DE1648817C3 - Verfahren und diagnostische Mittel zur Bestimmung von Hydroperoxiden bzw. peroxidatisch wirksamen Substanzen - Google Patents

Description

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Chromogen Substanzen der allgemeinen Forin welcher bedeutet R₁ eine Hydroxy- oder Aminogruppe, welche gegebenenfalls einen ein- oder mehrfach durch Hydroxy-, Amino- und Alkoxygruppen substituierten aliphatischen, araliphatischen, cycloaliphatischen, heterocyclischen oder aromatischen Rest tragen, R₂, R₃ und R₅ Wasserstoff oder eine Amino-, Hydroxy- oder Alkoxygruppe und R₄ Wasserstoff oder den Rest R₁. oder Gemische solcher Substanzen verwendet.

2. Diagnostisches Mittel zur Bestimmung von Hydroperoxiden bzw. Substanzen, die unter Freisetzung von Hydroperoxid reagieren, bestehend aus Peroxidase oder einer peroxidatisch wirksamen Substanz und einem Chromogen. dadurch gekennzeichnet, daß als Chromogen Substanzen der allgemeinen Formel 1 gemäß Anspruch 1 enthalten sind.

3. Diagnostisches Mittel zur Bestimmung von Hämoglobin oder anderen peroxidatisch wirksamen Substanzen, bestehend aus Hydroperoxid oder Hydroperoxid bildenden Substanzen und einem Chromogen. dadurch gekennzeichnet, daß als Chromogen Substanzen der allgemeinen Formel 1 gemäß Anspruch 1 enthalten sind.

Es sind eine Reihe von Verbindungen bekannt, die von Wasserstoffperoxid und Peroxidase als Katalysator zu einem Farbstoff oxidiert werden. Substanzen, die bevorzugt verwendet werden sind z. B. Benzidin, o-Dianisidin, o-Tolidin, Guajakol usw. Diese Verbindungen sind aber teilweise nicht sehr stabil und können nach den neuesten Erkenntnissen gesundheitsschädlich sein, so daß ihre Handhabung nicht ungefährlich erscheint.

Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, Substanzen zu finden, die als Chromogene für ein Verfahren der obengenannten Art geeignet und zugleich stabil und unschädlich sind.

Es wurde nun überraschenderweise eine Substanzgruppe gefunden, die zum Teil bessere Indikator-Eigenschaften als die bisher verwendeten Benzidinkörper zeigt. Die Substanzklasse ist geeignet, Wasserstoffperoxid und andere Hydroperoxide sowohl in optischen Tests, als auch mit Hilfe von Reagenzpapieren und Reagenzfilmen zu bestimmen.

Die Substanzen sind physiologisch sehr gut verträglich und besitzen die folgende allgemeine Formel I

R₄.

R₅

R.,

R₁

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Bestimmung von Hydroperoxiden bzw. von Substanzen, die unter Freisetzung von Hydroperoxid reagieren, sowie von Peroxidase bzw. peroxidatisch wirkenden Substanzen mit Hilfe eines Chromogens unter Verwendung der Reaktion der Hydroperoxide mit Peroxidase bzw. den peroxidatisch wirksamen Substanzen durch Auswertung der Verfärbung. Die Erfindung bezieht sich ferner auf ein diagnostisches Mittel zur Durchführung eines derartigen Verfahrens.

Von besonderem diagnostischem Interesse ist der Nachweis von Glucose im Harn, Blut und Serum bei Diabetes sowie der Nachweis peroxidatisch wirkender Substanzen, wie Hämoglobin im Harn und Blut und der Nachweis von Hydroperoxiden z. B. in der Milchwirtschaft, Kosmetik und Polymerchemie.

in welcher bedeutet R₁ eine Hydroxy- oder Aminogruppe. welche gegebenenfalls einen ein- oder mehrfach durch Hydroxy-, Amino- und Alkoxygruppen substituierten aliphatischen, araliphatischen, cycloaliphatischen, heterocyclischen oder aromatischen Rest tragen, R₂, R₃ und R₅ Wasserstoff oder eine Amino-, Hydroxy- oder Alkoxygruppe und R₄ Wasserstoff, oder den Rest R₁.

ELs ist bekannt, daß Substanzen gemäß 1 im alkalischen vorzugsweise im ammoniak-alkalischen Medium Haare farben können, wenn größere Mengen Wasserstoffperoxid (3 bis 10%) anwesend sind; vgl. DT-AS 1141 748, DT-AS 11 42 045, DT-AS 11 49 496, Fette-Seifen-Anstrichmittel 67, (1965), S. 222 bis 227. Es war jedoch nicht vorherzusehen, daß diese Verbindungsklasse im neutralen bis schwach sauren pH-Bereich sehr geringe Mengen Wasserstoffperoxid (bis etwa 0,0005% I und peroxidatisch wirkende Substanzen durch starke Farbreaktionen, welche je nach Anwendungsart außerdem noch verschieden nuanciert sind, anzeigen würde. Die Empfindlichkeit der Substanzen 1 gegenüber Wasserstoffperoxid bzw. Systemen, die Wasserstoffperoxid freisetzen, steigt jedenfalls um mehr als 3 Zehnerpotenzen, wenn Peroxidase anwesend ist. Gleichzeitig verkürzt sich die beim Haarfärben übliche Reaktionszeit von etwa 10 bis 30 Minuten (zum Teil auch bei erhöhter Temperatur bis 60' C) bei der erfindungsgemäßen Verwendung auf I Minute und weniger (jeweils bei Zimmertemperatur).

Die Aufgabe der Erfindung wird somit dadurch gelöst, daß man in einem Verfahren der eingangs genannten Art als Chromogene Substanzen der obenangegcbcncn, allgemeinen Formel 1 oder Gemische solcher Substanzen verwendet.

Die Bestimmung von Hydroperoxiden nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ist vorzugsweise für gekoppelte und ungekoppelte Enzymreaktionen ge-

eignet, beispielsweise für die Bestimmung von Glucose, Galactose, Aminosäuren, Harnsäure, Peroxiden, Hämoglobin, Peroxidase oder anderen peroxidatisch wirksamen Substanzen sowie von Enzymaktivitäten. Bei der Bestimmung von Glucose beispielsweise wird diese von Glucoseoxidase zu Gluconsäure oxidiert, wobei der Luftsauerstoff zu Wasserstoffperoxid reduziert wird. Das Wasserstoffperoxid oxidiert dann mittels Peroxidase oder einer peroxidatisch wirksamen Substanz den erfindungsgemäß verwendeten Indikator zum entsprechenden Farbstoff.

Weitere Beispiele für analytisch brauchbare Enzymsysteme, die unter Freisetzung von Wasserstoffperoxid reagieren, sind L-Aminosäureoxidase + L-Aminosäuie, Uricase + Harnsäure, Xanthinoxidasc + Hypoxanthin bzw. Xanthin, Glycinoxidase + Glycin, Monoaminooxidase + Monoamin (wie Adrenalin, Mescalin usw.), Diamin-oxidase + Diamine (wie Histamin), Luciferase + Luciferin, D-Asparaginsäureoxidase + D-Asparaginsäure, Leber-Aldehydoxidase + Aldehyd, Galactoseoxidase + Galactose, Edsons Flavinenzym + Milchsäure.

Die Auswertung der Verfärbung erfolgt in bekannter Weise, z. B. durch optische Ausmessung im Spektrophotometer oder bei Verwendung von Testpapierstreifen und Testfilmen durch Vergleich der Farbstärke mit Blindproben bekannter Zusammensetzung bzw. Farbtafeln.

Das erfindungsgemäße Verfahren und die diagnostischen Mittel werden an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1
Nachweis von Hydroperoxiden in Flüssigkeiten

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50 mg Peroxidase werden in 100 ml eines 0,1m Citrat- oder Phosphatpuffers von pH 5,6 gelöst und damit ein Filterpapier (2316 der Firma Schleicher & Schüll) imprägniert. Danach werden 300 mg 2-Phenylamino-5-amino-pyridin-hydrochlorid in 100 ml Methanol gelöst und das Filterpapier nochmals imprägniert. Beim Eintauchen in Lösungen von Wasserstoffperoxid verschiedener Konzentrationen werden die Papiere entsprechend der Konzentration verschieden stark weinrot bis dunkel-blaurot gefärbt. Mit Wasserstoffperoxidlösungen von 5 -/'ml erhält man noch eine deutliche Farbreaktion.

Beispiel 2
Nachweis von Glucose im Harn

100 mg Glucoseoxidase und 50 mg Peroxidase und 300 mg 2-Dimethylamino-5-amino-pyridin-dihydrochlorid werden in 100 ml eines 0,1-m Citrat- oder Phosphatpuffers von pH 5,6 gelöst. Mit dieser Lösung imprägniert man ein Filterpapier (2316 der Firma Schleicher & Schüll). Beim Eintauchen in glucosehaltigem Harn zeigt das Papier je nach Glucosekonzentration verschieden starke blauviolette Töne. Schon bei 50 oig % Glucose ist eine deutliche Farbreaktion zu sehen.

Beispiel 3

Nachweis von Glucose im Blut

90 g wäßrige Polyvinylpropionat-Dispersion, 1,30 g Natriumsalz einer Polymannuronsäure, 70 ml eines 0,5-m Citrat- oder Phosphatpuffers, 2 g organisches Natriumsulfonat, 32Ü mg Glucoseoxidase, 300 mg Peroxidase und 600 mg 2-Cyclohexylamino-5-amino-pyridin in 20 ml Methanol, werden zu einer homogenen Mischung verrührt, in einer Schichtdicke von 300 μ auf eine Folie aufgetragen und getrocknet. Bringt man auf den so hergestellten Film einen Tropfen Blut und entfernt diesen wieder nach etwa einer Minute, so färbt sich der Film je nach Glucosekonzentration rötlich bis braunrötlich.

Beispiel 4

Nachweis von Glucose in Serum mit einem
Indikatorgemisch

90 g Polyvinylpropionat-Dispersion, 1,30 g Natriumsalz einer Polymannuronsäure, 70 ml eines 0,5-m Citrat- oder Phosphatpuffers, 2 g organische Natriumsulfonate, 320 mg Glucoseoxidase, 300 mg Peroxidase und Lösungen von 300 mg 2,3-Diamino-pyridin-hydrochlorid und 300 mg 2,6-Diamino-pyridin-hydrochlorid in jeweils 12 ml Wasser, werden zu einer homogenen Mischung verrührt, in einer Schichtdicke von 3(X) μ auf eine Folie aufgetragen und getrocknet. Bringt man auf einen so hergestellten Film einen Tropfe;i Serum und entfernt diesen wieder nach etwa einer Minute, so färbt sich der Film je nach Glucosekonzentration verschieden stark grün.

Beispiel 5
Nachweis von Glucose in Flüssigkeiten

In der folgenden Tabelle sind die Farbreaktionen und Farbnuancen zusammengestellt, die eine Reihe weiterer Substanzen 1 mit Glucose (50 mg % und mehr) liefert, wobei die Testpapiere gemäß Beispiel 2 und die Filme gemäß Beispiel 3 hergestellt werden. Für die Tüpfelreaktionen wurden Lösungen analog Beispiel 2 verwendet. Bei Substanzen, die nicht wasserlöslich sind, wurden Lösungen in entsprechenden Lösungsmitteln oder Suspensionen eingesetzt.

Substanz I

2,3-Diamino-pyridin
2,6-Diamino-pyridin

2,5-Diamino-pyridin-dihydrochlorid

2,6-Dihydroxy-pyridin-hydrochlorid
2-PhenyIamino-5-amino-pyridin-hydrochlorid

film	Papier	Tupfelplalte
grau-braun	rosa-braun	rotbraun
blau	blau-grau	blau
	blau
gelblich-	rotbraun	rotbraun
braun
rosa-blau	blau	grünlich
karminrot	weinrot-	dunkelrot
	dunkelblau

Fortsetzung

Substanz I

2-(/i-Hydroxyäthylamino)-5-amino-pyridin-dihydro-

chlorid

2-Bis-(/i-hydroxyäthylamino)-5-amino-pyridin-hydro-

chlorid

2-Cyclohexylamino-5-amino-pyridin

2-(y-Dimethylamino-propyl-amino)-5-amino-pyridin

^-Dimethylamino-S-amino-pyridin-dihydrochlorid

5,5'-Diamino-bis-pyridyl-2-amin

2-()'-Methoxypropylamino)-5-amino-pyridin

Rim	Papier	Tüpfelplnltc
braun	rotbraun	rotbraun
braun	rotbraun	rotbraun
hellbraun braun blauviolett rot rötlich	braunrot orange blau rot rotbraun	orange orange blaugrau rot rotbraun

Beispiel 6

Photometrischer Nachweis von Glucose

16 mg Glucoseoxidase, 9 mg Peroxidase werden in 10 ml Phosphatpuffer von pH 6,0 gelöst. Je 1 ml dieser Lösung, 1 ml einer 0,0005-m wäßrigen Lösung von 2,5-Diamino-pyridin-dihydrochlorid, 1 ml der zu untersuchenden Glucoselösung mit physiologisch interessierenden Glucosekonzentrationen werden zusammenpipettiert und mit Phosphatpuffer (pH 6,0) auf 10 ml aufgefüllt. Die Extinktion dieser LOsung im Vergleich zu einer Blindprobe wird bei 435 nm gemessen und der Glucosegehalt an Hand einer vorher aufgestellten Eichkurve errechnet.

Beispiel 7
Nachweis von Blut im Urin

20 Ein Filterpapier (2312 der Firma Schleicher & Schüll) wird mit einer 0,1-m wäßrigen Lösung eines Phosphatpuffers (pH 7,0) imprägniert und getrocknet. Danach wird das Papier mit einer 0,5%igen methanolischen Lösung von 2-Phenylamino-5-aminopyridinhydrochlorid imprägniert und getrocknet. Bringt man auf ein so hergestelltes Testpapier einen Tropfen eines bluthaltigen Harns und einen Tropfen 3%iger Wasserstoffperoxidlösung, so verfärbt sich das Testpapier noch bei einer Konzentration 1:100000 von Weiß nach Rotviolett.

Claims (1)

s Patentansprüche:

1. Verfahren zur Bestimmung von Hydroperoxiden bzw. von Substanzen, die unter Freisetzung von Hydroperoxid reagieren, sowie von Peroxidase bzw. peroxidatisch wirksamen Substanzen mit Hilfe eines Chromogens unter Verwendung der Reaktion der Hydroperoxide mit Peroxidase bzw. den peroxidatisch wirksamen Substanzen durch Auswertung der Verfärbung, dadurch gekennzeichnet, daß man als mell