosyl-L-leucyl-L-asparagyl-i ß-tert.-butylester) -O-tert. -butyl-L-seryl-L-arginyKhydrobromid) L-arginyl(hydrobromid) -L-alanyl-L-glutawinyl-L-asparagyl(ßtert.-butylester)-1-phenylalanyl-L-valyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-leucyl-L-inethionyl-L-asparaginyl-O-rtert.-butyl-L-threonin-tert.^butylester (1-29)

1,9 g H-Thr(tBu)-3er(tBu)-Asp(0t3u)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Lys(BOC)-Tyr( tBu) -Leu-Asp( OtBu) -Ser ( tBu) -Arg(HBr) -ArgUlBr ) Ala-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr(tBu) OtBu·HBr (7-29-Hydrobromid) und 2.36 g AdOC-His(AdOC)-Ser(tBu)-Gln-Gly-Thr(tBu)-Phe-OH (2-6 ) und 0.3^5 g N-Hydroxysuccinimid werden in kO cnr frisch destillierten Dimethylacetamid/Phosphorsäure-tris-dimethylamid (1:1) unter Rühren gelöst. Die erhaltene Lösung wird anschließend mit 0,07 cur TriSthylamin versetzt, auf -15° abgekühlt, nach Zugabe von 0.618 g Dicyclohexylcarbodiiraid 2k Stunden bei 0-5° und weitere 3 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Danach wird .zur Reaktionsmischung nochmals 0,6 g AdOC-Hiβ(AdOC) Ser(tBu)-Gln-Gly-Thr(tBu)-Phe-OH (1-6 ), 0,06 g N-Hydroxysuccinimid ui d 0,103 Dicyclohexylcarbodiimld zugefügt, der Ansatz weitere 2 Tage unter Rühren belassen. Man erwärmt 30 Minuten lang auf 6o°, filtriert und dampft anschließend Dimethylacetamid bei 50° und 10" Torr ab} die verbleibende Lösung läßt man in 1*5 1 absol. Diäthyläther einfließen.

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- 7 - Fw 5^73 A

Nach 3stündigeai Stehenlassen wird der Niederschlag abfiltriert und mit absol. Diäthyläther sorgfältig nachgewaschen. Das erhaltene Produt wird 3mal mit heißem
Essigester und anschließend 2mal mit bidestilliertem
Wasser digeriert, im Vakuum kurz getrocknet und letztlich 17 Stunden lang im Soxhlet-Appara£ mit absol. Tetrahydrofuran erschöpfend extrahiert. Nach I5stündigem Trocknen
bei 80 und lo" Torr über P_o0_i weißes amorphes Pulver.

Ausbeutet 2.06 g (Sk % d.Th.).

C232H	367	N43	°55	Br2	S	+	6H2O	12	(^9	38,	,82	6)
Ber. t	C	56.	42	H	7	.7^	N	12	.20	0	19	.76
Gef.:	C	55.	91	H	7	.39	N	.31	0	19	.61

Aminosäureanalyse: His Ser GIu GIy Thr Phe Asp Tyr Lys Leu

Ber.: 14 3 13242

Gef.: 0,87 3.51 3.O6 0,98 2.77 1.97 3.97 1.75 0,94 1,95

	Arg	Ala	VaI	Trp	Met	N.	3
Ber.:	2	1	1	1	1	4
Gef.:	2,0	1.02	i.o4	_	0,94		,50

b) Glucagon (Sequenz 1-29)

L-Histidyl-L-seryl-L-glutaminyl-glycyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-L-threonyl-L-seryl-L-asparagyl-L-tyroeyl-L-seryl-L- lysyl-L-tyrosyl-L-leucyl-L-asparagyl-L-seryl-L-arglnyl-L-arginyl-L-alanyl-L-glutaminyl-L-asparagyl-L-phenylalanyl-

L-valyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-leucyl-L-methionyl-L-

asparaginyl-L-threonin (1-29)

0,5 g AdOC-His(AdOC)-Ser(tDu)-Gln-Gly-Thr(tDu)-Phe-Thr(tBu)-

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BAD ORJGiNAL

-8 - "Ew:5*73-A

Sei· ( tBu) -Asp( OiEu) *Tyr (tBu) -Ser(tBu) ^Lye(BOC) VTyr(tBu) , Leu-Ä\sp( OtTIu) «Ser( tBu) -ArgUffir ) -Ar₈(HBr)-Ala-Gin-AsptOtBu) Phe-Val-Gln^Trp-Leu^Met-Asn^Thr(tBu) -QtBu . ( 1-29· ) ^ 10 cmν wasserfreier Trifluoressigsäure übergössen und unter

- Argon-Atmosphäre "2 Stunden lang bei Raumtemperatur gelassen; hierbeiverfolgt Lösung. Anschließendowird. die Trif luöressigsäure bei- möglichst .tieferVTemperatur ·. (Bad-.temperatur, jnax. 15 · ) im Vakuum (10 Torr) abgezogen, der verbleibende^ Hückstand- mit.einer .wässrigen Aufschlämmung von Dowex Λ·(OH-Form) 1 Stunde lang und-nach Ansäuern mit Essigsäure.auf ca. pH » Λ weitere 10 Minuten gerührt. Das Filträt vom Ionenaustauscher wird lyophilisiert; das.erhaltene. Material in -eiskaltem Wasser aufgenommen, von wenig .Unlöslichem, abfiltriert und erneut Iyophilieiert: weißes . amorphes - Pulver.

Ausbeute: "."38Ό -mg' (Kbh-Glucagon) .

Aminosäureanalyse:

:

His

• Ser

GIu

GIy

Thr -

.68

Phe

Asp

02

.Tyr

Lye

Lau

Ber.

• •

1

k

3

1

Γ 3

Met

2

.2

1

2

Gef.

0,35

,3Λ&:

2 «'9*' 0

,99

. 2

1

1.96

3 »90

U 75

ν 0,-91

1.92

t

Arg

-Ala

ΛΤόΙ

-Trp

0,90

Ber.

:

: 2

1

il

1

Λ

Gef.

1.99

1,02

1.01

«.

5·

/9

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BAO

- 9 - ^Fw 5^73 A

Herstellung der Ausgangspeptide:

A Sequenz 1-6 > ~

1) Benzyloxycarbonyl-O-tert.-butyl-L-threonyl-L-phenyl· alanin-methylester (5-6)

Zu einer Lösung von 70 g (226 mMol) Z-Thr( tBu) -OH (5)' in 5OO cm Diclilormethan werden bei -5 nacheinander Jl.k cm Triäthylamin, 29 g (227 mMol) H-Phe-OMe .1ICl (6-Hydrochlorid) und 51 S (248 jiiMol) Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben. Man rührt die Reaktionsmischung 4 Stunden bei -5 und weitere 10 Stunden bei Raumtemperatur. Das Filtrat vom Dicyclo. hexylharnstoff wird im Vakuum eingedampft, der Rückstand zwischen Essigester und Wasser verteilt, die abgetrennte organische Phase wie üblich mit verd. Citronensäure-, Kaliunihydrogencarbonat-Lösung und Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach Eindampfen im Vakuum erhält man ein Öl, das mehrere Stunden im Hochvakuum getrocknet wird. Ausbeute 80,0 g (75 % d.Th.).

2) O-tert.-Butyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-methylesterhydrochlorid (5~6)

8o'.O g (170 niMol) öligen Z-Thr( tBu) -Phe-OMe (5-6) in 400 cm³ Methanol werden wie üblich unter Zutropfen von n-methanolischer Salzsäure bei pH » k hydriert. Das Filtrat vom Katalysator wird im Vakuum eingeengt, der Rückstand aus Methanol/Diäthyl- a'ther uoikrietalliserti Schmp. 162-163°} (oC)f_y°i + 26,6 ^ 1° bzw. (αύ) "^g J + 33,1° (c * 1.3 J in Äthanol). Chromatog. rein in tert.-^öutanol/Eiseeeig/Waeeer/Pyridin (30j6:2k!20) bzw,

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BAD ORIGINAL

tert.-Butanol/Eisessig/Wasser (6:2:2). Ausb. 59,1 g (93 # d.Th.)

C₁₈H₂₈N₂O^-HCl (372.9) Ber. C 57,98 H 7,84 N 7,51

Gef. C 57-79 H 7.85 N 7,31

3) Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl-glycinmethylester (3-4)

Zu 84,0 g (0,3 MoI) Z-GIn-OH (3) und 41,7 g cm³ Triäthylamin in 400 cm Tetrahydrofuran/Acetonitril (1:1) werden bei -15° unter Rühren 28,6 cm Chlorameisensäureäthylester langsam zugetropft. Zur Reaktionsmischung fügt man 37,8 g (ca. 0,3 Mol) H-GIy-OMe-HCl (Ί-IIydrochlorid) und 41.7 cm³ Triäthylamin in 200 cm Dimethylformamid, rührt eine Stunde bei -10° und weitere 'i Stunden bei Raumtemperatur. Danach destilliert man die Lösungsmittel im Vakuum ab. Der Rückstand wird mit 1000 cm·³ 0,5n-IICl behandelt, das gebildete feste Material abfiltriert, anschließend mit 0, Sn-Kaliiunhydrogencarbonat-Lösung digeriert, erneut auf das Filter gebracht und mit Wasser gut gewaschen. Das im Vakuum über P_o0_ getrocknete Produkt wird letztlich aus Methanol umkristallisert: Schmp. 174,5-175,5°; U)%° : -16,2 i 1° bzw. <oÄ>iJ4₆ ^: -^l8.⁸° (c = 0,8; in Äthanol) 1 (^)^⁰ : -6.6 +_ 1° bzw. ( )^₆ : -7.7° (C = Ij in Eisessig). Ausbeute 80,3 g (76 % d.Th.). O₆ (351-4) Ber. C 54.70 H 6,02 N 11,96 Gef. C 54. k& II 6.11 N 11,71

k) . L-Glutaminyl-glycin-methylester-hydrochlorid (3-4 IIydrochlorid)

Eine Aufschlämmung von 88.0 g (235 mMol) Z-Gln-Gly-OMe (3-4) in 400 cm Methanol wird in Gegenwart von Palladium-schwarz und unter Zutropfen von n-methanolischer Salzsäure bei pH 4 12 Stunden wie üblich hydriert. Dae Filtrat vom Katalysator wird im Vakuum eingedampfτ, der Rückstand aus abaol. Äthanol

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BAD ORIGINAL

5^73

umkristallieiert:

Schmp. 110-113°; («i)ß⁰: + 16.6 ± 1° bzw. ((Ki)^₆ : + 19-3° (c - 2.3; in Methanol). Ausb. 56.3 g (94.5 % d.Th.). CgH₁ N O^-IICl (253.7) Ber. C 37.87 H 6.36 N 16.56 Cl 13-98

Gef. C 37.66 II 6.32 N 16.38 Cl 13.97

5) Benzyloxycarbonyl-O-tert.-butyl-L-seryl-L-glutaminylglycin-methylester (2-4)

Zu 62.5 g (212 mMol) Z-Ser(tBu)-OH (2) hergestellt nach Chem. Ber. j)«*, 105 (1966) und 29.4 era³ Triethylamin in 400 cm³ Tetrahydrofuran werden bei -10° unter Rühren 20.2 cm Chlorameisensäureäthylester zugetropft, zur erhaltenen Lösung des asymm. Anhydrids 53.6 g (212 mMol) H-Gln-Gly-OMe.HCl (3-4-Hydrochlorid) und 29.4 cnr Triäthylamin in 300 cm Dimethylformamid zugegeben. Man rührt die Reaktionslösung 1 Stunde bei -10 , dann 2 Stunden bei Raumtemperatur und dampft anschließend im Vakuum ein. Der erhaltene Rückstand wird mit

verdünnter Citronensäure-Lösung behandelt, das gebildete feste Produkt auf das Filter gebracht, mit Wasser säurefrei gewaschen, um Vakuum über P₂O. getrocknet und letztlich aus Äthanol umkristallisiert: Schmp. I85-I86⁰; (oC)_D°: -9-2 £ 0,5° bzw. 0*0 -_L(- '. -10,7° (C » 1.6; in Äthanol); -I5.6 ± 1° bzw. (Od)JSJ₆ : -18.9° (c » 1; in 8o-proz. Essigsäure), nach Trocknen bei 90° und 10 Torr. Chromatog. rein in n-Ainylalkohol/Fyridin/Wasser (35:35:30). Ausb. 83.6 g (80 % d.Th.).

C₂₃Il₃₄N^O₈ (494.6) Ber. C 55-86 II 6.93 N 11.33

Gef. C 55.68 II 7.OI N 11.35

6) Benzyloxycarbonyl-O-tert.-butyl-L-seryl-L-glutaminyl-glycin (2-4)

32.7 g (66 mMol) Z-SeHtBu)-GIn-GIy-OMe (2-4) in I50 cm³ Dioxan werden mit 66 cm^J η-Natronlauge wie üblich verseift. Nach Ansäuern mit 66 cm n-Schwefelsaure wird die Lösung im Vakuum bis zur Trockene eingedampft, der Rückstand mit Aceton

10982671833 BAD ORIGINAL

/12

- 12 - Fw 5*173 A

behandelt, wobei Natriumsulfat ungelöst bleibt. Das im Vakuum eingedampfte Filtrat hinterläßt einen festen Rückstand, der aus wenig Wasser umkristallisiert wird: Schmp. I58-I59⁰ (1^5°); <οό)ρ° ϊ -9.0 _± 1° bzw. te) ^₆ : '-1O.3° (c m 1.2; in Äthanol). Chromatog. rein in tert.-Butanol/Eisessig/Wasser/Pyridin (30:6:24:20). Ausb. 29.2 g (90 % d.Th.).

C₂₂II₃₂N₄O₈. 1/2H₂O (489-5) Ber. C 53.98 H 6.8Ο N 11.43

Gef. C 54.Ο6 II 6.89 N 11.39

7) Benzyloxycarbonyl-0-tert.-butyl-L-seryl-L-glutaminylglycyl-O-tert.-butyl-L-thrconyl-L-phenylalanin-methylester (2-6)

Zu 42.2 g (88 mKol) Z-Ser(tBu)-Gln-Gly-OH (2-4) und 12.25 cm³ Triethylamin in 300 cin^J Dimethylformamid werden bei -5 32.9 g (88 mMol) Il-Thr(t3u)-Phe-0Me.HCl (5-6-Ilydrochlorid) 15.2 g (132 mMol) N-Hydroxysucciniinid und 20.0 g (97 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid gegeben. Die Reaktionsmischung wird 4 Stunden bei -5 und 14 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, vom ausgefallenen Dicyclohexylharnstoff abfiltriert und im Vakuum eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird nacheinander mit 5-proz. Citronensäure- bzw. 10-proz. Kaliumhydrogencarbonat-Lösung digeriert_t auf das Filter gebracht und sorgfältig mit Wasser gewaschen. Nach Umkristallisieren aus 70-proz. Methanol: Schmp. I78.5-181.5⁰; (o^)p°: +5^i 1° bzw. <*)?°₆ » +6.5° (c * 1.1ί in Methanol). Chromatogr. rein in n-Heptan/n-Butanol/ Eisessig (3:1:1) bzw. n-Propanol/Essigester/Wasser (7t1:2)-Ausb. 65 g (93 % d.Th.)

^C4O^H38^N6°11 i79ö.9) Ber. C 60. 13 H 7.32 N 10.52 0 22.03

Gef. C 6Ο.Ο7 H 7.28 N 10.60 0 21.99

8) Benzyloxycarbonyl-0-tert.-butyl-L-seryl-L-glutaminyl-glycyl-0-tert. -butyl -L-threonyJ -L-jihenylalanin ( 2-6)

Lösung von .¹M,'! _>L: (C? uIIoJ' -Hei ( < Pu> -<»7n-Gly-Tlr( i Ihi

109826/1833
BAD

!643345

- 13 - ^pw 5473 A

Phe-OMe (2-6) in 4O cnr Dioxan werden rait 25.5 cnr η-Natronlauge innerhalb 30 Minuten wie übliche verseift. Nach Ansäuern mit 25·5 cm η-Salzsäure entfernt man das Dioxan weitgehend im Vakuum; beim Stehenlassen der Rest-

o *

lösung bei +2 tritt Kristallisation ein. Das ausgefallene Produkt wird abfiltriert, über VQ im Vakuum getrocknet und schließlich aus Äthanol/Essigester oder Acetonitril umkristallisiert:

Schmp. 155.5-157°; (^)₀ ⁵⁰S + 16.7 i 1° bzw. (^)^₆ * +19-1° (c =» 1; in Methanol). Ausb. 16.3 g (83 % d.Th.). C HCgN₆O₁₁ (784.9) Ber. C 59.68 II 7.I9 N 10.7I 0 22.42

Gef. C 59.67 H 7.33 N 10.62 0 22.47

9) 0-tert.-Butyl-L-seryl-L-glutaminyl-glycyl-O-tert.-butyl-L-threonyl-phenylalanin (2-6)

I5.7 g (20 mMol) Z-Ser(tBu)-Gln-Gly-Thr(tBu)-Phe-OH (2-6)

3 3 -·

in 300 cnr wäßr. Methanol und 1 cnr Essigsäure werden wie üblich hydrogenolytisch entacyliert. Das B'iltrat vom Katalysator hinterläßt nach Eindampfen im Vakuum einen Rucks tan,der aus

20 Methanol/Propanol-2/Diäthyläther kristallisiert: (&6)_D ^:

+ 7.33 ± 1° bsw. fe6)r4ß ^{; +} 9-13° (c » 0.9; in Wasser). Chromatog. rein in tert.-Butanol/Eisessig/Wasser (4:1:5) bzw. Amylalkohol/Pyridin/Wa
Ausb. IO.85 g (80 % d.Th.).

Gef. C 54.94 II 8.O7 N 12.48 0

bzw. Amylalkohol/Pyridin/Wasser (35:35:30). Ausb. IO.85 g (80 % d.Th.).
C-.II.-N.O,, + 1.5 II_o0 (677·8) Der. C 54.96 II 7-86 N 12.41 0

10) Ne^,N(im)-Di-adamantyloxycarbonyl-L-histidin-iN-hydroxysticciriimidester) ( 1)

25.6 s AdOC-HiS(AdOC)-OH (I-3) herstellt nach J.Ainer,Chem.Soc. 88 (1966), ;ieite 1988 und ? g N-lIydroxy-succinimid in 25O cm³ Dioxan werden bei Ό mit 11 g Üicyclohexylcarbodiimid versetzt. Die It«takt ionsmischurig wird 2 Stunden bei 0° und 12 Stunden bei IU)UtU temper η tür gerührt, mich erneutem Abkühlen auf 0°

1098? η / 1833 ΒΑΪ> ORiQJNAL

Fw 5^73 Λ

vom abgeschiedenen Dicyclohexylharnstoff filtriert. Der nach Eindampfen des Piltrats im Vakuum erhaltene Rückstand wird mit 100 ein Dichlormethan behandelt „ wobei geringe Mengen Dicyclohexylharnetoff ungelöst bleiben. Die erwärmte Dichlorraethan-Löaung versetzt man vorsichtig mit wenig Petroläther; nach Einsetzen der Kristallisation wird mit Petroläther überschichtet und zuerst bei Raumtemperatur und anschließend bei -5 zur Vervollständigung der Kristallisation stehengelassen. Das abfiltrierte Produkt wird im Vakuum bei 60° getrocknet: Schmp. 16Ί.5-I67.5° (15I⁰). Ausb. 22.6 g.

(Der erhaltene AdOC-HIs(AdOC)-OSU enthält noch etwas N-Hydroxy-succinimid, ist jedoch für die weitere Umsetzung genügend rein).

H) N ,N(im)-Di-adamantyloxycarbonyl-L-histidyl-O-tert.-butyl-L-seryl-L-glutaminyl-glycyl-O-tert.-butyl-L-threonyl-L-phenylalanin (1-6)

6.78 g (1 mMol)- H-3er( tßu)-Gln-Gly-Thr(tBu)-Phe-OH (2-6) und 1.4 cm-* Triäthylamin in I50 cm-* Pyridin werden bei -5° mit 9.2 g (ca. I.5 mMol) AdOC-His(AdOC)-OSU (1) (Rohprodukt) versetzt; die Reaktionslösung wird 2 Stunden bei 0 und weitere 8 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, im Vakuum eingedampft, der Rückstand mit absol. Diethylether behandelt und auf das Filter gebracht. Die Lösung des erhaltenen Produktes in 100 cm^ Methanol läßt man in 500 cm^ Wasser, das k.3 g Citronensäure enthält, einfließen. Die gebildete Fällung wird abfiltriert, nach sorgfältigem Waschen mit Wasser im Vakuum getrocknet un-' sch ließ lieh in 300 cm Easigeater/Methanol {$'.1) aufgenommen. In diese Lösung läßt man unter Rühren 100 cnr abs. Diäthyläther langsam einflkfoen. Nach mehrstündigem Stehenlassen im Kühlschrank bei -5 wird der Niederschlag abfiltriert und im Vakuum bei k0° getrocknet (IJeim Umkristallisieren aus Acetonitril und

109826/1Bm

BAD ORfQtNAL

- 15 - ^Fw 5^73 A

Trocknen der Fällung bei 6o° und 1O~^J Torr erhält man das Acyl-hexapeptid mit 1 Mol Wasser und 1/2 Mol Acetonitril: C₅₉H₈₅N₉O₁₄ + H₂O + 1/2 CH₃CN (1182.9)

Her. C 60.92 II 7,5^li N 11.25 0 20.29

on ·

Gef. C 60.88 H 7.6I N 11.24 0 20.09). : (oC)q - + I6.63 ,+ 1° bzw. (0O)Z₄V ·' + 19.9^⁰ (c * 0.9; in Methanol). Chromatog. rein in Amylalkohol/Pyridin/Wasser (3505'-3O), n-Butanol/ Eisessig/Wasser (6:2:2) bzw. n-Heptan/n-Butanol/Eiaessig (1:2:1) Ausb. 9.^5 E (80 % d.Th.).
C₅₉H₃₅N₉O₁₄ + CH₃OH (1176.4)

Ber. C 6I.26 II 7.63 N 10.72 0 20. kO Gef. C 6θτ9Ο H 7.87 N 10.87 0 20-33

Aininosäureanalyse :

	His	96	Ser	GIu	GIy	C	Thr	Phe	NH
Ber.	1	A X	1	1	1	1	1
Gef.	ο,	0,96	1,0	1.	1.0	0,96	1

1.21

C Sequenz (7-2?)

1) Ne6-2-Nitrophenylsulf enyl-O-tert. -butyl -L-serin-4-nitrophenylester /ΝΓΞ-Ser(tDu)-CNP_7(S)

Zu 50 mMol H-Ser(tßu)-OH in 25 cnr Dioxan und I7 cm^ 2n-Natronlauge troi>ft man unter Rühren innerhalb von 30 Minuten 55 nillol 2-Nitro-phenylsulfenylchlorid in 25 cnr Dioxan sowie Ün-Natronlauge unter Linhalten eines pH-Wertes von 8 zu. (Verbrauch ca. 38 cm 2n-Natronlauge), Die Reaktionsmischung vird 1 Stunde lang weitergerührt, nach Verdünnen mit 6OO cn>. Wasser filtriert, und nach Zugabe von 200 cm Essige-ster vorsichtig bei 0 nit n-Schwef el säure ,»uf pH = 3 angesäuert. Die abgetrennte organische Phase wird zwfirial mit wenig Wasser £ßwa/fcben. ?.··> der erhaltenen über Natriunisulfyΐ getrockneten

0
BAD

- 16 - Fw 5*i73 A

Essigesterlösung des NPS-O-tert*-butyl-serins wird bei

0 ₌ unter Rühren 50 mMol 4-Nitrophenol und 50 mMol Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben. Die Reaktionsmischung wird

1 Stunde bei 0° und 3 Stunden bei Raumtemperatur nächgerührt, nach kurzzeitigem Abkühlen auf 0 vom ausgefallenen Dicyclohexylharnstoff abfiltriert und im Vakuum eingedampft. Der verbleibende Rückstand wird aus Äthanol umkristallisiert und im Vakuum über P₂O- getrocknet. Ausb. 67.5 96 d.Th.

Schmp. 82.5-83.5°; (*6)p°» -H6,0° bzw. t^)?^ - -130,8° (c β 1 in Dimethylformamid)

C₁ H₃₁N O_S(435,3) Ber.: C 52,43 H 4,86 N 9.65 S 7.35

.Gef.i C 52.I6 II 4.86 N 9.25 S 7.17

2) L-Asparagyl(ß-tert.-butylester)-0-tert.-butyl-L-tyrosyl-0-tert. -butyl-L-seryl-N/- -tert. -butyloxycarbonyl-L-lysyl-0-tert.-butyl-L-tyrosyl-L-leucyl-asparaginsrii.ire (ß-tert. butylester) (9-I5)

200 g (141 mMol) Z-Asp(OtBu)-Tyr-(tBu)-Ser(tBu)-Lys(BOC)-Tyr(tBu)-Leu-Asp(OtBu)-OH (9-15), hergestellt nach Chem. Ber. 92 (I966), Seite I05 in 2000 cm³ Dimethylformamid/ 95-proz. Methanol (1:1) und 3 cnr Eisessig werden bei 40 wie üblich 72 Stunden hydriert. Die lteaktionsmischung wird auf dem Wasserbad erwärmt, vom Katalysator abfiltriert und in der Kälte der Kristallisation überlassen. Das erhaltene Produkt wird mit Äthanol digeriert und im Vakuum getrocknet. Chromatog. rein in n-Amylalkohol/Pyridin/ Wasser (35J35:30) bzw. in n-Butanol/Eisessig/Wasser (6:2:2.). Schmp. über 250°; (06)_Ώ : + 3.5 +^ 1° bzw. + 4.6 (c a 1.4; in 80-proz. Essigsäure). Ausb. I76.4 g (99 %).

^c66ⁿio6^N8^oi7-^1H.'2^{O (}

Nach Trocknen bei 90 und IQ Tori' wird die wasserfreie

109826/1033 _/r?

BAD ORlGHAS^ ^ ^{/ (}

Ber.	C	60	.90	H	8	.36	N	8.	6	1
Gef.	C	60	,82	H	8	Λ2	N	8.	6	1

- 17 - Fw 5*73 A

Substanz erhalten.

^C66^H106^N8^O17 <¹²⁸3·6) Ber. C 61.76 H 8.32 N β.73

Gef. C 61.78 H 8..4Ο . N 8.73

3) Noi-Benzyloxycarbonyl-O-tert.-butyl-L-seryi-L-asparagyl (ß-itert.-butylester) -O-tert .-»butyl-L-tyrosyl-O-tert butyl-L-seryl-N£-tert.-foutyloxycarbonyl-L-lysyl-0—tert.-butyl-L-tyrosyl-L-leucyl-L~asparaginsäureiß-tert.-butylester) (8-15) .

8.21 g (6.3?mMol) H-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Lys(BOC)-Tyr(tBu)-Leu-Asp(OtBu)-OH (9-15) werden in 100 cm³ Dimethyl formamid mit Ο.89 cm Triäthylamin gelöst und bei Raumtemperatur unter Rühren mit 3.42 g (8,2 mMol) Z-Ser(tBu)-ONP (8 g) hergestellt nach Chem. Ber. j?2 (1966), Seite I05 versetzt. Nach 48 stündg. Rührenlassen wird die Reaktionsmischung mit 3*8 cm Eisessig versets&t, anschließend im Vakuum eingeengt. Der erhaltene Rückstand wird mit verdünnter Citronensäure-Lösung behandelt, auf das Filter gebracht und zunächst mit Wasser und dann mit Diäthyl-* äther aqrgfälig gewaschen. Nach Umkristallisieren aus 90-proz. Methanol und Trocknen bei 8O° und lo" Torr;

Schmp. 208-209°; (*Uq° i -12.8 ^ 1° bzw, (c^) ?^₆ s -17·5 (j

(c * 1; in Methanol). Chromatog. rein in Amylalkohol/ Pyridin/Waseer (35:35:30) bzw. in n-Butanol/Wasser/Eisessig (6:2:2). Ausbeute. 8.75 g ('Ö8 %) .

N₉O₃₁.1/4 H₂O (1565.5) ^öe^· ^c 62,15 H 8.08 N 8,05

Gef. C 62.06 Π 8.11 N8.01

4) 0-tert.-Butyl-L-seryl-L-asp&ragyl(ß-tert »-butylester)-0-t«rt» -butyl-L-tyrosyl-O-ter t. -butyl-L-seryl-^-ter t, hut/loxyca.rbonyl-L-lysyl-0-ter t «—butyl-Xf-tyrosyl-L-I "iucy 1-L-a-nparaginiSfiurei ß« tert,-butylea t«r) 8«15 J

/r' i! ■;· ι-^f/*r ' Xü ■»"' «

'j ^:.i ■> ■ - / HiTI
BAff

Fw 54?3 A

Lys(DOC)-Tyr(tBu)-Leu»Asp(QtBu)-OH (8-I5) in 800 cm³ Dimethylformamid/95-proz. Methanol (1:1) und 3 cnr Essigsäure werden bei ^5° wie üblich hydriert. Durch kurzes Erhitzen auf dem Wasserbad wird das ausgefallene Produkt in Lösung gebracht, noch heiß vom Katalysator filtriert» das Filtrat anschließend mehrere Stunden im Kühlschrank bei -5 stehengelassen. Das abgeschiedene Material wird abgesaugt, mit Methanol gewaschen und über P„0 im Vakuum getrocknet ι

Schmp. 250°; 6 )^°. -_3#9± i° _bzw-. (o^^g : -^5° <« » U in 80-proz. Essigsäure). Chromatog. rein in n-Butanol/ Eisessig/Wasser (2:2:1) bzw. in Amylalkohol/Pyridin/Waseer (3505530). Ausb. >0.9 g (SO %) .

ß) ^Ber· ^c 60.69 H ΒΛΊ N'8.?3 0 22.10 Gef. C 6O.79 H 8,58 N 8.73 0 2I.9I

5) Nc£r2-Nitro-phenylsulfenyl-O-tert.-butyl-L-threonin (NPS-Thr(tBu)-0H) (?)

; ι, (^iO mMol) U-TUrCtDu)-OH" werden- mit 2-N L tro -phsny Laulf ehyl ■;hl jrLil :>rLi) unter D 1) beechri&ban niii^ftsa tzt und auf gsarb^li's ;: .'■ ?t ^vi^;; It -»η-* Eiii; ig"* stir IiJiHm?; 'Kir 4 iu Vakuum-, zum Schluß uüt '-.-:■:--;, ·?ν i; "-.JiI-II^t L. \:i uii ': .·ί»π ::-O I ■ -J- .bit f-r.i *■ f Ki I r* I a Ll x^n, \ i ,

- 19 - Fw 5473 A

H	6	.13	N	8	• 53	S	9	.74
H	6	.07	N	8	.46	S	9	• ξ *

ein. Das Produkt wird nach Behandeln mit Petroläther abfiltriert, mit dem gleichen Lösungsmittel gut gewaschen und im Vakuum getrocknet. Nach Umkristallisieren aus Diäthyläther/Petroläther: F - 112 - 1ΐ4°{ (^>p°» -93·2 + 1° bzw. (o£) r λ/: " -95*9° (c- a 1; in Dimethylformamid) ο Ausb« 12.85 g (fast quantitativ). ₍

C₄HN₀O S (328.4) Ber.s C 51.21

Gef: C 51.26

6) Noi-S-Nitrophenyleulfenyl-O-tert.-butyl-L-threonin-N- %

hydroxysuccinimid-ester (NPS-Thr(tBu)-OSU) (7) ,

25 mMol NSP-Thr(tBu)-OH in I50 cm Essigester werden bei 0° unter Rühren mit 25 mMol N-Hydroxysuccinimid

' ι und 25 mMol

Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Die Heaktionsmischung wird 1 Stunde lang bei 0° und 3 Stunden bei Raumtemperatur nachgerührt. Nach Abfiltrieren des ausgefallenen Dicyclohexylharnstoffs wird die Lösung im Vakuum eingedampft, der erhaltene Rückstand mit Äthanol behandelt. Hierbei erfolgt zunächst Lösung und anschließend rasche Kristallisation, die durch mehrstdg. Stehenlassen im Kühlschrank vervoll- ä

ständigt wird. Ausb. 91 % d.Th. . Schmp". 138-139,5°; (οζ)^° =» -52,9° bzw. (°6)^5 » -56,9° (c »" 1 in Dimethylformamid) C₁₈H₂₃N₃O₇S (435,4) Ber.: G 50,82 H 5,45 N.-9,0.7 5 7,52

Gef.: C 50,8l H 5,46 N 9,70 S 7.58

7) No6-2-Nitro-phenylsulfenyl-0-tert.-butyl-L-threonyl-0-tert.-butyl-L-seryl-L-asparagylCß-tert.-butyleeter)-O-tert.-butyl-L-tyrosyl-0-tert.-butyl-L~seryl~N -tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-O-tert. -butyl-L-tyrosjt-l-leucyl-lasparaginsäure (ß-tert.-butylester) (7 * I5)

11,6 g (8 mMol) H-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-

/20

1098 26/183 3 BAO

- 20 - Fw .5*73 A

Lys(BOC)-Tyr(tBu)-Leu-Asp(OtBu)-OH (8-I5) in I50 cm³

3 Dimethylformamid werden mit 1.12 cm Triäthylamin und. 4.2 g (8.8 mMol) NPS-Thr(tBu)-OSU (7)*) versetzt, die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur I5 Stunden lang bis zum gallertartigen Erstarren gerührt. Beim Behandeln der Masse mit 1000 cm verd. Citronensäure-Lösung (pH » 4) flockt das Produkt aus; es wird nach sorgfältigem Verreiben abfiltriert und mit Wasser gut nachgewäsehen. Das noch feuchte Produkt wird in wenig heißem Methanol aufgelöst; beim Stehenlassen der Lösung über Nacht bei 0° scheidet sich reines, kristallines Nonapeptid-Derivat ab* Es wird abfiltriert und um Vakuum bei 10 ^J Torr getrocknet: (06) Jj⁰ : -20,8 £ 1° bzw. (o£)?£₆ ^: -23,0° (c - 0,9; in Dimethylformamid). Chromatog. rein in Amylalkohol/ Pyridin/Wasser (35:35:30), Chloroform/Methanol (7t3) bzw. n-Butanol/Eisessig/Wasser (6:2:2) bzw. n-Butanol/Äthanol/ Wasser (2:2:1). Ausb. 12.4 g (89 S).

c87Hi	37"H0	23s	(	II	[1	.95	2)	8	.87	S	1	.81	O	21	.19
Ber.:	C 60.	15	H	7	.05	N	8	.58	S	1	.94	O	21	.43
Gef.:	c 59.	94	8	N

Amlnosäureanalyse:

	Thr	Ser	Asp	Tyr	Lys	Leu
Ber.	1	2	2	2	1	1
Gef.	0,95	1,81	2,06	1,85	1,02	l,O3

) hergestellt nach Beispiel B 6)

109826/1833

_j( : . ^ : BAD ORJGfNAl.

- 21 - Fw 5^73 A

8) N^^-Nitro-phenylsulfenyl-O-tert.-butyl-L-seryl-L- arginyl-(hydrobromid)-L-arginyl(hydrobromid)-L-alanyl-Liglutaminyl-L-asparaginsäure(ß-tert.-butylester) (16-21)

15,8 g H-Arg(HBr)-Arg-(AcOH)-Ala-Gln-Aep(OtBu)-OH (17-21)*) in 200 cm Dimethylformamid werden bei -10° mit 10 g NPS-Ser(tBu)-ONP versetzt. Die Reaktionslösung wird 24 Stunden bei 0°, und 40 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, an- -schließend in viel Diäthyläther eingerührt. Das ausgefallene Material wird abfiltriert, in wenig Dimethylformamid gelöst und erneut in Diäthyläther eingerührt; die Prozedur wird nochmals wiederholt, das abgeschiedene Material auf das Filter gebracht und mit Essigester und Diäthyläther sorgfältig gewaschen. Nach zweimaligem Umkristallisieren aus Methanol/ Äthanol: Zers.P. ab 170°; t*)?^ '· -3Ll t 1° (c « 1; in Dimethylformamid). Chromatogr. rein in n-Butanol/Essigsäure/ Wasser (6:2:2).

Ausb	•	18.	4 g	(	93	% d	.Th.	)	.90	0	20	.44	Br	7	.29	S	2	.93
c4iH	69	Ni4	°13	+	H2	O	(109		.54	0	20	.39	Br	• 7	.05	S	2	.88
Der.	C	44	.93		II G	.53	N	17
Gef.	C	44	.97		H G	.78	N	17

9) N ~2-Nitro-phenylsulfenyl-0-tert.-butyl-L-seryl-L-arginyl-(hydrobromid)-L-arginyl)hydrobromid)-L-alanyl-L-gutaminyl-L-asparagyl(Π-tert.-butyleater)-L-phenylalanyl-L-valyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-leucyl-L-methionyl-L-asparaginyl 0-tert.-buty1-L-threonin-tert.-butyleater (I6-29)

16,5 t Nl'S-Ser( tBu)-Arg(HBr) -Arg-Al _ft-Gln-Asp( OtBu) -OH (16-21), If3,5 Ä II-l^>l»e-Val-Gln-Trp-Lsu<-Met-ABn-Tbr(tllu)-OtBii.HBr (22-29-Hydrobromid) - hergestellt aus dem freien Octapeptld (22-:»0)

*) hargeatellt nach Chem* Der. 100 ( I967), Seite 820

109826/1833 BADORIGiNAL

- 22 - ^Fw 5*73 A

Chem. Ber. 100 (I967, Seite 816 iii Dimethylformamid durch Umsetzung mit der berechneten Menge 0.1 n-Bromwasserstoffsäure - und 1.73 S N-Hydroxy-succinimid in 300 cnr Dimethylformamid werden bei -15° mit 3.42 g Bicyclohexylcarbodiimid versetzt. Die Reaktionslösung wird 60 Stunden bei 0° und 2.4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Filtrat vom abgeschiedenen Bicyclohexylharnstoff rührt man in 2000 cm Essigester ein; der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert und anschließend 2mal aus wenig Methanol/Wasser umgefällt. (Die gebildete Fällung wird zweckmäßig durch Zentrifugieren abgetrennt). Das so erhaltene Produkt wird letztlich durch dreimaliges Umfallen aus Dimethylformamid/Essigester/Wasser (200:2500: 20 cm"') weiter gereinigt: Schmpl 230-232° (Zera.); (^)₀ t -18.83 _+ 1° bzw. (^)^6 ^: -^2Ο·^8ο° ^ic * ¹J ⁱⁿ Dimethylformamid). Chromatogr. rein in Amylalkohol/Pyridin/Wasser (35i35s3O) bzw. tert.-Butanol/Essigsäure/Wasser/Pyridin (60:6:24:20). Ausb. 24.4 g (70 % d.Th.).

C98H	155	N25	°24	Br	2S	2 +	H2°	15.	(2309	.49)	32	Br	6	• 92	S	2	.78
Ber.	C	50.	57	II	6	.85	N	14.	16 0	17.	69	iär	6	.36	S	2	.79
Gef.	C	50.	94	11	6	.94	• N	96 0	17.

Asp	Phe	VaI	Leu	Met	Thr	NH3
2	1	1	1	1	1	3
2,01	1,02	1,03	1.04	1.01	0,96	3.26

Aminosäure-Analyse: Ser Arg Ala GIu

Der. 1 2 1 2

Gef. 0,84 1,98 0,97 2,0

10) O-tert.-Butyl-L-seryl-L-arginyl(hydrobromid)-L-arginyl(hydrobromid)-L-alanyl-L-glutaminyl-L-asparagyl(ß-tert.-butyl ester)· L-phenylalanyl-L-valyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-leucyl-L-methionyl-L-asparaginy1-0-tert.-butyl-L-threonin-1ert.-butylester-hydrobromid (16-29)

11.5 S Nl⁾S-Ser(tBu)-Arg(HBr)-Arg(HBr)-Ala-Gln-Asp(OtBu)-Phe-

109826/1833 BADORiGINAU

Fw 5^73 A

Val-Gln-Tro-Leu-Met-Asn-Thr(tBu)-OtBu (16-29) und 13.1 g

2-Methylindol in 8jO cm Dimethylformamid/Methanöl (16:1) werden

3 unter Eiskühlung tropfenweise mit 110 cm 0,1 n-methanolischer Bromwasserstoffsäure versetzt. Die Reaktionsmischu-ng wird unter weiterer Eiskühlung 2 Stunden und anschließend 5 Stunden bei Raumtemperatur nachgerührt, anschließend in viel absol. Diäthyläther eingegossen. Der ausgefallene Niederschlag wird abfiltriert und 2mal aus Dirnethylformamid/Methanol/Diäthyl-

äther unter Zusatz von 2-Methylindol umgefüllt. Das nunmehr farblose Produkt wird auf das Filter gebracht, mit absol·

_3 Diethylether gewaschen und letztlich im Vakuum bei 10 Torr

getrocknet: Schmp. 216-218° (Zera)? fcdp⁰ J -34,1 ± 1° bzw. (oC) cue ' -4l,l (c * 1; in 80-proz. Essigsäure). Chroma to grrein in tert.-Butanol/Essigsäure/Wasser/Pyridin (60:6:24:20); Whatman Nr. 1, aufsteigend. Ausb. 10 g (90 Ji d.Th.).

^C92^IIl53^N2^°22^Br3^{S + 3 H}2°

Ber. C 48.61 H 7,05 N U,79 0 17.60 Br 10.55 S 1,47

Gef. C 48,93 H 7,04 N 14,76 0 17.57 Br 10.51 S 1,46

Aminosäureanalyse: Ser Arg Αχ_β GIu Asp Phe VaI Leu Met Thr NH

Ber. 12 1 2 2 11 1 11

Gef. 0,89 1,95 1,0 2,02 2,05 1,0 1,01 1.02 0.94 Ο.96 3,15

H) Hv5-2-Nitrophenylsulfenyl-0-tert.-butyl-L-threonyl-0-tert.-butyl-L~eeryl-L-a«paragyl(ß-tert.-butylester)-0-tert.-butyll-tyroeyl-0-tert.-butyl-L-seryl-N^-tert.-butyloxycarbonyl-L-lyeyl-O-tert.-butyl-L-tyroeyl-L-leucyl-L-asparagyliß-tert.-butylester)-0-tert.-butyl-L-seryl-L-arginyllhydrobromid)* L-arginyl(hydrobroB»id)-L-alÄnyl-L-glutaminyl-L-asparagyl(ßt«rt.-butylester)-L-phenylalanyl-L-valyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-leucyl-L-methionyl-L-asparaginyl-O-tert.-butyl-L-threonin-tert.-butyleeter (7*29)

7.32 g H-Ser(tBu)-Arg(HBr)-Arg(HBr)-AIa-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Val-Gln-

109826/1833 bad ORKSWNA. ^/2k

- 2k - Fk 5473 A

Trp-Leu-Met-Asn-Thr(tBu) -OtBu-IIBr (16-29) und 5.25 g NPS-Thri tBu)-Ser(tBu)-Aap(OtBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Lys(BOC)-Tyr(tBu)-Leu-Asp(OtBu)-OH (7rl5) werden in I50 cm³ Dimethylacetamid unter Erwärmen und Rühren gelöst. Die auf Raumtemperatur abgekühlte Mischung wird nunmehr tropfenweise mit 0.42 cm^J Triäthylamin und anschließend mit 0.52 g N-Hydroxysuccinimid, nach Abkühlen auf -10 schließlich mit 0,93 S Dicyclohexylcarbodiimid unter Rühren versetzt.

Das Reaktionsgemisch wird 60 Stunden bei 0 «und weitere

*
Stunden bei Raumtemperatur unter Magnetrührung gehalten, anschließend im Vakuum bei 10 Torr zu einem zähen Brei eingedampft. Das nach Verrühren mit bidest. Wasser erhaltene feste Material wird abfiltriert, in wenig Dimethylacetamid suspendiert und erneut mit bidest. Wasser ausgefällt. Das nach sorgfältigem Waschen mit Wasser trockengesaugte Produkt wird anschließend mehrfach mit heißem Essigester digeriert, auf das Filter gebracht und mit Essigester und Diäthyläther nachgewaschen. Das so erhaltene Rohprodukt wird zur Entfernung von nicht umgesetzter Kopfkomponente (7-15) 18 Stunden mit absol. Tetrahydrofuran und anschließend ca. 9 Stunden mit absol. Methanol im Soxhlet extrahiert. Das so gereinigte Material wird mit Diäthyläther auf das Filter gebracht, und anschließend bei 8o° und 10 Torr 24 Stunden über P_o0 getrocknet: F * ab 250° allmähliche Zers., chromatogr. rein in tert.-Butanol/Eisessig/Wasser/Pyridin (60:6:24:20) bzw. in Amylalkohol/Pyridin/Wasser (35:35:3C). Ausb. 7,85 g (68 % d.Th.).

^ci79^H287^N35°44^Br2^S <3857,5D

Ber.	C 55	H 7,	Thr	Ser	Asp	3	50	N 12	,70 O	18.25	Br.	4	.14	S 1.	66	Phe	VaI
Gef.	C 55·	H 7.	2	3	4		44	N 12	.69 O	18.67	Br.	3	.78	S 1.	67	1	1
•73	AminosKureanalyse:	1,92	2,73	'»,ι	09										ι,ο4	I.03
.64		Met	NH		Tyr	Lye	Leu	Arg		Ala	GIu
Ber.	J	3		2	1	2	η «κ		1. -	2
Gef.	1 .02	3,		1,95	0,94	2.03	1,97		1.0	2,0	1
Her,
Gef.					.- -.

109826/1833 /₂₅

BAD ORiGINAt,

12) 0-tert.-Butyl-L-threonyl-O-tert.-butxl-L~seryl-L-asparagyl(ß-tert.-butylester)-O-tert.-butyl-L-tyroayl-O-tert.-butyl-L-seryl-N^-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-O-tert.-butyl-L-tyrasyl-L-leucyl-L-asparagyl-( ß-ter t. -butylester) -O-tert. -butyl-L-seryl-L-arginyl-(hydrobromid)-L-arginyl(hydrobromid)-L-alanyl-L-glutaminyl-L-asparagyl(ß-tert.-butylester)-L-phenylalanyl-L-valyl-L-glutaminyl-L-tryptaphyl-L-leucyl-L-methionyl~L-asparaginyl-O-tert.-butyl-L-threonin-tert.-butylester-hydrobromid (7-29-Hydrobromid)

• I

3.85 g NPS-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Aep(OtBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Lys(BOC)-Tyr(tBu)-Leu-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Arg(HBr)-Arg(HBr)-Ala-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr(tBu)-OtBu (7-29) und 13 g 2-Methylindol werden in ca. 5Q0 cm Dimethylacetamid unter Rühren gelöst, die Mischung nach Abkühlen auf 0° mit 100 cnr eiskaltem Methanol und unter Rühren

und Eiskühlung anschließend mit 2.2 cm ln-methanolischer

Bromwasserstoffsäure, verdünnt mit 100 cm Methanol, tropfenweise versetzt. Nach 3-stündigera Rühren bei O und 22 Stunden bei Raumtemperatur destilliert man das Methanol im Vakuum bei 15 Badtemperatur ab. Anschließend rührt man die verbleibende Lösung in 28ΟΟ cm' absol. Diäthyläther/Petroläther (25:1O) ein; die gebildete Fällung wird nach mehrstündigem Stehen im Kühlschrank abfiltriert und anschließend zweimal aus Dimethy1-acetamid/Diäthyläther umgefällt. Nach Trocknen bei 8O° und 1O~^ Torr über P 0_r : F « ab 220° allmähliche Zers.; (°C)q° * + 15·27 ± 2° bzw. Qj^) 5^6 » + I?.36° (c m 0,6 in Dimethylacetiunid/Phoephorsäure-tris-dimethylamid (9?¹))· Chroraatogr. rein in tert.-Butnnol/Eiseesig/Wasser/Pyridln (60*6:24:20) bzw. Amylalkohol/ Pydridin/Wasser (35:35:30). Ausb. 3.4 g » 88 % d.Th..

ci73	C	54	34°4	2Bl	?	S +·	2	N	H2O	(3821,	,22)	43	Br.	6	>33	S	O	.85
Ber.	C	54	,37	H	7	,62	N	12,	58 c	18.	65	Br.	6	.28	S	O	.99
Gef.			• 52	H		.69		12.	39 0	18.
					BAD	ORIGINAL

- 26 - ^Fw 5473 A

Aminosäureanalyse:

Thr Ser Asp Tyr Lys Leu Arg Ala 61u Phe Ber. 23k 212 2 1 2 Qef. 1,86 2,72 3,9*1 1.87 0.98 2,03 1,95 1,0 1,9^ 1,03

VaI Met NH Ber. 113 Gef. 1,03 0,97 3,63

BAD ORIGINAL 109826/1833

Claims (2)

1. - 27 - ^Fw 5^73 A

   Pat entanspruche

   Verfahren zur Herstellung von Glucagon, dadurch gekennzeichnet, daß man das Peptid der Glucagon-sequenz 7 bis 29 der Formel

   H-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Lys(BOC) 7 8 9 10_# 11 12

   Tyr (tBu) -Leu-Asp( OtBu) -Ser ( tBu) -Arg-Arg-Ala-Gln-Asp( OtBu)-

   13 14 15 16 17 18 19 20 21

   Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr( tBuKOtBu (D 22 23 2k 25 26 27 28 29

   mit einem Überschuß an dem Peptid der Glucagon-sequenz 1-6 der Forniel

   AdOC-His(AdOC)-Ser(tBu)-Gln-Gly-Thr(tBu)-Phe-OH (II) 1 2 3^5 6

   mittels Carbodiimiden in Gegenwart von N-IIydroxysuccinimid oder von N-Hydroxyphtaliiaid kondensiert und aus dem εο erhciltenen geschütz Len Glucagon der Formel

   AdOC-His(AdCC)-Ser(tBu)-Gln-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu) 1 2 3 k 5 67 -8

   Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Lye(BOC)-Tyr(tBu)-Leu-Asp(OtBu) 9 10 11 12 13 lk 15

   Ser(tBu)-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn 16 17 18 19 20 21 22 23 2k 25 26 27 28

   Thr( tBu) (-OtBu)
   29

   109826/1833

   BAD ORiOiNAt

   Fw 5473 A

   die Schntzgruppen anschließend mittels Trifluoreesigsäure abspaltet.
2. 2) Glucagon-derivat der Formel

   AdOC-HiS-(AdOC)-Ser(tBu)-Gln-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu) 1 2 3 4 5 67 3

   Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Lys(BOC)-Tyr(tBu)-L^u-Äep(OtBu)-9 10 11 12 13 14 15

   Ser(tBu)-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Aen 16 17 iS 19 20 21 22 23 24 25 26 27 2ί·:

   Thr(tBu)-/tBu)

   BAD ORIGfNAL