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DE2130559A1 - Diagnostisches Mittel zum Nachweis von Urobilinogen-Koerpern - Google Patents

Diagnostisches Mittel zum Nachweis von Urobilinogen-Koerpern

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Publication number
DE2130559A1
DE2130559A1 DE19712130559 DE2130559A DE2130559A1 DE 2130559 A1 DE2130559 A1 DE 2130559A1 DE 19712130559 DE19712130559 DE 19712130559 DE 2130559 A DE2130559 A DE 2130559A DE 2130559 A1 DE2130559 A1 DE 2130559A1
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DE
Germany
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urobilinogen
acid
detection
group
hydrogen
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Application number
DE19712130559
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English (en)
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DE2130559B2 (de
DE2130559C3 (de
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Dieter Dr Rer Nat Berger
Hans-Georg Dr Rer Nat Rey
Peter Dr Rer Nat Rieckmann
Walter Dr Rer Nat Rittersdorf
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Roche Diagnostics GmbH
Original Assignee
Boehringer Mannheim GmbH
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Publication date
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Priority to GB2781372A priority patent/GB1343247A/en
Priority to ES403875A priority patent/ES403875A1/es
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Priority to SU1799317A priority patent/SU535914A3/ru
Priority to CA144,993A priority patent/CA959389A/en
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Priority to DK303372A priority patent/DK143147C/da
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    • G01N33/72—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood pigments, e.g. haemoglobin, bilirubin or other porphyrins; involving occult blood
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Description

BOEHRINGER MANNHEIM GMBH 1766
Diagnostisches Mittel zum Nachweis von Urobilinogen-Körpern,
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein verbessertes diagnostisches Mittel zum Nachweis von Urobilinogen-Körpern in Körperflüssigkeiten, vorzugsweise in Urin.
Es ist bekannt, daß man Urobilinogen"Körper (Bilane), Indol, Sulfonamide,'Porphobilinogen, Harnindikan und 5-Hydroxy-indolessigsäure mit einer Lösung von p-Diraethylamino-b.ensaldehyd in Salzsäure nachweisen kann. Dieser Nachweis ist in der Literatur als Ehrlich's Reaktion bekannt, er hat insbesondere in der medizinischen Diagnostik als. Nachweis von "vermehrten Urobilinogenen" im Urin erhebliche Bedeutung gewonnen. Obwohl die Probe nicht sehr spezifisch ist, gilt sie als Standard-Methode für die Diagnose von Leber- und Gallenerkrankungen.
Da Testpapiere in der klinisch-chemischen Diagnostik immer mehr an Bedeutung gewinnen, sind inzwischen auch Testpapiere zum Nachweis von Urobilinogen auf der Basis der Ehrlich1sehen Reaktion entwickelt worden. Diesen Testpapieren haften zwei wesentliche Mängel an:
1. Die Farbreaktion entwickelt sich so langsam, daß man vor der Ablesung mindestens eine Minute warten muß.
2. Die Testpapiere besitzen naturgemäß die Unspezifität der Ehrlich1sehen Probe, so daß falsch positive Ergebnisse nicht ausgeschlossen werden können.
Es gibt zwar schon seit langer Zeit Hinweise, daß Urobilinogen mit diazotierter Sulfanilsäure zu einem gelben Farbstoff kuppelt
2 0 9852/0488
original inspected
Diese Reaktion wurde 1884 von Ehrlich, entdeckt und als sogenannte "gelbe Diazoreaktion" beschrieben. Die Reaktion wurde zwar in der Folgezeit noch mehrere Male untersucht, jedoch konnte bis heute nicht sichergestellt werden, ob es sich zweifelsfrei um eine Diazokupplung mit Urobilinögen handelt, öder ob etwa auch andere Stoffe für die Bildung des gelben Farbstoffes verantwortlich sind (vgl. Biologie der Gallenfarbstoffe, -Georg Thieme-Verlag, Stuttgart 1960, S. 32 und S. 211). Da es sich hier mehr um ein Kuriosum, als um ein brauchbares Mittel für die klinisch-chemische Diagnostik handelt, ist die gelbe Diazoreaktion praktisch bedeutungslos und wird in den einschlägigen Lehrbüchern kaum erwähnt.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß stabile, gegebenenfalls mehrfach substituierte Benzoldiazoniumsalze, deren Phenylrest in ortho- oder parä-Steilung mindestens eine mehratomige Eiektronendonatorgruppe mit wenigstens einem mesomeriefähigen Elektronenpaar enthält, für den Nachweis von Urobilihogen hervorragend brauchbar sind/ wenn die Summe der Hammett'sehen Sigmawerte aller Substituenten den Wert +0,4 nicht überschreitet.
EIektronendonatorgruppen sind erfindungsgemäß Gruppen, die Sauerstoff, Schwefel oder Stickstoff in direkter Bindung mit dem Phenylrest enthalten. Sauerstoffhaltige Gruppen sind beispielsweise Hydroxy-, Alkoxy- oder Aryloxygruppen. Als schwefelhaltige ' Gruppen kommen an sich nur Alkylmercapto- oder Ary!mercaptogruppen infrage, da freie Mercaptogruppen wegen ihrer Oxydationsempfindlichkeit in der Regel nicht brauchbar sind. Als stickstoffhaltige Gruppen sind Acylamino-, Arylamine- oder Aryl-alky!aminogruppen brauchbar, während unsubstituierte Aminogruppen und * Alkylaminogruppen aufgrund ihrer Basizität unter den Bedingungen der Reaktion meist protoniert werden und dann kein mesomeriefähiges Elektronenpaar mehr besitzen. Bei der Auswahl der Substituenten muß ferner" darauf geachtet werden, daß diese nicht mit der Diazogruppe reagieren. Dies trifft insbesondere für o-Acylamino- und o-Arylaminogruppen zu.
209852/0488
Erfindungsgemäß besonders geeignet sind Benzoldiazoniumsalze der allgemeinen Formel I
R:
(D,
R4
in welcher X ein stabilisierendes Anion und R, und R„ mehratomige Elektronendonatorgruppen mit mindestens einem mesomeriefähigen Elektronenpaar, wobei einer der Reste R1 und R auch Wasserstoff, Halogen oder eine niedere Alkylgruppe sein kann!, darstellen, und die Reste R, und R* Wasserstoff oder eine die Diazokupplung mit Urobilinogen sterisch nicht hindernde Gruppe darstellen, wobei die Summe der Hammeit' sehen Sigmawerte aller Subs ti tuen ten R,, R2, R3 und R4 +0,4 nicht überschreiten darf,
,Die Verbindungen 1 sind insbesondere für die* Verwendung auf saugfähigen Trägern brauchbar.
Die erfindungsgemäßen Benzoldiazoniumsalze reagieren mit Urobilinogen nahezu momentan und ergeben sehr spezifische rote bis. blaue Farbstoffe, welche sich zum Nachweis auch sehr geringer Konzentrationen besonders gut eignen. Darüber hinaus besitzen die erfindun
gemäßen Verbindungen den großen Vorteil, daß die Farbreaktion von Harnstoff nicht gestört wird. Die bisher bekannten Testpapiere werden von dem im Harn anwesenden Harnstoff je nach Konzentration gelb gefärbt, was den Nachweis geringer Urobilinogen-Mengen erheblich erschweren kann. Darüber hinaxis wird die erfindungsgemäße Farbreaktion gerade durch die Substanzen, die häufig im Harn
2098b2/(U88-
vorkommen und die Ehrlich1sehe Probe bekannterweise am meisten stören, nicht beeinflußt.zu diesen Störsubstanzen gehören insbesondere die arömatischenAmine, welche als Arzneimittel (Sulfonamide, Sulfonylharnstoffe etc.) vielfach mit dem Urin ausgeschieden werden. Die Anwesenheit dieser aromatischen Amine im Harn führte bis: zu gelben bzw. orangen Farbreaktionen, welche die durch Urobilinogen hervorgerufene Färbung sowohl überdecken als auch vortäuschen! können
Für den Nachweis des zur Diagnostizierung von Leber- und Gallenerkrankungen ebenfalls wichtigen Bilirubins, werden zwar Diazoniumsalze (z.B. Diazosulfaniisäure, p-Nitrobenzql-diazoniumsalz oder 2,4-Dichlorbenzol-diazoniumsalz) bereits seit längerer Zeit verwendet Diese ergeben jedoch erwartungsgemäß mit Urobilinogen keine brauchbare Farbreaktion.
Im Gegensatz dazu erlauben es die erfindungsgemäßen Verbindungen, Urobilinogen neben Bilirubin spezifisch nachzuweisen. In einigen Fällen reagiert zwar auch Bilirubin mit den erfindungsgemäßen Verbindungen, jedoch erfolgt die Reaktion erst nachdem die Farbreaktion mit Urobilinogen schon weitgehend entwickelt ist und unterscheidet sich farblich so stark, daß es überraschend sogar möglich ist, beide Gallenfarbstoffe mit einem Reagenz nebeneinander zu bestimmen, und die Mengenverhältnisse anhand der entwickelten Mischfarbe abzuschätzen. So zeigt etwa eine Rotfärbung die Anwesenheit von Urobilinogen und eine später entwickelte Blaufärbung das Vorhandensein ,von Bilirubin an. Bei gleichzeitiger Anwesenheit beider Gallenfarbstoffe färbt sich derJEest streif en zunächst rot und später zunehmend violett. In Ausnahmefällen entwickeln sich die Farbreaktionen gleichzeitig, wodurcli das Testergebnis jedoch nicht "beeinflußt wird.
0 2/0488
Für den Fall, daß die Reaktion mit Bilirubin unterdrückt werden soll, kann man dies dadurch erreichen, daß man als Indikator ein Diäzoniumsalz relativ niedriger Elektrophilie verwendet und die Reaktion unter Zugabe kationischer Netzmittel ablaufen läßt.
Es ist auf diese Weise möglich, die Mittel zum Nachweis von Urobilinogen gegebenenfalls zusammen mit Bilirubin so zu modifizieren, daß sie dem angestrebten Zweck optimal gerecht werden.
Die Verbindungen der allgemeinen Formel I werden vorzugsweise zur Herstellung von Testpapieren verwendet. Die Substanzen werden zu diesem Zweck mit einer Säure und gewünschtenfalls mit Zusatzstoffen, wie z.B. Stabilisatoren und Netzmittel auf einen saugfähigen Träger gebracht. Außerdem sind die Verbindungen I zur Herstellung von Testfilmstreifen gemäß DOS 1.598.153 und zum Nachweis von Urobilinogen in Lösungen geeignet.
Zur Herstellung der bevorzugten Ausführungsform der neuen diagnostischen Mittel wird ein saugfähiger Träger, vorzugsweise j Filterpapier, mit einer Lösung getränkt, die 0", 05-5 g, vorzugsweise 0,1-1 g (pro 100 ml)eines Diazoniumsalzes der allgemeinen Formel I sowie 2-30 g, vorzugsweise 5-20 g einer festen anorganischen oder organischen Säure und gewünschtenfalls Netzmittel und/oder Stabilisatoren enthält.
Als Lösungsmittel für "die Imprägnierlösungen kommen vor allem Wasser und leichtflüchtige organische Lösungsmittel, die nicht mit Diazoniumsalzen oreagieren, infrage. Es sirid dies vor allem niedere Alkohole, Essigester und Acetonitril. ■ · "
Bei der Herstellung der Diazoniumsalzlösung kann man entweder so verfahren, daß man das fertige Diazoniumsalz der Lösung zuführt, oder indem man das Salz in der Lösung durch Diazotierung eines aromatischen Amins in bekannter Weise erzeugt.
209852/0488 • ./.■·■
Bevorzugt und erfindungsgemäß besonders brauchbar sind diejenigen Verbindungen der allgemeinen Formel.If in weichen R1 eine Hydroxy-, Alkylmercapto- oder niedere Alkoxygruppe und R5 eine Hydroxy-, Alkoxy-, Phenoxy-, Alkylmercapto—, Pheny!mercapto—, Phenylalkyl-aminet-, gegebenenfalls substituierte Phenylamino- oder Acylaminogruppe, wobei einer der Reste R und R_ auch. Wasserstoff, Halogen oder eine Methylgruppe sein--kann und R3 und R- Wasserstoff, 'eine Halogenatom, eine Hydroxy-, Alkoxy-/ Phenoxy-, Alkylmercapto-, Pheny !mercapto-, Phenyl-alkylamino-, gegebenenfalls' substituierte Phenylamino/ Acylamino-, Alkyl- und Carboxylgruppe und X^ ein Halogenid, oder das Anion einer Sauerstoffsäure oder einer dutch Halogenwasserstoff koordinativ gesättigten Lewissäure darstellt.
Aus Haltbärkeitsgründen werden normalerweise nur stabile Diazoniumsalze eingesetzt, d.h. Salze, die ein stabilisierendes Anion besitzen, dies sind insbesondere das Sulfat-, das Tetrafluoroborat-, das Tetrachlorozinkat-, das Hexachloroantimonation sowie Arylsulfonationen.
Als feste anorganische und organische Säur entkommen beispielsweise o-Phosphorsäure, Metaphosphorsäure, Sulfosalicylsäure, Oxalsäure, oder saure Salze, vie z.B. Kaliumbisulfat infrage, auch Addukte aus Lewissäuren und Lewisbasen sind brauchbar, wenn sie entsprechend sauer reagieren. Besonders bewährt hat sich die handelsübliche Metaphosphorsäure, die ca. 50-60 % ihres Natriumsalzes enthält, da diese erfahrungsgemäß besonders stabile Testpapiere liefert.
Metaphosphor säure und Oxalsäure haben außerdem den Vorteil, daß sie Testpapiere liefern, die mit Bilirubin nur sehr langsam reagieren. --,."",, 'v- ' '
I *
Die stabilisierenden Zusätze sind aus der Diazochemie bereits hinlänglich bekannt, solche Zusätze sind z.B. Natrxumfluoroborat, Natriumaryisulfonat, Magnesiumsulfat oder Natriummetaphosphat.
209852/0488
Die Verwendung von Netzmitteln ist nicht nur wegen'der erzielten besseren Benetzbarkeit angezeigt, sie entfalten auch noch zusätzliche spezifische Wirkungen.' So bewirken anionische Netzmittel, insbesondere Sulfate und Sulfonate eine Erhöhung der Empfindlichkeit und eine leicht bathochrome Farbverschiebung beim Nachweis von Urobilinogen. Als Beispiele für anionische Netzmittel seien Natriumlaurylsulfat und Natrium-p-dodecylbenzolsulfonat genannt.
In manchen Fällen ist es erwünscht, nur signifikant erhöhte ürobilinogen-Spiegel nachzuweisen. In diesen Fällen ist es möglich, die Empfindlichkeit und die Reaktionsgeschwindigkeit durch einen Zusatz kationischer Netzmittel, wie z.B. Laurylpyridiniumchlorid herabzusetzen.
Nicht-ionogene Netzmittel, wie z.B. Polyoxyäthylentriglycerid beeinflussen im allgemeinen hur die Benetzbarkeit der Testpapiere.
Die Netzmittel werden in Mengen von ca. O,1-3 g, vorzugsweise 0,3-1 g pro 100.ml Imprägnierlösung zugesetzt.
Die einzelnen Bestandteile der Rezepturen können auch nacheinander aufgebracht werden, wenn es die Löslichkeiten erfordern, oder wenn besondere Effekte erzielt werden sollen. So kann es z.B. c Stabilitätsgründen günstig sein, erst das Diazonium- ?ilz und den Stabilisator aufzugeben und dann erst mit Säure η ach zu impr ägn i er en.
Nach dem Imprägnieren der saugfähigen Träger werden diese bei möglichst niederen Temperaturen getrocknet, um die Diazoniumsalze •nicht zu schädigen. - -
209852/048.8
Vft&Mtt
Als saugfällige Träger kommen vor allem Filterpapiere infrage, aber auch Vliese und Filze aus säurebeständigen Kunststoffen, wie z.B. Polypropylen und Polyester können verwendet werden.
Die mit den Reagenzien, versehenen saugfälligen Träger werden vorzugsweise in kleine Vierecke geschnitten und an Kunststoff-Folien angesiegelt oder zwischen Kunststoff-Folien oder· Kunststoff-Folien und feinmaschigen Netzwerken eingesiegelt. Obwohl ■.Testpapiere eine bevorzugte Ausfuhrungsform der .vorliegenden Erfindung und die elegantesten diagnostischen'Mittel für Inhaltsstoffe von Körperflüssigkeiten darstellen, ist es natürlich auch möglich, die erfindungsgemäßen Diazoniumsalze zum Urobilinogen-Nachweis in flüssiger Phase zu verwenden. Tropft man die Diazoniumsalze in saurer Lösung zu Urobilinogen-haltigem Urin, so erhält man rote bis blaue Färbungen oder Fällungen, welche gegebenenfalls mittels organischer Lösungsmittel, wie' z.B. Chloroform extrahiert werden, könne'n.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Nachweis von Urobilinogen in Körperflüssigkeiten taucht man die neuen diagnostischen Mitteln in. die zu untersuchende Lösung ein und liest den Farbumschlag nach kurzer Zeit ab.
Die erfindungsgemäß verwendeten Diazoniumsalze bzw. die entsprechenden Amine sind allgemein bekannt.
Zum quantitativen Nachweis von Urobilinogen im Urin mittels photometrysehen Methoden haben sich als Nachweisreagenzien 4-Methoxy-benzol-diazoniumsalze, sowie 2,4-Dimethoxy-benzo1-diazoniumsalze besonders bewährt.
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Die Hammett1 sehen Sigma-Werte sind bekanntlich Maßzahlen für den elektronenanziehenden oder elektronenliefernden Effekt von Substituenten (im ersteren Fall ergeben sich positive, im letzteren negative Sigma-Werte). Die Sigma-Werte sind additiv, wobei das Vorzeichen der Summe angibt, ob - verglichen mit dem Substituenten Wasserstoff - der elektronenanziehende oder der elektronenliefernde Effekt überwiegt. Der erfinxiungsgemäße Grenzwert von +0,4 besagt also, daß die Wirkung der elektronenliefernden Sub-, stituenten durch elektronenanziehende Sübstitüenten nur bis zum Sigma-Wert von +0,4 gemindert werden darf. Es kann beispielsweise ein Benzoldiazoniumsalz mit einer Hydroxylgruppe in Parastellung (Sigmawert = -0,37) noch einen oder mehrere elektronenanziehende Gruppen mit einem Gesamt-Sigmawert bis zu +0,83 besitzen, während ein solches Diazoniumsalz, das mit einer o-Methoxy- oder p-Acetaminogruppe substituiert ist (Sigmawert in beiden Fällen +0), elektronenanzxehende Gruppen nur noch bis zu einem Gesamt-Sigmawert von +0,4 enthalten darf.
Obvohl HammetJbr Berechnungen heute routinemäßig durchgeführt-werden und ein wertvolles Mittel für theoretische Aussagen in der Chemie der Aromaten darstellen, ist es nicht statthaft, diese als allgemeingültige Absolutwerte zu betrachten. Vielmehr handelt es sich um Näherungswerte, die mit gewissen Unsicherheiten der empirischen Ermittlung behaftet sind. Diese Unsicherheiten spielen jedoch nur in seltenen Grenzfällen eine Rolle, die die technische Lehre der vorliegenden Erfindung in keiner Weise beeinträchtigen.
In den folgenden Beispielen sind das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäßen diagnostischen Mittel näher erläutert.
209852/0488
Beispiell
Filterpapier [Schleicher und Schüll 23 SL] wird mit einer Lösung von folgender Zusammensetzung imprägniert und bei 40 C getrocknet,
4-Methoxybenzoldiazoniumf luoborat - 0,3 g
Metaphosphorsäure ΙΟ, Ο g
Dodecylbenzolsulfonsäure (Natriumsalz) 0,4 g
Methanol . 5,0 ml
Wasser ad 100 ml
Das Testpapier gibt bei Eintauchen im Urin nach ca. 5—10 Sekunden die folgenden Farbreaktionen:
Urobilinogenfreier Urin: keine Farbänderung ' Urin mit normalem Urobilinogengehalts rosa Urin mit erhöhtem Urobilinogengehalt: karminrot.
Ähnliche Farbreaktionen geben Testpapiere, die 0,3 g der folgenden Diazoniumsalze enthalten:
2-Methoxybenzoldiazoniumfluoborat 2-Hy dr oxybenzoldiazoniumsulfat 4-Hydroxybenzoldiazoniumsulfat 2,4-Dihydroxybenzoldiazoniumf luoborat.
Beispiel 2
Filterpapier [Schleicher und Schüll 23 SL] wird mit einer Lösung folgender Zusammensetzung imprägniert und bei 4O c getrocknet,
4-Methoxybenzoldiazoniumfluoborat 0,3 g Oxalsäure 10,0 g
Methanol ad 100 ml
20986^/0488
2 1 3 O 5-L 9
Einzelne Streifen des so erhaltenen Testpapiers (a) werden mit Lösungen von je 0,4 g Polyoxyäthylentrxglycerid (b), Dodecylbenzolsulfonsäure (Natriumsalz) (c) bzw.Laurylpyridiniumchlorid (d) in 100 ml Methylenchlorid nachimprägniert und im warmen Luftstrom getrocknet. Die Testpapiere geben mit urobilinogenhaltigen Urinen nach ca. 5-10 Sekunden die folgenden Reaktionen:
Testpapi&r Reaktionsfarbe · Urin mit mg% Urobilinogeri
0,5 1,0 2,0
a Ziegelrot +
c Karminrot ++
d Ziegelrot
(+ = schwach. ++ = mäßigt +++ = stärkt ++++ = sehr stark,"
Beispiel
Filterpapier [Schleicher und Schüll] wird mit einer Lösung folgender Zusammensetzung imprägniert und bei 40 C getrocknet.
4-Äthoxyanilin 0,25 g
Isoamylnitrit 1,0 ml
Oxalsäure 10,0 g
Dodecylbenzolsulfonsäure (Natriumsalz) 0,4 g
Methanol ad 100 ml
Das Testpapier reagiert mit urobilinogerihaltigem Urin karminrot. Mit ähnlichen, z.T. etwas mehr violetten Farbtönen reagieren Testpapiere, bei denen das 4-Äthoxy-anilin durch gleiche Mengen 2-Äthoxy-, 4-Butoxy-, 4-Phenoxy-, 4-Methoxy-2-methyl-, 2-Methoxy-5-methyl-, 2-Methylmercapto-, 4-Methylmercapto- oder 4-Chlor-2-methoxy-5-methyl anilin ersetzt ist.
2 0 9 8 5 2/0488
Beispiel 4
Filterpapier [Schleicher und Schüll .2.3 SL] wird mit folgenden Lösungen nacheinander imprägniert und getrocknet.
I. 4-Acetamidobenzoldiazoniumfluoborat O,3 g Natriummetaphosphat 5,0 g Wasser ad 100 ml
II. Oxalsäure 15,0 g Natriumlaurylsulfat 0,5 g Methanol ad lOO ml
Das Testpapier reagiert mit urobilinogenhaltigem Urin mit karminroter Farbe.
Beisp.iel 5
Filterpapier [Schleicher und Schüll 23 SL] wird mit einer Lösung folgender Zusammensetzung imprägniert und bei.40°c getrocknet.
3-Chlor-4-methoxybenzoldiazoniumtoluolsulfonat 0,5 g
Sulfosalbylsäure ■ 5,0 g
Dodecylbenzolsulfonsäure (Natriumsalz) 0,8 g
Methanol . ad 100 ml
Das Testpapier gibt beim Eintauchen in urobilinogenhaltigen Urin sofort eine Karminrotfärbung. Beim Eintauchen in bilirubinhaltigen Urin erhält man nach 10-20 Sekunden eine blaugrüne. Färbung. Urine, die Urobilinogen und Bilirubin enthalten, liefern je nach deren Verhältnis Zwischentöne zwischen diesen Färbungen.
209852/0488
Beispiel
Polyestervlies wird mit Lösungen folgender Zusammensetzung imprägniert und bei 40 C getrocknet.
Benzoldiazoniumsalz (a-f) 0/1 g
Sulfosalicylsäure 10,0 g
Dodecylbenzolsulfonsaure (Natriumsalz) 0,4 g
Methanol/Wasser 1:1 ad 1OO ml
Folgende Diazoniumsalze wurden verwendet:
2-Methoxy-5-chlor-benzol-diazoniumtetrachlorozinkat.
4-Benzamido-2~methy1-5-methoxy-benzoldiazonium-tetrachlorozinkat
4-Benzamido-2,5-dimethoxy-benzo1-diazonium-tetrachlorozinkat
4-Benzamido-2,5-diäthoxy-benzoldiazonium-tetrachlorozinkat
4-Methoxyphenylamino-benzol-diazoniumchlorid
Phenylamino-benzol-diazonium-hydrogensulfat
(Echtrotsalz RC) (Echtviolettsalz B) (Echtblausalz RR) (Echtblausalz BB) (Variaminblausalz B)
Mit urobilinogenhaltigem Urin wurden folgende Färbungen erhalten:
a rot ■> blau
b rotviolett
C blauviolett
d blauviolett
e blaugrün
f blaugrün.
2098S2/0488
Beispiel
Filterpapier [Schleicher und Schüll 23 SL] wird mit wässrigen Lösungen getränkt, die außer 5 g Kaliumhydrogensulfat noch je O,5 g der folgenden Diazoniumsalze auf 100 ml enthalten.
2,4-Dimethoxybenzoldiazoniumf luoborat 3,4-Dimethoxybenzoldiazoniumfluoborat 2,5-Dimethoxybenzoldiazoniumfluoborat 3,4,5-Trimethoxybenzoldiazoniumfluoborat 4-Hydroxy-3, 5-dichlorbenzoldiazoniumfluoborat
Alle diese Testpapiere reagieren mit urobilinogenhaltigern Urin mit roten bis lilaroten Farbtönen.
Werden diese Testpapiere mit 1 %igen Lösungen der folgenden Netzmittel nachimprägniert, so erhält man kräftigere Rotviolettbis Blauviolett-Färbungen.
Dodecylbenzolsulfonsäure (Natriumsalz) in Methylenchlorid. Natriumlaurylsulfat in Chloroform-Methanol Dodecansulfonsäure (Natriumsalz) in Chloroform-Methanol. Dioctylnatriumsulfosuccinat in Methylenchlorid.
Beispiel 8
Filterpapier [Schleicher und Schüll 23 SL] wird mit einer Lösung folgender Zusammensetzung imprägniert und bei 40°C getrocknet.
5-Amino-salizylsäure 0,2 g
Metaphosphorsäure 15,0 g
209852/04 8 8
Natriumnitrit O,1 g
DodecyIbenzolsulfosäure {Natriumsalz) 0,4 g
Methanol · . 5 ml
Wasser ad_ 100 ml
Das Testpapier reagiert mit urobilinogenhaltigem Urin mit ziegelroter Farbe.
Beispiel
5,0 ml urobilinogenhaltiger Urin wird mit 2,0 ml einer Lösung von 2 % 2,4-Dimethoxybenzoldiazoniumfluoborat in 2n-Salzsäure versetzt. Nach 2 Minuten wird mit 5,0 ml Chloroform versetzt und kräftig durchgeschüttelt. Danach wird ein Teil der Chloroform-Phase in eine Küvette überführt und die Extinktion bei 495 nm gemessen. Durch Vergleich mit der Extinktion eines Standards läßt sich der genaue Urobilinogen-Gehalt des Urins ermitteln.
2098b2/(U88

Claims (10)

  1. Paten tan s prüch e
    Verwendung von stabilen Benzoldiazoniurasalzen, deren gegebenenfalls mehrfach substituierter Phenylrest in ortho- oder paraStellung mindestens eine mehratomige Elektronendonatorgruppe mit wenigstens einem mesomeriefähigen Elektronenpaar enthält, wobei die Summe der Hammett1sehen Sigmawerte aller Substituenten den Wert +0,4 nicht überschreiten darf, als Indikatorsubstanzen für den ,Nachweis von Urobilinogen, gegebenenfalls zusammen.mit Bilirubin.
  2. 2. Verwendung von Verbindungen der allgemeinen Formel I,
    (D/
    in welcher X ein stabilisierendes Anion und R1 und R„
    "'·■ mehratomige E lek tr pnendona tor gruppen mit mindestens einem mesomeriefähigen Elektronenpaar, wobei einer der Reste R1 und R9 auch Wasserstoff, Halogen oder eine niedere Alkylgruppe sein kann, darstellen, und die Reste R^ und R4 Wasserstoff oder eine die Diazokupplung mit Urobilinogen sterisch nicht hindernde Gruppe darstellen, wobei die Summe der Hammet·' sehen Sigmawerte aller Substituenten R1, R2, R3 und R4 +0,4 nicht überschreiten darf,
    als Indikatorsubstanzen für den Nachweis von Urobilinogen gegebenenfalls zusammen mit Bilirubin.
    209852/0488
  3. 3. Verwendung von Verbindungen der allgemeinen Formel I gemäß Anspruch 1/ in welchen R, eine Hydroxy-, Alkylmercapto- oder niedere Alkoxygruppe und R0 eine Hydroxy-, Alkoxy-, Phenoxy-/ Alkylmercapto-, Phenylmercapto-, Phenyl-alkyl-amino-, ge.~ gebenenfalls substituierte Phenylamino oder Acylaminogruppe, wobei einer der Reste R, und R2 auch Wasserstoff, Halogen oder eine Methylgruppe sein kann und R3 und R4 Wasserstoff, ein Halogenatom, eine Hydroxy-, Alkoxy-, Phenoxy-, Alkylmercapto-, Phenylmercapto-, Phenyl-alkylamino-, gegebenenfalls substituierte Phenylamino-, Acylamino-, Alkyl- und Carboxylgruppe und X ein Halogenid oder das Anion*einer Sauerstoffsäure oder einer durch Halogenwasserstoff kbordinativ gesättigten Lewissäure darstellt,
  4. 4. Verwendung von Verbindungen gemäß Anspruch 3, in welcher X^ einen Chlorid-, Sulfat-, Tetrafluoroborat-, Tetrachlorozinkat-, Hexachloroantimonat-, Arylsulfonat- oder Carbonsäurerest bedeutet.
  5. 5. Verwendung von Diazoniumsalzen gemäß Anspruch 1 zur Herstellung von Reagenzien zum Nachweis von Urobilinogen, gegebenenfalls zusammen mit Bilirubin.
  6. 6. Mittel zum Nachweis von Urobilinogen, gegebenenfalls zusammen mit Bilirubin, gekennzeichnet durch einen Gehalt an mindestens einem· Diazoniumsalz gemäß Anspruch 1 und einer festen organischen oder anorganischen Säure.
  7. 7. Mittel gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es als feste Säure Metaphosphorsäure enthält.
  8. 8. Mittel gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich ein Netzmittel enthält.
  9. 9. Mittel gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es ein 4-Methoxy-benzoldiazoniumsalz enthält.
    209852/0488
    yf«
  10. 10. Mittel gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Diazoniumsalze auf einem saugfähigen Träger imprägniert sind.
    209852/0488
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