DE2350169C3

DE2350169C3 - 19.10.72 Japan 103988-72 11.12.72 Japan 123482-72 23.01.73 Japan 9146-73 1-N- [(S)-2-Hydroxy-4-amino-butyryl] -neamin-Derivate, Verfahren zu ihrer Herstellung und solche Derivate enthaltende Arzneimittel

Info

Publication number: DE2350169C3
Application number: DE2350169A
Authority: DE
Inventors: Shunzo Tokio Fukatsu; Shinichi Kondo; Kenji Maeda; Osamu Tsuchiya; Hamao Umezawa; Sumio Umezawa; Kanagawa Yokohama
Original assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Current assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Priority date: 1972-10-06
Filing date: 1973-10-05
Publication date: 1980-08-21
Also published as: DE2350169B2; FR2201875A1; GB1426908A; DE2350169A1; US4001208A; FR2201875B1

Description

in der die Bedeutungen

R: Wasserstoff oder Methyl,

A: Wasserstoff oder 3-Amino-3-desoxy-<x-D-glucopyranosyl,

B: Wasserstoff oder ß-D-Ribofuranosyl, X: Wasserstoff oder Hydroxy,
Y: Wasserstoff oder Hydroxy,

folgenden Verbindungen zuzuordnen sind:

a) I -N-[(S)-2-Hydroxy-4-amino-butyryl]-3'-desoxyneamin,

b) 1 -N-[(S)-2-Hydroxy-4-amino-butyryl]-3',4'-didesoxyneamin,

c) 1 -N-[(S)-2-Hydroxy-4-amino-butyryl]-kanamycin B,

d) 1 -N-[(S)-2-Hydroxy-4-amino-butyryl]-3'-desoxykanamycin B,

e) 1 -N[(S)-2-Hydroxy-4-amino-butyryl]-3',4'-dideso::ykanamycin B,

f) 1 -N-[(S)-2-Hydroxy-4-amino-butyryl]-3'-desoxy-6'-N-methyl-kanamycin B,

g) 1 -N-[(S)-2-Hydroxy-4-amino-butyryl]-3'-desoxy-ribostamycin,

h) 1 -N-[(S)-2-Hydroxy-4-amino-butyry!]-3',4'-didesoxyribostamycin

und deren pharmakologisch verträgliche Säureadditionssalze.

2. Verfahren zur Herstellung der l-N-[(S)-2-Hydroxy-4-amino-butyryl]-neamin-Derivate gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichne'., daß man jeweils in an sich bekannter Weise

A) ein Neamin-Derivat der allgemeinen Formel

in der R, A, B, X und Y die in Anspruch 1 angegebenen und wie in Anspruch I zuzuordnenden Bedeutungen haben, in dem, die 1-Aminogruppe ausgenommen, eine oder mehrere Aminogruppen durch übliche Schutzgruppen geschützt sind, mit einer an der Aminogruppe eine übliche Schutzgruppe tragenden und an der Carboxylgruppe aktivierten (S)-2-Hydroxy-4-amino-buttersäure acyliert, B) die Schutzgruppen aus den N-acylierten Verbindungen abspaltet,

C) aie erhaltenen Stoffgemische durch chromatographische Verfahren auftrennt und

D) die Neamin-Derivate gemäß Anspruch 1 gewinnt und gegebenenfalls in ihre Säureadditionssalze überführt.

3. Arzneimittel, bestehend aus einer Verbindung gemäß Anspruch 1 und üblichen Trägerstoffen und/oder Verdünnungsmitteln und/oder Hilfsstoffen.

Die Erfindung betrifft 1-N[(S)-2-Hydroxy-4-aminobutyryl]-neamin-Derivate, ferner ein Verfahren zur Herstellung dieser Derivate der Aminoglykosid-Antibiotika und solche Derivate enthaltende Arzneimittel.

Kanamycin und Neamin sind bekannte Aminoglykosid-Antibiotika; Ribostamycin, ursprünglich als Vistamycin oder Antibiotikum SF-733 bezeichnet (The Journal of Antibiotics (1970) Band 23, No. 3, Seiten 155 bis 161 und No. 4, Seiten 173 bis 183), ist auch ein bekanntes Aminoglykosid-Antibiotikum. Dieses Ribostamycin wurde als 5-O-|9-D-Ribofuranosylneamin identifiziert. Diese Aminoglykosid-Antibiotika sind weit verbreitete wertvolle chemotherapeutische Wirkstoffe.

Aber arzneimittelresistente Stämme, die resistent sind gegen diese bekannten Aminoglykosid-Antibiotika, sind in den letzten Jahren aufgetreten. Demgemäß wurde der Mechanismus der Resistenz dieser arzneimittelresistenten Bakterien gegen die bekannten Aminoglykosid-Antihiotika untersucht.

Von H. Umezawa und anderen wurde gefunden, daß einige aus Patienten isolierte Stämme gramnegativer Bakterien, die den R-Faktor tragen, Staphylococcus aureus und Pseudomonas aeruginosa, gegen Kanamycin resistent sind, und daß aufgrund des Resistenzmechanismus dieser kanamycinresistenten Stämme ein Enzym produziert wird, das die 3'-HydroxyIgruppe des Kanamycins phosphoryliert und mit Hilfe der Phosphotransferase inaktiviert (Science, Band 157 (1967), Seite 1559).

Daher haben H. Umezawa et al. 3'-Desoxy kanamycin und 3',4'-Didesoxykanamycin B, worin die 3'-Hydroxylgruppe des Kanamycinmoleküls entfernt war, sowie das 3',4'-Didesoxyneamin und das 3',4'-Didesoxyribostamycin halbsynthetisch hergestellt (Journal of Antibiotics, Serie A (1971), Band 21, Seiten 274 bis 275; Band 24 (1971), Seiten 485 bis 487; Band 24, Seiten 711 bis 712 und Band 25 (197?), Seiten 613 bis 617). Auch 3'-Desoxyneamin wurde hergestellt (Chjmical Abstracts, Bd. 81 (1974) 105909d. 3'-Desoxykanamyein, 3',4'-Didesoxykanamycin B, 3'-Dcsoxyncamin und 3',4'-Didesoxyneainin sind gegen die oben erwähnten kanamycinresistenten Stämme wirksam, aber 3',4'-Didesoxyribostamycin wurde durch die Phosphorylierung der 5'-Hydroxylgruppe dieses Antibiotikums du'rh die Phosphotransferase inaktiven. Weiterhin wurde gefunden, daß diese IX'soxyderivale des Kanamycins gegen eine andere Λπ von kanamycinrcsistentcn Stämmen inaktiv sind, wie lischerichia coli JR66/Wb77. das den R-Faktor von klinisch isolierten Klebsieila trägt. Von H. Umezawa wurde gefunden, daß die letztere Art

der kanamycinresistenten Stämme einen Resistenzmechanismus aufweist, der ein Enzym produziert, das die 2"-Hydroxylgruppe des Kanamycins oder des 3',4'-Didesoxykanamycin B-Moleküls mit ATP (Adenosintriphosphat) adenyliert und Kanamycin und 3',4'-Didesoxykanamycin B durch diese Nucleotidyltransferase inaktiviert (Journal of Antibiotics, Band 24 (1971), Seiten 911 bis 913, und Journal of Antibiotics, Band 25 (1972), Seite 492).

Ebenso ist bekannt, daß Butirosin B, das ein Aminoglykosid-Antibiotikum ist, das von einer Bacillusart gebildet wird, gegen einige kanamycin- und ribos>tamycinresistente Bakterien wirksam ist Butirosin B wurde aufgeklärt als l-N-[(S)-2-Hydroxy-4-amino-butyryl)-ribostamycin (Tetrahedron Letters, (1971), Seiten 2617 bis 2630 und DE-OS 19 14 527). Durch den Vergleich der antibakteriellen Wirkung des Ribostamycins mit dem Butirosin ü wurde nun gefunden, daß der (S)-4-Amino-2-hydroxy-butyryl-Substituent an der 1-Aminogruppe des Butirosin B-Moleküls eine bedeutende Rolle hat, um das Ribostamycin sogar gegen die ribostamycinresistenten und empfindlichen Stämme aktiv zu machen; und daß die Gegenwart des (S)-4-Amino-2-hydroxybutyryl-Substituenten an der 1-Aminogruppe des Butirosin B-Moleküls die Wirkung der Nucleotidyltransferase, die durch die kanamycinresistenten Stämme erzeugt wird, inhibieren kann. Aufgrund der obigen Untersuchungen sollte man erwarten, daß im allgemeinen ein l-N-[(S)-a-Hydroxy-u)-aminoacyl)-Derivat eines Aminoglykosid-Antibiotikums einschließlich dessen Desoxyderivats ein geeignetes und wirksames Mittel gegen arzneistoffresistente Bakterien wäre, wenn es synthetisiert werden könnte. Daher wurde die Möglichkeit erforscht, solche neuen l-N-[(S)-2-Hydroxy-4-aminobutyryi]-Derivate des Kanamycins B, 3'-Desoxyneamins, 3',4'-Didesoxyneamins, 3',4'-Didesoxyribostamycins und 3',4'-Didesoxykanamycins B herzustellen.

Aufgabe dieser Erfindung ist es, neue und wertvolle l-N-[(S)-2-Hydroxy-4-amino-butyryl]-Derivate bekannter Aminoglykosid-Antibiotika oder deren Desoxyderivate herzustellen, die auch gegen Stämme, die gegen die Aminoglykosid-Antibiotika und deren bekannte Desoxyderivate resistent sind, wirksam sind. Weiter soll die Erfindung ein Verfahren für die Herstellung solcher neuer und wertvoller Derivate bekannter Aminoglykosid-Antibiotika und deren bekannter Desoxyderivate angeben.

Gegenstand der Erfindung sind daher l-N-[(S)-2-Hydroxy-4-amino-butyryl]-neamin-Derivate der allgemeinen Formel

CH₂NHR NH,

(S)
CO CH OH

(C¹Hj)₂ (1)
NH₂

in der die Bedeutungen

R: Wasserstoff oder Methyl,

Λ: Wasserstoff oder 3-Amino-J-clesoxy-ix-D-gliiW) pvranosyl.

B: Wasserstoff oder /S-D-Ribofuranosyl,
X: Wasserstoff oder Hydroxy,
Y: Wasserstoff oder Hydroxy,

folgenden Verbindungen zuzuordnen sind:

a) 1 -N-[(S)-2-Hydroxy-4-amino-butyryl]-3'-desoxy-

neamin,

ίο b) l-N-[(S)-2-Hydroxy-4-amino-butyryl]-3'4'-didesoxyneamin,

c) l-N-[(S)-2-Hydroxy-4-amino-butyryl]-kanamycin B,

d) l-N-[(S)-2-Hydroxy-4-amino-butyryl]-3'-desoxykanamycin B,

e) l-N-[(S)-2-Hydroxy-4-amino-butyryl]-3',4'-r)idesoxykanamycin B,

0 l-N-[(S)-2-Hydroxy-4-amino-butyryl]-3'-desoxy-

6'-N-methyl-kanarriycin B,
g) 1 -N-fJS^-Hydroxy^-amino-butyryQO'-desoxy-

ribostamycin,

h) 1 -N-[(S)-2-Hydroxy-4-amino-butyryl]-3',4'-didesoxyribostamycin

und deren pharmakologisch verträgliche Säureadditionssalze.

Diese neuen Derivate besitzen, wie sich nun gezeigt hat, eine wertvolle bakterizide Wirkung gegen Bakterien, die gege lüber den bekannten Aminoglykosid-

jo Antibiotika empfindlich jind, sowie gegen Bakterien, die gegen die bekannten Aminoglykosid-Antibiotika einschließlich deren Desoxyderivate resistent sind.

Das Symbol (S) in der Formel (I) ist eine Konfigurationsbezeichnung organischer Verbindungen (R. S.

r, Cahn, CK. Ingold&V. Prelog; Experientia, Band 12 (1956), Seiten 81-94).

Beispiele für pharmakologisch verträgliche Säureadditionssalze der erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel (I) schließen die Hydrochloride, Sulfate, Phosphate, Acetate, Maleate, Fumarate, Succinate, Tartrate, Oxalate, Citrate, Methansulfonate, Äthansulfonate ein.

l-N-[(S)-2-Hydroxy-4-amino-butyryl]-3',4'-didesoxyneamin (im folgenden als AHB-Didesoxyneamin abge-

Y, kürzt) hat die folgenden physikalischen, chemischen und biologischen Eigenschaften: Diese Verbindung ist ein farbloses kristallines Pulver.[>]?; +38°,(cO,85, Wasser). Sie hat einen Rr-Wertj'^-Didesoxyncamin von 0,47 (bei der Papierchromatographie mit 6:4:3:1 n-Butanol —Py-

->n ridin —Wasser—Essigsäure als Entwicklungslösung). Das AHB-Didesoxyneamin ist von geringer Toxizität bei Tier und Mensch-, es hat eine LD50 von mehr als 100 mg/kg nach intravenöser Injektion dieser Verbindung in Mäuse. Außerdem zeigt diese Verbindung eine

v, antibakterielle Wirkung gegen verschiedene grampositive und gram-negative Bakterien, einschließlich gegen kanamycinresistente Stämme. Das AHB-Didesoxyneamin zeigt eine höhere antibakterielle Wirkung als die Staniniverbindiing 3',4'-Didesoxyneamin, gegen

w) sensitive sowie gegen rcsistente Bakterien. Die minimale Hemmkonicntration (ng/ml) des AHB-Didesoxyneamins gegenüber verschiedenen Mikroorganismen wurde nach der Standardsericnvcrdünnungsmethode mit IMähragar in einem Inkubator bei 37°C nach

ir> I^ Stunden Inkubation bestimmt.

.ms antibakteriell Spektrum des ΛΗΒ-Didesoxyncamins ist in der folgenden Tabelle I mit denen des 3'.4'-Didesoxyneamins und Neamins verglichen.

Tabelle 1

Test-Organismen*)

Minimale Hemmkonzentration
AHB- 3',4'-Di-

Neamin

. didesoxy-	desoxyneamin	6,25
neamin		>100
3,12	6,25	0,78
25	50	123
<0,39	039	>100
6,25	25	3,12
12,5	25	123
1,56	3,12	6,25
3,12	123	>100
3,12	6,25	>100
50	50	>100
3,12	123	12,5
3,12	12,5	>100
3,12	6,25	6,25
12,5	25	12,5
3,12	6.25	6,25
3,12	6,25	123
3,12	123	6,25
12,5	12,5	>100
3,12	6,25	>100
12,5	25	>100
6,25	6,25	>100
6,25	25	>100
6,25	25	>100
>100	>100	>100
6.25	25	100
25	50	25
25	50	12,5
12,5	25	C und 18 Stunden)
6,25	25
ie (Agar-Agar	Nährboden bei 37°

Staphylococcus aureus FDA 209 P Sarcina lutea PCI 1001
Bacillus subtilis NRRL B-558
Klebsiella pneumoniae PCI 602 Klebsiella pneumoniae Typ 22 * 3038 Salmonella typhosa T-63
Escherichia coli NIH]
Escherichia coli K-12
Escherichia coli K-12 R-5
Escherichia coli K-12 ML 1629 Escherichia coli K-12 ML 1630 Escherichia coli K-12 ML 1410 Escherichia coli K-12 ML 1410 R 81 Escherichia coli K-12 LA 290 R 55 Escherichia coli K-12 LA 290 R 56 Escherichia coli K-12 LA 290 R 64 Escherichia coli K-12 C 600 R 135 Escherichia coli K-12 W 677
Escherichia coli K-12 JR 66/W 67 Escherichia coli J 5 R 11-2
Pseudomonas aeruginosa A 3 Pseudomonas aeruginosa No. 12 Pseudomonas aeruginosa GN 315 Pseudomonas aeruginosa Tl-13 Pseudomonas aeruginosa 99
Proteus rettgeri GN 311
Proteus rettgeri GN 466
Mycobacterium smegmatis ATCC 607**) *) Agar-Agar-Verdünnungs-Aufstreichmethode **) 48 Stunden.

l-N-[(S)-2-Hydroxy-4-amino-butyryl]-3',4'-didesoxyribostamycin (im folgenden als AHB-Didesoxyribostamycin abgekürzt) hat die folgenden Eigenschaften: l-N-[(S)-2-Hydroxy-4-amino-butyryl]-3',4'-didesoxyribostamycin, nämlich das 3',4'-Didesoxybutirosin B als Monohydrat zeigt [«]'„« +25° (c 1,8, Wasser). RfButirosin β 1,73 (papierchromatographiert mit 1-Butanol —Pyridin-Wasser-Essigsäure (6:4:3:1), Rf 0,24 (Dünnschichtchromatographie mit Silicagel und Chloroform-Methanol-17% Ammoniak (1 :4 : 3)). [Berechnet für C21H41N5O10 ■ H₂O:
C 46,57, H 8,00, N 12,93;

Tabelle II

50

gefunden:

C 46,74, H 7,70, N 13,131

Das AHB-Didesoxyribostamycin zeigte wesentlich verstärkte antibakterielle Wirkung, verglichen mit der des Ribostamycins und des 3',4'-Didesoxyribostamycins und war vergleichbar mit dem des Butirosin B. Außerdem war es wirksam gegen Klebsiella pneumoniae Typ 22, No. 3038 und Escherichia coli K-12 JR 66/W 677, welches resistent gegen Butirosin B ist.

Der antibakterielle Bereich des AHB-Didesoxyribostamycins, Butirosins B, 3',4'-Didesoxyribostamycins und Ribostamycins werden in Tabelle Il verglichen.

Test-Organismen*)

Staphylococcus aureus FDA 209 P
Sarcina lutea PCI 1001
Bacillus subtilis NRRL B-558
Klebsiella pneumoniae VJ. b02
Klebsiella pneumoniae Typ 22 No. 3038 Salmonella typhosa T-63
Escherichia coli NIHI
Escherichia coli K-12
Escherichia coli K-12 R-5
Escherichia coli K-12 ML 1629
Escherichia coli K-12 Ml. Ib50

Minimale Hemmkonzentration (ng/<	Butirosin B	nl)	3\4'-	Ribosta
AHB-		Didesoxyribosla-	mycin
didesoxyribosla-		mycin
mycin	1,56	3,12	3,12
136	50	>100	100
25	0,39	1.56	3,12
<0,39	0.78	3,12	1,56
0.78	> 100	6,25	> 100
3,12	0.39	1,56	1,56
0.39	3.12	6.25	6,25
1.56	0.78	3.12	3,12
1.25	6.25	100	50
6.25	1.56	> 100	> 100
1,^r)6	1.5(i	:> 100	• 100
0.78

Fortsetzung

Test-Organismen*)

Escherichia coü K-12 ML 1410
Escherichia coli K-12ML1410R81 Escherichia coli K-12 LA 290 R 55 Escherichia coli K-12 LA 290 R 56 Escherichia coli K-12 LA 290 R 64 Escherichia coli C 600 R 135
Escherichia coli W 677
Escherhhia coli JR 66/W 677
Escherichia coli J 5 R 11-2
Pseudomonas aeruginosa A 3
Pseudomonas aeruginosa No. 12
Pseudomonas aeruginosa GN 315 Pseudomonas aeruginosa TI-13
Pseudomonas aeruginosa A 3 99
Proteus rettgeri GN 311
Proteus rettgeri GN 466
Mycobacterium smegmatis ATCC 607*

Minimale Hemmkonzentration ^g/	Butirosin B	I-	0,78	'ml)	3',4'-	Ribosta
AHB-		3,12	Didesoxyribosta-	mycin
didesoxyribost;	0,78	mycin
mycin	0,78	6,25	3,12
0,78	0,78	>100	>100
1,56	0,78	3,12	3,12
1,56	0,39	1,56	3,12
<0,39	>!00	3,12	1,56
1,56	1,56	3,12	1,56
0,78	3,12	3,12	1,56
0,78	6,25	6,25	>100
3,12	>100	100	>100
<039	25	6,25	>100
6,25	50	12,5	>100
6.25	6,25	>100	>100
>100	3,12	25	>100
12,5	0,78	50	>100
25	6,25	12,5
12,5	6,25	6,25
3,12	3,12	6,25
<0,39

*) Agar-Agar-Verdünnungs-Aufstreichmethode (Agar-Agar-Nährboden bei 37°C und 18 Stunden).

48 Stunden.

Die akute intravenöse LD50 in Mäusen von AHB-Didesoxyribostamycin lag über 100 mg/kg.

1-N-[(S)-2-Hydroxy-4-amino-butyryl]-3',4'-didesoxykanamycin B (im folgenden als AHB-Didesoxykanamycin B abgekürzt) hat die folgenden Eigenschaften: Diese Verbindung ist ein farbloses kristallines Pulver mit einem Zersetzungspunkt von 178⁰C, [a]? +86,8⁰C (cO.77, Wasser). Ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Verbindung in wäßriger Lösung zeigt nur Endabsorption, ein Ultrarot-Absorptionsspektrum dieser Verbindung in Kaliumbromid zeigt Hauptabsorptionsmaxima bei 3450, 2950, 1630, 1570, 1480, 1385, 1335 und 1030cm-¹, woraus das Vorhandensein von Amid-Bindungen in dem Molekül dieser Verbindung bestätigt werden kann.

Das AHB-Didesoxykanamycin B zeigt eine stärkere antibakterielle Wirkung als das Kanamycin A und 3',4'-Didesoxykanamycin B (im folgenden als DKB abgekürzt) gegen verschiedene gram-positive und gram-negative Bakterien, die empfindlich gegenüber

Tabelle III

Kanamycin und DKB sind. Außerdem zeigt das AHB-Didesoxykanamycin B eine hohe antibakterielle Wirkung gegen arzneistoffresistente Stämme wie Staphylococcus aureus, Escherichia coli und Pseudomonas aeruginosa, die resistent gegen Kanamycin und DKB sind.

Das AHB-Didesoxykanamycin B ist von derselben

-*> geringen Toxizität wie das Kanamycin; AHB-Didesoxykanamycin B zeigt eine LD50 in Mäusen von mehr als 150 mg/kg nach intravenöser Injektion.

Die minimale Hemmkonzentration (μξ/τη\) des AHB-Didesoxykanamycin B gegen verschiedene Mikro-

^Δ<> Organismen wurde nach der Standardserien-Verdünnungsmethode mit Agar-Agar in einem Inkubator bei 37° C nach 18 Stunden Inkubationszeit bestimmt.

Der antibakterielle Bereich des AHB-Didesoxykanamycin B wird in der folgenden Tabelle III mit dem

4ϊ antibakteriellen Bereich des Kanamycins und DKB verglichen.

Tesi-Organismen

Kanamycin

DKB

AHB-didesoxykanamycin B

Staphylococcus aureus FDA 209 P 3,12

Escherichia coli K-12 0,78

Escherichia coli K-12 ML 1629 >

Escherichia coli K-12 ML 1630 >

Escherichia coli K-12 ML 1410 1,56 Escherichia coli K-12 ML 1410 R 81 >

Escherichia coli LA 290 R 55

Escherichia coli LA 290 R 56 12,5

Escherichia coli LA 290 R 64 12,5

Escherichia coli W 677 1,56

Escherichia coli JR 66/W 77 >

Pseudomonas aeruginosa A3 >

Pseuomonas aeruginosa No. 12

Pseudomonas aeruginosa TI-13 >

Pseudomonas aeruginosa 99 >

1,56	0,78
1,56	0,78
3,12	0,78
3,12	0,78
1,56	0,78
3,12	136
>100	0,78
25	Ο39
25	0,78
1,56	0^9
100	1,56
3,12	3,12
3,12	136
3,12	3,12
12,5	12,5

ίο

l-N-[(S)-2-Hydroxy-4-amino-butyryl]-3'-desoxyneamin (im folgenden als AHB-Desoxyneamin abgekürzt) hat die folgenden Eigenschaften: Diese Verbindung ist ein farbloses kristallines Pulver, [λ] ϊ +86° (c 1, Wasser).

1 -N-[(S)-2- Hydroxy-4-amino-butyryl]-3'-desoxyribostamycin (im folgenden als AHB-Desoxyribostamycin abgekürzt) hat die folgenden Eigenschaften: Die Verbindung ist ein farbloses kristallines Pulver, [«]? +38° (c 1, Wasser).

1 -N-[(S)-2-Hydroxy-4-amino-butyryl]-3'-desoxykanamycin B (im folgenden als AHB-Desoxykanamycin B abgekürzt) hat die folgenden Eigenschaften: Die Verbindung ist ein farbloses kristallines Pulver, [α]? +90° (c 1, Wasser).

l-N-[(S)-2-Hydroxy-4-amino-butyryl]-3'-desoxy-6'-N-methylkanamycin B (im folgenden als AHB-Methyldesoxykanamycin B abgekürzt) hat die folgenden Eigenschaften: Diese Verbindung ist ein farbloses kristallines Pulver, [<x]? +93° (c 1, Wasser).

Das AHB-Desoxyneamin, AHB-Desoxyribostamycin, AHB-Desoxykanamycin B und AHB-Methyldesoxykanamycin B zeigen nicht nur antibakterielle Wirkung, ebenso hoch wie die ihrer Stammsubstanzen (3'-Desoxyneamin, 3'-Desoxyribostamycin und 3'-Desoxykana-

Tabelle IV

mycin B), gegen verschiedene gram-positive und gramnegative Bakterien, die gegen diese Stammsubstanzen empfindlich sind, sondern sie zeigen auch eine hohe antibakterielle Wirkung gegen die kanamycinresistenten Stämme des Staphylococcus aureus, Escherichia coli und Pseudomonas aeruginosa sowie gegen Klebsiella pneumoniae und Salmonella typhosa. Außerdem sind sie von derselben geringen Toxizität wie die Stammsubstanzen, ersichtlich an einer LD₅O von mehr als 100 mg/kg nach intevenöser Injektion dieser Verbindung in Mäuse.

Die minimale Hemmkonzentration ^g/ml) des AHB-Desoxyneamin, AHB-Desoxyribostamycin, AHB-Desoxykanamycin B und AHB-Methyldesoxykanamycin B gegen verschiedene Mikroorganismen wird nach der Standardserienverdünnungsmethode mit Agar-Agar in einem Inkubator bei 37°C nach 18 Stunden Inkubation bestimmt.

Der antibakterielle Bereich des AHB-Desoxyneamin, AHB-Desoxyribstamycin, AHB-Desoxykanamycin B und AHB-Methyldesoxykanamycin B werden in der folgenden Tabelle IV mit dem::i des 3'-Desoxyneamin, 3'-Desoxyribostamycin und 2'-Desoxy-6' N-methylkanamycin B verglichen.

Test-Organismen

AHB-	3'-Desoxy-	6,25	—	100	AHB-
desoxy-	neamin	>100	desoxy-
neamin			ribosta-
		mycin
3,12		1,56
3,12	—	1,56
6,25	1,56
6,25	0,78
6,25	1,56
6,25	0,78
6,25	3,12
6,25	1,56

3'-Desoxy- AHB- 3'-Desoxy- AHB- 3'-Desoxy-

ribosta- desoxy- kana- methyl- 6'-N-me-

mycin kana- mycin B desoxy- thylkana-

mycin B kana- mycin B

mycin B

Staphylococcus aureus 3,12 - 1,56 - 0,78 - 0,78

FDA 209 P 3,12 - 1,56 - 0,78 - 0,78

Escherichia coli ML 1629* 6,25 6,25 1,56 >100 0,78 0,78 0.78

Escherichia coli ML 1410 6,25 - 0,78 - 0,78 - 0,78

Escherichia coli LA 290 6,25 100 1,56 >100 0,78 50 0,78

R 55

Escherichia coli W 677 6,25 - 0,78 - 1,56

Escherichia coli JR 66/W 677 6,25 >100 3,12 >100 3,12 50

Pseudomonas aeruginosa 6,25 — 1,56 — 0,78

Pseudomonas aeruginosa 6,25 — 3,12 — 0,78 —

No. 12

Pseudomonas aeruginosa >100 >i00 >100 > 100 50 100

GM 315*

In der obigen Tabelle bedeutet * einen Arzneistoff-resistenten Stamm.

3,12
3,12
0,78

0,78
6,25

1,56
50

50
6,25

1 -N-[(S)-2-Hydroxy-4-amino-butyryl]-kanamycin B >o (im folgenden als AHB-Kanamycin-B abgekürzt) hat die folgenden Eigenschaften: Diese Verbindung isi ein farbloses kristallines Pulver mit einem Zersetzungspunkt von 181 bis 183°C[α]·;. +85° (el, Wasser). Diese Verbindung gibt einen einzigen Fleck, der positiv auf die Ninhydrinreaktion reagiert bei 0,12 in der Dünnschichtchromatographie auf Siücagel bei Verwendung eines Lösungsmittelsystems von 4:1 :2 :1 Methanol—Chloroform—28% wäßriges Ammoniak—Wasser als Entwicklungslösungsmittel (Kanamycin B zeigt Rf 0,37 e>o unter denselben Bedingungen). Diese Verbindung gibt auch einen einzigen Punkt bei Rr 0,06 bei Dünnschichtchromatographie mit einem Lösungsmittelsystem von 4:5:2:5 Butanol—Äthanol—Chloroform—17%iges wäßriges Ammoniak als Entwicklungslösung (Kanamycin B zeigt ein Rf-Wert von 0,17 in diesem Falle). Ein Ultraviolettabsorptionsspektrum dieser Verbindung in Wasser zeigt nur Endabsorption, ein Ultrarotabsorptionsspektrum dieser Verbindung in Kaliumbromid zeigt Absorptionsmaxima bei 3450, 2950, 1650, 1575, 1490, 1385, 1340, 1140 und 1030 cm ^!, woraus das Vorhandensein einer Amid-Bindung in dem Molekül dieser Verbindung bestätigt werden kann.

Das AHB-Kanamycin B zeigt nicht nur hohe antibakterielle Wirkung gegen verschiedene gram-positive und gram-negative Bakterien, die empfindlich gegen Kanamycin sind, sondern auch eine antibakterielle Wirkung gegen Arzneistoff-resistente Stämme von Escherichia coli und Pseudomonas aeruginosa. Diese Verbindung ist auch von geringer Toxizität bei Tier und Mensch; das AHB-Kanamycin B zeigt einen LDso-Wert von mehr als 100 mg/kg nach intravenöser Injektion dieser Verbindung in Mäuse.

Die minimale Hemmkonzentration ^g/ml)des AHB-Kanamycin B gegen verschiedene Mikroorganismen wird nach der Standardserienverdünnungs-Methode mit Agar-Agar in einem Inkubator bei 37°C nach 18

Stunden Inkubationszeit bestimmt.

Der antibakterielle Bereich des AHB-Kanamycin B wird in der folgenden Tabelle V mit dem Bereich des Kanamycins verglichen.

Tabelle V

Test-Organismen	Minimale Hemm	>100	AHB-
	konzentration, μ0/πι1	kana-
	Kana	mycin B
	mycin B	0,78

Staphylococcus aureus FDA	0,39	<0,20
209 P		0,20
Staphylococcus aureus Smith	<0,20	3,13
Staphylococcus aureus Terajima	<0,20	<0,20
Sarcina lutea PCI 1001	1,56	<0,20
Bacillus anthracis	<0,20	<0,20
Bacillus subtilis PCI 219	<0,20	1,56
Bacillus subtilis NRRL B-558	<0,20	0,39
Bacillus cereus ATCC 10702	0,78	0,78
Corynebacterium bovis 1810	1,56
Mycobacterium smegmatis	0,78	3,12
ATCC 607		3,12
Shigella dysenteriae JS 11910	3,13	1,56
Shigella flexneri 4b JS 11811	3,13	0,39
Shipella sonnei JS 11746	1,56	3,12
Salmonella typhose T-63	0,20	1,56
Salmonella enteritidis 1891	1,56	0,39
Proteus vulgaris OX 19	0,78	6,25
Klebsieila pneumoniae PCI 1602	0,78	0,78
Klebsieila pneumoniae 22*3038	>100	0,78
Escherichia coli NIHJ	0,78	0,78
Escherichia coli K-12	0,78	1,56
Escherichia coli K-12 R 5	1,56	1,56
Escherichia coli K-12 ML 1629	>100	3,13
Escherichia coli K-12 ML 1630	>100	1,56
Escherichia coli K-12 ML 1410	0,78
Escherichia coli K-12 ML 1410	>100	1,56
R81		0,39
Escherichia coli LA 290 R 55	12,5	0,39
Escherichia coli LA 290 R 56	3,13	0,39
Escherichia coli LA 290 R 64	3,13	3,12
Escherichia coli W 677	0,39	6,25
Escherichia coli JR 66/W 677	>100	6,25
Pseudomonas aeruginosa A 3	50	6,25
Pseudomonas aeruginosa No. 12	12,5	50
Pseudomonas aeruginosa TI-13	100	25
Pseudomonas aeruginosa GN 315 > 100
Pseudomonas aerueinosa 99

"i-idungsgernäßen Verbindungen der allgemeinen Formel (I) sind von niederer Toxizität bei Tier und Mensch. Sie zeigen einen LDso-Wert von mehr als 100 mg/kg bei intravenöser Injektion der Verbindungen in Mäuse. Außerdem zeigen die erfindungsgemäßen Verbindungen eine hohe antibakterielle Wirkung gegen verschiedene gram-positive und gram-negative Bakterien einschließlich gegen kanamycinresistente Stämme, so daß diese neuen erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung von Infektionen durch gram-positive und gram-negative Bakterien wertvoll sein können. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können oral, intraperitoneal, intravenös oder intramuskulär in jeder bekannten pharmazeutischen Form und in ähnlicher Weise wie Kanamycin verabreicht werden. Zum Beispiel kann die erfindungsgemäße Verbindung der allgemeinen Formel (I) oral in jeder bekannten pharmazeutischen Form verabreicht werden. Beispiele der pharmazeutischen Formen für die orale Verabreichung sind Pulver, Kapseln, Tabletten und Sirup. Geeignete Dosen der Verbindung für die wirksame Behandlung von Bakterieninfektionen liegen in dem Bereich von 0,25 bis 2 g pro Person pro Tag bei oraler Verabreichung. Vorzugsweise werden diese Dosen in drei bis vier Teilen pro Tag verabreicht Die erfindungsgemäße Verbindung kann auch durch intramuskuläre Injektion in Dosen von 50 bis 200 mg pro Person ein bis zweimal am Tag verabreicht werden. Weiterhin kann diese erfindungsgemäße Verbindung für die äußere Behandlung formuliert werden in Salben, die die erfindungsgemäße Verbindung in einer Konzentration von 0,5 bis 5 Gewichtsprozent in einer bekannten Salbengrundiage, wie z. B. Polyälhyiengiykoi, enthält.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung der l-N-[(S)-2-Hydroxy-4-aminobutyryij-neamin-Derivate der Formel I, dadurch gekennzeichnet, daß man jeweils in an sich bekannter Weise

A) ein Neamin-Derivat der allgemeinen Formel
CH₂NHR NH₂

NH₂

_ys? λ k™ j ^(1I)

NH₂ OA

in der R, A, B, X und Y die oben angegebenen und wie oben zuzuordnenden Bedeutungen haben, in dem die l-Aminogruppe ausgenommen, eine oder mehrere Aminogruppen durch übliche Schutzgruppen geschützt sind, mit einer an der Aminogruppe eine übliche Schutzgruppe tragenden und an der Carboxylgruppe aktivierten (S)-2-Hydroxy-4-amino-buttersäure acyliert,

B) die Schutzgruppen aus den N-acylierten Verbindungen abspaltet,

C) die erhaltenen Stoffgemische durch chromatographische Verfahren auftrennt und

D) die Neamin-Derivate gemäß Formel I gewinnt und gegebenenfalls in ihre Säureadditionssalze überführt.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren ist es naheliegend, daß die gewünschte Verbindung der allgemeinen Formel (I) in bester Ausbeute erhalten würde, wenn die Aminosäure-Reaktäonskcrnpcnente mit einem solchen aminogeschützten Derivat des Aminoglykosid-Antibiotikums der allgemeinen Formel (II) umgesetzt wird, in dem alle Aminogruppen außer der l-Aminogruppe des vorstehenden Antibiotikums mit einer Aminoschutzgruppe maskiert worden sind. Es ist zu überlegen, daß Kanamycin B und 3\4'-Kanamycin B die fünf Aminogruppen alle in einem Molekül enthalten, während

bo Neamin, Ribostamycin und deren Desoxyderivate die vier Aminogruppen alle in einem Molekül enthalten. Es ist möglich, aber sehr kompliziert, solche aminogeschützten Derivate der Aminoglykosid-Antibiotika der allgemeinen Foimei (II) herzustellen, in denen alle

Aminogruppen außer der 1-Aminogruppe durch eine Aminoschutzgruppe geschützt werden, wobei die l-Aminogruppe frei bleibt. Demgemäß wird vorgezogen, ein solches aminogeschütztes Derivat des Amino-

glykosid-Antibiotikums der allgemeinen Formel (II) herzustellen, in dem nur die primäre Aminogruppe in der 6'-Stellung des Antibiotikummoleküls durch eine Aminoschutzgruppe geschützt wird, da es relativ einfach ist, die 6'-Aminogruppe bevorzugt zu schützen, wegen der höchsten Reaktivität der 6'-Aminogruppe unter den Aminogruppen in dem Antibiotikummolekül. Kanamycin B und 3',4'-Didesoxykanamycin B enthalten auch die 2'-Aminogruppe in ihrem Molekül, und die Reaktivität der 2'-Aminogruppe ist geringer als die der ι ο 6'-Aminogruppe, aber höher als die der übrigen Aminogruppen. Daher ist es möglich, ein derart aminogeschütztes Derivat des Kanamycin B oder des 3',4'-Didesoxykanamycin B herzustellen, in dem entweder nur die 6'-Aminogruppe oder beide, die 6'-Aminogruppe !5 und 2'-Aminogruppe, durch eine Aminoschutzgruppe geschützt worden sind.

Um ein aminogeschütztes Derivat des Antibiotikums der allgemeinen Formel (II), das als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet wird, herzustellen, wird das Antibiotikum (einschließlich seines Desoxyderivates) der allgemeinen Formel (II) umgesetzt mit einer für die konventionelle Peptidsynthese bekannten Verbindung zur Einführung einer Aminoschutzgruppe. Als geeignete Beispiele für bekannte Aminoschutzgruppen im Rahmen dieser Erfindung sind unter anderem zu erwähnen eine Alkyloxycarbonylgruppe, wie t-Butoxycarbonyl; eine Cycloalkyloxycarbonylgruppe, wie Cyclopentyloxycarbonyl und Cyclohexyloxycarbonyl; eine Aralkyloxycarbonylgruppe, wie Benzyloxycarbonyl und p-Nitro-benzyloxycarbonyl; eine Aryloxycarbonylgruppe, wie Phenoxycarbonyl; und Furfuryloxycarbonyl und eine Acylgruppe, wie Phthaloyl. Eine besonders bevorzugte Aminoschutzgruppe ist die Benzyloxy- und die ü t-Butoxygruppe.

Das aminogeschützte Derivat des Antibiotikums (II), in dem zumindest eine der Aminogruppen außer der 1-Aminogruppe des Antibiotikummoleküls, insbesondere d^!e 6'-Aminogruppe allein oder zusammen mit der 2'-Aminogruppe durch eine bekannte Aminoschutzgruppe geschützt worden ist, kann bevorzugt in der folgenden Weise hergestellt werden: Das vorstehende Aminoglykosid-Antibiotikum der allgemeinen Formel (II) wird mit 0,5 bis 3 Molteilen eines Chlorformiats. eines p-Nitrophenylcarbonats, eines N-Hydroxysuccinimidesters oder eines Azidoformiats umgesetzt; die Umsetzung erfolgt in einer für die Peptidsynthese bekannten Weise in geeigneten Lösungsmitteln, wie Wasser, Äthylalkohol, Aceton oder in einer Mischung derselben unter neutralen oder basischen Bedingungen. Die so erhaltenen Umsetzungsprodukte bestehen aus einer Mischung verschiedener aminogeschützter Derivate des Antibiotikums, wobei der Hauptanteil ein aminogeschütztes Derivat des Antibiotikums, in dem nur die 6'-Aminogruppe des ursprünglichen Antibiptikummoleküls durch die Aminoschutzgruppe blockiert wurde, ist und geringere Anteile der aminogeschützten Derivate des Antibiotikums, in dem die 6'-Aminogruppe und eine oder mehrere der anderen Aminogruppen durch die Aminoschutzgruppe blockiert wurden, vorhanden sind. Daher wird die Mischung der vorstehenden Umsetzungsprodukte vorzugsweise chromatographisch mit einem Kationenaustauscherharz, das Carboxylgruppen enthält, z.B. einem Copolymerisat der Methacrylsäure mit Divinylbenzol (in freier oder NH4+-Form) getrennt, um das aminogeschützte Antibiotikum der allgemeinen Formel (II) zu isolieren, worin die 6'-Aminogruppe allein oder möglicherweise zusammen mit der 2'-Aminogruppe vorzugsweise durch die Aminoschutzgruppe maskiert wurde.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird das aminogeschützte Derivat des Antibiotikums der allgemeinen Formel (II) in einer für die Amid-Synthese bekannten Acylierungsweise mit der substituierten Aminosäure umgesetzt. Das aminogeschützte Derivat des Antibiotikums der allgemeinen Formel (II) kann durch Kondensation mit der substituierten Aminosäure in einer Lösung von Dimethylformamid, Aceton oder Tetrahydrofuran unter Eiskühlung und in Gegenwart eines Entwässerungsmittels wie Dicyclohexylcarbodiimid acyliert werden. Die substituierte Aminosäure kann auch in Form ihres Säurechlorids, ihres gemischten Säureanhydrids, ihres aktivierten Esters oder ihres Azid-Derivats eingesetzt werden. Es ist also möglich, die substituierte Aminosäure zuerst mit N-Hydroxysuccinimid in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid zu ihrem aktivierten Ester umzusetzen, der dann anschließend mit dem aminogeschützten Derivat des Antibiotikums der allgemeinen Formel (II) für die N-Acylierung des letzteren umgesetzt wird. Vorzugsweise wird das aminogeschützte Derivat des Antibiotikums (II) mit 0,5 bis 3 Molteilen des aktivierten Esters der substituierten Aminosäure in einem Reaktionsmedium aus Wasser und einem organischen Lösungsmittel wie Dimethoxyäthan umgesetzt.

Weiter werden die gemischt-acylierten Verbindun gen durch Kondensationsreaktion der substituierten Aminosäure mit dem aminogeschützten Derivat des Antibiotikums (II) hergestellt. Die so erhaltenen acylierten Produkte bestehen im allgemeinen aus einer Mischung von mono-N-acylierten Verbindungen, di-N-acylierten Verbindungen und anderen N-acylierten Verbindungen, einschließlich der erwünschten mono-1-N-acylierten Verbindung, die von dem vorstehenden aminogeschützten Derivat des Antibiotikums (II) stammen. Die Mischung der acylierten Verbindungen kann sofort behandelt werden, um die vorhandenen Aminoschutzgruppen zu entfernen; d. h. urn die Amino Schutzgruppen in Wasserstoffatome umzuwandeln. Es ist auch möglich, die gemischt-acylierten Verbindungen chromatographisch zu trennen, z. B. mit Silicagel, so daß die nicht-umgesetzten aminogeschützten Derivate des Antibiotikums (II) entfernt werden, bevor die Umwandlung der aminogeschützten Gruppen in Wasserstoffatome erfolgt.

Die Umwandlung der aminogeschützten Gruppe der acylierten Verbindungen in Wasserstoffatome kanr auf mehreren bekannten Wegen erfolgen. Wenn die Aminoschutzgruppe eine Alkyloxycarbonylgruppe, wie t-Butoxycarbonyl, Cycloalkyloxycarbonyl oder Aryl- oxycarbonyl ist, kann die Abspaltung der Aminoschutzgruppe von den acylierten Verbindungen durch eine milde Hydrolysebehandlung der acylierten Verbindungen mit einer schwachen Säure, wie wäßriger Trifluoressigsäure, wäßriger Essigsäure und verdünnter Salzsäure, erreicht werden. Wenn die Aminoschutzgruppe Aralkyloxycarbonyl, wie Benzyloxycarbonyl ist, kann die Entfernung dieser Art der Aminoschutzgruppen durch eine Hydrierung der acylierten Verbindungen in Gegenwart eines Palladhim-KoMenstoff-Katalysator'- oder durch Behandeln mit Bromwasserstoffsäure in Essigsäure erreicht werden. Die o-Nitrophenoxyacetylgruppe als Aminoschutzgruppe kann durch eine reduktive Behandlung entfernt werden. Wenn die Amino schutzgruppe die Phthaloylgruppe ist, kann letztere von

den acylierten Verbindungen mit Hydrazinhydrat in Äthanol unter Erhitzen abgespalten werden. Wenn die acylierten Verbindungen verschiedene Arten von Aminoschutzgruppen enthalten, können diese gleichzeitig oder hintereinander verschiedenen Behandlungsweisen ausgesetzt werden, um die verschiedenen Aminoschutzgruppen zu entfernen. Wenn zum Beispiel die acylierten Verbindungen die t-Butoxycarbonylgruppe und die Benzyloxycarbonyigruppe als Aminoschutzgruppe enthalten, können diese Gruppen gleichzeitig durch eine saure katalytische Hydrierung mit 5% Palladium/Kohienstoff in 90%iger Trifluoressigsäure und Methanol entfernt werden.

Nach dem Abspalten der Aminoschutzgruppe von den acylierten Verbindungen werden letztere Chromatographien, um die nicht-umgesetzten Verbindungen zu entfernen und die gewünschte Verbindung der allgemeinen Formel (I) zu isolieren. Die Entfernung der nichtumgesetzten Verbindungen kann durch Säulenchromatographie an Silicagel erreicht werden. Die Isolierung der gesuchten Verbindungen der allgemeinen Formel (I) aus den gemischten acylierten Verbindungen kann durch Chromatographie der acylierten Verbindungen an einem Ionenaustauscher, z. B. an einem Kationenaustauscher, der Carboxyl-Gruppen enthält, an einem schwachen Kationenaustausch^ oder an CM-Cellulose wirksam erreicht werden. Die Eluate der chromatographischen Arbeitsweise werden in Fraktionen gesammelt, und die antibakterielle Wirkung dieser Fraktionen wird durch die Verwendung der empfindlichen und resistenten Bakterien als Testmikroorganismen bestimmt. Durch diese Untersuchung der antibakteriellen Wirkung jeder Fraktion können die wirksamen Fraktionen, die die gesuchte Verbindung der allgemeinen Formel (I) enthalten, festgestellt und die gewünschte Verbindung in einer für die Gewinnung von Aminoglykosid-Antibiotika bekannten Weise gewonnen werden.

Zur Isolierung und Reinigung der gewünschten Verbindung (I) aus der Mischung der acylierten Verbindungen hat es sich als sehr wirkungsvoll erwiesen, die Liganden-Austauschchromatographie an einem Anionenaustauscherharz (in Η-Form) anzuwenden, das zuerst mit einem Metallsalz wie Kupfer-II-chlorid, Kobcit-ll-chlorid. N'ickelnitrat, Eisen-III-chlorid. Zinkchlorid und Kadmiumchlorid beladen war und dann mit Ammoniak oder Aminen, wie Methylamin, behandelt wurde.

Die 2',6'-di-N-benzyloxycarbonylierten Derivate der Desoxyneamine oder der Desoxyribostamycine können in einfacher Weise durch Umsetzen der entsprechenden Desoxyneamine und Desoxyribostamycine mit 2 oder mehr Molteilen Benzyloxycarbonylchlorid in wäßriger Lösung bei einer Temperatur von 0 bis 10° C unter Eiskühlung, Chromatographieren der Mischung an einer Ionenaustauscherharz-Säule und Eluieren des Harzes mit verschiedenen konzentrierten wäßrigen Ammoniaklösungen hergestellt werden.

Die 6'-N-benzyloxycarbonylierten Derivate des Kana mycin B, oder des Desoxykanamycins B werden in hoher Ausbeute hergestellt, indem die Antibiotika in Wasser mit 1 bis 3 Molteilen Benzoyloxycarbonylchlorid bei einer Temperatur von 0 bis 10°C durch Zutropfen des Benzyloxycarbonvlchlorids unter Eiskühlung und Rühren und Abschluß der Reaktion bei Zimmertemperatur umgesetzt werden. Hauptsächlich können die poly-N-benzyloxycarbonylierten Verbindungen außer dem gesuchten 6'-N-benzyloxycarbonylierten Derivat aus dem Reaktionsgemisch ausfallen. Das Reaktionsgemisch wird filtriert, und das Filtrat wird mit Äthyläther gewaschen. Das Filtrat wird dann neutralisiert und unter vermindertem Druck eingeengt, und die konzentrierte Lösung wird an einem Kationen.austauscherharz (NH4⁺-Form) Chromatographien, um die gereinigte Form des 6'-N-benzyloxycarbonylierten Kanamycin-Derivats zu erhalten. Die 6'-N-terL-butoxycarbonylierten Derivate des Kanamycins

ίο können in günstiger Ausbeute hergestellt werden, indem das Kanamycin in einem Lösungsgemisch von Pyridin, Wasser und Triethylamin mit 1 bis 3 Molteilen des tert-Butoxycarbonyl-azids tropfenweise unter Rühren versetzt, das Reaktionsgemisch über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und dann zur Trockne eingeengt wird. Das so erhaltene feste Material wird in Wasser aufgelöst und an einem Kationenaustauscherharz (NH₄+-Form) Chromatographien, um das gewünschte 6'-N-tert.-butoxycarbonylierte Kanamycin-

:o Derivat zu erhalten. Das 2',6'-di-N-tert.-butoxycarbonylierte Derivat des Kenamycin B oder des Desoxykanamycin B kann wie vorstehend beschrieben hergestellt werden, mit der Ausnahme, daß 2 bis 3 Molteile des tert.-Butoxycarboi.ylazids verwendet werden. Das 6'-N-benzyloxycarbonyl-2'-N-tert.-butoxycarbonylierte
Derivat des Kanamycins B oder des Desoxykanamycin B kann durch Umsetzen des zuvor gebildeten 6'-N-benzyloxycarbonylierten Derivats mit 1 bis 2 Molteilen des tert.-Butoxycarbonylazids hergestellt werden. Diese aminogeschützten Derivate können als Ausgangsmaterialien in dem erfindungsgemäßen Verfahren ohne vorhergehende Reinigung eingesetzt werden.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.

B e i s ρ i e 1 1

Synthese des l-N-[(S)-2-Hydroxy-4-amino-butyryl]-

3',4'-didesoxyneamins (in der Formel (I)

A=B=R=X=Y=H

(a) S^'.ö'-Tri-N-benzyloxycarbonyl-S'^'-didesoxyneamin (280 mg) werden in wasserfreiem Tetrahydrofuran gelöst und mit einer Tetrahydrofuranlösung des aktivierten Esters der (S)-2-Hydroxy-4-phthalimido-nbuttersäure vermischt, die vorher durch Umsetzung von 110 mg der substituierten Buttersäure, 50 mg N-Hydroxysuccinimid und 90 mg Dicyclohexylcarbodiimid in wasserfreiem Tetrahydrofuran hergestellt wurde. Die Mischung wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Umsetzungsgemisch wird filtriert, und das

so Filtrat wird zu einem festen acylierten Rohprodukt eingedampft. Dieses Rohprodukt wird an Kieselgel Chromatographien. Die gereinigte acylierte Verbindung wird als S^'.ö'-Tri-N-benzyloxycarbonyl-S'^'-didesoxy-1 -N-[(S)-2-hydroxy-4-phthalimidobutyryl]-

neamin identifiziert. Die Ausbeute ist 62%; F. 228 bis 230°C (unkristallisiert aus Methanol); [α] 5?+ 32° (c 1,5 Chloroform), IR: 1705, 1690, 1655, 1535 cm-'.
Elementaranalyse für C48H53N5O14 ■ H2O:
Berechnet: C 61,20; H 5,89; N 7,43;

gefunden: C 61,34; H 5,93; N 7,39.

b) 200 mg S^'.ö'-Tri-yyy

desoxy-1 -N-[(S)-2-hydroxy-4-phthalimidobutyryl]-

neamin (das Produkt der vorstehenden Stufe (a))

werden in 80%igem wäßrigen Äthanol gelöst und dann mit 4% Hydrazinhydrat in 80%igem Äthanol-Dioxan (1 :1) bei 6O⁰C 2 Stunden behandelt, um die Phthaloylgruppe zu entfernen. Das Umsetzungsgemisch wird

030 234/187

unter vermindertem Druck getrocknet und der erhaltene feste Rückstand in Chloroform gelöst. Die Chloroformlösung wird mit Wasser gewaschen und eingedampft; das erhaltene entphthaloylierte Produkt wird in 4 ml WasserDioxan (! : 1) gelöst Diese Lösung wird mit einer geringen Menge Essigsäure versetzt und dann in Gegenwart von Palladium/Kohle in wäßrigem Dioxan (1:1) hydriert, um die Benzyloxycarbonylgruppe zu entfernen. Das so erhaltene Endprodukt wird mit Ammoniak (0 bis 0,5 n) an Ionenaustauscherharz (NH4+-Form) chromatographiert 0,4 η Ammoniak eluierte die gewünschte Verbindung, und weitere Behandlung ergab l-N-[(S)-2-Hydroxy-4-amino-butyryl]-3',4'-didesoxyneamin als Monohydrat in einer Ausbeute von 53%. [α]?+38° (c0,85, Wasser), IR: 1650, 1560 cm-'. Rf 3',4'-Didesoxy-neamin 0,47 (Papierchromatographie mit 1-Butanol-Pyridin-Wasser-Essigsäure (6:4:3:1)).

Elementaranalyse für C16H33N5O6 · H2O:
Berechnet: C 46,93; H 8,62; N 17,10;
gefunden: C 46,92; H 8,52; N 17,24.

(c) Die Ausgangsverbindung der Stufe (a), 3,2',6'-Tri-N-benzyloxycarbonyl-3',3'-didesoxyneamin, wird hergestellt durch Umsetzen des 3',4'-Didesoxyneamins mit Benzyloxycarbonylchlorid in 70% Methanol zu Tetra-N-benzyloxycarbonylneamin in einer Ausbeute von [λ] L⁵+45,4° (c2, Chloroform), das dann mit Natriumhydrid behandelt wird. Das so erhaltene Tetra-N-benzyloxycarbonylneamin wird in wasserfreiem Dimethylformamid (DMF) gelöst und unter Stickstoff mit 3 Mol-Äquivalenten Natriumhydrid versetzt und die Mischung 4 h in einem Eisbad gerührt. Die erhaltene klare Lösung wird mit Essigsäure neutralisiert und in ein Gemisch einer großen Menge Chloroform-Wasser gegossen. Das erhaltene Rohprodukt der organischen Phase wird an Kieselgel mit Chloroform-Äthanol (20:1) chromatographiert. Tri-N-benzyloxycarbonyl-3',4'-didesoxyneamin-1,6-carbamat wird in einer Ausbeute von 62% erhalten; F. 107 bis 110⁰C, [λ] +58° (c 1,9, Chloroform), IR: 1765 cm-' (cyclisches Carbamat), für C₃₇H₄₂N_nOh:

Berechnet: C 61,83; H 5,89; N 7,80;

gefunden: C 61,92; H 5,99; N 7,67.

750 mg des Tri-N-benzyloxycarbonyl-S'^'-didesoxyneamin-l,6-carbamats werden in 20 ml Wasser-Dioxan (1:1) gelöst und mit 300 mg Bariumhydroxyd-Octahydrat versetzt. Die Mischung wird 2 h bei 95° gerührt, um eine partielle Hydrolyse der Carbamatverbindung zu erreichen. Das Verbindungsgemisch wird filtriert und vom Filtrat das Dioxan abdestilliert; der Rückstand wird mit Chloroform extrahiert, der Chloroformextrakt mit Wasser gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet; anschließend wird das Chloroform abdestilliert und der erhaltene Rückstand mit Kieselgel chromatographisch gereinigt. Das Produkt ist 3,2',6'-Tri-N-benzyloxycarbonyl-3',4'-didesoxyneamin.

Beispiel 2

Synthese des 1-N-[(S)-2-Hydroxy-4-amino-butyryl]-3',4'-didesoxykanamycin B (Formel (I); A=3-Amino-

3-desoxy-«-D-glucopyrano!>yl, B = R = X = Y = H.
(a) Herstellung des 6'-N-Benzyloxycarbonyl-3',4'-di-

desoxykanainycin B

13,53 g (30 mMol) des 3',4'-Didesoxykanamycins (abgekürzt als DKB) in der Form der freien Base werden in 135 ml Wüsser gelöst und zu dieser Lösung werden 5,61 g (3 Mol) Benzyloxycarbonylchlorid innerhalb einer Stunde unter Rühren und Eiskühlen (0 bis 5° C) getropft Nach der Zugabe wird die Mischung weiter für eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt und dann filtriert Das Filtrat wird mit 135 ml Äthyläther gewaschen. Die wäßrige Phase wird mit Ammoniak neutralisiert und unter vermindertem Druck eingeengt Die konzentrierte Lösung wird durch eine Säule mit 480 ml eines Kationenaustauschers (ein Copolymerisat der Methacrylsäure mit Divinylbenzol in der NH₄ + Form) gegeben, um die Adsorption des benzyl ixycarbonylierten DKB am Harz zu bewirken. Das Austauscherharz wird mit 1920 ml Wasser gewaschen und dann mit 0,1 η wäßriger Ammoniaklösung eluiert. 960 ml des ersten Eluats -.verden verworfen, und die darauf folgende Fraktion des Eluats (780 ml) wird gesammelt, eingeengt und gefriergetrocknet um 5,43 g eines farblosen Pulvers von 6'-N-Benzyloxycarbonyl-DKB in einer Ausbeute von 31 % zu ergeben: F. 113 bis 115° C (unter Zersetzung und Schäumen).

(b) Herstellung von l-N-[(S)-2-Hydroxy-4-amino-butyryl]-DKB

4,04 g (6,9 mMol) des ö'-N-benzyloxycarbonyl-DKB werden in 26 ml Wasser gelöst und mit einer Lösung, hergestellt aus 2,94 g (8 mMol) des N-Hydrosuccinimidesters der (S)-2-Hydroxy-4-benzyloxycarbonylaminobuttersäure in 45 ml Dimethoxyäthan, versetzt. Das Gemisch wird 90 min bei Raumtemperatur gerührt und dann zur Trockne eingedampft Der Rückstand wird in Wasser gelöst und durch eine Säule mit 560 g Kieselgel gegeben. Die Elution erfolgte mit einer Lösung von Methanol-Chloroform-17% wäßrigem Ammoniak (4:2:1); die Eluatfraktionen, die nicht-umgesetzte Verbindungen enthalten, werden verworfen. Die Fraktioner, mit den gemischtacylierten Produkten werden gesammelt und zu 5,63 g gemischtacylierter Verbindungen eingeengt, die in einem Gemisch aus 67 ml Essigsäure, 63 ml Methanol und 17 ml Wasser gelöst werden und mit 1,6 g 5%igem Palladium/Kohlenstoff versetzt werden. Das vorstehende Gemisch wird 4 h bei Atmosphärendruck hydriert, um die Benzyloxycarbonylgruppen der acylierten Verbindungen zu

4^r, entfernen. Das Reaktionsgemisch wird vom Katalysator abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck zu 5,2 g des pulverförmigen Acetats der acylierten Verbindungen eingedampft, die 1-N-[(S)-2-hydroxy-4-amino-butyryl]DKB-acetat enthalten. Dieses Pulver wird in Wasser aufgelöst und an 250 ml des vorstehend genannten Kationenaustauscherharzes (in NH₄ ⁺ -Form) adsorbiert. Das Harz wird mit 1000 ml Wasser gewaschen und der Reihe nach mit 0,1 η wäßrigem Ammoniak (850 ml), 0,3 η wäßrigem

Ti Ammoniak (830 ml), 0,63 η wäßrigem Ammoniak (830 ml) und 1 η wäßrigem Arrmoniak (830 ml) eluiert. Die Eluate werden in Fraktionen von je 17 ml gesammelt. Jede Fraktion wird an sich bekannter Weise auf ihre antibakterielle Wirkung unter Verwendung des

ho Bacillus subtilis PC 1219, empfindlich auf DKB, und Eschcrichia coli |R 66/W 677, resistent gegen DKB, als Testmikroorganismen untersucht. 320 ml der Fraktionen, die mit 1 η wäßrigem Ammoniak eluiert wurden und hohe antibukteriellc Wirkung gegcnübei den

h^ri beiden vorstehend genannten Stämmen zeigten, wurden vereinigt und zu 301 mg eines Pulvers eingedampft. Dieses Pulver wurde wieder in Wasser gelöst und an ! 1 ml des vorstehend genannten Kationenaiis-

tauscherharzes (in NH4+-Form) Chromatographien. Die Harzsäuie wurde zuerst mit 40 ml Wasser und dann mit 90 m! 03 η wäßrigem Ammoniak gewaschen und darauf mit 0,75 η wäßrigem Ammoniak eluiert Die Eluatfraktionen, die Ninhydrin-positiv waren und einen einzigen Fleck (R, 0,17) bei der Kieselgel-Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Butanol-Äthanol-Chloroform-17% wäßrigem Ammoniak (4:5:2:5) ergaben, wurden zu einem Gesamtvolumen von 26 ml vereinigt und zu 61 mg eines farblosen kristallienen Pulvers des l-N-[(S)-2-Hydroxy-4-aminobutyryl]-DKB eingedampft.

Ausbeute 1,6%, Zersetzungspunkt 178° C, [«.]% +86,8° (c0,77. Wasser).

Elementaranalyse tür CmHmNsOio:

Berechnet: C 47,8!; H 8,03; N 15,21; O 28,95%;
gefunden: C 47,60; H 8,21; N 14,93%.

B e i s ρ i e I 3

Synthese des l-N-[(S)-2-Hydroxy-4-amino-butyryl]-DKB

6'-N-Benzyloxycarbonyl-DKB (611mg, 1,05 mMol) wird in 3,2 ml Wasser gelöst und zu einer Lösung von 347 mg (1,05 mMol) des N-Hydroxysuccinimidesters der (S)-2-Hydroxy-4-phthalimido-buttersäure in 3,2 ml Dimethoxyäthan gegeben.

Das Gemisch wird wie in Beispiel 2 behandelt, und die Chromatographie an Kieselgel ergab 480 mg der Jo gemischt-acylierten Verbindungen. Die gemischt-acylierten Verbindungen werden in einem Gemisch von 17,5 ml Essigsäure, 14 ml Methanol und 3,5 ml Wasser gelöst, und 120 mg 5% Palladium/Kohlenstoff werden hinzugegeben. Die Lösung wird bei Atmosphärendruck i^r> 2,5 h katalytisch hydriert, um die Benzyloxycarbonylgruppen der acylierten Verbindungen abzuspalten. Das Reaktionsgemisch wird zur Entfernung des Katalysators filtriert und eingedampft; das erhaltene Pulver wird in 15 ml einer 10%igen Hydrazinhydratlösung in 4« Äthylalkohol gelöst. Das Gemisch wird 2 h bei 90⁰C unter Rückfluß gekocht und dann eingedampft. Der so erhaltene Rückstand wird an dem vorstehend genannten Kationenaustauscherharz (in der NH4 + -Form) Chromatographien, wie in Beispiel 2 angegeben, um ·»■> 6 mg weißes Pulver von 1-N-[(S)-2-Hydroxy-4-aminobutyryl]-DKB in l%iger Ausbeute zu erhalten.

^r)0

Beispiel 4

Synthese des 1-N-[(S)-2-Hydroxy-4-aminobutyryl]-DKB

(a) Herstellung des 2',6'-di-N-tert.-Butoxycarbonyl-DKB

5 g (I I mMol) 3',4'-Didesoxykanamycin B, d. h. DKB in Form der freien Base, werden in 550 ml eines Gemischs aus Pyridin, Wasser und Triethylamin (5:3:5) gelöst und dann mit 3,94 g (27,5 mMol) tert.-Butoxycarbonylazid versetzt. Die Mischung wird 18 h «) bei Raumtemperatur gerührt. Das Umsetzungsgemisch wird unter vermindertem Druck bis zur Trockne eingedampft. Der feste Rückstand wird in Wasser gelöst und am 300 ml des vorstehenden Kationenaustauseherhar/es (in der IM H4"¹-Form) Chromatographien, um die ^h"> biitoxycarbonyliertcn Produkte am Harz /11 adsorbieren. Das Auslauscherharz wird mit 100 ml Wasser gewaschen und dann mit 0,l%igem wäßrigem Ammoniak eluiert Solche Fraktionen des Eluats, die einen einzigen Fleck mit positiver Rydon-Smith-Reaktion bei der Hochspannungspapierelektrophorese ergaben, werden vereinigt und eingedampft, um 1,45 g weißes Pulver von 2',6'-Di-N-tert.-äthoxycarbonyl-DKB in 24%iger Ausbeute zu ergeben. Die Harzsäule wird dann mit 0,2%igem wäßrigem Ammoniak eluiert, um 2,98 g des 6'-N-tert.-butoxycarbonyl-DKB zu ergeben.

(b) Herstellung des l-N-[(S)-2-Hydroxy-4-amino-butyryl]-DKB

639 mg (0,98 mMol) des 2',6'-Di-N-terL-butoxycarbonyl-DKB, des Produkts der Stufe (a), werden in einem Gemisch aus 5 ml Wasser und 5 ml Dimethoxyäthan gelöst und mit einer Lösung von 375 mg (1,07 mMol) N-Hydroxysuccinimidester der (S)-2-Hydroxy-4-benzyloxycarbonylamino-buttersäure in 10 ml Dimethoxyäthan versetzt. Das Gemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und dann bis zur Trockne eingedampft. Der feste Rückstand wird in 8 ml 90%iger wäßriger Trifluoressigsäure aufgenommen und 20 Min bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wird mit 5,6 ml Methanol, 0,6 ml Wasser und 334 mg 5% Palladium/Kohlenstoff versetzt. Die Hydrierung wird bei Atmosphärendruck 4,5 h durchgeführt, um die Benzyloxycarbonylgruppen abzuspalten. Das Reaktionsgemisch wird zur Entfernung des Katalysators filtriert und das Filtrat unter vermindertem Druck eingeengt, um 1,70 g eines Pulvers der gemischtacylierten Verbindungen in Form der Trifluoracetate zu erhalten. Dieses Pulver wird dann wie in Beispiel 2 an dem vorstehend genannten Kationenaustauscherharz (in NH4+-Form) Chromatographien. In einer Ausbeute von 20,4% werden 110 mg des 1-N-[(S)-2-Hydroxy-4-amino-butyryl]-DKB als farbloses kristallines Pulver erhalten.

Beispiel 5

Synthese des l-N-[(S)-2-Hydroxy-4-amino-butyryl]-DKB

950 mg (1,62 mMol) 6'-N-Benzyloxycarbonyl-DKB werden in 85 ml eines Gemischs aus Pyridin—Wasser— Triäthylamin (10:10:1) gelöst und mit 256 mg (1,78 mMol) tert.-Butoxycarbonylazid versetzt. Das Gemisch wird 21 h bei Raumtemperatur gerührt und anschließend bis zur Trockne eingedampft, um ein schwach gefärbtes Pulver zu ergeben, das das butoxycarbonylierte 6'-N-Benzyloxycarbonyl-DKB enthält. Dieses Pulver wird ohne Reinigung in einem Gemisch aus 5 ml Wasser und 5 ml Dimethoxyäthan gelöst und dann mit einer Lösung von 623 mg (1,78 mMol) des N-Hydroxysuccinimids der (S)-2-Hydroxy-4-benzyloxycarbonylamino-buttersäure in 20 ml Dimethoxyäthan versetzt. Das Gemisch wird 24 h bei Raumtemperatur gerührt und dann bis zur Trockne eingedampft. Der feste Rückstand wird in einem Gemisch aus 13 ml 90%iger wäßriger Trifluoressigsäure, 9 ml Methanol und 1 ml Wasser gelöst und dann bei Atmosphärendruck 5 h in Gegenwart von 640 ml 5% Palladium/Kohlenstoff hydriert, um die tert.-Butoxycarbonyl- und Benzyloxycarbonylgruppen (Aminoschutzgruppen) zu entfernen. Das Reaktionsgemisch wird zur Entfernung des Katalysators filtriert und unter vermindertem Druck zur Tro. kiic eingeengt. Die so erhaltene feste Substanz wird an dem vorstehend genannten Kationenaustausch^' (in der NH₄ '-Form) gereinigt, um 160 mg l-N-[(S)-2-l Iy-

droxy-4-aminobutyryl]-DKB als farbloses kristallines Pulver in 17,9%iger Ausbeute zu erhalten.

Beispiel 6

Synthese des l-N-[(S)-2-H/droxy-4-amino-

butyryl]-3'-desoxyneamins
(Formel (I): A = B = R=X = H. Y=OH)

100 mg 3'-Desoxyneamin werden in 5 ml eines Gemischs aus Wasser und Dioxan (1 :2) gelöst und mit 230 mg Benzyl-p-nitrophenylcarbonat

(C₆H₅CH₂-OCO-OC₆H₄NO₂)

versetzt. Das Gemisch wird 6 h bei 0°C gerührt und dann an dem vorstehend genannten Kationenaustauscherharz (in der NH₄+-Form) adsorbiert und anschließend mit Wasser-Dioxan (1 :1) gewaschen und dann mit Wasser—Dioxan (1 :1), das 0 Ws 0,1 n-Ammoniak enthält, eluiert. Die Fraktionen des Eluats, die eine positive Ninhydrinreaktion ergaben, wurden gesammelt und vereinigt und anschließend bis zur Trockne eingeengt, um 105 mg einer festen Substanz zu ergeben, die in der Hauptsache aus di-N-benzyloxycarbonyliertem 3'-Desoxyneamin besteht

Die erhaltene Substanz wird in Wasser—Tetrahydrofuran (1 :1) gelöst und mit einer Lösung des aktivierten Esters der (S)-2-Hydroxy-4-N-phthalimido-buttersäure versetzt, die vorher durch Umsetzen von 103 mg der vorstehenden Buttersäure mit 45 mg N-Hydroxysuccinimid und 90 mg Dicyclohexylcarbodiimid \u wasserfreiem Tetrahydrofuran hergestellt wurde. Die Mischung wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und anschließend filtriert. Das Filtrat wird bis zur Trockne eingeengt und die erhaltene Substanz in einer Mischung von Wasser und Dioxan (1 :2) gelöst. Die Lösung wird an dem vorstehend genannten Kationenaustauscherharz (in der NH₄ ⁺-FoHTi) adsorbiert, mit Wasser—Dioxan (1 :1) gewaschen und mit Wasser— Dioxan (1 :1), das Ammoniak in zunehmender Konzentration enthält, eluiert. Die Fraktionen des Eluats, die schwach positiv bei der Ninhydrinreaktion sind, werden gesammelt und vereinigt und bis zur Trockne eingedampft. Der so erhaltene feste Rückstand war das Rohgemisch der acylierten Verbindungen, die das l-N-f(S)-2-Hydroxy-4-phthalimido-butyryl]-Derivat des di-N-benzyloxycarbonylierten 3'-Desoxyneamins enthalten.

Der feste Rückstand wird in 8O°/oigem wäßrigem Äthanol gelöst und mit einer kleinen Menge Hydrazinhydrat versetzt. Die Mischung wird 2 h bei 60° C gerührt, um die Phthaloylgruppe abzuspalten. Das Reaktionsgemisch wird dann zur Trockne eingedampft und der Rückstand in einem Gemisch aus Wasser-Äthanol-Toluol gelöst, wiederum zur Trockne eingedampft, um 85 mg einer festen Substanz zu ergeben, die hauptsächlich ein Gemisch des Di-N-benzyloxycarbonyl-mono-(S)-2-hydroxy-4-amino-butyryl-Derivats des 3'-Desoxyneamins ist. Diese feste Substanz wird in einem Gemisch aus Wasser—Dioxan (1 :3) mit einer geringen Menge Essigsäure gelöst. Die so erhaltene Lösung wird in Gegenwart von 5% P?'ladium/Kohlenstoff hydriert (4 bar), um die Benzyioxycarbonylgruppen aus den acylierten Verbindungen abzuspalten. Das Umsetzungsgemisch wird zur Entfernung des Palladiumkatalysators filtriert und dann das Filtrat bis zur Trockne eingeengt.

Diese feste Substanz wird in Wasser gelöst und an einem schwachen Kationenaustauscherharz (ein handelsübliches dreidimensionales Dextran-Gel, das Carboxymethylreste als schwache kationenaustauschende Gruppen enthält) absorbiert Die Säule mit dem Molekularsieb wird mit einer 0 bis 0,15 η wäßrigen Ammoniaklösung (steigender Konzentration) eluiert. Die Fraktionen des Eluats, die gegen Escherichia coli JR 66/W 677, resistent gegen DKB₁ wirksam sind, werden gesammelt vereinigt und zur Trockne eingeengt, um 32 mg einer festen Substanz zu ergeben. Diese Festsubstanz wird durch Ligandenaustausch-Chromatographie (mit koordinierten Nickelionen) gereinigt Dazu

ίο wurden 35 ml eines handelsüblichen Kationenaustauscherharzes, das aus einem sulfonierten Copolymerisat von Styrol und Divinylbenzol besteht mit 500 ml einer 0.05 molaren Nickelacetatlösung in einer 0,4 η wäßrigen Ammoniaklösung gemischt. Das Gemisch wird 2 h ge-

•5 rührt, um ein tief blaugefärbtes Harz zu ergeben. 17 ml dieses blaugefärbten Harzes werden in eine Säule gefüllt und mit 200 ml 0,1 η wäßrigem Ammoniak gewaschen. Durch diese Harzsäule wird die vorstehende Substanz, gelöst in 0,1 η wäßrigem Ammoniak, gegeben.

Das Harz wird mit 0,1 η bis 0,15 η wäßrigem Ammoniak bei zunehmender Ammoniakkonzentration eluiert. Die Eluatfraktionen, die bemerkenswert aktiv gegen Escherichia coli JR 66/W 677 sind, werden gesammelt und vereinigt und zu 12 ml einer festen Substanz eingedampft, die aus l-N-[(S)-2-Hydroxy-4-amino-butyryl]-3'-desoxyneamin besteht. Dies wird dadurch betätigt, daß 2'-Desoxystreptamin durch die Oxydation dieser festen Substanz mit Perjodsäure und anschließende Hydrolyse gebildet wird. [<%]■/' +86° (c 1, Wasser).

Elementaranalyse für C16H23N5O7 ■ H2O:

Berechnet: C 45,16, H 8,29, N 16,46%;
gefunden: C 45,38, H 8,31, N 16,52%.

Beispiel 7

Synthese des l-N-[(S)-2-Hydroxy-4-amino-butyryl)-

3'-desoxyribostamycin (Formel (1): A = R = X = H,

B = jJ-D-Ribofuranosyl, Y = OH)

Das Verfahren des Beispiels 6 wird mit 100 mg des 3'-Desoxyribostamycins als Ausjjangsverbindung wiederholt. Die Titel-Verbindung wird in einer Ausbeute von 8,3 mg, [<%]?'' + 38° (c 1, Wasser), erhalten.

Beispiele

Synthese des l-N-[(S)-2-Hydroxy-4-amino-butyryl]-

3',4'-didesoxyribostamycin (Formel (I):
A-R = X = Y-H, B=0-D-Ribofuranosyl)

Das Verfahren des Beispiels 6 wird mit 100 mg des 3',4'-Didesoxyribostamycins als Ausgangsverbindung wiederholt. Die Titelverbindung wird in einer Ausbeute von 5 mg, [<x]2f +25° (c 1,8, Wasser), erhalten.

Beispiel 9

Synthese des 1-N-[(S)-2-Hydroxy-4-amino-butyryl)-

3'-desoxykanamycins B (Formel (I): A=3-Amino-

3-desoxy-a-D-glucopyranosyl, B = R = X = H,

Y = OH)

Das Verfahren des Beispiels 6 wird mit 100 mg des 3'-Desoxykanamycins B als Ausgangsverbindung wiederholt. Die Titelverbindung wird in einer Ausbeute von 11,2 mg, [λ]Γ +90° (c 1, Wasser), erhalten.

Elementaranalyse für C22H44N6O11 · H₂O:

Berechnet: C 45,05, H 7,90, N 1432%;
gefunden: C 45,28, H 7,81, N 14,53%.

Beispiel 10

Synthese des l-N-[(S)-2-Hydroxy-4-amino-butyryl]-

3'-desoxy-6'-N-methyIkanamycins B (Formel (I):
A = 3-Amino-3-desoxy-a-D-glucopyranosyl, B = X = H,

R = CH₃₁Y = OH)

Das Verfahren des Beispiels 6 wird mit 3'-Desoxy-6'-N-methylkanamycin B (Herstellung nach »Journal of Antibiotics«, Bd. 25, (1972), Nr. 12, Seiten 743-745) als Ausgangsverbindung wiederholt. 8,1 mg, [a]o+93° (c 1, Wasser), der Titelverbindung werden erhalten.

Beispiel 11

Synthese des l-N-[(S)-2-Hydroxy-4-amino-butyryl]-kanamycins B (Formel (I): A = 3-Amino-3-desoxya-D-glucopyranosyl, B = R = H, X = Y = OH)

(a) Herstellung des
ö'-N-Benzyloxycarbonyl-kanamycins B

5,8 g (12 mMol) Kanamycin B (freie Base) werden in 116ml Wasser gelöst und während lh mit 2,04g (12 mMol) Benzyloxycarbonylchlorid unter Eiskühlung und Rühren umgesetzt. Nach der Zugabe wird das Gemisch 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Das Umsetzungsgemisch wird filtriert, das Filtrat mit 116 ml Äthyläther gewaschen, die wäßrige Phase mit Ammoniak neutralisiert und dann unter vermindertem Druck eingeengt. Die konzentrierte Lösung wird auf 240 ml des vorstehend genannten Kationenaustauscherharzes (in der NH₄ ⁺ -Form) gegeben, um das ö'-N-benzyloxycarbonylierte Kanamycin B an das Harz zu adsorbieren. Die Harzsäule wird mit 960 ml Wasser gewaschen und darauf mit 0,1 η wäßrigem Ammoniak eluiert. Die Fraktionen des Eluats, die bei der Rydon-Smith-Reaktion positiv sind und einen einzigen Fleck bei der Hochspannungspapierelektrophorese geben, werden gesammelt und vereinigt und bis zur Trockne eingeengt. 2,7 g des ö'-N-Benzyloxycarbonyl-kanamycins B werden in 37%iger Ausbeute als weißes Pulver erhalten.

(b) Herstellung des

1 -N-[(S)-2-Hydroxy-4-amino-butyryl]-kanamycins B

815 mg (1,2 mMol) ö'-N-Benzyloxycarbonyl-kanamycin B, das Produkt der vorstehenden Stufe (a), wird in 3,8 ml Wasser gelöst und mit 416 mg (1,2 mMol) des N-Hydroxysuccinimidesters der (S)-2-Hydroxy-4-phthalimido-buttersäure in 4,8 ml Dimethoxyäthan versetzt. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur 1 h gerührt und dann bis zur Trockne eingeengt. Der erhaltene Rückstand wird in Wasser gelöst und auf eine Säule mit 90 g Kieselgel gegeben. Das Kieselgel wird mit Methanol—Chloroform—17% wäßrigem Ammoniak (4 :2 :1) als Entwicklungslösung eluiert Die Fraktionen des Eluats, die die gemischt-acylieiten Verbindüngen enthalten, aber frei von nicht umgesetztem Ausgangsmaterial sind, werden gesammelt, vereinigt und bis zur Trockne eingeengt Die gesammelten 510 mg Substanz bestanden aus den gemischt-acylierten Verbindungen, enthaltend l-N-[(S)-2-Hydroxy-4-phthalbutyryiJ-e'-N-benzyloxycarbonyl-kanamycin B.

Diese Verbindung wird in einem Gemisch aus 17,5 ml Eisessig, 14 ml Methanol und 3,5 ml Wasser gelöst und bei Atmosphärendruck 2,5 h in Gegenwart von 120 mg 5% Palladium/Kohlenstoff hydriert, um die Benzyloxycarbonylgruppe aus den acylierten Verbindungen abzuspalten. Das Umsetzungsgemisch wird zur Entfernung des Katalysators filtriert und das Filtrat unter vermindertem Druck eingeengt. Der so erhaltene Rückstanc wird in 13,9 ml Alkohol und 1,1 ml Hydrazinhydrat ge löst und 2 h auf 85°C unter Rückfluß gekocht, um die Phthalovlgruppe zu entfernen. Das Reaktionsgemiscl· wird unter vermindertem Druck bis zur Trockne eingeengt.

Die erhaltene Festsubstanz wird in Wasser gelöst und auf eine Säule von 30 ml des vorstehend genannten Kationenaustauschers (NH₄ ⁺-Form) gegeben. Das Harz wird mit 150 ml H₂O gewaschen und dann der Reihe nach mit 150 ml 0,1 η wäßrigem Ammoniak, 180 ml 0,3 η wäßrigem Ammoniak und 180 ml 0,5 η wäßrigem Ammoniak eluiert. Das Eluat wird in Fraktionen von je 3 ml gesammelt. Jede Fraktion wird in an sich bekannter Weise auf ihre antibakterielle Wirkung mit Kanamycinn-B-empfindlichem Bacillus substilis PCI 219 und mit Kanamycin-B-resistenten Escherichia coli JR 66/W 677 als Testmikroorganismen geprüft. Die Fraktionen, die durch Elution mit 0,5 η wäßrigem Ammoniak erhalten wurden und eine hohe antibakterielle Wirkung gegen beide vorstehenden Bakterienstämme zeigten und einen einzigen Fleck bei der Dünnschichtchromatographie mit Kieselgel ergeben, werden vereinigt und unter vermindertem Druck bis zur Trockne eingedampft. Mit einer Ausbeute von 1,3% werden 9 mg eines farblosen kristallinen Pulvers erhalten, das l-N-[(S)-2-Hydroxy-4-amino-butyryl]-kanamycin B ist. Zersetzungspunkt 181 bis 183^CC; [«]'/ + 85° (Cl₁Ol, Wasser).

Elementaranalyse für C22H44N6O16:

Berechnet: C 45,20, H 7,59, N 14,38%;
gefunden: C 44,94, H 7,61, N 14,02%.

Beispiel 12

Synthese des
1 -N-[(S)-2-Hydroxy-4-amino-butyryl]-kanamycin B

(A) Herstellung des
2\6'-Di-N-tert.-butoxycarbonyl-kanamycin B

5 g (10,3 mMol) Kanamycin B (freie Base) werden in 516 ml eines Gemisches aus Pyridin—Wasser—Triäthylamin (10:10:1) gelöst und mit 3,7 g (25,9 mMol) des tert-Butoxycarbonylazids versetzt. Die Mischung wird 20 h bei Raumtemperatur gerührt und dann unter vermindertem Druck bis zur Trockne eingeengt. Der erhaltene Rückstand wird in Wasser gelöst und auf eine Säule mit 200 ml des vorstehend genannten Kationenauitauschers (in der NH4⁺-Form) gegeben. Die Harzsäule wird mit 1000 ml Wasser gewaschen und dann mit 0,l%igem wäßrigem Ammoniak eluiert. Die Fraktionen des Eluats, die bei der Rydon-Smith-Reaktion positiv sind und einen einzigen Fleck bei der Hochspannungspapierelektrophorese ergeben, werden vereinigt und bis zur Trockne eingeengt 1,96 g 2',6'-Di-N-tertbutoxycarbonylkanamycin B werden als weißes Pulver erhalten.

(b) Herstellung des
1 -N-[(S)-2-Hydroxy-4-amino-butyryl]-kanamycins B

638 mg (1 mMol) 2',6'-Di-N-tert-butoxycarbonylkanamycin B, das Produkt der vorstehenden Stufe (a), werden in einer Mischung von 5 ml Wasser und 5 ml Dimethoxyäthan gelöst und mit einer Lösung von 413 mg (1,1 mMol) des N-Hydroxysuccinimidesters der (S)-2-Hydroxy-4-benzyloxycarbonylamino-buttersäure in 10 ml Dimethoxyäthan versetzt Das Gemisch wird

18 h bei Raumtemperatur gerührt und anschließend eingeengt, um eine Substanz zu ergeben, die die gemischt-acylierten Verbindungen enthält. Diese Substanz wird in einem Gemisch aus 8 ml Trifluoressigsäure, 5,6 ml Methanol und 0,6 ml Wasser gelöst und in Gegenwart von 400 mg 5% Palladium/Kohlenstoff während 4,5 h bei Atmosphärendruck hydriert, um die tert.-Butoxycarbonyl- und Benzyloxycarbonylgruppen aus den acylierten Verbindungen abzuspalten. Das Reaktionsgemisch wird zur Entfernung des Palladiumkatalysators filtriert und unter vermindertem Druck bis zur Trockne eingedampft. Die erhaltene Substanz wird in 15 ml Wasser gelöst und in ähnlicher Weise wie in Beispiel 11 Chromatographien, unter Verwendung des vorstehend genannten Kationenaustauschers (in der NH,^-Form) und einer wäßrigen Ammoniaklösung als Entwicklungslösung. In 17,8%iger Ausbeute werden 104 mg l-N-[(S)-2-Hydroxy-4-amino-butyryl]-kanamycin B als weißes kristallines Pulver erhalten.

20 Beispiel 13

Synthese des
1 -N-[(S)-2-Hydroxy-4-amino-butyryl]-kanamycins B

6'-N-Benzyloxycarbonyl-kanamycin B (1 g, 1,62 mMol) wird in einem Gemisch aus 85 ml Pyridin — Wasser— Triäthylamin (10:10:1) gelöst, das mit 256 mg (1,78 mMol) tert.-Butoxycarbonylazid versetzt wird. Das Gemisch wird 21 h bei Raumtemperatur gerührt und dann unter vermindertem Druck bis zur Trockne eingedampft. 1,27 g des schwach gelb gefärbten Pulvers enthalten tert.-butoxy-carbonyliertes 6'-N-Benzyloxycarbonyl-kanamycin B. Dieses Pulver wird ohne Reinigung in einem Gemisch aus 5 ml Wasser und 5 ml Dimethoxyäthan gelöst, zu dem anschließend eine Lösung von 623 mg (1,78 mMol) des N-Hydroxy-succinimidesters der (S)-2-Hydroxy-4-benzyIoxycarbonylaminobuttersäure in 20 ml Dimethoxyäthan gegeben wurde. Das Gemisch wird zur Acylierung 24 h bei Raumtemperatur gerührt. Dann wird das Reaktionsgemisch bis zur Trockne eingeengt und die feste Substanz in einem Gemisch aus 13 ml 19%iger wäßriger Trifluoressigsäure, 9 ml Methanol und 1 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird bei Atmosphärendruek in Gegenwart von 640 mg 5% Palladium/Kohlenstoff 5 h hydriert, um die tert.-Butoxycarbonyl- und die Benzyloxycarbonylgruppen aus den acylierten Verbindungen abzuspalten. Das Reaktionsgemisch wird zu Entfernung des Katalysators filtriert; das Filtrat wird anschließend bis zur Trockne unter vermindertem Druck eingeengt. Das erhaltene feste Material wird gelöst und in ähnlicher Weise wie in Beispiel 11 unter Verwendung des vorstehend genannten Kationenaustauschers (NH4 + -Form) Chromatographien. In 18,6%iger Ausbeute werden 176 mg 1-N-[(S)-2-Hydroxy-4-amino-butyryl]-kanamycin B als weißes kristallines Pulver erhalten.

Claims

Patentansprüche:

1. 1- N- [(S)- 2- Hydroxy- 4- amino- butyryl]-neamin-Derivate der a'lgemeinen Formel

NH₂ (S)

NH-CO-CH-OH

(CH₂), (I) NH₂