DE2130559B2

DE2130559B2 - Diagnostisches mittel zum nachweis von urobilinogen

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Publication number: DE2130559B2
Application number: DE19712130559
Authority: DE
Inventors: Walter Dr rer nat 6800 Mannheim Berger Dieter Dr rer nat 6806 Viernheim Re> Hans Georg Dr rer nat Rieckmann Peter Dr rer nat 6800 Mannheim Rittersdorf
Original assignee: Boehnnger Mannheim GmbH, 6800 Mann heim
Priority date: 1971-06-19
Filing date: 1971-06-19
Publication date: 1973-04-26
Also published as: CH564774A5; SE394328B; GB1343247A; AU4354072A; NL7208232A; AT317441B; ES403875A1; SU535914A3; DE2130559C3; FI53508B; JPS5741693B1; DK143147C; AT322116B; IT956664B; DD98763A5; HU162948B; NL170773C; US3853466A; FI53508C; FR2158791A1

Description

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substanzen für den Nachweis von Urobilinogen, ge- Bilirubins werden zwar Diazoniumsalze (z. B. Diazo-

gebenenfalls zusammen mit Bilirubin. sulfanilsäure, p-Nitrobenzol-diazoniumsalz oder 2,4-

Elektronendonatorgrappen sind erfindungsgemäß Dichlorbenzol-diazoniumsalz) bereits seit längerer Gruppen, die Sauerstoff, Schwefel oder Stickstoff in Zeit verwendet Diese ergeben jedoch erwartungsdirekter Bindung mit dem Phenylrest enthalten. 5 gemäß mit Urobüinogen keine brauchbare Farb-Sauerstoffnaltige Gruppen sind beispielsweise Hy- reaktion.

4roxy-, Alkoxy- oder Aryloxygruopen. Als schwefel- Im Gegensatz dazu erlauben es die erfindungsgemä-

haltige Gruppen kommen an sich nur Alkylmercapto- Ben Verbindungen, Urobilinogen neben Bilirubin

oder Arylmercaptogruppen in Frage, da freie Mercap- spezifisch nachzuweisen. In einigen Fällen reagiert

togruppen wegen ihrer Oxydationsempfindlichkeit in 10 zwar auch Bilirubin mit den erfindungsgemäßen Ver-

der Regel nicht brauchbar sind. Als stickstoffhaltige bindungen, jedoch erfolgt die Reaktion erst, nachdem

Gruppen sind Acylamino-, Arylamino- oder Aryl- die Farbreaktion mit Urobilinogen schon weitgehend

alkylaminograppen brauchbar, während unsubstitu- entwickelt ist, und unterscheidet sich farblich so

leite Aminogruppen und Alkylaaünogruppen auf stark, daß es überraschend sogar möglich ist, beide

Grund ihrer Basizität unter den Bedingungen der 15 Gallenfarbstoffe mit einem Reagenz nebeneinander

Reaktion meist protoniert werden und dann kein zu bestimmen, und die Mengenverhältnisse an Hand

mesomeriefähiges Elektronenpaar mehr besitzen. Bei der entwickelten Mischfarbe abzuschätzen. So zeigt

der Auswahl der Substituenten muß ferner darauf etwa eine Rotfärbung die Anwesenheit von Urobili-

geachtet werden, daß diese nicht mit der Diazognippe nogen und eine später entwickelte Blaufärbung das

reagieren. Dies trifft insbesondere für o-Acylamino- 20 Vorhandensein von Bilirubin an. Bei gleichzeitiger

und o-Arylaminogruppen zu. Anwesenheit beider Gallenfarbstoffe färbt sich der

Besonders vorteilhaft lassen sich Verbindungen der Teststreifen zunächst rot und später zunehmend

allgemeinen Formel I verwenden, violett. In Ausnahmefällen entwickeln sich die Farbreaktionen gleichzeitig, wodurch das Testergebnis

R j^ 35 jedoch nicht beeinflußt wird.

³ \ / ^x Für den Fall, daß die Reaktion mit Bilirubin unter-

P _N _ _Ne yr_ drückt werden soll, kann man dies dadurch erreichen,

² _ _ ' Φ daß man als Indikator ein Diazoniumsalz relativ

/ niedriger Elektrophilie verwendet und die Reaktion

R4 30 unter Zugabe kationischer Netzmittel ablaufen läßt.

~Es ist auf diese Weise möglich, die Mittel zum

in welcher X~ ein stabilisierendes Anion und R₁ Nachweis von Urobilinogen gegebenenfalls zusammen und R₂ mehratomige Elektronendonatorgruppen mit mit Bilirubin so zu modifizieren, daß sie dem anmindestens einem mesomeriefähigen Elektronenpaar, gestrebten Zweck optimal gerecht werden,
wobei einer der Reste R₁ und R₂ auch Wasserstoff, 35 Die Verbindungen der allgemeinen Formel I werden Halogen oder eine niedere Alkylgruppe sein kann, vorzugsweise zur Herstellung von Testpapieren verdarstellen, und die Reste R₃ und R₄ Wasserstoff oder wendet. Die Substanzen werden zu diesem Zweck eine die Diazokupplung mit Urobilinogen sterisch mit einer Säure und gewünschtenfalls mit Zusatznicht hindernde Gruppe darstellen, wobei die Summe stoffen, wie z. B. Stabilisatoren und Netzmittel, auf der Hammettschen Sigmawerte aller Substituenten 40 einen saugfähigen Träger gebracht. Außerdem sind Rn R2. R3 und R4 +0,4 nicht überschreiten darf. die Verbindungen I zur Herstellung von Testfilm-

Die Verbindungen I sind insbesondere für die Ver- streifen gemäß der deutschen Offenlegungsschrift

wendung auf saugfähigen Trägern brauchbar. 1 598 153 und zum Nachweis von Urobilinogen in

Die erfindungsgemäßen Benzoldiazoniumsalze rea- Lösungen geeignet.

gieren mit Urobilinogen nahezu momentan und 45 Zur Herstellung der bevorzugten Ausführungsform

ergeben sehr spezifische rote bis blaue Farbstoffe, der neuen diagnostischen Mittel wird ein saugfähiger

welche sich zum Nachweis auch sehr geringer Konzen- Träger, vorzugsweise Filterpapier, mit einer Lösung

trationen besonders gut eignen. Darüber hinaus be- getränkt, die 0,05 bis 5 g, vorzugsweise 0,1 bis 1 g

sitzen die erfindungsgemäßen Verbindungen den (pro 100 ml) eines Diazoniumsalzes der allgemeinen

großen Vorteil, daß die Farbreaktion von Harnstoff 50 Formel I sowie 2 bis 30 g, vorzugsweise 5 bis 20 g

nicht gestört wird. Die bisher bekannten Testpapiere einer festen anorganischen oder organischen Säure

werden von dem im Harn anwesenden Harnstoff je und gewünschtenfalls Netzmittel und/oder Stabili-

nach Konzentration gelb gefärbt, was den Nachweis satoren enthält.

geringer Urobilinogen-Mengen erheblich erschweren Als Lösungsmittel für die Imprägnierlösungen

kann. Darüber hinaus wird die erfindungsgemäße 55 kommen vor allem Wasser und leichtflüchtige orga-

Farbreaktion gerade durch die Substanzen, die häufig nische Lösungsmittel, die nicht mit Diazoniumsalzen

im Harn vorkommen und die Ehrlichsche Probe be- reagieren, in Frage. Es sind dies vor allem niedere

kannterweise am meisten stören, nicht beeinflußt; Alkohole, Essigester und Acetonitril,

zu diesen Störsubstanzen gehören insbesondere die Bei der Herstellung der Diazoniumsalzlösung kann

aromatischen Amine, welche als Arzneimittel (Sulfon- 60 man entweder so verfahren, daß man das fertige

amide, Sulfonylharnstoffe usw.) vielfach mit dem Diazoniumsalz der Lösung zuführt oder indem man

Urin ausgeschieden werden. Die Anwesenheit dieser das Salz in der Lösung durch Diazotierung eines

aromatischen Amine im Harn führte bisher zu gelben aromatischen Amins in bekannter Weise erzeugt,

bzw. orangen Farbreaktionen, welche die durch Bevorzugt und erfindungsgemäß besonders brauch-

Urobilinogen hervorgerufene Färbung sowohl über- 65 bar sind diejenigen Verbindungen der allgemeinen

decken als auch vortäuschen können. Formel I, in welchen R₁ eine Hydroxy-, Alkylmercapto-

Für den Nachweis des zur Diagnostizierung von oder niedere Alkoxygruppe und R₂ eine Hydroxy-,

Leber- und Gallenerkrankungen ebenfalls wichtigen Alkoxy-, Phenoxy-, Alkylmercapto-, Phenylmercapto-,

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Phenylaücyl-amino-, gegebenenfalls substituierte Ph«- säurebeständigen Kunststoffen, wie z. B. Polypropylen

jiylamino- oder Acylaminogruppe, wobei einer der und Polyester, können verwendet werden.

Reste R₁ und R₈ auch Wasserstoff Halogen oder eine Obwohl Testpapiere eine bevorzugte Ausführungs-

Methylgruppe sein kann, und R₈ und R₄ Wasserstoff, form der vorliegenden Erfindung und die elegantesten ein Halogenatom, eine Hydroxy-, Alkoxy-, Phenoxy-, 5 diagnostischen Mittel für Inhaltsstoffe von Körper-

Alkylmercapto-, Phenylmercapto-, PhenyKalkylanii- flüssigkeiten darstellen, ist es natürlich auch möglich,

no-, gegebenenfalls substituierte Phenylamiiso, Acyl- die erfmdungsfKBiäßea Diazoniumsalze zum Urobili-

amino-, Alkyl- und Carboxylgruppe und X~ ein nogen-Nachweis in flüssiger Phase zu verwenden.

Halogenid, oder das Anion einer Sauerstoffsäore oder Tropft man die Diazoniumsalze in saurer Lösung einer durch Halogenwasserstoff koordinativ gesättigten io zu urobilinog?nhaltigem Urin, so erhält man rote

Lewissäure darstellt. bis blaue Färbungen oder Fällungen, welche gegebe-

Aus Haltbarkeitsgründen werden normalerweise nenfalls mittels organischer Lösungsmittel, wie z. B.

nur stabile Diazoniumsalze eingesetzt, d. h. Salze, die Chloroform, ejrtrahiert werden können,

ein stabilisierendes Anion besitzen; dies sind ins- Zur Durchführung des erfindungsgemäßen V-;rbesondere das Sulfat-, das Tetrafluoroborat-, das 15 fahrens zum Machweis von Urobilinogen in Körper-

Tetrachlorozmkat-, das HexachloroanCJmonation so- flüssigkeiten tiucht man die neuen diagnostischen

wie Arylsulfonationen. Mittel in die zu untersuchende Lösung ein und liest

Als feste anorganische und organische Säuren den Farbumschlag nach kurzer Zeit ab. kommen beispielsweise o-Phosphorsäure, Metaphos- Die erfindungsgemäß verwendeten Diazoniumsalze phorsäure, Sulfosalicylsäure, Oxalsäure, oder saure 20 bzw. die entsprechenden Amine sind allgemein beSalze, wie z. B. Kaliumbisulfat in Frage, auch Ad- kannt.

dukte aus Lewissäuren und Lewisbasen sind brauch- Zum quantitativen Nachweis von Ur bilinogen im bar, wenn sie entsprechend sauer reagieren. Besonders Urin mittels photometrischen Methoden haben sich bewährt hat sich die handelsübliche Metaphosphor- als Nachweisreagenzien 4-Methoxy-benzol-diazoniumsäure, die etwa 50 bis 60% ihres Natriumsalzes 25 salze bowie 2,4-Dimethoxy-benzoldiazoniumsalze beenthält, da diese erfindungsgemäß besonders stabile sonders bewährt.

Testpapiere liefert. Die Hammettschen Sigmawerte sind bekanntlich

Metaphosphorsäure und Oxalsäure haben außer- Maßzahlen für den elektronenanziehenden oder elek-

detn den Vorteil, daß sie Testpapiere liefern, die mit tronenlieferndi;n Effekt von Substituenten (im ersteren

Bilirubin nur sehr langsam reagieren. 30 Fall ergeben sich positive, im letzteren negative

Die stabilisierenden Zusätze sind aus der Diazo- Sigmawerte). Die Sigmawerte sind additiv, wobei das

chemie bereits hinlänglich bekannt; solche Zusätze Vorzeichen der Summe angibt, ob — verglichen mit

sind z. B. Natriumfluoroborat, Natriumarylsulfonat, dem Substitusnten Wasserstoff — der elektronen-

Magnesiumsulfat oder Natriummetaphosphat. anziehende oder der elektronenliefernde Effekt über-

Die Verwendung von Netzmitteln ist nicht nur 35 wiegt. Der erfindungsgemäße Grenzwert von -t-0,4

wegen der erzielten besseren Benetzbarkeit angezeigt, besagt also, daß die Wirkung der elektronenliefernden

sie entfalten auch noch zusätzliche spezifische Wir- Substituenten durch elektronenanziehende Substi-

kungen. So bewirken anionische Netzmittel, insbe- tuenten nur bis zum Sigmawert von +0,4 gemindert

sondere Sulfate und Sulfonate, eine Erhöhung der werden darf. Es kann beispielsweise ein Benzoldiazo-

Empfindlichkeit und eine leicht bathochrome Färb- 40 niumsalz mit einer Hydroxylgruppe in Parastellung

verschiebung beim Nachweis von Urobilinogen. Als (Sigmawert == —0,37) noch einen oder mehrere

Beispiele für anionische Netzmittel seien Natrium- elektronenanziehende Gruppen mit einem Gesamt-

laurylsulfat und Natrium-p-dodecylbenzolsulfonat ge- Sigmawert bis zu τ 0,83 besitzen, während ein solches

nannt. Diazoniumsalz, das mit einer o-Methoxy- oder p-Acet-

In manchen Fällen ist es erwünscht, nur signifikant +5 aminogruppe substituiert ist (Sigmawert in beiden

erhöhte Urobilinogen-Spiegel nachzuweisen. In diesen Fällen ± 0), elektronenanziehende Gruppen nur noch

Fällen ist es möglich, die Empfindlichkeit und die bis zu einem Gesamt-Sigmawert von +0,4 enthalten

Reaktionsgeschwindigkeit durch einen Zusatz katio- darf.

nischer Netzmittel, wie z. B. Laurylpyridiniumchlorid, Obwohl H ammett-Berechnungen heute routineherabzusetzen. 50 mäßig durchgeführt werden und ein wertvolles Mittel Nichtionogene Netzmittel, wie z. B. Polyoxyäthylen- für theoretische Aussagen in der Chemie der Aromaten triglyceiid, beeinflussen im allgemeinen nur die darstellen, ist es nicht statthaft, diese als allgemein-Benetzbarkeit der Testpapiere. gültige Absolutwerte zu betrachten. Vielmehr handelt Die Netzmittel werden in Mengen von etwa 0,1 es sich um Näherungswerte, die mit gewissen Unbis 3 g, vorzugsweise 0,3 bis 1 g pro 100 ml Im- 55 Sicherheiten der empirischen Ermittlung behaftet prägnierlösung zugesetzt. sind. Diese Unsicherheiten spielen jedoch nur in Die einzelnen Bestandteile der Rezepturen können seltenen Greiizfällen eine Rolle, die die technische auch nacheinander aufgebracht werden, wenn es die Lehre der vorliegenden Erfindung in keiner Weise Löslichkeiten erfordern oder wenn besondere Effekte beeinträchtigen.

erzielt werden sollen. So kann es z. B. aus Stabilitäts- ⁶° I_n den folgenden Beispielen sind das erfindungs-

gründen günstig sein, erst das Diazoniumsalz und den gemäße Verfahren und die erfindungsgemäßen dia-

Stabilisator aufzugeben und dann erst mit Säure gnostischen Mittel näher erläutert, nachzuimprägnieren.

Nach dem Imprägnieren der saugfähigen Träger Beispiel 1 werden diese bei möglichst niederen Temperaturen 65

getrocknet, um die Diazoniumsalze nicht zu schädigen. Filterpapier (Schleicher und Schüll 23 SL) wird

Als saugfähige Träger kommen vor allem Filter- mit einer Lösung von folgender Zusammensetzung

papiere in Frage, aber auch Vliese und Filze aus imprägniert und bei 40° C getrocknet.

4-Methoxybenzoldiazoniumfluoborat 0,3 g

Metaphosphorsäure 10,0 g

Dodecylbenzolsulf onsäure

(Natriumsalz) 0,4 g

Methanol ;. 5,0 ml

Wasser, ad 100 ml

Das Testpapier gibt bei Eintauchen im Urin nach etwa 5 bis 10 Sekunden die folgenden Farbreaktionen:

Urobilinogenfreier Urin: keine Farbänderung, Urin mit normalem Urobilinogengehalt: Rosa, Urin mit erhöhtem Urobilinogengehalt: Karminrot.

Ähnliche Farbreaktionen geben Testpapiere, die 0,3 g der folgenden Diazoniumsalze enthalten:

2-Methoxybenzoldiazoniumfluoborat, 2-Hydroxybenzoldiazoniumsulfat, 4-Hydroxybenzoldiazoniumsulfat, 2,4-Dihydroxybenzoldiazoniumfluoborat.

Beispiel 2

Filterpapier (Schleicher und Schüll 23 SL) wird mit einer Lösung folgender Zusammensetzung imprägniert und bei 40⁰C getrocknet.

4-Methoxybenzoldiazoniumfluoborat 0,3 g

Oxalsäure 10,0 g

Methanol, ad 100 ml

Einzelne Streifen des so erhaltenen Testpapiers (a) werden mit Lösungen von je 0,4 g Polyoxyäthylentriglycerid (b), Dodecylbenzolsulfonsäure (Natriumsalz) (c) bzw. Laurylpyridiniumchlorid (d) in 100 ml Methylenchlorid nachimprägniert und im warmen Luftstrom getrocknet. Die Testpapiere geben mit urobilinogenhaltigen Urinen nach etwa 5 bis 10 Sekunden die folgenden Reaktionen:

4-Butoxy-, 4-Phenoxy-, 4-Methoxy-2-methyl-, 2-Methoxy-5-methyl-, 2-Methylmercapto-, 4-Methylmercapto- oder 4-Chlor-2-methoxy-5-methylanilin ersetzt ist.
5

Bei spiel 4

Filterpapier (Schleicher und Schüll 23 SL) wird mit folgenden Lösungen nacheinander imprägniert ίο und getrocknet.

I. 4-Acetamidobenzoldiazonium-

fluoborat 0,3 g

Natriummetaphosphat 5,0 g

Wasser, ad 100 ml

Π. Oxalsäure 15,0 g

Natriumlaurylsulfat 0,5 g

Methanol, ad 100 ml

ao Das Testpapier reagiert mit urobilinogenhaltigem Urin mit karminroter Farbe.

Beispiel 5

Filterpapier (Schleicher und Schüll 23 SL) wird mit einer Lösung folgender Zusammensetzung imprägniert und bei 40° C getrocknet.

S-Chlor^-methoxybenzoldiazonium-

toluolsulfonat 0,5 g

Sulfosalicylsäure 5,0 g

Dodecylbenzolsulfonsäure

(Natriumsalz) 0,8 g

Methanol, ad 100 ml

Testpapier	Reaktionsfarbe	Urin mit mg % Ure 0,5 j 1,0
a b C d	Ziegelrot Ziegelrot Karminrot Ziegelrot
+ = schwach; ++=a 4- 4- -+■ + = sehr stark.
	ibflinogen 2,0
Bei	XXX₊
iäßig; +++ = stark;
spiel 3

35 Das Testpapier gibt beim Eintauchen in urobilinogenhaltigen Urin sofort eine Karminrotfärbung. Beim Eintauchen in bilirubinhaltigen Urin erhält man nach 10 bis 20 Sekunden eine blaugrüne Färbung.

Urine, die Urobilinogen und Bilirubin enthalten, liefern je nach deren Verhältnis Zwischentöne zwischen diesen Färbungen.

45

Filterpapier (Schleicher und Scholl) wird mit einer Lösung folgender Zusammensetzung imprägniert und bei 40⁰C getrocknet.

4-Äthoxyanilin 0,25 g

Isoamylnitrit 1,0 ml

Oxalsäure 10,0 g °°

Dodecylbenzolsulfonsäure

(Natriumsalz) 0,4 g

MetoanoLad 100 ml

Das Testpapier reagiert mit urobilinogenhaltigem Urin karminrot. Mit ähnlichen, zum Teil etwas mehr violetten Farbtönen reagieren Testpapiere, bei denen das 4-Äthoxy-anilin dnrch gleiche Mengen 2-Äthoxy-,

Beispiel 6

Polyestervlies wird mit Lösungen folgender Zusammensetzung imprägniert und bei 40⁰C getrocknet

Benzoldiazoniumsalz (a bis f) 0,1 g

Sulfosalicylsänre 10,0 g

Dodecylbenzolsulfonsäure

(Natriumsalz) 0,4 g

Methanol/Wasser 1: 1, ad 100 ml

Folgende Diazoniumsalze wurden verwendet:

a 2-Metooxy-5-cMor-benzol-diazonium-tetrachlorozinkat (Echtrotsalz RC),

b ^Benzamido-Z-methyi-S-methoxy-benzoldiazonium-tetrachlorozinkat (Echtviolettsalz B),

c 4-Benzamido-2,5-dmietboxy-benzol-diazonTOmtetrachlorozinkat (Echtblansalz RR),

d 4-Benzamido-2^-diäthoxy-benzol-diazoniuintetrachlorozinkat (Echtblausalz BB),

e 4-Methoxyphenylamino-benzol-diazoniumchlorid (Variaminblausalz B),

f Phenylamino-benzol-diazonium-hydrogensulfat.

309517/40

9 10

Mit urobilinogenhaltigem Urin wurden folgende B e i s d i e 1 10 Färbungen erhalten:

Rot -> Blau Filterpapier (Schleicher und Schüll) wird mit eine

h Bnt«iniAtt ' Lösung folgender Zusammensetzung imprägniert un

c Blauviolett, 5 be. 40 C getrocknet.

d Blauviolett, 5-Chlor-2-hydroxyanilin 0,25 g

e Blaugrün, Isoamylnitrit 1,0 ml

f Blaugrün. Oxalsäure 10,0 g

Dodecylbenzolsulfonsäure

B e i s ρ i e 1 7 ¹⁰ (Natriumsalz) 0,4 g

_., . ,„,,., , ο , .... „„,,,, . , Methanol, ad 100 ml

Filterpapier (Schleicher und Schull 23 SL) wird

mit wäßrigen Lösungen getränkt, die außer 5 g Das Testpapier reagiert mit urobilinogenhaltigen

Kaliumhydrogensulfat noch je 0,5 g der folgenden Urin karminrot. Denselben Farbumschlag ergibt eir

Diazoniumsalze auf 100 ml enthalten. 15 Testpapier, das in analoger Weise unter Verwendung

von 4-Benzyloxy-anilin hergestellt wurde. 2,4-Dimethoxybenzoldiazoniumfluoborat,

3,4-Dimethoxybenzüldiazoniumfluoborat, Beispiel 11

2,5-Dimethoxybenzoldiazoniumfluoborat, Filterpapier (Schleicher und Schüll 23 SL) wird

3,4,5-Trimethoxybenzoldiazoniumfluoborat, _ao mit folgenden Lösungen nacheinander imprägniert

4-Hydroxy-3,5-dichlorbenzoldiazoniumfluoborat. _und getrocknet:

„ ,. ^ . . ..... I. S-Methoxy^-acetamidobenzoldiazo-

AHe diese Testpapiere reagieren mit urobihnogen- niumfluoborat 0 3g

haltigem Urin mit roten bis Iilaroten Farbtönen. Natriummetaphosphat 5Og

Werden diese Testpapiere mit l%igen Lösungen 25 Wasser, ad 100 ml

der folgenden Netzmittel nachimprägniert, so erhält jj Oxalsäure 15 0e

man kräftigere Rotviolett- bis Blauviolett-Färbungen. ' NatriumlaurVlsuifat .'.'.'.'.'.'..'.'.'.'.'.'.'. 0,'5 g

^ , „ , ,„ _Λ , Methanol, ad 100 ml

Dodecj lbenzolsulfonsaure (Natnumsalz)

in Methylenchlorid, 30 Das Testpapier reagiert mit urobilinogenhaltigem

Natriumlaurylsulfat in Chloroform-Methanol, Urin mit rotvioletter Farbe.

Dodecansulfonsäure (Natnumsalz) _ . .J₁-

in Chloroform-Methanol, Beispiel u

Dioctylnatriumsulfosuccinat in Methylenchlorid. Filterpapier (Schleicher und Schüll 23 SL) wird

35 mit einer wäßrigen Lösung getränkt, die außer 5 g Kaliumhydrogensulfat 0,5 g 5-Chlor-2,4-dimethoxy-

Beispiel 8 benzoldiazoniumfluoborat auf 100 ml enthält. So

hergestelltes Testpapier reagiert mit urobilinogen-

Filterpapier (Schleicher und Schüll 23 SL) wird haltigem Urin schön rotviolett.

mit einer Lösung folgender Zusammensetzung im- 40 Wird das Testpapier mit l%igen Lösungen der prägniert und bei 40⁰C getrocknet. folgenden Netzmittel nachimprägniert, so erhält man

noch kräftigere Rotviolett-Färbungen.

5-Amino-salicylsäure 0,2 g ^ . „ , ., _ ,.,

Metaphosphorsäure 15,0 g Dodecylbenzolsulfonsäure (Natnumsalz)

Natriumnitrit Οίε ^{in Metn}y^lencnlon">

Dodecylbenzolsulfosäure ' ** Natriumlaurylsulfat in Chloroform-Methanol,

(Natnumsalz) 0 4g Dodecansulfonsäure (Natriumsalz)

Methanol 5ml Jⁿ Chloroform-Methanol,

Wasser ad 100 ml Dioctylnatriumsulfosuccinat in Methylenchlorid.

Das Testpapier reagiert mit urobilinogenhaltigem

Urin mit ziegelroter Farbe. Filterpapier (Schleicher und SchüD 23 SL) wird

mit einer Lösung folgender Zusammensetzung im-Beispiel 9 prägniert und bei 40⁰C getrocknet:

, _n , ,.,. ... _ττ. ., . „„ , S-Amino-S-sulfo-salicylsäure

5,0 ml urobüinogenhaltiger Unn wird mit 2,OmI MetaDhosDhorsäure isni

einer Lösung von 2 ·/, 2,4-Dimethoxybenzoldiazo- NaSEmnTtri? 0 1 f

niumfiuoborat in 2 n-Saksäure versetzt Nach 2 Mi- Dodecylbenzolsülfosäure ^§

nuten wird mit 5,0 ml Chloroform versetzt und kräftig f Natriumsalz) O d

durchgeschüttelt Danach wird ein Teil der Chloro- 6o x>fltiinnni c' ¥

fonn-Phase in eine Küvette überführt und die Ex- wlTjr L inn 1

tinktion bei 495 mn gemessen. Durch Vergleich mit wasser, aa j.ou ml

der Extinktion eines Standards läßt sich der genaue Das Testpapier reagiert mit urobüinogenhaltigem

Urobilinogen-Gehalt des Urins ermitteln. Urin mit ziegelroter Farbe.

3105

Claims

1 2 8. Mittel gemäß Anspruch 6, dadurch gekenn- Patentansprüche: zeichnet, daß es als Diazoniumsalz 4-Methoxy-ben- zoldiazoniumsalz enthält

1. Verwendung von stabilen Benzoldiazonium- 9. Mittel gemäß Anspruch 6, dadurch gekennsalzen, deren gegebenenfalls mehrfach substitu- 5 zeichnet, daß die Diazoniumsalze auf einem saugierter "Phenylrest in ortho- oder para-Stellung fähigen Träger imprägniert sind.

mindestens eine mehratomige Elektronendonatorgruppe mit wenigstens einem mesomeriefähigen

Elektronenpaar enthält, wobei die Summe der

Hammettschen Sigmawerte aller Substituenten den io
Wert +0,4 nicht überschreiten darf, als Indikatorsubstanzen für den Nachweis von Urobilinogen,
gegebenenfalls zusammen mit Bilirubin. Die vorliegende Erfindung betrifft Indikatorsub-

2. Verwendung von Verbindungen der allge- stanzen zum Nachweis von Urobilinogen in Körpermeinen Formel I 15 flüssigkeiten, vorzugsweise in Urin.

Es ist bekannt, daß man Urobilinogen-Körper

R R₁ (Bilane), Indol, Sulfonamide, Porphobilinogen, Harn-

\ / indikan und 5-Hydroxy-indolessigsäure mit einer

R ' ^ jq N X - (T) Lösung von p-Dimethylamino-benzaldehyd in SaIz-

² ₌₌₌.-^/ ao säure nachweisen kann. Dieser Nachweis ist in der

Literatur als Ehrlichs Reaktion bekannt; er hat ins-

*■« besondere in der medizinischen Diagnostik als Nach

weis von »vermehrten Urobilinogenen« im Urin er-

in welcher X~ ein stabilisierendes Anion und R₁ hebliche Bedeutung gewonnen. Obwohl die Probe und R₂ mehratomige Elektronendonatorgruppen 25 nicht sehr spezifisch ist, gilt sie als Standard-Methode mit mindestens einem mesomeriefähigen Elektro- für die Diagnose von Leber- und Gallenerkrankungen, nenpaar, wobei einer der Reste R₁ und R₂ auch Da Testpapiere in der klinisch-chemischen Dia-

Wasserstoff, Halogen oder eine niedere Alkyl- gnostik immer mehr an Bedeutung gewinnen, sind gruppe sein kann, darstellen, und die Reste R₃ inzwischen auch Testpapiere zum Nachweis von und R₄ Wasserstoff oder eine die Diazokupplung 30 Urobilinogen auf der Basis der Ehrlichschen Reaktion mit Urobilinogen sterisch nicht hindernde Gruppe entwickelt worden. Diesen Testpapieren haften zwei darstellen, wobei die Summe der Hammettschen wesentliche Mängel an:

Sigmawerte aller Substituenten R₁, R₂, R₃ und R₄ _λ _Die Farbreaktion entwickelt sich so langsam, +0,4 nicht überschreiten darf, als Indikatorsub- _{daß man vor der Ablesung} mindestens 1 Minute

stanzen fur den Nachweis von Urobilinogen, ge- 35 warten muß
gebenenfalls zusammen mit Bilirubin. _ ' , . „ ,. _T,

3. Verwendung von Verbindungen der allge- ^Z ^Die .J^estP^aP^ieI? ,^bef ^tz,fⁿ naturgemäß die Unmeinen Formel I gemäß Anspruch 1, in welchen spezifitat der Ehrlichschen Probe so daß falsch R₁ eine Hydroxy-, Alkylmercapto- oder niedere P^0SItIve Ergebnisse nicht ausgeschlossen werden Alkoxj'gruppe und R₂ eine Hydroxy-, Alkoxy-, 40 können.

Phenoxy-, Alkylmercapto-, Phenylmercapto-, Phe- Es gibt zwar schon seit langer Zeit Hinweise, daß

nyl-alkyl-amino-, gegebenenfalls substituierte Phe- Urobilinogen mit diazotierter Sulfanilsäure zu einem

nylamino oder Acylaminogruppe, wobei einer der gelben Farbstoff kuppelt. Diese Reaktion wurde 1884

Reste R₁ und R₂ auch Wasserstoff, Halogen oder von Ehrlich entdeckt und als sogenannte »gelbe Di-

eine Methylgruppe sein kann, und R₃ und R₄ 45 azoreaktion« beschrieben. Die Reaktion wurde zwar in

Wasserstoff, ein Halogenatom, eine Hydroxy-, der Folgezeit noch mehrere Male untersucht, jedoch

Alkoxy-, Phenoxy-, Alkylmercapto-, Phenylmer- konnte bis heute nicht sichergestellt werden, ob es

capto-, Phenyl-alkylamino-, tregebenenfalls sub- sich zweifelsfrei um eine Diazokupplung mit Urobili-

stituierte Phenylamino-, Acylamino-, Alkyl- und nogen handelt oder ob etwa auch andere Stoffe für

Carboxylgruppe und X^- ein Halogenid oder das 50 die Bildung des gelben Farbstoffes verantwortlich

Anion einer Sauerstoffsäure oder einer durch sind (vgl. T. K. W ith, Biologie der Gallenfarbstoffe,

Halogenwasserstoff koordinativ gesättigten Lewis- Georg Thieme-Verlag, Stuttgart, 1960, S. 32 und 211).

säure darstellt. Da es sich hier mehr um ein Kuriosum als um ein

4. Verwendung von Verbindungen gemäß An- brauchbares Mittel für die klinisch-chemische Diaspruch 3, in welcher X~ einen Chlorid-, Sulfat-, 55 gnostik handelt, ist die gelbe Diazoreaktion praktisch Tetrafiuoroborat-, Tetrachlorozinkat-, Hexachloro- bedeutungslos und wird in den einschlägigen Lehrantimonat-, Arylsulfonat- oder Carbonsäurerest büchern kaum erwähnt.

bedeutet. Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß

5. Reagenz zum Nachweis von Urobilinogen, stabile Benzoldiazoniumsalze, deren gegebenenfalls gegebenenfalls zusammen mit Bilirubin, gekenn- 60 mehrfach substituierter Phenylrest in ortho- oder parazeichnet durch einen Gehalt an mindestens einem Stellung mindestens eine mehratomige Elektronen-Diazoniumsalz gemäß Anspruch 1 und einer festen donatorgruppe mit wenigstens einem mesomerieorganischen oder ^organischen Säure, fähigen Elektronenpaar enthält, wobei die Summe der

6. Mittel gemäß Anspruch 5, dadurch gekenn- Hammettschen Sigmawerte aller Substituenten den zeichnet, daß es als feste Säure Metaphosphoi - 65 Wert+0,4 nicht überschreiten darf, für den Nachweis säure enthält. von Urobilinogen hervorragend brauchbar sind.

7. Mittel gemäß Anspruch 6, dadurch gekenn- Demgemäß besteht die Erfindung in der Verwendung zeichnet, daß es zusätzlich ein Netzmittel enthält. der genannten Benzoldiazoniumsalze als Indikator-