DE2118636A1

DE2118636A1 - 3-Nucleotide von Lincomycin und deren Analogen, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung in therapeutischen Präparaten

Info

Publication number: DE2118636A1
Application number: DE19712118636
Authority: DE
Inventors: Alexander Demetrios; Coats John Henry; Kalamazoo Mich. Argoudelis (V.StA.)
Original assignee: Upjohn Co
Current assignee: Pharmacia and Upjohn Co
Priority date: 1970-04-20
Filing date: 1971-04-17
Publication date: 1971-11-04
Also published as: GB1298295A; FR2092060A1; BE766008A; FR2092060B1

Description

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DR. JUP. Dr !.-CHEW. WALTER BEIl

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DR. J . S. ül L-CriΕΛΑ. H.-J. WOLFF DR. JL-R. hAN3 CHk. BEIL

623 FRAMKFURT AM MAJN-HÖCHST

ADELÜNSIRASSE 58

2118636 16. April 1971

Unsere Nr. 17 007

The Upjohn Company Kalamazoo, Mich., V.St.A.

3-Nucleotide von Lincomycin und deren Analogen, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung in therapeutischen Präparaten.

Die Erfindung betrifft neuartige antibakterielle Verbindungen der allgemeinen Formel

1 CHt

H \

HO i

V ι/

OH

109345/1941

in der

Y einen -SR-Rest, wobei R einen Alkylrest mit 1 bis 6 C-Atomen darstellt, einen -S-CH₂-CH₂-O-

CjL Jj oder einen -S-CH₂-CH₃-OH-ReSt,

HO
R. H oder einen Cis- oder trans-Hiederalkyl-Rest

mit 1 bis 8 C-Atomen,
R₀ H, einen CH,- oder C₀H^-ReSt, X einen OH-Rest, ein Chlor-, Brom- oder Jodatom

oder einen -OR,-Rest, wobei R, einen Alkylrest

mit 1 bis 6 C-Atomen darstellt, und zwar jeweils

in der (R)- oder (S)-Konfiguration und Z eine Nucleosid-5'-phosphatgruppe, wobei das Mucleo-

sid Adenosin, Guanosin, Cytidin oder Uridin sein

kann, bedeuten,

deren Salze sowie Verfahren zu ihrer Herstellung.

Die Erfindung betrifft insbesondere neue 3-Hucleotide von Lincomycin sowie von deren Analogen und von Celesticetinen.

Beispiele für Alkylreste mit 1 bis 8 C-Atomen sind der "-!ethyl-, Äthyl-, Propyl-, Butyl-, Pentyl-, Hexyl-, Heptyl- und Octyl-Rest sowie deren Isomere.

Die Herstellung der neuartigen Verbindungen erfolgt dadurch, dass man eine Verbindung der Formel I, in der Z in der 3-Stellung des Moleküls Wasserstoff bedeutet (im folgenden als "Stammverbindung" bezeichnet) in das Fermentationsmedium einer Strentomyces-Fermentation und diese Verbindung in ein vorstehend beschriebenes neuartiges 3-Nucleotid überführt. Das erfindungsgemäße Verfahren liefert in unterschiedlichen Mengen auch j5~Phosphatester der 'Stammverbindungen. Diese 3-Phosnr.utester sind leicht von den erfindurnrsgemiGen 3-Nucleotidfn zu unterscheiden,

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INSPECTE0

ι ο 6 ο 6

L·

denn die 3-Phosphate besitzen kein UV-AbSorptionsmaximum und werden auch nicht durch Schlangengift-Diesterase (Tiergift-Phosphodiesterase) oder Milz-Diesterase zur Stammverbindung hydrolysiert. Wie nachstehend noch ausführlich beschrieben, werden die 3-Nucleotide im erfindungsgemäßen Gewinnungsverfahren durch Ultraviolettanalyse und durch Test mit der Schlangengift-Diesterase ermittelt. Die Gift-Diesterase spaltet z.B. Clindamycin-adenylat in Clindamycin und Adenosin-5¹-Dhosphat.

Das anfängliche Vorhandensein von 3-Nucleotiden in Fermentationsbrühen wird durch den nachstehend beschriebenen Test mit alkalischer Phosphatase festgestellt. Dieser Test unterscheidet jedoch nicht zxtfischen 3-Phosphaten und 3-^ucleotiden, so dass die 3-Nucleotide unerkannt blieben, würden nicht, wie vorangehend beschrieben, andere Untersuchungen durchgeführt.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen besitzen zwar iji vitro keine antibakterielle Wirksamkeit gegen S.aureus und Sarcina lutea, doch werden sie bei Verwendung in vivo z.B. gegen S.aureus aktiviert. Diese Aktivierung iri vivo ist wahrscheinlich damit zu vergleichen, daß bei Kontakt der 3~Nucleotid-lincomycin-Verbindung mit alkalischer Phosphatase in vitro die Lincomycin-Stammverbindung entsteht.

Die nachstehend als Ausgangs- oder Stammsubstanz bezeichneten Lincomycin-Verbindungen können nach in verschiedenen Patentschriften, Veröffentlichungen und Patentanmeldungen offenbarten Verfahren hergestellt werden, nämlich:

Lincomycin USA-Patentschrift 3.086.912

mit Bezug auf Formel I,

in der

Y = -SCH₃- bis -SC₆H₁₃-ReSt USA-Patentschrift 3.380.9^2

1 0 9 8 k 5 / 1 9 4 1

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R₁ = eis- oder trans-Alkyl- USA-Patentschrift 3.38O.992 rest bis 8 C-Atome

R₂ = Wasserstoff oder Alkyl- USA-Patentschrift 3.380.992 rest bis 8 C-Atome

X = (S)OH- oder OR,-Rest USA-Patentschrift 3.380.992

X = (R) oder (S) Cl- oder BeIg. Patentschrift 676.202 Br-Atom USA-Patentschrift 3.496.163

X =-(R) oder (S) J-Atom USA-Patentschrift 3.496.163 Celesticetin USA-Patentschrift 2.928.844

Desalicetin USA-Patentschrift 2.851.463

4'-Depropyl-4¹-äthyllincomycin, wobei in der Formel I Y den -SCH-z-Rest, R. trans-A'thyl, R₂ den CH_-Rest und X den (R)OH-Rest bedeutet, ist nach dem Verfahren gemäß Beispiel 1 und 2 der USA-Patentschrift 3.359.164, in der diese Verbindung mit Lincomycin B bezeichnet wird, erhältlich.

l'-Demethyl-l'-äthyllincomycin, wobei in der Formel I Y den -SCH-z-Rest, R. den trans-n-Propyl-Rest, R₂ den Äthyl-, rest und X den (R)OH-Rest bedeutet, ist nach dem Verfahren gemäß Beispiel 1 und 2 der USA-Patentschrift 3.359.163, in der diese Verbindung mit Lincomycin C bezeichnet wird, erhältlich.

I¹-Demethyllincomycin, wobei in der Formel I Y den -SCH,-Rest, R₁ den trans-n-Propyl-Rest, R₂ H und X einen (R)OH-Rest bedeutet, ist nach dem Verfahren gemäß Beispiel 1 der USA-Patentschrift 3.329.568, in der diese Verbindung mit Lincomycin D bezeichnet wird, erhältlich.

Aus der Reihe der vorgenannten Verbindungen ist das 7(S)-Chlor-7-desoxylincomycin derzeit auch unter der allgemeinen Bezeichnung "Clindamycin" bekannt.

Wie bereits ausgeführt, lassen sich die Lincomycin-Stammverbindungen oder deren Analogen sowie das Celesticetin da-

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durch in die 3-Nucleotide der Formel I überführen, daß man die Stammverbindung in eine Streptomyces-Fermentation einarbeitet. So erhält man z.B. Clindamycin-nucleotide nach Zusatz von Clindamycin-hydrochlorid zu einer Fermentation von Streptomyces coelicolor Müller, NRRL 3532.

Die Fermentation für die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen kann in einem wässrigen Mährmedium unt^r submersen aeroben Bedingungen erfolgen. Für die Gewinnung beschränkter Mengen an 3~Nucleotiden können selbstverständlich auch Oberflächenkulturen und Flaschen verwendet werden. Der für die Fermentation verwendete Organismus wird in einem Mährmedium gezüchtet, das eine Kohlenstoffquelle, z.B. ein assimilierbares Kohlenhydrat, sowie eine Stickstoffquelle, z.B. eine assimilierbare Stickstoffverbindung oder eiweisshaltige Substanz enthält. Als Kohlenstoffquelle werden bevorzugt: Glucose, Kochzucker (brown sugar), Saccharose, Glycerin, Stärke, Maisstärke, Lactose, Dextrin, Melasse und dgl. Vorzugsweise zu verwendende Stickstoffquellen sind Maiswasser, Hefe, autolysierte Brauhefe mit Milch-Feststoffen, Sojamehl, Baumwollkernmehl, Maismehl, Milch-Feststoffe, pankreatischer Kasein-Verdauungssaft (pancreatic digest of casein), in Brennereien anfallende Rückstände der Getreidegärung (distillers' solubles), tierische Peptonflüssigkeiten, Fleisch- und Knochenschnitzel und dgl. Es ist vorteilhaft, diese Kohlenstoffe und Stickstoffquellen miteinander zu kombinieren. Spurenmetalle wie Zink, Magnesium, Kobalt, Mangan, Eisen und dgl. brauchen den GSr-Trtedien nicht zugesetzt zu werden, da als Bestandteile des Mediums Leitungswasser und ungereinigte Ingredienzien verwendet werden.

Die Herstellung der erfLndungsgemäßen Verbindung η kann hol jeder Temperatur erfolgen, die zufriedenstellendem Wachstum dor 51tv<iptornyceb-Ku 1 fcur -.iienlLch IfJt₃ heirjpiol«viel.-.-' !'.irischen fhvn

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18 und 40⁰C,, vorzugsweise zwischen etwa 20 und 37°C.

Wird eine vorstehend beschriebene Streptomyces-Permentation zur Herstellung von Nucleotiden von Lincomycin oder von einer seiner vorliegend definierten analogen Verbindungen oder von Celesticetin verwendet, so kann die Lincomycin- oder Celesticetin-Stammverbindung (Nichtnucleotid) vor der Inoculation des Gärmediums zugesetzt werden. Man kann aber auch die Stammverbindung in kleinen Inkrementen während des Fermentationszyklus zusetzten, solange die Zugabe in einem solchen Fermentationszyklus nicht zu spät erfolgt, um die angestrebte überführung der gesamten zugesetzten Stammsubstanz zu erzielen. Die Zeit und die Mengen des Zusatzes der Stammverbindung lassen sich für jede Fermentation dadurch leicht ermitteln, dass man die Stammverbindung zusetzt bis eine gewisse Toxizität auf die Fermentation beobachtet wird, wie z.B. eine Hemmung der 3~ Nucleotid-Bildung. Bei Verbleib von Stammverbindung am Ende des Fermentationszyklus sollten ferner bei darauffolgenden Fermentationen kleinere Mengen Stammverbindung verwendet und/ oder die Zeit des Zusatzes geändert werden.

Da die antibakterielle Wirksamkeit der Stammverbindung gegen §.· lutea in vitro nach ihrer überführung in ein 3-^ucleotid verloren geht, ist das Vorhandensein einer solchen antibakteriellen Restwirksamkeit _in vitro in einer Kultur oder in einem Kulturextrakt 24 Stunden nach Zusatz der Stammverbindung ein Beweis dafür, daß die Fähigkeit der Kultur oder des Kulturextraktes, die Stammverbindung umzuwandeln, überstiegen wurde, oder daß der Gehalt an zugesetzter Verbindung zu hoch war und bei dem überfiihrungsprozess hemmend auf den Γ^τϊ kroorfanismus wirkte. Pie vorstehend cenannte antibakteriell:? '.'irknamkeit _Ln jn_ivro läßt α ich lurch normale mi.krobiolnrisnhf! PLattenprobe raren -len .fflikroor^inlninun Sarcina Tuten erinl ttoln.

BAD ORIGINAL

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Die Isolierung und Reinigung der erfindungsgemäßen Verbindungen kann nach verschiedenen Verfahren erfolgen, so z.B. durch Lösungsmittelextraktion, durch Flüssigkeit-Flüssigkeitsverteilung in einer Craig-Vorrichtung, durch Ionenaustausch-Flüssigkeitsextraktion oder Adsorption an einem geeigneten Adsorbens, wie Kohlenstoff und Säulen-Chromatographie. Nach einem bevorzugten Gewinnungsverfahren werden die neuen 3~ Nucleotid-Verbindungen aus einer Fermentationsbrühe, wie beschrieben durch Filtration isoliert. Das Filtrat gelangt dann über ein geeignetes Absorptionsmittel, wie Aktivkohle oder Amberlit XAD-2 (ein nichtionisches, makroporöses Mischpolymer aus mit Divinylbenzolharz vernetztem Styrol, Rohm and Haas Company). Dieses Harz erhält man durch Suspensionspolymerisation von Styrol/Divinylbenzol-Mischpolymeren in Ge-genwart einer Substanz, die für das Mischpolymerisat ein gutes Lösungsmittel ist (vgl. J.A.C.S-. 8jj_, 306, 1962), um wasserlösliche Verunreinigungen, die die anschließende Chromatographie störend beeinflussen könnten, zu entfernen. Das Harz wird mit einem Gemisch aus Wasser und mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln, wie Wasser und niedere Alkohole, Wasser und niedere Ketone und dgl.eluiert. Das Eluat aus der Kohle oder dem Amberlit XAD-2-Harz gelangt anschließend durch eine Chromatographiesäule, die ein Anionen-Austauschharz, z.B. Dowex-1-(X-Jj) in der Acetat form (Dow Chemical Company, Midland, Michigan) enthält. Fraktionen werden aus der Chromatographiesäule aufgefangen und vor und nach ihrer im folgenden zu beschreibenden Behandlung mit alkalischer Phosphatase auf ihre Wirksamkeit gegen den Mikroorganismus S_. lutea geprüft. Fraktionen, die nach Prüfung mit alkalischer Phosphatase die höchste Wirksamkeit gegen S. lutea entfalten, werden vereinigt, eingeengt und anschließend einer Gegenstrom-Verteilung in einer Craig-Vorrichtung unterworfen, wobei ein Lösungsmittelsystem aus n-Butanol und Wasser (1:1 Vol./Vol.) verwendet wird. Diejenigen Fraktionen, di ο maximale Tlltraviolettabsorption aufweisen und

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die durch Schlangengift-Phosphodiesterase hydrolysiert werden, werden aufgefangen und ergeben ein Präparat, das ein Gemisch aus 3-Nucleotiden enthält. Dieses Gemisch kann durch entsprechende Trennverfahren in die einzelnen 3-Nucleotide getrennt werden.

Bei einem bevorzugten Trennverfahren zur Gewinnung der einzelnen 3-Nucleotide aus einem Gemisch derselben wird eine DEAE-Sephadex-Säulenchromatographie (Pharmacia Pine Chemicals, Inc., Pscataway, N.J., USA oder Pharmacia, Uppsala, Schweden) durchgeführt. Die Säule wird mit Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (THAM)-acetat eluiert. Die Fraktionen werden durch Testen vor und nach ihrer Behandlung auf ihre Wirksamkeit gegen S. lutea mit alkalischer Phosphatase und durch Ultraviolettspektralanalyse bei dem ursprünglichen pH-Wert der Fraktion und bei einem sauren pH-Wert (_ca. 2.0) untersucht. Fraktionen mit biologischer Wirksamkeit gegen i3. lutea nach der Behandlung mit alkalischer Phosphatase und mit Ultraviolettabsorption werden vereinigt. Jede derartige Ansammlung enthält ein einziges 3-Nucleotid zusammen mit anderen unerwünschten Stoffen. Der THAM-acetat-Puffer wird dadurch aus diesen Ansammlungen entfernt, daß man diese Sammelfraktionen über eine Säule leitet, die in Wasser gepacktes Amberlit XAD-2 enthält. Die Säule wird mit Wasser gewaschen und dann mit wässrigem Methanol (ca.. 80 % wässriges Methanol) eluiert. Fraktionen von jeweils etwa 20 ml werden aufgefangen und durch UltraviolettSpektrum analysiert. Fraktionen mit UV-Absorption werden vereinigt und zur Trockne eingeengt. Der verbliebene Rückstand wird in einem niederen Alkohol, z.B. in Methanol gelöst. Nach Vermischung der Lösung mit Äther" erhält man einen Niederschlag aus einer 3-Nucleotid-Verbindung gemäß Formel I. Nach dieser Formel I besteht der 3~ Nucüeotid-Anteil der neuen Verbindungen aus dem 3-(5'-Cytidylat), ?-(5'-Adenyla1:), 3-(5'-Uridylat) und 3-(5^f-Guanylat).

5 /;

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Die Nucleotide können auch durch VerteilungsChromatographie über Diatomeenerde (Dicalite) voneinander getrennt werden, wobei Lösungssysteme aus Wasser und einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel verwendet werden.

Lincomycin-3-nucleotide sowie die 3-Nueleotide der Lincomycin-Analogen sind iri vitro gegen Bakterien praktisch unwirksam. Nachgewiesen werden diese neuen 3-Nucleotid-Verbindungen daher durch Prüfung auf ihre Bioaktivität gegen £5. lutea, nachdem die Proben mit alkalischer Phosphatase behandelt worden sind. Das Reaktionsgemisch besteht beispielsweise aus 0,5 ml (0,5 M) Tris-Puffer mit einem pH-Wert von 8,0, 0,5 ml alkalische Phosphatase (1 mg/ml) in Tris-Puffer (0,5 M) mit einem pH-Wert von 8,0 und 0,05 ml (etwa 50 pg) an Lincomycin-3-nucleotiden. Dieses Reaktionsgemisch wird über Nacht bei 28°C inkubiert.

Streptomyces, die für die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden können, sind z.B.: S. coelicolor 19*15, NRRL 3531; S, coelicolor Müller, MRRL 3532 sowie S. venezuelae, NRRL 3527. Diese Kulturen sind unbeschränkt vom Northern Utilization and Research Division, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, USA erhältlich.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind amphobere Verbindungen, die je nach dem pH der Umgebung in verschiedenen ionischen Formen vorliegen könnea Bei niedrigem pH existieren die Verbindungen in Form des Säureadditionssalzes, bei höherem pH in zwitterionischer Form und bei noch höherem pH in Form eines Metallsalzes. Zu den Säureadditionssalzen gehören solche starker organischer oder anorganischer Säuren, deren pK dem des Phosphats gleichkommt oder unter diesem liegt, wie z.B. Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure und dgl.

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2 ^: I 8636 - ίο -

Säure- und Metallsalze sind z.B. die Alkalimetallsalze (mit Na und K sowie Ammoniak) und die Erdalkalimetallsalze (mit einschließlich Calcium, Magnesium, Zink und Aluminium), wie sie durch Neutralisieren einer Säureform mit der entsprechenden Base wie Ammoniumhydroxid, Natrium- und Kaliumhydroxid o.der -alkoxiden, Calcium- oder Magnesiumhydroxid usw. erhalten werden. Zu den sauren und neutralen Salzen gehören auch Aminsalze, wie sie durch Neutralisation einer Säureform mit z.B. einem basischen Amin entstehen. Beispiele für basische Amine sind Mono-, Di- und Trimethylamine, Mono-, Di- und Triäthylamine, Mono-, Di- und Tripropylamine (in Iso- und Normalform), Äthyldimethylamin, Benzyldiäthylamin, Cyclohexylamin, Benzylamin, Dibenylamin, N,N'-Dibenzyläthylendiamin, Bis-(o-methoxy-phenylisopropyl)-amin und ähnliche niedere aliphatische, niedere cycloaliphatische und niedere araliphatische Amine, die niederen aliphatischen und niederen cycloaliphatischen Reste mit bis zu und einschließlich 8 C-Atomen; heterocyclische Amine wie Piperidin, Morpholin, Pyrrolidin, Piperazin und die niederen Alkyl-Derivate, deren Alkylrest bis 8 C-Atome aufweist wie 1-Methylpiperidin, ^-Äthylmorpholin, 1-Isopropylpyrrolidin, 1,^-Dimethylpiperazin, 1-n-Butylpiperidin, 2-Methylpiperidin und l-Sthyl-2-methylpiperidin; Amine mit wasserlöslich-machenden oder hydrophilen Gruppen wie Mono-, Di- und Triäthanolamine, Äthyldiäthanolamin, n-Butyl-monoäthanolamin, 2-Amino-l-butanol, 2-Amino-2-äthyl-l,3-propandiol, 2-Amino-2-methyl-l-propanol, Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, Phenylmonoäthanolamin, p-tert.-Amylphenyl-diäthanolamin und Galactamin, N-Methylglucamin, N-Methylglucosamin, Ephedrin, Phenylephrin, Epinephrin und Procain, Tetraäthylammoniumhydroxid und Guanidin. Die verschiedenen Formen können austauschbar verwendet werden, doch werden für die meisten Zwecke die zwitterionische Form,

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CH.

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in der R₁, R₂, X, Y und Z die vorstehend genannte Bedeutung haben, sowie die AmmoniumsäLzform bevorzugt.

Gegenstand der Erfindung ist ein Präparat zur therapeutischen Behandlung von Menschen und Tieren, die von darauf ansprechenden, krankheitserregenden Mikroben-Organismen (bakterielle und andere Mikroparasiten) befallen sind, und zur vorbeugenden Behandlung krankheitsgefährdeter Subjekte durch Verabreichung der 3-Nucleotidester oder eines pharmakologisch verträglichen Salzes.

Die arfindungsgemäßen Gemische eignen sich wie Lincomycin und Celesticetin zur Behandlung von Menschen, Vögeln und Tieren mit verschiedenen Krankheitsbildern. Sie stellen ein Mittel zur oralen und parenteralen Verabreichung des therapeutisch wirksamen Bestandteils zur systemischen Behandlung bereit und können für die Therapie von Tonsillitis, Pneumonie, Otitis, Konjunktivitin, Furunkeln, Karbunkeln und anderen bakterien bedingten Infektionskrankheiten beim Menschen verwendet werden. Bei Tieron kann man die Verbindungen prophylaktisch anwenden. Ratten bei ;^jpi el nwoi ne können damit währnvi der Verschickung

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vor Streptococcus viridans geschützt werden. Tiere für den Fleischbedarf können zugunsten erhöhter Gewichtszunahme prophylaktisch behandelt werden.

Säugetiere, die von einer parasitären Protozoenart der Klasse Sporazoa aus der Gattung Coccidia (ein parasitärer Mikroorganismus, der die Krankheit Coccidiose hervorruft) befallen sind, können durch Verabreichung mit den erfindungsgemäfien Verbindungen behandelt werden, z.B.: Rinder, die mit E. zurnii, E. bovis, E. illipsordalis, Schafe und Ziegen, die mit E. parva, E. faurei, Schweine, die mit E. debliecki, E. scabra.und Isospora suic, Hunde und Katzen, die mit Isospora biqemina, Isospora felis, E. canis, E. felini, Geflügel, das mit E. tenella, Kaninchen, die mit E. steedae» E. perforans,und Nerze, die mit E. mustelae infiziert sind.

Die Gemische eignen sich auch zur Behandlung von Krankheiten, die von Mitgliedern der Gattung Mycoplasma verursacht werden. Die am weitesten bekannten Formen sind die PPLO (Pleuropneumonia-ähnliche Organismen) wie M. hominis, M. salivarium, M. mycoides, M. hyopneumonia, M. hyorhinis, M. gallisepticum, M. arthriditis sowie andere Arten, die bei Menschen und Tieren, einschließlich Haustieren wie Schafen, Hundert Rindern, Schweinen, Geflügeln (z.B, Hühner, Truthühner, Enten und Gänse), und Versuchstieren (z.B. Ratten und Mäuse) vorkommen.

Die Verbindungen werden verwendet zur Behandlung von Infektionen der Nieren und anderen Infektionen, wenn L-Formen gramnegativer und grampositiver Bakterien, etwa die L-Formen von P. mirabilis, anwesend sind.

Die vorliegenden 3-Nucleotide und Salze werden in Form fester und flüssiger Dosierungseinheiten für orale und parenterale

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Verabreichung zur Verfügung gestellt, z.B. als Tabletten, Kapseln, Pulver, Körnchen, Pillen, sterile parenterale Lösungen und Suspensionen und orale Lösungen und Suspensionen und Öl/Wasser-Emulsionen.

Pulver werden durch Zerkleinerung der 3~Nucleotide zu einer geeigneten Feinheit und Mischen mit ebenso feinzerteilten Streckmitteln hergestellt. Als Streckmittel können geniessbare Kohlenhydrate wie Stärke oder Lactose verwendet werden. Vorzugsweise ist ein Süßstoff oder Zucker sowie ein Geschmacksstoff vorhanden. Trockengranulate für die Aufbereitung mit Wasser werden unter Verwendung wasserlöslicher Streckmitteln hergestellt. Ein Pulvergemisch aus einem feinzerteilten 3-Nucleotid und einem wasserlöslichen Streckmittel wie Saccharose, Glucose oder dgl. wird mit einem Bindemittel wie Akaziengummi-Mucilago (aciiacia mucilage) oder Gelatinelösung angefeuchtet und dann durch ein Sieb gedrückt, um Körnchen zu bilden, die man trocknen läßt. Vorzugsweise setzt man auch ein Dick- oder Suspensionsmittel, wie Methylcellulose sowie ein Netzmittel und ein Aromaöl zu.

Zur Herstellung von Kapseln wird wie oben beschrieben eine Pulvermischung hergestellt und in geformte Gelatinehüllen gefüllt, Es empfiehlt sich, der Pulvermischung als Adjuvans vor dem Füllen ein Gleitmittel wie Talkum, Magnesiumstearat oder Calciumstearat zuzusetzen.

Für Herstellung von Tabletten stellt man ein Pulvergemisch her, das nass oder trocken granuliert bzw. pressgekörnt, mit einem Gleitmittel versetzt und zu Tabletten verpresst wird. Das Pulvergemisch wird durch Mischen des entsprechend zerkleinerten 3-Nucleotids mit einem Streck- oder Trägermittel wie Stärke, Milchzucker, Kaolin, Dicalciumphosphat und dgl. hergestellt. Zur Granulierung wird das Pulvergemisch mit einem Bindemittel wie Maissyrup, Gelatinelösung, Methylcelluloselösung oder Akazien-

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gummi-Mucilago angefeuchtet und durch ein Sieb gedrückt. Statt der Granulierung kann man das Pulvergemisch auch presskörnen, d.h. durch die Tablettiermaschine schicken und die entstandenen grossen Tabletten (Presslinge) in Körnchen aufbrechen. Damit sie nicht an den Tablettierformen haften bleiben, kann man die Körnchen durch Zugabe von Stearinsäure, ehern StearatsäLz, Talkum oder Mineralöl gleitfähig machen. Das gleitfähige Gemisch wird dann zu Tabletten verpresst. Vorzugsweise kann man die Tabletten mit einem Schutzüberzug aus einer abdichtenden Schellackschicht, einem Überzug aus Zucker und Methylcellulose und einem glatten Belag aus Carnauba-Wachs überziehen.

Oral zu verwendende Flüssigkeiten werden in Form von Dosierungseinheiten wie Syrups und Elixieren bereitgestellt, wobei jeder Teelöffel des Präparats ehe bestimmte Menge zu verabreichenden 3-Nucleotids enthält.

Einen Syrup erhält man durch Dispersion des 3-Nucleotids in einer entsprechenden, schmackhaften wässrigen Saccharoselösung. Elixiere werden in ähnlicher Weise unter Verwendung eines Hydro-alkoholischen Trägers hergestellt. Elixiere eignen sich vorzugsweise zur Verwendung als Trägerstoffe, wenn eine Lösung einer Verbindung gewünscht wird, die in Wasser eine geringe Löslichkeit und in einem wässrig-alkoholichen Medium eine gute Löslichkeit zeigt.

Zur parenteralen Verabreichung kann man Formen steriler flüssiger Dosierungseinheiten herstellen. Bei der Herstellung der parenteralen Form wird eine abgemessene Menge des 3-Nucleotids in eine Ampulle gebracht, die man samt Inhalt sterilisiert und verschliesst. Als Trägerkomponente zxxv Herstellung einer Suspension oder Lösung (je nach der Wasserlöslichkeit der Verbindung) vor der Verabreichung kann eine Ampulle mit sterilem Wasser beigegeben werden. Vorteilhaft kann in dem sterilen

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Wasser ein Suspensionsmittel, Lokalanaesthetikum und Puffermittel gelöst sein.

Eine parenteral anzuwendende Suspension mit verlängerter Wirkung erhält man dadurch, dass man das 3-Nucleotid in einem für parenterale Verabreichung verträgliches pflanzliches öl mit oder ohne zusätzlichen Adjuvantien suspendiert.

Die in der Beschreibung und den Ansprüchen verwendete Bezeichnung "Form der Dosierungseinheit (unit dosage form)" bezieht sich auf physikalisch getrennte, als Dosierungseinheit für den Menschen geeigente Einheiten, die jeweils eine bestimmte, auf die gewünschte Dosis berechnete Menge Wirkstoff in Verbindung mit dem nötigen pharmazeutischen Streckmittel oder Vehikel enthalten. Die Spezifikationen für die neuen erfindungsgemäßen Einheitsdosierungsformen werden diktiert von und sind direkt abhängig von

a) den einzigartigen Eigenschaften des Wirkstoffes und dem zu erzielenden speziellen therapeutischen Effekt,

b) den Beschränkungen, die durch die Technik des Vermischens eines derartigen Wirkstoffes für therapeutische Verwendung gemäss ausführlicher Beschreibung bedingt sind - dies sind Merkmale der Erfindung. Beispiele für geeignete erfindungsgemäße Formen von Dosierungseinheiten sind Tabletten, Kapseln, Pulverpackungen, Körnchen, Oblaten, Teelöffelvoll (teaspoonfuls) und Esslöffelvoll, Tropferdosen (dropperfuls), Ampullen, Phiolen, gesonderte Mehrfache aller ben genannten Formen, und andere hier beschriebene Arten. Die mit geeigneten pharmazeutischen Trägern formulierten Formen von Dosierungseinheit⁷ enthalten in bevorzugten Ausführungsformen je Dosierungseinheit 25 bis 500 mg 3-Nucleotid oder dessen pharmakologisch verträgliche Salze und 5 bis 65 f Gew/Vol für parenteral zu verwendende Präparate.

In welcher Menge das 3-Nucleotid oder dessen Salze zu verab-

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reichen sind, hängt vom Alter und Gewicht des Patienten, den jeweils zu behandelnden Zustand und dem für die Verabreichung gewählten Weg ab. Für. systemische Behandlung werden Dosen von etwa 1 mg/kg/Tag bis etwa 50 mg/kg/Tag bevorzugt.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern, ohne sie einzuschränken. Soweit nicht anders vermerkt, sind alle Prozentangaben auf das Gewicht und alle angegebenen Lösungsmittelgemischverhältnisse auf das Volumen bezogen.

Beispiel 1

Clindamycin-3-nucleotide

A. Fermentation

Mit einer Bodenkultur von Streptomyces Coelicolor Müller, NRRL 3532, wurden mehrere 500 ml Erlenmeyer-Kolben beimpft, die jeweilö 100 ml steriles Keim-Medium (seed medium) folgender Zusanunensetzung enthielten:

Glucose-Monohydrat 25 g/l Pharmamedia 25 g/l

Leitungswasser (q.s.) Rest

Pharmamedia ist ein Baumwollsamen-Mehl für industrielle Zwecke (von Trader's Oil Mill Company, Fort Worth / Texas)

Die Schüttelkolben blieben zur Zucht 3 Tage bei 28°C auf einer Drehschüttelvorrichtung.

Mit 5 ml des so hergestellten Impfmaterials wurden mehrere 500 ml Erlenraeyer-Kolben beimpft, die jeweils 100 ml steriles

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Fermentationsraedium folgender Zusammensetzung enthielten:

Hefe-Extrakt	2,5	g/l
NZ Amin B⁺	5,0	g/l
Glucose-Monohydrat	20	g/l
Natriumnitrat	3	g/i
Dikaliumphosphat	1	g/l
Magnesiumsulfat	0,5	g/l
Kaliumchlorid	0,5	g/l
Perrosulfat	0,01	g/l
Leitungswasser	Rest

⁺(Difco Laboratories, Detroit / Michigan; ein Pepton in Pulverform, das durch die pankreatische Verdauung von Kasein gewonnen wird.)

2k Stunden nach der Beimpfung wurde der Nährlösung im Fermentationskolben 100 mg/1 Clindamyein-hydrochlorid zugesetzt.

Die Gärkolben blieben zur Entwicklung 2k Stunden bei 28⁰C auf einer Drehschüttelvorrichtung. Nach der Transformationsreaktion im Gärkolben wurde nach der Standardkurvenprobe mit S_. lutea die Abnahme der Clindamycin-Wirksamkeit gemessen. In etwa 2k Stunden wurden nahezu 100 % des zugesetzten Clindamycins in eine in vitro antibakteriell inaktive Form übergeführt. Die Probe mit ^. lutea wurde wie folgt durchgeführt: Das Probematerial wurde auf Agar mit Phosphat-Puffer (pH 7,0; 0,1 M) auf pH 6 - 8 eingestellt. Eine Volumeneinheit (0,08 ml) der Lösung, die den zu prüfenden Stoff enthält, wurde auf eine 12,7 mm messende Prüfscheibe gebracht, die anschließend auf eine mit dem Test-Mikroorganismus bekeimte Agarplatte gebracht wurde. Die Schale wurde 18 - 2k Stunden bei 37⁰C inkubiert. Die antibakterielle Wirksamkeit in vitro zeigt sich in einer die Scheibe

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umgebenden Zone der Wachstumshemmung (grown inhibition). Die antibakterielle Wirksamkeit kann quantitativ in Mg (mcg) Stammverbindung (oder Lincomycin bzw. Clindamycin) je ml durch das lineare Verhältnis von log. Dosierung zu Zonendurchmesser (log dose to zone diameter), in bekannter Weise im Vergleich zum Standard, ausgedrückt werden. Die Gegenwart von Clindamycin-3-nucleotiden wird bestimmt, indem man zuerst die inaktive Gärlösung mit alkalischer Phosphatase bei pH 8,0 in Tris-Puffer inkubiert und dann das Reaktionsgemisch wie oben beschrieben gegen S. lutea geprüft.

B. Gewinnung

1) Filtration und Absorption an nichtionischem Harz

Die oben beschriebene Fermentation wurde in entsprechend grösserem Maßstab zur Herstellung von ^90 1 Fermentationsbrühe, die Clindamycin-3-nucleotide enthielt, in einen Fermentationstank übertragen. Um die Clindamycin-3~nucleotide aus der gesamten Fermentationsbrühe zu gewinnen, filtrierte man Brühe zunächst mit 10 kg Diatomeen-Filterhilfe. Der Filterkuchen wurde mit Wasser gewaschen. Die wässrigen Waschlösungen wurden mit der klaren Brühe vereinigt und die vereinigten Lösungen zur Entfernung von wasserlöslichen Verunreinigungen, die die Wirksamkeit der nachfolgenden Chromatographie vermindern, mit einem Adsorbens, wie Kohle oder Amberlit XAD-2 (Rohm and Haas Company) behandelt. Zur Herstellung der Absorptionssäule wurden etwa 22 kg Adsorbens (Amberlit XAD-2) in Wasser aufgeschlämmt. Die Schlämme wurde in eine Glassäule (Innendurchmesser 50,8 mm) gegossen, unter Atmosphärendruck absitzen lassen und dann wurde ablaufen lassen. Die vorstehend beschriebene, mit der Waschflüssigkeit vereinigte klare Brühe wurde mit einer Durchlaufgeschwindigkeit von etwa 1 Liter je Minute durch die Säule geleitet. Die Säule wurde mit Wasser gewaschen, 100 Liter des stam

ORIGINAL IMSPECTED ■>-■ ■"'■ ^' 10 3 8 4 5/1941

- 19 - 21 1 β R 3 R

Waschen benutzten Wassers wurden weggegossen. Die Säule wurde dann mit 120 Liter 60 %-igem wässrigem Methanol (Eluat I) und 100 Liter 95 £-igem wässrigem Methanol (Eluat II) eluiert. Eluat I wurde zur Gewinnung der Clindamycin-3-nucleotide weiterbehandelt, Eluat II wurde weggegossen.

2) Absorption an Ionenaustauschharz

Das vorstehend beschriebene Eluat I wurde an einer Anionenaustausch-Chromatographiesäule chromatographiert. Die Säule wurde mit 22 kg Dowex-1 (X-¹O in der Acetat-Form (Dow Chemical Company, Midland / Michigan) gepackt. Eluat I wurde mit konzentriertem Ammoniumhydroxid auf pH 10,0 eingestellt und die alkalische Lösung über die Chromatographiesäule geleitet. Die verbrauchte Flüssigkeit aus der Säule wurde zur Trockne eingeengt. Die Ausbeute betrug 877 g des Materials, das Clindamycin-3-nucleotide enthielt und als "Material A" bezeichnet wurde. Die Säule wurde dann mit 100 1 Wasser gewaschen und mit 70 1 5 %-igev wässriger Essigsäure eluiert. Die Essigsäure-Eluate wurden eingeengt und das Konzentrat wurde gefriergetrocknet. Man erhielt 89,4 g eines Materials, das Clindamycin-3-nucleotide enthielt und "Material B" genannt wurde.

C. Reinigung

1) Absorption an nichtionischem Harz

Der Hauptteil (776 g) des vorstehend genannten "Materials A" wurde in 1,5 1 Wasser gelöst. Die Lösung wurde mit konzentriertem Ammoniumhydroxid auf pH 7,5 eingestellt und über eine Säule geleitet, die 2 1 Amberlite XAD-2 Harz enthielt. Die Säule wurde mit 6 1 Wasser gewaschen. Die wässrigen Waschlösungen wurden in drei Fraktionen je 2 Liter (W-I, W-2, W-3) aufgefangen. Die Säule wurde dann mit 90 $-igem wässrigem Methanol eluiert. Es

1 0 9 B U b / 1 U 4 1 °«W/MAL iNSP_£oreo

2 1 1 8B3R

wurden 20 ml-Fraktionen aufgefangen und vor und nach der Behandlung mit alkalischer Phosphatase auf die Wirksamkeit gegen Σ3. lutea geprüft. Die Fraktionen mit den Nummern 61 250 wurden vereinigt und zur Trockne eingeengt. Man erhielt 52 g eines Materials, das Clindamycin-3-nucleotide enthielt und das mit "ADA-IO.1" bezeichnet wurde.

Die vorstehend beschriebenen Fraktionen W-2 und W-3 wurden mit den Fraktionen 1 - 60 von der vorstehend beschriebenen Säule aus Amberlit XAD-2 vereinigt und gemeinsam wieder über die gleiche Amberlit XAD-2-Säule geleitet, die zuerst mit 15 1 Wasser (W-I wie oben beschrieben erhalten) regeneriert und dann mit 4 1 absolutem Methanol eluiert wurde. Es wurden 3 Schnitte vorgenommen: Methanol-Fraktion 1=1 Liter, Methanol-Fraktion 2=1 Liter, Methanol-Fraktion 3=3 Liter. Diese Fraktionen wurden vor und nach Behandlung mit alkalischer Phosphatase auf die Wirksamkeit gegen S. lutea untersucht. Aus Methanol-Fraktion 2 wurde zur Trockne eingeengt. Ausbeute 12,63 g eines Materials, das Clindamycin-3-nucleotide enthielt und "ADA-Il.1" benannt wurde.

Die zur Trockne eingeengte Methanol-Fraktion 3 ergab 0,7 g eines Materials, das Clindamycin-3-nucleotide enthielt und mit "ADA-Il.Z" bezeichnetwurde.

Die im vorangehenden hergestellten Präparate "ADA-IO.1", "ADA-11.1" und "ADA-Il.2" wurden zum Präparat ADA-37.1 (61,7 g) vereinigt. Dieses Präparat, das Clindamycin-3-nucleotide enthielt, wurde durch die im folgenden beschriebene Doppelgegenstromverteilung weiter gereinigt.

2) Doppelgegenstromverteilung

Ein Teil des vorstehend beschriebenen Präparates ADA-37.1

109845/1941 ORIGINAL INSPECTED

- 2a -

(21 g) wurde in 100 ml oberer und 100 ml unterer Phase eines Lösungssystems aus n-Butanol/Wasser (1 : 1, VoI/VoI) gelöst. Die Lösung wurde in die Zentralröhren eines Vollglas-Doppelgegenstromverteilers (100 Röhren) eingeleitet. Nach 48 Stufen (transfers) wurden die obere und untere Phase in 50 ml-Franktionen aufgefangen. Insgesamt wurden 100 Stufen ausgeführt. Die aufgefangenen Fraktionen und das Material in den Röhren des Doppelgegenstromverteilers (DGSV) wurden vor und nach der Behandlung mit Alkalischer Phosphatase auf die Wirksamkeit gegen £>. lutea geprüft.

Unter den gleichen Bedingungen wie vorstehend beschrieben wurden 2 weitere Doppelgegenstromverteilungen mit jeweils 21 g des Präparates ADA-37.1 durchgeführt.

In allen drei Verteilungen wurden folgende Sammelfraktionen gebildet:

Sammelfraktion I Kollektor der unteren Phase

Fraktionen Nr. 20 - 50

Sammelfraktion II In der DGSV-Vorrichtung verbliebene

untere und obere Phase

Sammelfraktion III Kollektor der oberen Phase

Fraktionen Nr. 5 - 35

Die Sammelfraktion I aus allen drei Verteilungen wurde zur Trockne eingeengt. Der anfallende Rückstand wurde in absolutem Methanol gelöst und die Lösung mit Äther gemischt. Der entstehende Niederschlag wurde abfiltriert und getrocknet. Die Ausbeute betrug 7»12 g. Dieses Präparat wurde nicht weiter verfolgt.

Die Sammelfraktionen II und III aus allen drei Verteilungen

109845/1941 *^

wurden wie Sammelfraktion I behandelt. Die Ausbeute von Sammelfraktion II betrug 13,6 g und wurde mit "ADA-39.2" bezeichnet, Sammelfraktion III ergab 0,^9 g eines Materials, das die Bezeichnung "ADA-39.3" erhielt. Unwirksamkeit gegen S. lutea vor und Wirksamkeit gegen S. lutea nach der Behandlung mit alkalischer Phosphatase bewiesen, daß die Präparate ADA-39.2 und ADA~39«3 aus weitgehend reinen Clindamycin-3" nucleotiden bestanden. Das Vorhandensein von Clindamycin nach der Behandlung mit Phosphatase wurde durch Dünnschicht-Chromatographie festgestellt.

D) Abtrennung von Clindamycin-3-nucleotiden durch Chromatographie

Die so gewonnenen Clindamycin-3-nucleotide wurden durch Chromatographie an DEAE - Sephadex in die einzelnen Clindamycin-3-nucleotide zerlegt. Das Harz wurde durch etwa einstündiges Aufschlämmen von 500 g DEAE - Sephadex (A-25) mit Wasser hergestellt. Dann wurde das Harz abfiltriert und 2 Stunden mit 0,5n wässriger Natriumhydroxidlösung gerührt. Dann wurde das Harz erneut filtriert, mit Wasser gewaschen, bis der pH-Wert der Waschlauge nahezu neutral war, anschließend 2 Stunden mit 0,5n wässriger Essigsäure gerührt und schließlich gewaschen, bis der pH-Wert neutral war.

Das so hergestellte Harz brachte man in eine Glassäule und liess es unter Atmosphärendruck absitzen. Die Säule wurde mit ¹J 1 Wasser, dann mit 4 1 0,1 ?-iger wässriger Tris-(hydroxymethyD-aminomethan-Lösung (THAM) gewaschen.

Der Ausgangsstoff (ADA-39.2, 13»0 g) wurde in 100 ml Wasser gelöst und der pH-Wert mit konzentriertem Ammoniumhydroxid auf pH 9,0 eingestellt. Diese Lösung wurde dann auf die Säule (am Kopfteil) gebracht, die nacheinander wie folgt eluiert wurde:

109845/1941

-23- 2:18636

1) 15 1 0,05-molares THAM-acetat (Herstellung: 6,05 e THAI τ wurden in 800 ml Wasser gelöst, der pH-Wert mit Eisessig auf pH 8,0 eingestellt und dann das Volumen auf 1 Liter gebracht)

2) 40 1 0,1-molarer THAM-acetat-Puffer, pH 8,0

3) 20 1 0,2-molarer THAM-acetat-Puffer, pH 8,0 l») 20 1 0,3-molarer THAM-acetat-Puffer, pH 8,0.

Es wurden 20 ml-Fraktionen gesammelt. Folgende Fraktionen wurden mit den einzelnen Puffern erhalten:

0,05-molarer Puffer - Fraktionen 1 0,1-molarer Puffer - Fraktionen 723 - 2920 0,2-molarer Puffer - Fraktionen 2921 - 3985 0,3-molarer Puffer - Fraktionen 2985 - 5000

Ausgewählte Fraktionen wurden durch Prtfung der Wirksamkeit gegen S. lutea vor und nach der Behandlung mit alkalischer Phosphatase und durch UV-Spektren von der aus der Säule auslaufenden Flüssigkeit - einmal wie es erhalten wurde und einmal bei saurem pH-Wert (ca. 2,0) - untersucht.

Folgende Sammelfraktionen wurden gebildet: SaBooelfraktion 1

Fraktionen 850 - 965
Volumen ca. 2300 ml

109845/19 4

neutral, pH 7,0

sauer, pH 2,0 basisch, pH 11,0

18636

X» max. (a)

270 (3,72) 279 (5,40)

271 C3,72)

Sammelfraktion II

Fraktionen	1240 - 1535	7,0	λ	max.	(a)
Volumen	ca. 5200 ml	,0	261	(11	,4)
ITV ·	neutral, pH	11,0	255	(11	,25)
UV»	sauer, pH 2		258	(11	,25)
	basisch, pH

Sammelfraktion III

Fraktionen	1550 - 1680	7,0	X	max	. (a)
Volumen	2600 ml	,0	262	(3	,60)
TTV ·	neutral, pH	11,0	262	(3	,64)
uv·	sauer, pH 2		261	(2	,82)
	basisch, pH

Sammelfraktion IV

Fraktionen	1771 - 2125	7,0	X	max	. (a)	278
Volumen	7000 ml		254	(3	,74):Schulter	278
UV:	neutral, pH	,0	254	(3	,66):Schulter
		11,0	264	(3	,20)·
	sauer, pH 2
	basisch, pH

a) ISOLIERUNG DES IN DER SAMMELFRAKTION I VORHANDENEN CLINDAMYCIN-3-(5'-CYTIDYLAT) DURCH CHROMATOGRAPHIE

Die Säule wurde aus 150 ml Amberlit XAD-2 hergestellt. Die

109845/1941

vorstehend genannte Saramelfraktion I wurde mit einer Geschwindigkeit von 6 ml/Minute über die Säule geleitet. Der Austrag wurde in 116 Fraktionen von je 20 ml aufgefangen. Sämtliche Fraktionen zeigten kein UV-Maximum und wurden verworfen. Die Säule wurde dann mit 900 ml Wasser gewaschen (Fraktionen 117 - l6l). Die Waschlauge wurde ebenfalls verworfen. Anschließend eluierte man die Säule mit 80 Ji-igem wässrigem Methanol. Die UV-Analyse der Fraktionen erbrachte folgende Ergebnisse:

Fraktion Nr. A.max. (a)

162 Kein UV-Maximum

163 Kein UV-Maximum

164 Kein UV-Maximum

165 Kein UV-Maximum

166 Kein UV-Maximum

167 271 (9,9)

168 271 (161,8)

169 271 (168,0)

170 271 (61,6)

171 271 (19,4)

172 271 (3,6)

173 271 (1,0)

174 271 (0,3)

175 271 (0,15)

Die Fraktionen I67 - 172 wurden vereinigt. Die Lösung wurde zu einem wässrigen Konzentrat eingedampft und gefriergetrocknet. Man erhielt 750 mg Clindamycin-3-(5'-cytidylat).

500 mg dieses Präparates wurden in 5 ml Methanol gelöst und die Lösung mit Xther gemischt. Man erhielt ¹JOO mg Clindamycin-3-(5^f-cytidylat) folgender Formel:

109845/1941

CH.

CH

H-C-Cl

CONH ΌΗ

SCH.

OH

CH₂CH₂CH

NH,

.0

Z =

ti

P-O-CH OH

II

OH OH

109845/1941

118B3G

Analytische Daten Für C₂₇H₁₁₅N₅O₁. berechnet:

gefunden:

C 44,48; H 6,17; N 9,60;
0 26,39; S 4,39; Cl 4,87; P 4,25.

C 45,62, 45,86; H 6,99, 7,63; N 9,80; S 3,61; Cl 3,90, 4,04; P 3,44.

Molekulargewicht

verechnet: 729,5

gefunden: 742 (Dampfdruck-Osmometrie in Methanol).

Potentiometrische Titration

In Wasser: pKa^f 7*7

Äquivalentgewicht (eg. wt.) 587

Spezifische Drehung

, +61 (c, 1, Wasser)

Infrarot-Spektrum: Die Infrarot-Spektren sowohl in

Mineralöl-Mull als auch in KBr-Tabletten sind folgende:

fNSPECTED

109845/1941

In Mineralöl-Mull

Bandenfre-

Inten- Bandenfre-

Inte«- Bandenfre-

Inten-

— 1 —1 —1

quenz (em ) sität quenz (cm ) sität quenz (cm ) sität

3340	(öl)	S	In	1490	S	992	S
3240	(öl)	S	1455 (öl)	S	967	M
2930	(Sch)	S	1375 (öl)	S	933	M
2860		S	1365 (Sch)	S	886	S
2730		M	1282	S	853	M
1717	(Sch)	M	1215	S	805 (Sch)	M
1650		S	1095	S	787	S
1610		S	IO7O	S	720 (öl)	S
1520	S	1050	S
	KBr-Tabletten

Bandenfre	Inten	Bandenfre-'	Inten	Bandenfre-	Inten
quenz (cm~ )	sität	quenz (cm )	sität	quenz (cm )	sität
3400	S	1530 (Sch)	M	1045	S
3210	S	1520	S	990	M
3100 (Sch)	S	1490	S	965	M
2955	S	1455	M	930	M
2925	S	1395	M	882	M
2870	M	1380	M	850	M
2790	M	1286	M	800 (Sch)	M
1640	S	1215	S	785	M
1615	S	1083	S	700	M
1575 (Sch)	M	1065	S

Die Banden-Intensitäten in den vorliegend angegebenen Infrarot-Spektren sind mit "S", "M" bzw. "W" bezeichnet und werden annähernd in Beziehung zur Hintergrundabsorption in der Umgebung

109845/1941

der Banden angegeben. Eine "S"-Bande besitzt die gleiche Intensität wie die stärkste Bande im Spektrum. "M"-Banden haben eine Intensität, die zwischen einem Drittel und zwei Dritteln der Intensität der stärksten Bande lieg; die "W"-Banden besitzen eine Intensität von weniger als ein Drittel der Intensität der stärksten Bande.

Diese Beurteilungen werden auf der Basis einer prozentualen Durchlässigkeits-Skala durchgeführt. Der Vermerk "Sch" verweist auf eine"Schulter".

UV-Spektrum in Wasser bei den folgenden pH-Werten:

	,0	/\max.	Enzymen	α	,16	ε	600
pH 2	,0	279	13	,37	9	835
pH 7	,0	269	9	,10	6	638
pH 11	mit	271	9		6
Reaktionen

Rohe alkalische Phosphatase

Eine Behandlung mit alkalischer Phosphatase ergab Clindamycin, das durch Dünnschicht-Chromatographie (Silikagel, Äthylacetat-Aceton-Wasser [8:5:1, Vol/VolD ) identifiziert wurde.

Tiergift-Diesterase

Die Behandlung mit Tiergift-Diesterase ergab mittels Dünnschicht-Chromatographie identifiziertes Clindamycin (wie vorstehend). Neben Clindamycin wurde Cytidin-5'-phosphat gebildet.

109845/1941

b) ISOLIERUNG VON IN SAMMELFRAKTION II VORHANDENEM
CLINDAMYCIN-3-(5'-ADENYLAT) DURCH CHROMATOGRAPHIE

Die Säule wurde aus ¹IOO ml Amberlit XAD-2 hergestellt. Die
Sammelfraktion II wurde mit einer Geschwindigkeit von 15 ml/ Minute über die Säule geleitet. Die Säule wurde mit 4 1 Wasser gewaschen. Weder die Waschlauge noch der Austrag zeigten UV-Maxima, beides wurde daher verworfen. Die Säule wurde mit 80 #-igem wässrigen Methanol eluiert. Die UV-Analyse der Fraktionen hatte folgende Ergebnisse:

Fraktion Nr.

10 12 14

15 16 17 18

19 20 21 22

23

24

25 26 27 28 29 30

31 32 33

Amax. (a)

260 Kein Maximum 26O (0,18) 26O (0,46) 260 (0,47) 260 (230,0) 260 (632) 260 (628) 260 (540) 260 (405) 260 (280) 260 (230) 260 (135) 26O (80) 260 (55) 260 (31,5) 260 (26,4) 260 (12,8) 260 (9,0) 260 (5,5) 260 (3,65) 260 (2,60) 260 (2,0) 260 (1,55)

109845/1941

Die Fraktionen 15 - 21 wurden vereinigt und die Lösung wurde mit 1500 ml Aceton gemischt. Der Niederschlag wurde aufgefangen und getrocknet und ergab 2,1 g Clindamycin-3-(5'-adenylat) folgender Strukturformel

SCH.

III

CH₂CH₂CH

NH,

N'

Z *

O tr,

•P-O-CH-i . 2

OH

OH OH

109845/1941

Clindamycin^-(5'-adenylat) besitzt folgende chemischen und physikalischen Eigenschaften:

Analytische Daten
Für C₂₈H₁₁₅N₇O₁

berechnet: C M,63; H 6,05; N 13,07; S 4,28; Cl 4,72; P 4,11

gefunden: C 44,77; H 6,66; N 12,57; S 4,65; Cl 4,38; P 3,52. ί

Molekulargewicht

Für C₂₈H₄₅N₇O₁₁PSCl

berechnet: 753,5

gefunden: 726 (Dampfdruck-Osmometrie in Methanol)

Potentiometrieche Titration

In Wasser: pKa' 7,6

Äquivalentgewicht 620

Spezifische Drehung: Ca] ^ , +62,9° (c, 1,04, Wasser) Infrarot-Spektrum in Mineralöl-Mull und KBr-Tabletten:

10.9 8 45/ 1 94

In Mineralöl-Mull

Bandenfre- Inten- Bandenfre- Inten- Bandenfre- Inten-

—1 —1 —1

quenz (cm ) sität quenz (cm ) sität quenz (cm ) sität

3300	S	1470	(Sch)	S	1065	S
3240	S	1450	(öl)	S	1050	S
2940 (öl)	S	1445	(Sch)	S	987	S
2920 (öl)	S	1435	(Sch)	S	965	S
2845 (öl)	S	1417		S	927	M
1680 (Sch)	S	1373	(öl)	S	885	S
1653	S	1363	(Sch)	S	853	M
1635	S	1327		S	817	M
1595	S	1298		S	795	S
1570	S	1245	(Sch)	S	717 (öl)	S
1510	S	1215		S

In KBr-Tabletten

Bandenfre- Inten- Bandenfre- Inten- Bandenfre- Inten-

■*1 —1 —1

quenz (cm ) sität quenz (cm ) sität quenz (cm ) sität

3340	S	1637	S	1313	S
3270	S	1593	S	1085	S
3220 .	S	1570	M	1065	S
2950	M	1510	M	1045	S
2920	S	1470	M	986	M
2865	M	1453	M	927	M
1682	S	1415	M	885	M
I675	S	1375	M	852	M
I66O	S	1325	M	815	M
1650	S	1295	M	795	M
1645	S	1245 (Sch) _λ	M	717	M
		10 9 8 4 5/1941

2113636

UV-Spektrum in Wasser bei den folgenden pH-Werten:

	2	,0	Xmax.	16	C	£	628
pH	7	,0	257	16	,76	12	56Ö
pH	11	,0	261	16	,67	12	711
pH		261	,87	12

Reaktionen mit Enzymen
Rohe alkalische Phosphatase

Die Behandlung mit alkalischer Phosphatase ergab Clindamycin, das durch Dünnschicht-Chromatographie (Silikagel, Äthylacetat-Aceton-Wasser C 8:5:1, Vol/Vol3 identifiziert wurde

Töffgift-Diesterase

Die Behandlung mit Tiergift-Diesterase ergab Clindamycin und Adenosin-5'-phosphat.

Wirksamkeit in vivo

Clindamycin-3-(5'-adenylat) ist in vitro gegen S. lutea antibakteriell unwirksam. In vivo zeigt es jedoi keit von 30 mg/kg (Mäuse, S.Q., S. aureus).

bakteriell unwirksam. In vivo zeigt es jedoch eine CD,-₀-Wirksam-

c) ISOLIERUNG VON IN SAMMELFRAKTION III VORHANDENEM CLINDAMYCIN-3" ( 5'-URIDYLAT) DURCH CHROMATOGRAPHIE

Die Säule wurde aus 150 ml Amberlit XAD-2 hergestellt. Die Sammelfraktion III wurde mit einer Geschwindigkeit von 10 ml/Minute über die Säule geleitet. Die Säule wurde mit 1 Liter Wasser ge-

109845/1941

-^ ■) ίΐ 4 < Γ. Λ ft :1

c \ ι ö 6 3 b

waschen. Weder die wässrige Waschlauge noch der Austrag zeigten UV-Maxima. Die Säule wurde dann mit 80 55-igem wässrigen Methanol eluiert. Die UV-Analyse der Fraktionen hatte folgende Ergebnisse:

Fraktion Nr* Xmax. (a)

2 Kein Maximum

4 261 (0,25)

5 261 (0,97)

6 261 (107)

7 261 (248)

8 261 (75)

9 261 (18)

10 261 (2,5)

11 261 (0,87)

Die Fraktionen 6-9 wurden vereinigt und die Lösung wurde zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde in Methanol gelöst und die Lösung mit Äther gemischt, wobei ein Niederschlag entstand; man erhielt 7¹IO mg Clindamycin-3" (5 '-uridylat) mit folgender Strukturformel

R₁ = CH₂CH₂CH

IV

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ο 5^f ζ = -p-o-Ch

OH

OH OH

Clindamycin-3-(5'-ui»idylat) besitzt folgende chemischen und physikalischen Eigenschaften:

Analytische Daten

berechnet:

gefunden:

Molekulargewicht

C M,27; H 6,33; N 7,68; 0 28,49; S 4,39; Gl 4,86; P 4,24

C 44,62; H 6,19; N 7,79; S 4,04; Cl 4,32; P 4,22.

berechnet: gefunden:

732,5

764 (Dampfdruck-Osmometrie in Methanol)

109845/1941

Potentiometrische Titration

In Wasser pKa¹ 7,6

Äquivalentgewicht

Spezifische Drehung: Ca] ²^ , +79,5° (c-, 0,99, Wasser) Infrarot-Spektrum in Mineralöl-Mull und KBr-Tabletten:

In Mineralöl-Mull

Bandenfre-	Inten	Bandenfre	Inten	Bandenfre	Inten
quenz (cm )	sität	quenz (cm )	sität	quenz (cm )	sität
3330	S	1660 (Sch)	S	1060	S
3080	S	1545	S	990	S
2950 (öl)	S	1515	S	885	S
2920 (öl)	S	1455 (öl)	S	850	S
2840 (öl)	S	1375 (öl)	S	810	S
1750 (Sch)	M	1260	S	763	S
1680	S	1215	S	720 (öl)	S

In KBr-Tabletten

Bandenfre-^, Inten- Bandenfre-₁ Intenquenz (cm ) 4%$&p_r quenz (cm" ) sität

Bandenfre^ Inten· quenz (cm ) sität

3410	(Sch)	S	1685
3260		S	1512
3100		M	1458
2960		S	1380
2920		S	1260
2865		M	1215
2800	(Sch)	M	1085
1700	S	1060

S M M M S S S S

990
965
883
850
808
760
705

M M M M M M M

1098A5/1941

- 38 - 2 ': 1 8636

UV-Spektrum in Wasser bei den folgenden pH-Werten:

λmax. a_ £

pH 2,0 261 11,18 8 189

pH 7,0 262 11,44 8 379

pH 11,0 262 8,90 6 519

Reaktion mit Enzymen

Rohe alkalische Phosphatase

Die Behandlung mit alkalischer Phosphatase ergab Clindamycin, das durch Dünnschicht-Chromatographie (Silikagel, Äthylacetat-Aceton-Wasser [ 8:5:1, VoI/VoI3 ) identifiziert wurde.

Tiergift-Diesterase

Durch Behandlung mit Tiergift-Diesterase entstand Clindamycin und Uridin-5*-phosphat.

Wirksamkeit in vivo

Clindamycin-3-(5'-uridylat) ist in vitro gegen Sarcina lutea antibakteriell unwirksam. In vivo zeigt es jedoch eine Wirksamkeit mit einem CD,_₀-Wert von 37 mg/kg (S.Q., Mäuse, S_. aureus).

d) ISOLIERUNG VON IN SAMMELPRAKTION IV VORHANDENEN CLINDAMYCIN- 3-(5^f-GUANYLAT) DURCH CHROMATOGRAPHIE

Die Säule wurde aus 200 ml Amberlit XAD-2 hergestellt. Die Sammelfraktion IV wurde mit einer Geschwindigkeit von 20 ml/Minute

109845/1941

**> 1 Ί Λ

8636

über die Säule geleitet. Die Säule wurde mit 3 1 Wasser gewaschen. Weder die wässrige Waschlauge noch der Austrag zeigten UV-Maxima. Die Säule wurde mit 80 ϊ-igem wässrigem Methanol eluiert; die UV-Analyse der Fraktionen ergab folgende Resultate:

Fraktion Nr.

2 H 6 7 8

10 11 12 13 14

7V.Max. (a)	Maximum	(⁺Schulter)
Kein	Maximum	278
Kein	(0,56); Sch	278
254	(260); Sch	278
254	(740); Sch	278
254	(400); Sch	278
254	(168); Sch	278
254	(50); Sch	278
254	(11,5); Sch	278
254	(3,2); Sch	278
254	(1,16); Sch
254

Die Fraktionen 7-10 wurden vereinigt und die Lösung mit 1 Liter Aceton gemischt. Der entstehende Niederschlag ergab 1,2 g Clindaraycin-3-(5'-guanylat) mit folgender Strukturformel:

H-C-Cl

CONH

-CH

NT i/l

109845/1941

CH₂CH₂CH

OH

S 5·
-P-O-CH
t

OH

OH OH

Clindamycin-^-(5*-guanylat) besitzt folgende chemischen und physikalischen Eigenschaften: .

Analytische Daten

C₂₈H₁₁₅N₇O₁₂PSCl

berechnet: . C 43,71; H 5,85; N 12,74;

0 25,00; S 4,16; Cl 4,61; P 4,03

gefunden: C 43,69; H 6,34; N 11,62;

S 3,63; Cl 4,15; P 3,81.

Molekulargewicht

berechnet:
gefunden:

769,5

750 (Dampfdruck-Osmometrie in Methanol)

1098A5/19A1

Potentiometrische Titration

In Wasser:	Ir	pKa· 7,6	Inten	Inten	0, Wasser)	Inten
	Inten		sität	sität	i KBr-Tabletten:	sität
	sität		S	S		S
Spezifische Drehuni?:	S	Äquivalentgewicht 721	S	M	Bandenfre-	M
Infrarot-Spektrum	S	ία} ²g , +69°	M	M	—1 quenz (cm )	M
	S	' (c, 1,	S	M	1050 (Sch)	M
Bandenfre	S	in Mineralöl-Mull und	S	M	987	S
quenz (cm~ )	S	ι Mineralöl-Mull	M	M	963	M
3330	S	Bandenfre	S	M	925	M
3220	S	quenz (cm )	S	S	885	M
2920 (öl)	S	1530	S	S	855	M
2845 (öl)	S	1457	S		795	M
1684	S	1409	In KBr-Tabletten	780
1675		1375 (öl)	Bandenfre-	717 (öl)	Inten
1635	Inten	1365	—1 quenz (cm )	680	sität
1630	sität	1315	1570		S
1595	S	1250 (Sch)	1530	Bandenfre	S
1565	S	1215	1450	quenz (cm )	M
	S	1080 (Sch)	1405	IO65	M
Bandenfre	S	IO65	13 80	1045	M
quenz (cm)	S	1355	985	M
3420	S	1255 (Sch)	925	M
3240 (Sch)	S	1210	885	M
2950	S	1080	855
2920	S	109845/1941	800
2865	78Ο
1685
1635
I63O
1595

W-Spektrum in Wasser bei den folgenden pH-Werten:

_/JLmax. & £

pH 1,0 pH 7,0 pH 11,0

256 277	Sch	14,49 9,69	11 7	150 456
254 273	Sch	■16,18 11,21	12 8	45O 626
259 266		13,95 13,78	10 10	734 603

Reaktion mit Enzymen

Rohe alkalische Phosphatase

Eine Behandlung mit alkalischer Phosphatase ergab Clindamycin, das durch Dünnschicht-Chromatographie (Silikagel, Äthylacetat-Aceton-Wasser [ 8:5:1, Vol/Vol] ) identifiziert wurde.

Tiergift-Diesterase

Die Behandlung mit Gift-Diesterase ergab Clindamycin und Guanosin-5'-phosphat.

Wirksamkeit in vivo

Clindamycin-3-(5'-guanylat) ist in vitro gegen Sarcina lutea antibakteriell unwirksam. In vivo zeigt es jedoch eine Wirksamkeit mit einem CD_c/~-Wert von 26 mg/kg (S.Q., Mäuae, S. aureus).

tju — —

10984S/1941

Beispiel 2;

Verwendete man anstelle des in Beispiel 1 eingesetzten Mikroorganismus S. coelicolor Miller MRL 3532 den Mikro Organismus Streptomyces venezuelae NREL 3527t erhielt man die Clindamyein-3-nucleotide gemäß Beispiel 1«

Beispiel 3:

Verwendete man Lincomycin anstatt Clindamycin im Fermentationsmedium in Beispiel 1, so wurden Lincomycin-3-nucleotide mit den gleichen Nucleotid-Anteilen wie in Beispiel 1 erhalten.

Beispiel 4:

Mit l'-Demethyl-clindamycin anstelle von Clindamycin im Fermentationsmedium von Beispiel 1 wurden l'-Demethylclindamycin-3-nucleotide mit den gleichen Nucleotid-Anteilen wie in Beispiel 1 erhalten.

Beispiel 5:

.Mit l'-Demethyl-4'-depropyl-4'-pentyl-clindamycin anstelle von Clindamycin im Fermentationsmedium von Beispiel 1 wurden 1·-Demethyl-4'-depropyl-4'-pentyl-clindamycin-3-nucleotide mit den gleichen Nucleotid-Anteilen wie in Beispiel 1 erhalten.

109845/194

Beispiel "-6 j.

Mit 4^f-Depropyi-4'-ätb.yl-lineomycin anstelle von Clindamycin im lermentationsmedium von Beispiel 1 wurden 4'-Deprapyl-4'-äthyl-lincomycin-3-nucleotide mit den gleichen Kueleotid-Anteilen wie in Beispiel 1 erhalten.

Beispiel 7 t

Mit l'-Demethyl-l'-äthyl-lincomycin anstelle von Clindamycin im Fermentationsmedium von Beispiel 1 wurden 1'-Demethyll'-äthyl-.lincomycin-3~nucleotide mit den gleichen Nucleotid-Anteilaci wie in Beispiel 1 erhalten.

Beispiel 8t

Mit l'-Demethyl-lincomyein anstelle von Clindamycin im Fermentationsmedium von Beispiel 1 wurden l^f-Desmethyl-lincomycin-3-nucleotide mit den gleichen Nucleotid-Anteilen wie in Beispiel 1 erhalten.

Beispiel 9t

Mit Celesticetin anstelle von Clindamycin im Fermentationsmedium von Beispiel 1 wurden Celesticetin-3-nucleotLde mit den gleichenNucleotid-Anteilen wie in Beispiel 1 erhalten.

109845/1

In den folgenden Beispielen sind, wie in den vorhergehenden Beispielen auch, die Nucleotid-Anteile der Verbindungen der Beispiele die gleichen wie in Beispiel 1 beschrieben, nämlich Gytidylat, Adenylat, Uridylat und Guanylat.

Beispiel 10;

Lincomycin-3-nucleotid-ammoniumsalz.

Bin Lincomycin-3-nucleotid in zwitterionischer Form wurde in einer kleinstmöglichen Menge Wasser gelöst und mit der gleichen Menge Methanol verdünnt. Die Lösung wurde im Eis-Wasserbad gekühlt, dann mit Ammoniakgas gesättigt und bei 30 C unter starkem Vakuum zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wurde in einer kleinstmöglichen Menge Methanol gelöst und mit dem fünffachen Volumen Äther verdünnt, wobei das Lincomycin-3-nucleotid als Ammoniumsalz ausfiel.

Beispiel 11;

Wässriges oral in Form von Tropfen zu verabreichendes Präparat .

Ein Lincomycin-3-nucleotid 100 g

Propylparaben 0,25 g

Methylparaben 0,75 g

Sorbinsäure 1,0 g

4 η wässriges Hatriumhydroxid in der für die Einstellung auf pH 7,5 erforderlichen Menge

Entionisiertes Wasser zum Auf -

füllen auf 1000 ml

109845/19A 1

Beispiel 12?

Syrup.

Aus folgenden Bestandteilen wurde ein wässriges Präparat zur oralen Verabreichung, das in je 5 ml 400 mg eines Lincomycin-3-nucleotids enthielt, aus folgenden Bestand teilen hergestelltj

Lincomycin-3-nucleotid 800 g

Methylparaben, (U.S.P.) 7,5 g

Propylparaben (U.S.P.) 2,5 g

Sorbinsäure 10 g

Saccharin-Natrium 6,5 g

Glycerin 3000 ml

Tragacant-Pulver 100 g

Orangenöl-Aroma 10 g

P.D. und C. Orangen-Farbstoff 7,5 g

4n wässriges Natriumhydroxid in erforderlicher Menge, um auf pH 7,5 einzustellen

Entionisiertes Wasser zum Auffüllen auf 10 000 ml

Anstelle eines Lincomycin-3-nucleotids gemäß Beispiel 11 und 12 können auch ein 7(S)-ChIor-7-desoxylincomycin-3-nueleotid oder wasserlösliche Salze eines 7(S)-Ghlor-7-desoxylincomycin-3-nucleotids, z.Bspl. die Alkalimetallsalze einschließlich des Ammoniumsalzes, eingesetzt werden.

109845/1941

Die wässrigen Formulierungen von Beispiel 11 und 12 sind besonders gut als pädiatrisehe Präparate geeignet und können oral in der gleichen Dosierung wie Lincomycin verabreicht werden.

Beispiel 13:

Kapseln.

1000 doppelte Hartgelatine-Kapseln für orale Anwendung, die jeweils 350 mg eines l'-Demethyl-clindamycin-S-nucleotids enthielten, wurden aus folgenden Bestandteilen in den angegebenen Mengen hergestellt:

ein l'-Demethyl~clindamycin-3-nucleotid 550 g

Maisstärke 50 g

Talkum 25 g

Magnesiumstearat 2§5 g

Die Substrate wurden gründlich vermischt und dann in der üblichen Weise zu Kapseln verarbeitet.

Diese Kapseln eignen sich gut zur systemischen Behandlung von Infeltionen bei Erwachsenen durch orale Verabreichung von 1 Kapsel alle 4 Stunden.

Nach dem vorangehenden Verfahren werden entsprechend Kapseln mit einem l^l-Demethyl-clindamycin-3-nucleotid in Mengen von 50, 125, 250 und 500 mg hergestellt, indem man anstatt der oben angegebenen 350 g eines l'-Demethyl-clindamycin-

109845/1941

3-nucleotides dieses Nucleotid in Mengen von 125» 250 und 500 g verwendet.

Beispiel 14t
Tabletten.

1000 Tabletten zur oralen Verwendung mit je 500 mg eine s 1' -Demethyl-4 · -depropyl-4' -pentyl-clindamycin-3-nucleotides wurden aus folgenden Bestandteilen in den angegebenen Mengen hergestellt:

ein 1·-Demethyl-4 t-pyy

elindamyein-3-nucleotid 500 g

Lactose 50 g

Maisstärke , 65 g

Magnesiumstearat 3 g

Flüssiges (leicht-) Paraffin 3 g (light liquid petrolatum)

DLe Bestandteile wurden gut vermischt und preßgekörnt. Die Presslinge wurden zum Aufbrechen durch ein Sieb mit einer Maschenweite von 1,0 mm (number sixteen screen) gedrückt. Das körnige Material wurde dann zu Tabletten mit einem Wirkstoffgehalt von je 500 mg gepreßt.

Diese Tabletten eignen sich gut zur systemischen Behandlung von Infektionen bei Erwachsenen, indem alle Stunden eine Tablette oral verabreicht wird.

Nach diesem Verfahren lassen sich bei Verwendung von

109845/1941

nur 200 g Wirkstoff Tabletten mit einem Wirk stoff gehalt von 200 mg herstellen.

Beispiel 15:

Präparat für parenterale Verabreichung.

Ein steriles wässriges Präparat zur intramuskulären Verabreichung mit 300 mg eines Celesticetin-3-nucleotides je Milliliter wurde aus den folgenden Bestandteilen in den angegebenen Mengen hergestellt:

ein Celesticitin-3-nucleotid 300 g Benzylalkohol 9 g

Wasser zur Injektion zum Auffüllen auf 1000 ml

Das sterile Material wurde in der sterilen Trägerflüssigkeit aus Benzylalkohol und Wasser verteilt und in Phiolen abgefüllt, die verschlossen wurden.

Beispiel 16:
Tierfutter.

1000 g eines Futtergemisches wurden aus folgenden Bestandteilen und in den angegebenen Mengen hergestellt:

ein 4'-Depropyl-4^l-äthyl- 20 g

lincomycin-3-nucleotid

109845/1941

2 Ü8638

Sojabohnenmehl 390 g

Fischmehl 4flK) g

Weizenkeimöl 50 g

Sorghum-Melasse 140 g

Diese Bestandteile wurden vermischt und zu Ta bletten gepreßt. Sie können Versuchstieren wie Hatten, Mäusen, Meerschweinchen oder Kaninchen vorbeugend bei Verschickung verabreicht werden.

Bei größeren Tieren kann das, Präparat in für die richtige Dosierung des Wirkstoffes entsprecnend be messener Menge dem regulären Futter zugesetzt werden.

Beispiel 17;

Präparat für parenterale Verabreichung.

Ein intramuskulär zu verwenaenues steriles wässriges Präparat mit 300 mg eines Linco:aycin-3-nucleotides in 1 Milliliter wurde aus folgenden Bestandteilen und in den angegebenen Mengen hergestellt:

ein Lincotaycin-3-nucleotid 300 g

Benzylalkohol 9 g

"Wasser zur Injektion zum Auffüllen

auf 1000 ml

Das sterile Material wurae in der sterilen Träger flüssigkeit aus Benzylalkohol und Wasser verteilt und in

109845/1941

2118638

Phiolen gefüllt, die verschlossen wurden.

Beispiel 18:

7-Deoxy-7(S)-methoxy-lincomycin-hydrochlorid.

Teil 18 A: Methyl-N-acetyl-7-desoxy-7(S)-methoxy-a-thiolincosaminid.

CH

HN'.

HO /j

OH

CH

■•z

AeNH

OHe

HO /.
'\0H

SMe

OH

VI

VII

2,35 g Methyl-6,7-aziridino-6-desamino—7-desoxy-athiolincosaminid (VI) wurde unter Rühren in 25 ml Methanol in Suspension gehalten. Die Suspension wurde dann mit

109845/1.941

211863S

2,04 g Essigsaureanhydrid versetzt. Nach einstündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde das Lösungsmittel an einem Rotationsverdampfer bei 40⁰C und 7 mm Druck entfernt. Die zurückbleibenden Feststoffe wurden an einer 4,8 χ 94 cm Silikag el -Säule mit 1 MeOH : 10 CHCl ·* als Lösungsmittelsystem chromatographyert. Die Kieselerde wog 750 g. Nach 1000 ml Vorlauf wurden 50 ml-Fraktionen aufgefangen. Die Fraktionen 31-85 wurden vereinigt und zur Trockne eingeengt; Sie ergaben 3,2 g Methyl~N-acetyl-7(S)-methoxy-7-desoxy-a-thiolincosaminid (VII) als farbloser amorpher Peststoff mit dem massenspektrometrisch festgestellten Molekulargewicht 309 (berechnetes Molekulargewicht 309,38).

Die Aziridino-Ausgangsverbindungen der Formel VI wurden durch Halogenwasserstoffabspaltung von Methyl~7(S)-ehlor-7-desoxy-a-thiolinoosaminid (belgische Patent schrift 705 427, U.S.A-Patentanmeldung 692 272 erhalten. Die Halogenwasserstoffabspaltung wurde mit wasserfreiem Natriumcarbonat durch Erhitzen unter Rückfluß in Dimethylformamid (belgische Patentschrift 732 352 , U.S.A.-Patentanmeldung 725 531 durchgeführt.

Teil 18 B: Methyl-7-desoxy-7(S)-methoxy-a-thiolin cosaminid (VIII)

(Methyl-ö.S-didesoxy^-O-methyl-o-amino-1-thio-Ii-threo-a-D-galacto-octopyranosid).

109845/1941

2118638

OH

NH,

OMe

VIII

Eine Lösung von 3»2 g Methyl-7-desoxy-7(S)-methoxya-thiolincosaminid (VII) in 25 g Hydrazinhydrat wurde übernacht unter Rühren und unter schonenden Rückfluß im Ölbad auf 145⁰C erhitzt. Durch'möglichst vollständig Entfernung des Lösungsmittels aus der farblosen Lösung durch Destillation aus einem Ölbad bei 100°C/l5 mm Druck und schließlich unter starkem Vakuum erhielt man Methyl-7-desoxy-7(S)-methoxy-a-thiolincosaminid als farblosen Syrup. Dieser Syrup wurde an 750 g Silikagel in einer Säule 4,8 χ 97 cm mit 1 MeOH : 10 CHCl, als Lösungsmittel system chromatographiert. Nach 1,4 1 Vorlauf wurden 50 ml-Draktionen aufgefangen. Die Fraktionen 281-600 wurden vereinigt und zur Trockne eingeengt. Die Ausbeute betrug 2,06 g Methyl-7-desoxy-7(S)-methoxy-a-thiolincosaminid (VIII), das nach der Umkristallisation aus Acetonitril in Form farbloser Nadeln mit folgenden Eigenschaften erhalten wurde:

Schmelzpunkt: 154 - 155°C;

1098A6/1941

£ ^a-7_D + 260° (ο, 0,5634, H₂O).
Analyse:

Für C₁₀H₂₁O₅HS

berechnet: C 44,92; H 7,92; N 5*24; S 12,00; OMe 11,61; gefunden : 0 45,20; H 7,96; N 5,08; S 12,19; OMe 11,86.

Molekulargewicht: berechnet 267,35;

gefunden (Massenspektrometrie): 267.

Teil 18 Ci 7-Desoxy-7(S)-methoxy-lincomycin-hydroehlorid.

Me

Pr

Il

Pr α n-Propyl

CH,
j

HO

OMe

,0H )! J V ÖMe

OH

.HCl

IX

Eine Suspension von 2, 7 g trans-1 -Methyl-4-propyl-L-2-pyrrolidin-carboxylsäure-hydrochlorid in 90 ml Acetonitril wurden unter Rühren mit 2,89 g Triäthylamin versetzt.

109845/1941

Das Rühren wurde fortgesetzt, bis sich der gesamte Feststoff gelöst hatte, dann wurde das Reaktionsgemisch in einem Eis/Methanol-Bad auf -5°C gekühlt und bildete einen Niederschlag von Triäthylamin-hydrochlorid. Während der tropfenweisen Zugabe von 1,78 g Isobutyl-chlorformiat wurde die Reaktionstemperatur auf -5° bis -3 G gehalten. Es setzte sich weiteres Triäthylamin-hydrochlorid ab und das Rühren wurde 20 Minuten bei -5°C fortgesetzt. Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde mit 1,74 g Methyl-7-desoxy-7(S)-methoxy-a-thiolincosaminid (VIII) gelöst in 10 ml Wasser versetzt.. Bei der Lösung der Feststoffe stieg die Temperatur auf etwa O⁰C, das Rühren wurde ohne weiteres Vereisen des Kühlbades 2 Stunden fortgesetzt. Nach Ent fernung des Lösungsmittels an einem Rotationsverdampfer bei 4O°C/15 mm Druck blieb ein brauner zähflüssiger Rückstand zurück, der in verdünnter Salzsäure gelöst wurde. Diese Lösung (pH-Wert 2) wurde zweimal mit Chloroform extrahiert; die vereinigten Extrakte wurden einmal «it Wasser gewaschen. Die wässrige Phase, die das Waschwasser enthielt, wurde mit Natriumhydroxid (50^-ige wässrige Lösung) auf den pH-Wert 11 eingestellt, mit Natriumchlorid gesättigt und dreimal mit Chloroform extrahiert. Die vereinigten Chloroformextrakte wurden über wasserfreie» Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne eingeengt, wobei 1,76 g eines dunkelgelben amorphen Feststoffs erhalten wurden. Der Feststoff wurde an 750 g Silikagel in einer Säule 4,8 χ 94 cm mit 1 MeOH : 15 CHCl₅ als Lösungs mittelsystem chromatographiert. Nach 1,3 1 Vorlauf wurden 50 ml-lraktionen aufgefangen. Die Fraktionen 60-80 wurden vereinigt und ergaben nach Einengung zur Trockene 7-Desoxy-7(S)-methoxy-lincomycin in Form der freien Base als nahezu farbloser Syrup. Diese freie Base wurde in ver-

109845/1941

diinnter wässriger Salzsäure aufgenommen. Durch Filtern und Gefriertrocknen dieser Lösung wurden 801,4 mg 7-Desoxy^iSj-methoxy-lincomycinhydrochlorid als farbloser amorpher Feststoff mit folgenden Eigenschaften erhalten:

Cα J-Q + 117° (c, 0,9626, H₃O);

Analyse:

Für C₁₇H₂₆O₆N₂S.HCl

berechnet: C 49,93; H 8,16; N 6,13; S 7,02; gefunden ( 5,14 # H₃O berücksichtigt):

C 49,44; H 7,99; N 6,20; S 6,48.

Molekulargewicht

berechnet für wasserfreie freie Base: 420,57; gefunden (Massen-Spektrometrie): 420.

Das so erhaltene 7-Desoxy-7(S)-methoxy-lincomycin kann durch die erfindungsgemäßen Verfahren in die entsprechenden neuen erfindungsgemäßen 3-Nucleotide über führt werden.

Beispiel 19:

Alternativ-Verfahren säur Herstellung von Methyl-7-desoxy-7(S)-methoxy-a-thiolineosaminid (VIII).

Teil 19 A: Methyl-N-acetyl-6, 7-aziridino-6-desamino-7-desoxy-2,3»4-tri-0-acetyl-a-thiolincosaminid (X).

109845/1941

CH,

Ac-

AeO / 0

fa* )

¹ Λ/ SMe

I
OAc

Eine Lösung von 2,0 g Methyl-6,7-aziridino-6-des amino-7-desoxy-a-thiolincosaminid (VI) in 20 ml Pyridin wurden unter Rühren mit 10 ml Essigsäureanhydrid ver setzt und das Reaktionsgemisch über Naeht bei Raumtemperatur abgestellt. Das flüchtige Material -wurde aus dem Reaktionsgemisch an einem Rotationsverdampfer bei 40 C/7 mm und schließlich unter starkem Vakuum möglichst vollständig entfernt, wobei ein farbloser Feststoff zurückblieb. Der Rückstand wurde in Chloroform gelöst, zur Beseitigung des Pyridine mit wässrigem Cadmiumchiοrid gerührt und filtriert. Die Chloroformschicht wurde zweimal mit Wasser gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Nach Entfernung des Lösungsmittels am Rotationsverdampfer bei 40°C/7 mm erhielt man 3,1 g Methyl-N-acetyl-6,7-aziridino-6-desamino-7-desoxy-2,3,4-tri-0-acetyl-£X-thiolincosaminid (X) als farblosen kristallinen Feststoff. Nach Umkristallisation aus Äthylacetat/techn. Hexan (Skelly solve B) wurde das Produkt in Form farbloser prismatischer Nadeln erhalten. Eigenschaften:

109845/1941

2113636

Schmelzpunkt: 173t5 - 175°C

['a_7_D + 222° (c, 0,912, CHCl₃);

Analyse;

Für C₁₇H₂₅OgNS

berechnet: C 50,61; H 6,25; N 3,47; S 7,95; gefunden : C 50,43; H 6,33; N 3,41; S 8,31.

Molekülargewi cht:

berechnet: 403»45;

gefunden (Massen-Spektrometrie): 403.

Teil 19 B: Methyl-N-acetyl-2, 3,4-tri-0-acetyl-7-desoxy-7(S)-methoxy-a-thiolincosaminid (XI).

Ein Gemisch aus 5 g Methyl-N-acetyl-2,3,4-0-triacetyl-6,7-aziri dino-o-desamino^-desoxy-a-thiolincosaminid (X), 50 ml Methanol und 5 ml Eisessig wurde 6 Stunden unter mäßigem Rückfluß in einem Ölbad bei 130°C erhitzt. Fach Entfernung des Lösungsmittels aus der farblosen Lösung an einem Rotationsverdampfer bei 40 C/7 mm blieb ein kristallisierender hellgelber Syrup zurück. Die Kristalle wurden in Methylenchlοridlösung aufgenommen, zuerst mit gesättigtem wässrigem Natriumbicarbonat und dann mit Wasser gewaschen und anschließend über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Nach Entfernung des Lösungsmittels, wie vorstehend angegeben, erhielt man 5,31 g Methyl-N-acetyl-2,3,4-tri-0-acetyl-7(S)-methoxy-7-desoxy-a-thiolincosaminid (XI) als farblose Kristalle .

109845/194 1

Kristallisation aus Äthylacetat / Hexan (Skellysolve B) ergab feine farblose Nadeln mit folgenden Eigenschaften:

Schmelzpunkt: 235 - 236°C;
faJ_J}+2Ob° (c, 0,9952, GHGl₃);

Analyse

Für C₁₉H₂₉O₉NS

berechnet: C 49,64; H 6,71; N 3,22; S 7,36; OMe 7,13; gefunden : C 49,77; H 6,92; N 3,65; S 7,90; OMe 7,38.

Molekulargewi ch t

berechnet: 435,49;

gefunden : (Massen-Spektrometrie): 435·

Nach Hydrazinolyse gemäß dem Verfahren von Teil 18 B erhielt man Methyl~7-desoxy-7(S)-methoxy-α-thiolincosaminid (VIII).

Beispiel 20:

Abwandlung von Beispiel 18

Teil 20 A: Methyl-N-acetyl-2,3,4-tri-0-acetyl~7-desoxy-7(S)-methoxy-a-thiolincosaminid (XI) und Methyl-K-acetyl-2,3-di-0-acetyl-7-desoxy-7 (Sj-methoxy-a-thilincosaminid (XII).

1098AB/19 A 1

CH,

OH-

AcKH¹

AcO

OHe

AcNH

OMe

SNe

SMe

OAc

XII

26,61 g Methyl-N-acetyl-7-desoxy-7(S)-methoxy-athiolincosarainid (VII) in 100 ml Pyridin wurden unter Rühren mit 50 ml Essigsäureanhydrid versetzt und das Reaktionsgemiseh über Nacht bei Raumtemperatur abgestellt, dann wurde das flüchtige Material durch Destillation an einem Rotationsverdampfer bei 40⁰C / 7 mm und schließlich unter starkem Vakuum entfernt* Der Rückstand wurde in Chloroform gelöst und mit gesättigtem wässrigem Natriumbicarbonat gewaschen. Die wässrige Schicht wurde mit Chloroform gewaschen. Aus den vereinigten Chloroform-Extrakt en wurde durch Rühren mit wässrigem Cadmiumchlorid das Pyridin entfernt.

Der Niederschlag wurde abfiltriert und gut mit Chloroform gewaschen. Die abgetrennte Chloroform-Schicht wurde zweimal mit Wasser gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer bei 40⁰G/ 7 mm entfernt. Man erhielt einen hellgelben Syrup, der nach Stehen kristallisierte. Nach Umkristalli-

109845/1941

2118836

sation aus Äthylaeetat/Hexan wurde das Produkt in Form kielner, farbloser, abgeflachter Nadeln mit folgenden Eigenschaften erhalten;

Schmelzpunkts 245 - 247°C;
£"«J_D + 202° (c, 0,7142, CHCl,);

Analyse

Fur C₁₈H₂₉O₉JiS

berechnet: C 49,64; H 6,71; N 3,22; S 7,36; OMe 7,13; gefunden : C 49,24; H 6,75; N 3,34; S 7,52; OMe 7,17.

Molekulargewi cht

berechnet: 435*49;

gefunden (Massen-Spektrometrie): 435.

Bei diesem Material wurde durch Craig-Gegenstromverteilung mit 1 ÄtOH : 1 H₃O : 1 ÄtOAc : 1 Cyclohexan als Lösungsmittel syst em ein Gehalt von 70 $» Methyl-N-acetyl-2,3,4r-tri-0-acetyl-7-deso3cy-7(S)-methoxy-a-thiolincosaminid (XI) und 3O56 Methyl-N-aeetyl^^-di-O-aeetyl^-desoxy-7(S)-methoxy-a-thiolincosaminid (XII) ermittelt. Dach 500 Stufen wurden die Fraktionen aus den Röhren 225-310 zusammengefaßt (K-Wert 1,14) und zur Trockne eingeengt. Nach Umkristallisation aus Äthylacetat/Hexan erhielt man Methyl-N-acetyl-2,3,4-tri-0-acetyl-7-desoxy-7( S )-methoxy-athiolincosaminid (XI) in SOrm feiner farbloser Nadeln, das mit dem Produkt aus Teil 19 B identisch war.

109845/1941

Auch die Fraktionen der Röhren 115-220 (K-Wert 0,59) warden susammengefaßt und ergaben nach Eindampfen zur Trockne und Umkristallisation aus Äthylaeetat/Hexankohlenwasserstof f en Methyl-l-acetyl-2,3-di-Q-aeetyl-7-aesoxy-7(S)-»itt9thoxy-a-thiolineosaminid (XII) in Form farbloser klumpiger (chunky) ladein mit folgenden Eigenschaften:

Schmelzpunkt; 189 - 19Ö°C ;

fcc J_D + 275° (c, 1,0188, GHCl₃);

Analyse

Für C₁₆H₂₇O₈NS

"berechnet: C 48,84; H 6,92; N 3,56; S 8,15; OMe 7,89; gefunden s C 48,71; H 7,11; N 3,93; 3 7,96; OMe 7,98.

Molekulargewicht

berechnet 393*46;

gefunden (Massen-Spektrometrie)s 393-

Teil 20 B: Acetylienmg von Methyl-B-acetyl-2,3~di-0-

ac etyl-7—desoxy- 7 (S ) -methoxy-a-thi olinco sami nid (XII).

Eine Lösung von 200 mg Methyl-H-aeetyl-2,3-di-O-acetyl-7-desoxy-7(S)-metlioxy'-a-thiolincosaminid (XII) in 20 ml Pyridin wurde unter Rühren rait IO ml Essigsäureanhydrid versetzt und das Reaktionsgesniseh über Nacht bei

10S845/i 941

Raumtemperatur abgestellt. Das Lösungsmittel wurde aus der farblosen Lösung am Rotationsverdampfer bei 40° c / 7 mm und schließlich bei 40°C/Hochvakuum entfernt. Der syrup artige Rückstand wurde in Chloroform gelöst, mit verdünnter wässriger HCl (0,5 normal), zweimal mit Wasser, mit gesättigter Natriumbiearbonat-CLösung und wiederum zweimal mit Wasser gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Nach Entfernung des Lösungsmittels am Rotationsverdampf er bei 40°C / 7 am wurde Methyl-N-acetyl-2,3_f4-tri-0-acetyl-7-desoiy-7(S)-methoxy-a-thiolincosaminid (XI) als farbloser Syrup erhalten, der nach Stehen kristallisierte.

Nach Hydrazinolyse der Produkte aus Teil 20 A und 20 B erhielt man Methyl-7-desoxy-7(S)-methoxy-a-thiolincosaminid (VIII).

Beispiel 21:

Alternative zu Beispiel 18.

Teil al A: Äethyl-H-acetyl-6,7-aziridino-6-desamino-7-desoxy-tt-thiolineosaminid (XIII).

XIII

109845/194

Sine Suspension von 2,3 g Methyl-6,7-aziridino-6-desamino-7-desoxy-a-thiolincosaminid (Vl) in 25 ml Iso propylalkohol wurde unter Bühren mit 2 »04 g Essigsäureanbydrid versetzt. Der Feststoff schien größtenteils in Lösung zuL gehen, um dureh neuen Feststoff ersetzt zu werden. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur geriikrt und dann filtriert; der Bückstand wurde mit Isöpropylalkohol gewaschen und im Vakuumofen bei 60 C/ 15 m getrocknet. Man erhielt 2,28 g Methyl-N-acetyl-6,7-aziridino—ö-desamino-o-desamino^-desoxy-a-thiolincosaminid als farblose Plättchen mit folgenden Eigenschaften:

Scisaelzpunkt: 145⁰C;

C α J_D + 255° (c, 0,7916, H₂O);

Analyse

für C₁₁H₁₉O₅NS

berechnet: C 47,63; H 6,9; N 5,05; S 11,56; gefunden s 0 47.57; H 6,71; N 5,23; S 11,29.

Molekulargewicht

berechnet: 277,34;

gefunden (Mass en-Sp ektrometrie): 277.

Teil 21 B: Methyl-N-acetyl-.7-desoxy-7(S)-methoxy-a-thiolincosaminid (VII).

Mach Behandlung von Methyl-N-aeetyl-6, 7-aziridino-6-

109845/1941

desamino-7-desoxy-a-thiolincosaminid (XIII) mit Methanol und Essigsäure unter Rückfluß erhielt man Methyl-B-acetyl-7-desoxy-7(S)-methoxy-Ur-thiolincosaminid (VII), das mit dem Produkt in Teil 18 A identisch war.

Beispiel 22:

7-Desoxy-7(S)-äthoxy-lincomycin-hydrochlori d.

Teil 22 A: Methyl-N-acetyl-7-desoxy-7(S)-äthoiy-a-thiolincosaminid (XIV).

AcNH

OÄt

ho /r—°

KpH / \L__j/

SMe ™

OH

Behandelte man das Methyl-N-acetyl-6,7-aziridino-6-desamino-7-desoxy-a-thiolincosaminid (XIII) unter Mäßigem Rückfluß mit Äthanol und Essigsäure, erhielt man Methyl-N-acetyl-7-desoxy-7(S)-äthoxy-l-thio-a-lincosaminid. (XIV) als Syrup mit dem massenspektrometrisch festgestellten Molekulargewicht 323 und dem berechneten Mol,gewicht 323_t41-·

109846/1941

Teil 22 B:

MetJh.yl-ii-acetyl-2 ,3 »4—tri-O-acetyl-7—desoxy-7{s)-äthoxy-a-thiolincosaniinid (XV) und

Methyl-N-acetyl-^-desöxy-?! S)-äthoxy-2, 3-diö-aeetyl-a-thiolineosaminid (XVI).

CH,

AcNH

OÄt

AcM

OAt

HO

- Q

/SMe

OAc

OAc

Behandelte man naoh dem Verfahren in Teil 20 A das Methyl-I\r-acetyl-7-desoxy-7 (S) -äthoxy-a-thiolincosaaiinid
(XIV) mit Essigsäureanhydrid und Pyridin, erhielt man
Methyl -N-acetyl-2,3,4-tri-0-acetyl-7-desoxy-7( S)-Ö-äthyla-thiolincosaminid (XV) sowie eine kleinere Menge H-Acetyl-2,3-di-0-acetyl-7-aesoxy-7 (S J-äthoxy-a-thiolincosiaeiiinid
(XVI), Die mit einer Craig-Vorrichtung in 500 Stufen mit einem Lösungsmittel sy st em aus Äthanol/Waaaer/Äthylacetat/ Cyclohexan (Verhältnis 1:1:1:1) isolierten Produkte l>esitzen folgende Eigenschaften:

Gemisch: Schmelzpunkt 197-199°C.

109845/1941

faJj₃ +247° (c, 0,665, CHCl₅);
Analyse

Für C₁₉H₃₁O₉HS

berechnet: C 50,76; H 6,95; IT 3,12; S 7,13; (Ät 10,02; gefunden : C 50,42; H 7,07; N 3,18; S 7,37; OÄt 11,85.

XV rein (E = 1,59); Schmelzpunkt 254-255°C; £ aJ_B + 199° (c, 8638, CHCl₃).

Analyse

Für C₁₉H₃₁O₉SS

berechnet: C 50,76; H 6,95; H 3,12; S 7,13; OÄt 10,02; gefunden : C 50,75; H 7,06; N 3,37; S 7,31; OÄt 10,25.

Molekulargewicht

berechnet: 449,52;
gefunden (Massen-Sp.) ϊ 449;

rein (K = 0,87)| Schmelzpunkt 215,5 - 216,5°C ;

²⁶¹* (^c» 1.0448, CHCl₃)

Analyse
Pur

109845/1941

berechnet: C 50,11; H 7,17; N 5,44; S 7,87; gefunden : C 50,17; H 7,30; Ή 3,50; S 7,62.

Molekulargewicht

berechnet: 407,48;
gefunden (Massen-Sp.): 407.

Teil 22 C: Methyl-7-desoxy-7(S)-äthoxy-a-thiolincosaminid (XVII).

OÄt

SMe

XVII

- Unterwarf man die Produkte von Teil 22 B, also das Gemisch, die reine Verbindung XV und die reine Verbindung XVI der Hydrazinolyse, erhielt man Methyl-7-desoxy-7(S)-äthoxya-thiolincosaminid (XVII) mit den folgenden Eigenschaften:

Schmelzpunkt: 194 - 196 C;

+ 252° (c, 0,7438,

1 09845/1941

L ! I ο ο 3 ο

Analyse

berechnet: C 46,95; H 8,24; If 4,98; S 11,40; gefunden : C 46,66; H 8,09; N 5,26; S 11,33.

Molekulargewi cht berechnet: 281,37; gefunden (Massen-Sp.): 281.

Teil 22 D:

7-Desoxy-7(S)-äthoxy-lineomycin-hydroehlorid (XVIII).

Me

Pr

Me = Methyl Ät = Äthyl Pr = Propyl

OÄt

Y \

I OH Λ

SMe

OH

XVIII

.HCl

Nach dem Verfahren in Teil 18 G wurde Methyl-7-desoxy-

109845/1941

211863S

7(S)-äthoxy-a-thiolincosaminid (XVII) in 7--Desoxy-7(S)-äthoxy-lincomycin-hydrochlorid, "der die folgenden Eigenschaften besitzt, überführt:

Schmelzpunkt: farbloser, amorpher Peststoff;

/~<x_7_D + 109° (e, 0,9824, H₂O)-T

Analyse

Pur C₂₀H₅₈O₆F₂S^HCl

berechnet: C 50,99; H 8,35; F 5,95;

Cl 7,53; S 6,81; OÄt 9,57;

gefunden (5*07 $ Wasser berücksichtigt):

C 50,54; H 8,19; » 5,63; Cl 7,61; ö 6,95; OÄt 10,16.

Beispiel 23:

Teil 23 A: Methyl-N-acetyl-7-desoxy-7(S)-propoxy-athiolincosaminid (XIX), Methyl-M-aeefyl-2,3,4-tri-0-ac etyl-7—desoxy-7( S ) -propoxy-ccthiolincosaminid (XK) und. Meth.yl-U-aeetyl-7-desoxy-7 (S) -propoxy-2,3-di-0-acetyl-athiolincosaminid (XXI).

109845/1941

OPr

HD A \

\ OH 1 ^Xj]

OH

AcNH

AcO/

OPr

OAC )

SMe OAc

XIX

XX

AcBH

OPr

HO Ί—O

NOAe β

OAc

XXI

Bach Behnndlung von Methyl-N-acetyl-ö.T-aziridino-odesamino—7-desoxy—α-thi olincosajninid (XIII) mit Propanol und Essigsäure unter mäßigem Rückfluß wurde Methyl-N-acetyl-7-

109845/1941

desoxy-7(S)-propoxy-oc-thiolincosaminid und daraus nach Acetylierung mit Essigsäureanhydrid in Pyridin gemäß dem Verfahren in Teil 22 B Methyl -N-acetyl-2,3,4-tri-O-acetyl-7(S)-propoxy-7-desoxy-QC-thiolincosaminid (XX), das eine geringe Menge Methyl-N-acetyl-2, 3-di-0-acetyl-7 (S)-propoxy-7-desoxy-a-thiolincosaminid (XXI) enthielt, erhalten.

Eigenschaften:

Gemisch: Schmelzpunkt 240-242⁰C;
ZTaT₁) +207° (c, 0,9054, CHCl);

Analyse
Für C

berechnet: C 51,81; H 7,17; N 3,03; S 6,92; gefunden: C 51,41; H 7,33; N 3,16; S 6,92.

Molekulargewicht

berechnet: 463»60;

gefunden (Massenspectrometrie): 463;

XX rein:
Schmelzpunkt 241,5 - 242,5°C;

[_ cc J_D-1- 193° (c, 09254, CHCl₃)

Analyse

Für C₂₀H₃₃O₉NS

109845/1941

berechnet: 0 51,81; H 7,17; N 3,03; S 6,92; gefunden : C 51,77; H 7,02; N 3,37; S 6,84.

Molekulargewicht

berechnet: 463.60;

gefunden (Massenspectrometrie): 463.

Teil 23 B: Methyl-7-desoxy-7(S)-propoxy-a-thiolincosaminid (XXII).

CH

OPr

SMe

XXII

Nach Hydrazinolyse der vorstehend genannten Produkte (Teil 23 A) wurde Methyl-7-desoxy-7(S)-propoxy-a-tMolincosaminid (XXII) erhalten.

Teil 23 C: 7-Desoxy-7(S)-propoxy-lincomycin-hydroehlorid (XXIII).

109846/

Il

OPr

-NH

i
OH

XXIII

Nach Acylierung mit trans-1-itüethyl-4-propyl-L-2-pyrrolidincarbonsäure nach dem Verfahren in Teil 18 C wurde T-Desoxy-TiSj-propoxy-linetHaycin-hydrocüLorid (XXIII) erhalten.

Beispiel 24;

Teil 24 Δ:

7(S)-isopropoxy-a-tMolincosaminid (XUV)

109845/1941

OH,

AcNH

0 (iPr)

AcO

XXIV

Verwendete man in dem Verfahren des Teils 19 B Isopropylalkohol anstatt Methanol, erhielt man Methyl-N-aeetyl-2,3 ,A-tri-O-aeetyl-T-desoxy-T (S) -i s op rop oxy-ct- thi olincosaainid (2X1V) ait den folgenden Eigenschaften:

Schmelzpunkt: 253-254 C; C^J-Q + !32° <^c» 0,535,

Analyse

Für C

20^H33⁰9^HS

berechnet: C 51,81; H 7,17; N 3,03; S 6,92; gefunden : C 51,96; H 7,07; N 3,19; S 6,61.

109845/1941

Molekulargewicht

berechnet: 463,6;

gefunden (Massenspectrometrie): 463.

Teil 24 B: Methyl-7-desoxy--7-(S)-isopropoxy-a-thiolineosaminici (XXV).

O(iPr)

jjp_r _

SMe

XKV

lach Hydrazinolyse der Verbindung XXIV (Teil 24 A) erhielt man Methyl-7-desoxy-7(S)-isopropoxy-a-thicün cosaminid mit folgenden Eigenschaften:

Schmelzpunkt: 215°G;

+ 225° (c, 0,376,

Analyse

109845/1941

-Tl-

berechnet: G 48,79; H 8,53; N 4,74; S 10,86; gefunden: G 48,52; H 8,55; H 5,26; S 10,84.

Mol ekul argewi eilt

berechnet: 295.40;

gefunden (Massenspectrcanetrie): 295·

Teil 24 C: 7-Desoxy-7(S)-isopropoxy-lincomycin-hydrochlorid (XXVI).

HO

OH

"0

O(iPr)

.HGl

SMe

OH

XXVI

Nach dem Verfahren des Teils 18 C wurde die Verbin dung XXVI (Teil 24 G) in 7-Desoxy-7(S)-isopropoxy-lincomycin-hydrochlorid mit den folgenden Eigenschaften überführt:

1 098487T941

Schmelzpunkt - amorph;

/~ a7_D + 81° (o, 0,898, H₂O);

Analyse

Mir C₂₁H₄₀O₆N₂S-HCl

berechnet: C 51,99; H 8,52; N 5,78; S 6,61; Gl 7,31; gefunden : (4,36 % Wasser berücksichtigt): C 51,72; H 8,33; IT 5,59; S 6,35; Cl 7,29.

Molekulargewi cht

berechnet (freie Base): 448,62;

gefunden: 448.

Wirksamkeit: etwa die gleiche wie Lincomycin.

Beispiel 25 A: Methyl-N-acetyl^^^-ti-i-O-aeetyl-^-desoxy-

7(S)-cyclohexyloxy-a-tluLolineosaininid (XXVII)

—— OCyclohexyl

AcNH j

AcO } -°.

KOAc ^v

' M ι. me XXVII

OAc

1098A5/1941

Verwendete man in dem Verfahren des Teils 19 B Cyclohexanol anstatt Methanol, so erhielt man Methyl-N-acetyl—2,3,4-tri-O-aeetyl—7—desoxy-7(S)-cyclohexyloxy-athiolincosaminid (XXVII) mit folgenden Eigenschaften:

Schmelzpunkt: 266-268°C;
°

^α-^ + 163 (c, 1,055, GHCl₃).

Analyse

PUr G₂₅H₃₇O₉NS

berechnet: C 54,85; H 7,41; N 2,78; S 6,37; gefunden : C 54,93; H 7,53; N 2,87; S 6,65.

Molekulargewicht

berechnet; 503»6;

gefunden : (friassenspectrometrie): 503.

Teil 25 B: *iethyl-7(S)-cyelohexyloxy-7-desoxy-α-1hi olincosaminid (XXVIII).

BH₂
HO

OCyclohexyl

(o„

XXVIII

} SMe i

OH

109845/19A1

Nach Hydrazinolyse der Verbindung XXVII (Teil 25 A) wurde Methyl-TiSi-cyclohexyloxy-T-desoxy-a-thiolincosaminid (XXVIII) erhalten.

Teil 25 G: 7(S)-Cyclohexyl-7-desoxy-lincomycin-hydrochlorid.

CH

NH

— OCyclohexyl

.HGl

- SMe

• Nach dem Verfahren des Teils 19 G wird Methyl-7(ö)-cyclohexyloxy-7-desoxy-a-thiolincosaininid (XXVIII) in 7 (S) -Gy el ohexyl oxy-7-desoxy-l incomycin-hydro ohl orid üb erführt.

Beispiel 26;

Teil 26 A: Methyl-N-acetyl-7-desoxy-7(S)-2'-hydroxyäthoxy-a-thiolincosaminid (XXIX) und Methyl-N-acetyl-2,3,4-tri-0-acetyl-7(S)-2'-acetoxyäthoxy-7-desoxy-a~thiolincosaminid (XXX).

109845/1941

211863S

-SI

CH,

HO

OCH₂CH₂OH

AcNH

K OB. λ

und

OCH₂CH₂OAc

SMe

OH

XXIX

XXX

Nach dein Verfahren in Teil 18 A erhielt man bei Verwendung von 2-Hydroxy-äthanol anstelle von Methanol Methyl-N-acetyl-7-desoxy-?(S)-2'-hydroxyäthoxy-a-thiolincosaminid (XXIX). Dieses wurde nach dem Verfahren des Teils 20 A acyliert, wobei man jedoch eine Erhitzung auf dem Dampfbad
anwendet, um ein vollständig acyliertes Produkt zu gewinnen. Man erhielt Methyl-N-acetyl-2,5,4-tri-0-acetyl-7
(S) -2' -ace toxyäthoxy-7-desoxy-a~ thiolincosäminid.

Eigenschaften: Schmelzpunkt: 223 - 225°C;

f(xJ_D + 172° (c, 1,010, C Analyse
Für Ο«,

109845/1941

berechnet: G 49,69; H 6,55; N 2,76; S 6,32; gefunden ί G 49,56; H 6,63; M 2,90; S 6,63-

Molekulargewicht
berechnet: 507,55 j
gefunden: 507.

Teil 26 B: Methyl-7-desoxy-7(S)-2'-hyaroxyäthoxy-a-thiolin cosaminid (XXXI).

GH,

OCH₂CH₂OH

NH,

HO/

XXXI

SMe

OH

Nach Hydrazinolyse von Wethyl-li-acetyl-2,3,4-tri-0-acetyl-7-desoxy-7(S )-2' -acetox.yäthoxy-α- thiolincosaminid (XXXI) erhielt man Methyl-7-desoxy-7(s)-2'-hyüroxyäthoxyoc-thiolincosaminid mit folgenden Eigenschaften:

Schmelzpunkt : 178,5 - 179,5°C;

109845/1941

2118638

£<xJ_D+ 245° (c, 0,662, H₂O).

Analyse

Mir C₁₁H₂₅O₆NS

berechnet: C 44,45; η 7,8ü; S 10,78; N 4,71; gefunden: C 44,40; H 7,99; S 10,bl; N 4,60.

Molekulargewicht: 297,37;

gefunden (Massenspectrometrie): 297.

Teil 26 C: Mexhyl-7-aesoxy-7(S)-2'-hydroxyäthoxylincomycinhydrochlorid (XXXIl).

Me

, N CH,

\ Pr . ,/ 1 OCH₂CH₂OH

C NH

Q HO \ 0 .HCl

\ ] avie

OH
XXXII

Nach dem Verfahren in Teil 18 C wird Methyl-7-desoxy-7(fcj)-2'-hydroxyäthjxy-a-thiolincosaminid (XXXI) in 7-Des-

1 09845/1941

oxy-7(S)-2ⁱ-hydroxyäthox.y-lincomycin-hyd.rochlorid mit folgenden Eigenschaften überführt:

Schmelzpunkt: - amorph;

jTaJ + 105° (c, 1,102, H₀O).

D ^ά

Analyse

Für C₂₀H₅₈O₇N₂S* HGl

berechnet: C 49,32; H 8,07; N 5,75; S 6,58; Cl 7,28; gefunden (2,11 $ Wasser berücksichtigt):

C 49,61; H 7,85; N 5,54; S 6,46; Cl 7,26.

Molekulargewicht

berechnet (freie Base): 450,59; gefunden (Massenspectrometrie): 450.

Wirksamkeit: ungefähr 1/3 des Lincomycins.

Beispiel 27:

Teil 27 A: Methyl-N-aeetyl-7-desoxy-7(S)-2'-methoxyäthoxyoc-thiolincosaminid (XXXIII) und Methyl-N-acetyl-2,3,4-tri~0-acetyl-7-desoxy-7(S)-2'-methoxy äthoxy-oc-thiolincosaminid (XXXIV)

109845/194

CH₃ CH₃

' _{0CH CH} _me —J OCH₂CH₂OMe

1 -TLTTT j

AcNH —

^WÄ~\

U.. I/ SMe OMe

XXXIII XXXIV

Verwendete man in dem Verfahren des Teils 18A anstatt Methanol 2-Methoxyäthanol, so erhielt man Methyl-N-acetyl-7-desoxy-7(S)-2'-methoxyäthoxy-a-thiolincosäminid (XXXIII). Dieses Produkt wurde nach dem Verfahren des Teils 20-A acetyliert, wobei man jedoch eine Erhitzung auf dem Dampfbad vornahm, um ein vollständig acetyliertes Produkt zu gewinnen. Man- erhielt Methyl-N-acetyl-2,3,4-tri-O-acetyl-7-desoxy-7(S)-2'-methoxyäthoxy-a-thiolincosaminid (XXXIV).

Eigenschaften:

Schmelzpunkt: 222-223°0;
£a J_B + 177° (c, 1,079, CHCl₃).
Analyse

"D(I·ψ% /*t XT f\ 10Ό

109845/1941

2118638

berechnet: C 50,09; H 6,94; N 2,92; S 6,69; OMe 6,47; gefunden : C 50,13; H 7,00; N 2,77; S 6,33; OMe 7,28.

Molekulargewicht

berechnet: 479»54;

gefunden (Massenspectrometrie): 479.

Teil 27 B: Methyl-7-desoxy-7(S)-2'-methoxyäthyl-a-thiolincosaminid (XXXV).

CH

OCH₂CH₂OMe

HO,/ \,

Γ OH 1

« / SMe

OH

Mach Hydrazinolyse von Methyl-M-acetyl-2,3,4-tri-O-acetyl-7-desoxy-7(S)-2'~methoxyäthoxy-a-thiolinGOsaminid (XXXIV) erhielt man Methyl-7-desoxy-7(S)-2^t-methoxyäthoxya-thiolincosaminid (XXXV) mit folgenden Eigenschaften:

Schmelzpunkt: 178-179°C;

L <*7_D + 231° ( c, 0,827, H₂O)

109845/1941

Analyse

Pur G₁₂H₂₅O₆NS

berechnet: C 46,28; H 8,09; N 4,50; S 10,30; gefunden : G 46,57; H 8,32; N 5,01; S 10,70.

Molekulargewi cht

berechnet: 3H»40;

gefunden (Massenspectrometrie): 311.

Teil 27 C: kethyl-7-desoxy-7(S)-2'-methoxyäthoxy-lin comycin-hydrochlorid (XXXVI).

Me

Pr !

' ' —I OGH₂CH₂OMe

.HCl

C MH

ο ^Η°,

OH

-0

i ^me χχχνί

OH

Nach dem Verfahren in Teil 18 C wurde Methyl-7-desoxy-7(b)-2'-methoxyäthoxy-a-thiolincosaminid (XXXV) in

7-Desoxy-7(ö)-2^f-methoxyäthoxy-lincomycin-hydrochlorid überführt.

109845/1941

2118838

Eigens chaft en:

Schmelzpunkt - amorph ; /~a7_D + 87° (c, 0,575

Analyse

Für C₂₁H₄₀U₇N₂S

berechnet: C 50,53; H 8,25; N 5,59; S 6,40; Cl 7,08; gefanden (4,17 # H₃O berücksichtigt):

C 50,47; H 8,60; N 5,26; S 5,86; Cl 7,50.

Molekulargewicht

berechnet (freie Base): 464,62; gefunden (Massenspectrometrie): 464.

Wirksamkeit: ungefähr 1/3 von Lincomycin.

Beispiel 28:

Methyl-7-desoxy-7(Sj-hydroxy-a-thiolincosaminid (XXXVII) (Methyl-ö-amino-ojS-didesoxy-L-threo-a-D-galactoocto pyranosid).

CH₃

OH

HO,/' Λ» XXXVII

OH /I

I SlVIe

OH

109845/19A1

Teil 28 A:

Methyl-N-acetyl-7-desoxy-7(3)-hydroxy-athiolincosaminid (XXXVIII)

(Methyl-o-acetamido-ö^-didesoxy-L-threo-a-D-galacto-octopyranosid).

CH₃

OH

AoNH

^H9/~~ \ OH

XXXVIII

t SMe OH

Eine Lösung von 2,35 g Methyl-6,7-aziridino-6-desamino-7-desoxy-oc-thiolincosaminid (VI) in 25 ml Wasser wurden mit 2,04 g Essigsäureanhydrid versetzt und die Lösung über Nacht bei Raumtemperatur abgestellt. Nach Einengen der Lösung zur Trockne am Rotationsverdampfer bei 40°G / 7 mm erhielt man einen farblosen Syrup, den man an 750 g Silikagel in einer 4,8 χ 98 cm Säule mit 1 MeOH : 7 CHCl-z als Lösungsmittelsystem chromatographyerte. Nach 550 ml Vorlauf wurden 50 ml-Fraktionen aufgefangen. Die Fraktionen Nr. 90-160 wurden vereinigt und zur Trockne eingeengt. Die Ausbeute betrug 2,3 g Methyl-N-acetyl-7-desoxy-7(s)-hydroxy-a-thiolincosaminid als einen farblosen Peststoff, der aus Methanol in Form farbloser Stäbchen kristallisierte.

10984 5/ΊΠ1

2118R36

Eigenschaften:

Schmelzpunkt: 21b - 219⁰C;
Γ *■ 7-η + 260° (e, 1,0296,

Analyse

Für C₁₁Hp₁OgNo

berechnet: C 44,7'5; H 7,17; N 4,74; S 10,86; gefunden : C 44,89; H 7,02; M 5,16; S 10,64.

Molekulargewicht

berechnet: 295»36;

gefunden (iViassenspectrometrie): 295.

Teil 28 B: Deacetylierung.

Das kristallisierte Material aus Teil 28 A wurde mit den Mutterlaugen vereinigt und am Rotationsverdampfer bei 40°C / 7 mm zur Trocicne eingeengt. Man erhielt 2,01 g Feststoff, der über Nacht unter Rühren und mäßigem Rückfluß mit 40 ml Hydrazinhydrat erhitzt wurde. Nach Entfernen des Lösungsmittels von der farblosen Lösung an einem Rotationsverdampfer bei 7 mm Druck und bei 120 C im Ölbad verblieb ein farbloser, kristalliner Rückstand, der aus Metnanol umkristallisiert wurde. Man ernielt Methyl-7-desoxy—7(S)-hydroxy-oc-thiolineosaminid (XXXVII) als farblose Plättchen mit folgenden Eigenschaften:

Schmelzpunkt: 211 - 212°C;

109845/1941

Z"a_7_D + 280° (c, 0,7728, HgO).

Analyse

Für CqH4q0p-NS

berechnet: G 42,67; H 7,56; H 5,53; S 12,66; gefunden : C 42,81; H 7,69; N 5,85; S 12,73.

Molekulargewicht

berechnet: 253,32;

gefunden (hassenspectrometrie): 253·

Beispiel 29:

Methyl -H-acetyl-2,3 ^-tri-ü-acetyl-^Sj-äthoxy-^-desoxycc-thiolincosaminid (XV) und

Methyl-N-acetyl-2»3,4-tri-0-acetyl-7(S)-acetoxy-7-desoxya-thiolincosaiainid (XXXIX).

CH, CH,

OÄt

OAc

AcNH —I und ^AcNH !

AcO₁ '■ ° AcO J °

¹ 1 öf-ie J J SMe

OAc OAc

XV . XXXIX

109845/19A1

Verwendete man in dem Verfahren des Teils 19 B Äthanol anstatt Methanol, so erhielt man Methyl-N-acetyl-2,3,4-tri-0-acetyl-7(S)-äthoxy-7-desoxy-a-thiolincosaminid (XV), [ identisch mit dem Produkt in Teil 22 Bj, und in geringerer Menge N-Acetyl-2,3»4-tri-0-aoetyl-7(S)-acetoxy-7-desoxy-oc-thiolincosaminid (XXXIX), das durch G-egenstromverteilung. nach Craig in 500 Stufen mit dem Lösungsmittelsystem 1 ÄtOH : 1 EUO : 1 ÄtOAc : 1,5 Cyclohexan abge trennt wurde. Der kleinere Bestandteil (XXXIX) wurde aus den Röhren 14Ü - 200 (K = 0,52) und der größere Bestandteil (XV) aus den Röhren Nr. 260-330 (K = 1,43) erhalten. Kristallisation des kleineren Bestandteils (XXXIX) aus Äthylacetat ergab farblose Nadeln mit folgenden Eigen schäften:

Schmelzpunkt; 312 - 313°C.
Z>7_D + 182° (c, 0,5898, CHGl₃).

Analyse

Für C₁₉H₂₉O₁₀NS

berechnet: C 49,22; H 6,31; N 3,02; S 6,92; gefunden: C 49,17; H 6,51; N 3,08; S 6,81.

Molekulargewi cht

berechnet: 463,50;

gefunden (Massenspectrometrie): 463.

Nach Hydrazinolyse des kleineren Bestandteils erhielt man mit dem Produkt des Teils 28 B identisches Methyl-7-desoxy-7(S)-hydroxy-a-thiolincosaminid (XXXVII).

109845/1941

Beispiel 30:

Teil 30 A: 2'-Hydroxyäthyl-N-acetyl-2' ,2,3,4-tetra-O-

acetyl-7-0-methyl-l-thio~<x--lineosaminid (XL)

CH^O
AcMH

AcO

OAo

OAc

I / S-CH₂-CH₂-O-Ac

l»0 g 2'-Hydroxyäthyl-l-thio-a-celestosaminid (Seispiel 3 eier USA-Patentschrift 3 255 174) wurde in 25 ml

Pyridin und 12 ml Essigsäureanhydrid gelöst und über Hacht abgestellt. Nach Entfernung des Lösungsmittels im Vakuum erhielt man ein farbloses Öl» das in Chloroform gelöst und mit Wasser, verdünnter wässriger Salzsäure» Wasser, gesättigtem wässrigem Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen wurde. Das Gemisch wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt» Man erhielt 2_fO3 g Syrup, der nach Kristallisation aus Äthylacetat/techn. Hexan (Skellysolve B) 2¹-

Hydroxyäthyl-N-acetyl-2 · , 2,3,4-tetra-O-acetyl-7-O-methyl-. 1-thio-a-lincosaminid (Formel XL) in Form abgeflachter, farbloser Prismen ergab.

ORJGiNAL INSPECTED

109845/1941

Schmelzpunkt: 143 -

Analyse

- 94 -

144°C;

Für ^G2i^H33°ll^NS

berechnet 0 49,68; H 6,54; N 2,76; 8 6,32 ^ gefunden: 0 49,66; H 6,50; N 2,91; S 6,34$

+ 216° (c, 0,7746, CHCl,) .

Teil 30 B: Methyl-N-acetyl-2, 3,A-

1-thio-a- una -ß-lincosaminide, (XLI und XLII).

CH₃O
AcHH

AcO

und

OAc

' SCH

OAc

CH₃O-

AcNH-

AcO h—O

SCH,

OAc

XLI

XLII

Eine Lösung von 10 g 2^l-Hydroxyäthyl-N-acetyl-2^l , 2,3,4-tetra~0-acetyl-l-thio-a-celestosaminid (hergestellt nach dem Verfahren von Teil 30 A) in 200 ml Chloroform

109845/1941

ORIGINAL INSPECTED

wurde innerhalb von etwa 30 Minuten aus einem Druckaus gleich-Tropftrichter unter Rühren und unter wasserfreien Bedingungen mit einer Lösung von 5.05 g (1,62 ml) Brom in 100 ml Chloroform versetzt. Zunächst verschwand die Bromfarbe augenblicklich, später entwickelte sich ein tief orange-roter Farbton. Nach weiterem halbstündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde das Lösungsmittel an einem Rotationsverdampfer bei 40⁰C / 7 mm entfernt , man erhielt einen gelblich-orangefarbenen, syrupartigen Rückstand. Diesen löste man wieder in Chloroform, entfernte das Lösungsmittel im Vakuum und wiederholte den Prozeß so lange* jis das Destillat farblos wurde und ein gelblicher amorpher Rückstand von l-Brom-T-O-methyl-ß-lincosamin-tetra-acetat der Foi-mel

CH.

CH,0 —
AcNH —

AcO

0.

XT¹*

OAc

erhalten wurde.

Der Rückstand wurde in 200 ml trockenem Dimethyl formamid gelöst, mit 4,5 g Thioharnstoff versetzt und das Reaktionsgemisch (farblose Lösung) über Wacht bei Raumtemperatur gerührt. Es bildeten sieh die Isothio uroniumsalze der Formeln:

c-^CmU 0 9 8 4 5 / 1 9 A 1 ORIGINAL INSPECTED

CH,

CH,0

und

AcNH

AcOT

-0

NOAc

OAc

XLIV

XLV

Ohne Isolierung der Salze und nach Kühlung in einem Eisbad wurden langsam 100 ml Wasser und anschließend 8,3 g wasserfreies Kaliumcarbonat, 10,6 g Natriumbisulf at und 28 g (12,3 ml) Methyljodid zugesetzt. Das Gemisch wurde drei Stunden lang kräftig mit einem Magnetrührer gerührt, das Kühlbad wurde nach 20 Minuten entfernt.

Flüchtige Stoffe wurden im Vakuum bei 40⁰C und schließlich bei 80⁰C/< 1 mm entfernt. Der gelbe fiückstand wurde in einem Chloroform/Wasser-Gemiseh gelöst, die wässrige Schicht wurde mit Chloroform extrahiert und die vereinigten Chloroformextrakte wurden zweimal mit Wasser gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet» Nach Entfernung des Lösungsmittels im Vakuum verblieb ein farbloser amorpher Rückstand (6,48 g). Bei der Dünnschicht-Chromatographie (Aceton/Hexankohlenwasserstoffe 1:1) zeigte sich eine größere Zone des Produktes mit einer kleinen Zone mit geringfügig höherem R^

109845/1941

Dieses Material wurde in einem Aeeton/Hexankohlenwasserstoff-System (1 : 1,5) an 1,2 kg Silikagel (Säulengröße 5,8 χ 90 cm) Chromatograph!ert. Nach 500 ecm Vorlauf wurden 50 ccm-Fraktionen automatisch aufgefangen und nach Eluierung der Stoffe wurde IXinns chi cht-Chromatographie durchgeführt. Fraktionen Nr. 145 - 173 ein schließlich entsprachen dem Material mit höherem R^-Wert, Fraktionen Nr. 185-310 einschließlich entsprachen dem Hauptprodukt, Fraktionen Nr. 174-184 waren ein Gemisch aus beiden.

Nach Entfernen des Lösungsmittel von den ver einigten Fraktionen 145 - 173 in vacuo blieben 570 mg eines farblosen Syrups zurück, der nach Kristallisation aus Äthylacetat/Hexankohlenwasserstoffen Methyl-N-acetyl-2,3,4-tri-0-acetyl-7-0-methyl-l-thio-a-lincosaminid in Form von kleinen, farblosen Prismen bildete. Schmelzpunkt 212-213°C, der sich bei Mischung mit einer Probe nach Beispiel 31 (Teil 31 G) mit dem Schmelzpunkt 211,5 - 213°C nicht erniedrigte, auch nicht, davon unter scheidbar durch Infrarot-, NMR- und Massen-Spektrum, noch durch optische Drehung.

Nach Entfernung des Lösungsmittels in vacuo von den vereinigten Fraktionen 185 - 310 erhielt man 4_f 23 g eines schwachgelben, amorphen Feststoffes, der nach Kristallisation Methyl-N-acetyl^^^-tri-O-acetyl^-O-methyl-1-thio-ß-lincosaminid in Form farbloser Prismen mit dem Schmelzpunkt 187-188⁰C bildete.

Analyse

109845/1941

berechnet: G 49,64; H 6,71; Ii 3,22; S 7,36; MeO 7,15; gefunden ι G 49,73; H 6,95; N 3,18; S 7,64; MeO 7,41.

f OiJ-Q + 24° (c, 0,7484, CHGl₃);

Mol ekulargewi cht

berechnet: 435,49;

gefunden! (Massenspektrometrie, M ) :

435.

Die Gesamtausbeute der Einführung der SMe-Gruppe (d.h. α- und ß-Anomeren) betrug 49,2 $ (6,7$ α, 42,5$ B), wobei das Verhältnis von α zu ß 1 : 6,35 betrug. Das ß-Anomere kann in den Prozeß des Teils 30 B rückgeführt und damit die Gesamtausbeute des bevorzugten a-Anomeren gesteigert werden.

Teil 30 Cs

In Wiederholung des Verfanrens von Teil 30 B wurde anstatt Methyl formamid Hexamethyl -phosphortriamid £ (Me₂K") J?=0_7 verwendet. Die Gesamtausbeute betrug 65»5 #, davon 22,7 # α und 42,8 <$> Q, was einem Verhältnis a/ß von 1 : 1,9 entsprach.

Teil 30 D-I: · Methyl-7-O-methyl-l-thio-a-lincosaminid (XLVI).

R-O

NH

2
HO

CH,

3H

S-Alkyl

OH

109845/1941

XLVI

ORIGINAL INSPECTED

1,46 g hethyl-7-Ü-methyl-l-thio-a-lincosaminidtetraacetat wurden in 50 ml Hydrazinhydrat gelöst und 24 Stunden unter mäßigem Rückfluß bei 15b G in einem Ölbad erhitzt. Bas flüchtige Lösungsmittel T»;urde dann so weit als möglich durch Destillation bei HO⁰C / 15 mm entfernt, wobei ein farbloser kristalliner Rückstand erhalten wurde, der mit wasserfreiem Acetonitril trituriert wurde. Der Feststoff abfiltriert und getrocknet. Nach Kristallisation aus einem Konzentrat von 95 # Äthanol ergab 430 mg Methyl-T-O-methyl-l-thio-a-lincosaminid-halbhydrat (PoIymorph I) in Form abgeflachter, farbloser Nadeln, Schmelzpunkt 126 - 126,5°C.

Analyse

Für C₁₀H₂₁O₆HS.1/2 H₃O

berechnet: 0 43,46; H 8,03; N 5,07; S 11,60; OMe 11,23;

Mol.Gewicht (wasserfrei) 267,35;

gefunden: C 43,63; H 8,30; N 5,18; S 11,67; OMe 11,74. pKa· 7,1;

+ 263° (c, 0,8284, HgO);

Molekulargewicht (Massenspectrometrie, M⁺): 267.

Teil 30 D-2:

In Wiederholung des Verfahrens von Teil 30 D-I wurde die Kristallisation langsam in einer verdünnteren Lösung in 95 i» Äthanol herbeigeführt. Es entstanden farblose

109845/194

2118638

Plättchen des Methyl-7-O-methyl-l-thio-a-lincosaminidhalbhydrats; Schmelzpunkt 162 - 163°C (Polymorph II).

Beide Polymorph-Formen zeigten identisches chromatographisches Verhalten (R~ 0,2 bei Dünnschicht-Ohr oma- ■ tographie an Silikagel in Methanol/Chloroform im Vol.verh.

1:15).

I und II

II und II
I und II

Schmelzp.
Schmelzp.
Schmelz

126 -

- 163° C

regenwart der Form IL/vird also die Form I bei femperatur unterhalb yfe C in die Form II über -

Teil 30 E: T-O-Methyl-lincomycin-hydrochlorid (XLVII)

ca.

HO .·

OH

SCH,

OH

XLVII

.HCl

109845/1941

Ein Gemisch aus 3.08 g 4-trans.- Propyl-hygrinsäure-hydrochlorid und 75 ml Acetonitril wurde in einem mit Trockenröhre und die ELüssigkeitsoberfläche erreichendem Thermometer ausgestatteten 500 ml Dreihalskolben magnetisch gerührt. Nach Zugabe von 3»31 g Triäthylamin wurde der Feststoff rasch zu einer fahlbraunen (pale tan) Lösung gelöst.

Nach Kühlung im Eis/Methanol-Bad auf -5 0 wurde ein farbloser Niederschlag von Triäthylammoniumchlorid abgetrennt. Ohne diesen Niederschlag zu entfernen, wurden 2jO2 g (1,94 ml) Isobutyl-chlorformiat in solch einer Geschwindigkeit zugesetzt, daß die Temperatur zwischen -5°C und 8°C gehalten wurde. Danach wurde 15 Minuten bei -5°C weitergerührt.Dann wurden der obigen gemischten Anhydrid-Lösung rasch 2,0 g Methyl-7-O-methyl-l-thio-ctlincosaminid in 25 ml Wasser zugesetzt, wobei eine fahlbraune Lösung erhalten wurde, die 45 Minuten bei 0 C gerührt wurde. Dünnschicht-Chromatographie an Silikagel (Äthylacetat/Aeeton/Wasser im Volumenverhältnis 8:5sl) zeigte lediglich eine Spur restLichen Aminozuckers sowie eine große neue Zone mit R^ = 0,4. Das leichtflüchtige Lösungsmittel wurde bei 40 C in vacuo entfernt, die fahle wässrige Restlösung durch Zugabe von wässrigen Natriumhydroxid (N) auf pH 10 eingestellt und das Gemisch dreimal mit je 100 ml Chloroform extrahiert und die vereinigten Extrakte wurden mit Wasser gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Nach Entfernung des Lösungsmittels in vacuo bei 40 C blieb ein, fahl brauner amorpher Peststoff zurück (2,32 g).

Man führte eine Chromatographie an 450 g Silikagel (Säulengröße 3,8 χ 95 cm) mit Methanol/Chloroform im

109845/1941

113636

Volumenverhältnis 1 : 15 durch, bei der nach 250 ml Vorlauf automatisch 25 ml-Fraktionen aufgefangen wurden. Aus Fraktionen 44-70 gewann man nach Entfernung des Lösungsmittels in vacuo 2,20 g 7-0-Methyl-lincomycin als einen farblosen Sirup. Dieser Sirup wurde unter Rühren in 5 nil Wasser und durch Zugabe von konzentrierter Salzsäure, um einen pH von 3 zu erzielen, gelöst. Die Lösung wurde unter Saugwirkung filtriert, der Sinter mit 3 ml Wasser gewaschen und Filtrat und Waschlaugen im Ei s/m ethanol-Bad gekühlt. Unter Rühren wurden 200 ml Aceton und dann 100 ml Äther zugesetzt. Es bildete sicn ein farbloser kristalliner Niederschlag, der abgezogen und im Vakuumexsikkator bei Raumtemperatur getrocknet wurde. Es wurden 1,71 g Feststoff in kleinen, länglichen farblosen Plättchen erhalten. Schmelzpunkt 155-157°C.

Analyse
Für C₁

HCl

berechnet: C 49,93; H 8,16; N 6,13; S 7,02; Cl 7,76;

OMe 6,79;

Molekulargewicht (freie Base) 420,57;

gefunden? (4,83 # Wasser berücksichtigt)

C 50,09; H 8,22; N 6,02; S 7,20; Cl 7,46;

OMe 7,03.

[ α 7_D + 145° (c, 1,063, H₂O); pKa« 7,6.

109845/1941

Molekulargewicht (Massenspektrometrie, M der freien Base): 420.

Das so erhaltene 7(R)-0-feethyl-lincomycin kann nach dem vorliegenden neuartigen Verfahren zum entsprechenden 3-Nucleotid weiterverarbeitet werden.

Beispiel 31 i

Teil 31 A-I: Methyl-N-acetyl-2-O-acetyl~3f4-0-isopropyliden-1-thio-a-lincosaminid (XLVIII).

0 ^H0

Il

CH₅C-NH

XLVIII

5 g Methyl-6-N,7-0-äthylidin-3,4~0-isopropyliden-1-thio-a-lineosaminid (Beispiel 1 C der USA-Patentschrift 3 337 527 ) wurden zur Acetylierung über Efacht bei Raumtemperatur in einem Gemisch aus 25 ml Pyridin und 12 ml Essigsäureanhydria abgestellt. Bas Lösungsmittel wurde am Rotationsverdampfer bei 40 C in vacuo entfernt, wobei ein fahlgelber Sirup erhalten wurde. Der Sirup wurde in Chloroform gelöst, mit Wasser, gesättigtem wässrigem Na-

109845/1941

triumbiearbonat und nochmals mit Wasser gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Die Dünnschicht-Chromatographie (Silikagel, Methyläthylketon/ Aceton/Wasser im Volumenverhältnis 75 : 25 : 10) zeigte, daß kein Ausgangsstoff vorhanden war und eine neue Zone mit etwas höherem R--Wert ausgebildet war. Nach Entfer nung des Lösungsmittels in vacuo bei 40 C wurde Methyl-2-0-acetyl-6N,7-0-äthylidin-3,4-0-isopropyliden-l-thio-alincosaminid als ein fast farbloser Sirup erhalten, der nicht zum Kristallisieren gebracht werden konnte.

75 ml Wasser mit dem pH-Wert von 7 wurden unter magnetischem Eühren zugesetzt. Das G-emisch wurde auf einem Dampfbad erhitzt. Nach 6 Stunden wurde das Lösungsmittel bei 40 C in vacuo entfernt, 'wobei 5,95 g eines farblosen kristallinen Feststoffes erhalten wurden, der an 600 g Silikagel (Säule 4,8 χ 79 cm) in Methanol/Chloroform im Volumenverhältnis 1 : 7 chromatographyert wurde. Nach 650 ecm Vorlauf wurden automatisch 25 ml Fraktionen aufgefangen. Nach dem Eluieren folgte Dünnschicht-Chromato graphie. Das gewünschte Produkt befand sich in den Fraktionen 35-41. Nach Entfernen des Lösungsmittels wurden 1.5.7 g eines farblosen amorphen Feststoffes erhalten. Durch Umkristallisieren aus Aceton/techn. Hexankohlenwasser stoffen erhielt man farblose Nadeln von Methyl-N-acetyl-2-0-acetyl-3,4-0-isopropyliden-l-thio-a-lincosaminid; Schmelzpunkt 178 - 179°C

Analyse

Für C₁₆H₂₇O₇NS

103845/1941

118636

berechnet: C 50,92; H 7,21; N 3,71; S 8,49;

Molekulargewicht 377,46;

gefunden : G 50,50; H 7,20; N 3,77; S 8,50.

Molekulargewicht (Massenspektrometrie, M⁺): 377. Teil 31 A-2:

In Wiederholung des Verfahrens nach Teil 31 A-I wurde das Lösungsmittel nun nach einer Erhitzungs -

zeit von 2 Stunden (anstatt von 6 Stunden) entfernt. Die Ausbeute an Methyl-N-acetyl-^-O-acetyl-^^-isopropiliden-1-thio-a-lincosaminid erhöhte sich auf 60,5$«

Teil 31 B: Methyl-N-acetyl^-O-acetyl-^-O-methyl-^,4-0-isopropyliden-1-thio-a-lincosaminid (XLVIX).

CH,

Il

HO

.0

XLVIX

S-Alkyl

OAo

1,0 g (1 Mol) Methyl-N-acetyl-2-0-aoetyl-3,4-0-isopropyl-

109848/1941

2113638

iden-l-thio-a-lincosaminid, 37,6 g (16,5 ml, 100 nol) Methyljodid und 3,1 g (5 Mol) Silberoxid wurden erhitzt und 16 Stunden unter mäßigem RückfluiS gerührt. Das Methyljodid wurde bei 40 C in vacuo entfernt, das zurückbleibende gelbgraue Pulver wurde gründlich mit Methylenchlorid extrahiert. Nach Entfernung des Lösungsmittels in vacuo wurden 1,09 g eines gelben Sirups erhalten. Dieses Rohprodukt wurde einer Gegenstromverteilung (500 Stufen) t in Äthylacetat/Äthanol/Wasser/Cyclohexan im Volumenverhältnis 1:1 : 1 : 2 unterworfen, wobei man gleiche Volumina der oberen und unteren Phase verwendete. Es wurde ein Hauptpeak von K= 0,34 gefunden, was der theoretischen Kurve entsprach.

Nach Entfernen des Lösungsmittels aus den ver einigten Fraktionen des Materials von K = 0,34 wurden 250 mg eines Sirups erhalten, der nach Stehen kristallisierte. Nach dem Umkristallisieren aus Äthylacetat/techn. Hexankohlenwasserstoffen wurden 160 mg Methyl-N-acetyl-2-0-acetyl-7-0-methyl-3,4-0-isopropyliden-l-thio-a-lincosaminid in Form stumpfer (blunt), farbloser Nadeln mit fc dem Schmelzpunkt 152-154 0 erhalten. Durch eine zweite Umkristallisation aus dem gleichem Lösungsmittel gemisch erhielt man das reine Produkt; Schmelzpunkt 152,5 - 154 C.

Analyse

Für C₁₇H₂₉O₇NS

berechnet: C 52,15; H 7,47; N 3,58; S 8,19;

Molekulargewicht 391,48; gefunden: C 52,24; H 7,48; N 3,92; S 7,98.

ORIGiWAL INSPECTED

109846/1941

2118638

Molekulargewicht (Massenspektrometrie, M⁺): 391. £ OiJ-Q + 188° (c, 1,185,

Teil 31 G: Methyl-N-acetyl-7-O-methyl-l-thio-a-lincosaminid und dessen Tri-acetat.

CH₃

RO

Il

CH,C-NH

HO

1 S-Alkyl

OH

100 mg Methyl-N-acetyl^-O-acetyl^j/V-O-isopropyliden-1-thio-a-lincosaminid wurden über Nacht bei Raumtemperatur mit 20 ml Wasser und 5 ml wässriger Salzsäure (N) gerührt. Zur Neutralisierung wurde die Lösung mit 3 g SiI-bercarbonat gerührt. Die Feststoffe wurden abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Das Piltrat und die Waschlaugen wurden am Rotationsverdampfer bei 60 G /7 mm zur Trockene eingeengt, wobei Methyl-N-acetyl-7-O-methyl-l-thio-oc-lincosaminid als farbloser, nicht kristallisierender Sirup erhalten wurde. Zur weiteren Charakterisierung wurde dieses in das Tri-acetat übergeführt.

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5 ml Pyridin und 3 ml Essigsäureanhydrid wurden zugesetzt. Das Gemisch wurde gerührt, bis sich der Sirup gelöst hatte» Dann stellte man das Gemisch, über Nacht bei Raumtemperatur ab. Anschließend wurde das Lösungsmittel bei 40⁰C / <1 mm so vollständig als möglich entfernt, wobei ein dunkelgelbes kristallines Gemisch erhalten wurde, das in Chloroform gelöst, mit wässriger 0,1η Salz saure, Wasser, gesättigtem wässrigem Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet wurde. Nach Entfernung des Lösungsmittels in vacuo wurde Methyl-N-acetyl-2, 3»4«-tri-0-acetyl-7-C-methyl*· l-thio-cc-lincosaminid als ein nahezu farbloser , kristalliner Feststoff erhalten, der aus Äthylacetat/techn. Hexankohlenwasserstoffen in kleinen, farblosen Prismen aus kristallisierte.

Schmelzpunkt: 211,5 - 213°C*
Analyse

berechnet: C 49,64; H 6,71; N 3,22; S 7,36; MeO 7,13;

Molekulargewicht: 435,49;

gefunden: G 49,72; H 6,77; N 3,36; S 7,27; MeO 7,08.

[ α J_B + 229° <e, C, 7174, CHCl₃); Molekulargewicht (Massenspektrometrie, M⁺): 435.

Anstelle von Methyljodid wurden Äthyl-, Propyl-, Butyl-, Isobutyl-, sec. Butyl- und tert.-Butyljodid zur Herstellung der entsprechenden 7-0-(nieder.)-Alkyl-Analogen eingesetzt.

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Anstelle des 4-Propylhygrinsäure-hydrochlorids (l-Methyl-4-trans -propyl-L-2-pyrrolidin-carbonsäure-hydrochlorid) können die Hydrochloride anderer L-2-Pyrrolidincarbonsäuren der Formel

R₁

OH

worin R« ein Wasserstoffatom oder einen niederen Alkylrest, wie den Methyl- oder Äthylrest, und R₁ ein Wasserstoffatom oder einen niederen Alkylrest, z.B. den Methyl-, Äthyl-, Propyl-, Butyl-, Pentyl-, Hexyl-, Heptyl-, Octyl- sowie deren isomere Formen, oder einen niederen Cycloalkylrest, wie einen Cyclopentyl-, Cyclohexyl- oder Cyclohexylmethylrest bedeuten, zur Herstellung von Verbindungen der folgenden Formel

ti

CH,O-

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2 ! 18636

worin R„ und R₁ die vorstehend angegebene Bedeutung besitzen, eingesetzt werden. Die entstehenden Lincomycin-Verbindungen können nach den erfindungsgemäßen neuartigen Verfahren in die entsprechenden neuen 3-Nucleotide übergeführt werden.

ORIGINAL INSP5CTPD

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Claims

- Ill -

Patentanspili ehe:

Verbindung aer Formel

R,

CH₅

< I öb3b

ti

NH

OH

in der Y einen -SR-Rest, wobei R einen Alkylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen darstellt,

einen -S-

It

_Ί_ο -c —.-·

HO

Ort**-

, feinen -S-CH₂-CH₂-OH

ιQn Πι

sowie deren isomere Formen,

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R₁ ein Wasserstoffatom oder einen eis- oder trans-Niederalkylrest mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, R₂ ein Wasserst off atom, einen CH,- oder CgHppRest, X einen OH-Rest, ein Chlor-, Brom- oder Jodatom, einen -OR-z-Rest, wobei R, einen Alkylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen darstellt und zwar jeweils in der (R)- oder (S)-Konfiguration, und Z eine Nucleosid-5'-phosphatgruppe, deren Nucleosid Adenosin, Guanosin, Cytidin oder Uridin ist, bedeuten, sowie deren Salze.
2. Die zwitterionische Form der Verbindung nach Anspruch 1.
3. Verbindung nach Anspruch 1 der Formel

HO

GH,

HO /

ι/

l\oz

OH

in der Y, R₁ und R₂ die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben, und Z eine Nueleosid-5'-phosphatgruppe, deren Nucleosid Adenosin, Guanosin, Cytidin oder Uridin ist, bedeutet, sowie deren Salze.

109846/1941
4. Verbindung nach Anspruch 3 der Formel

GH,

n-C

3^H7

HO

ft

HO/

f>OZ

K SCH

OH

in der Z eine IMucleosid-S'-phosphatgruppe, deren Nucleosid Adenosin, Guanosin, Cytidin oder Uridin ist, bedeutet, sowie deren Salze.
5. Verbindung nach Anspruch 3 der Formel

CH,

HO

NH

HO

,OZ

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I M α

- 114 -

in der Z eine Nucleosid-5'-phosphatgruppe, deren Nucleosid Adenosin, Guanosin, Gytidin oder Uridin ist, und R* einen CEU-Rest bedeuten.
6. Verbindung nach Anspruch 1 der Formel

GH,

Halo

HO/"⁰

OZ

OH

in der der "Halo-Rest" ein Chlor oder ein Bromatom bedeutet und Y, R₁, R₂ und Z die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben, sowie deren Salze.

7. Verbindung nach Anspruch 6 der Formel:

109845/1941

INSPECTED

*3 C Il O I N n-C_xI
ι ^y N

- 115 -

Cl

HO

OZ

SR,

OH

in der Z eine Nueleosid-5'-phosphatgruppe, deren Nucleosid Adenosin, G-uanosin, Cytidin oder Uridin ist, und R* einen CH^-Rest bedeuten, sowie deren Salze.

8. Verbindung nach Anspruch 6 der Formel

Cl

in der Z eine Nucleosid-5¹-phosphatgruppe, deren Nucleosid

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Adenosin,- Guanosin, Cytidin oder Uridin ist, und einen CH~-Rest bedeuten.
9. Verbindung nach Anspruch 1 der Formel

CH

Halo

OH

in der der "Halo"—Rest ein Chlor- oder ein Bromatom, R, einen CH^-Rest-, R^ einen Pentyl-Rest und Z eine NucleOsid-5^l-phosphatgruppe, deren Nucleosid Adenosin, G-uanosin, Cytidin oder üridin ist, bedeuten , sowie de · ren Salze.
10. Verbindung nach Anspruch 9 der Formel:

109845/1941

.ο

CH

01

HO /[" O

OH

in der IU einen CH^-Rest, R₁ einen Pentyl-Rest, und Z eine Nucleosid-5'-piiosphatgruppe, deren Nucleosid Adenosin, Guanosin, Gytidin oder Uridin ist, bedeuten, sowie deren Salze.
11. Verbindung nach Anspruch 9 der Formel

CH,

Cl

109845/19Λ1

211

8638

- 118 -

in der Z eine hucleοsid-5'-phosphatgruppe, deren Nucleosid Adenosin, G-uanosin, Gytidin oder Uridin ist,. R., einen GH^-Rest, und R, einen Pentylrest bedeuten.
12. Verbindung nach Anspruch 1 der Formel

Halo

in der der ^!fHalo"-Rest ein Chlor- oder ein Bromatom, R, einen CEU-Rest, R-, einen Pentylrest, R ein Wasserstoff atom und Z eine Nueleosid-5^?-phosphatgruppe, deren Nucleosid Adenosin, Guanosin, Gytidin oder Uridin ist, bedeuten, sowie deren Salze.
13. Verbindung nach Anspruch 12 der Formel:

109845/1941

ORlQlMAL INSPECTED

211

3636

- 119 -

Il

GH.

NH

HO

Cl

} OZ

J SR OH

in dei- R~ einen GH^-Rest, R₁ einen Pentylrest und Z eine Nucleosid-5¹-phosphatgruppe, deren hucleosid Adenosin, G-uanosin, Cytidin oder üridin ist, bedeuten, sowie deren öalze.
14. Verbindung nach Anspruch 12 der Formel

^H ©

Il

CH

Gl

NH

HO /\ 0

ί SR₃

OH

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in der R^ einen CH^-Rest, R₁ einen Pentylrest und Z eine Nucleosid-5'-phosphatgruppe, deren Nucleosid Adenosin₅ G-uanosin, Cytidin oder Uridin ist, bedeuten.
15· Verbindung nach Anspruch 1, wobei Y der Formel einen -SCEz-Rest, R₁ einen Propyl-Rest, R₂ einen CH-z-Rest, X ein Chloratom und Z eine Nucleosid-5¹-phosphatgruppe, deren Nucleosid Cytidin ist, bedeuten.
16. Verbindung nach Anspruch 1, wobei Y der Formel einen -SCH^-Rest, R₁ einen Propyl-Rest, R_? einen CH,-Rest, X ein Chloratom und Z eine Nucleosid-5'-phosphatgruppe, deren Nucleosid Adenosin ist, bedeuten»
17. Verbindung nach Anspruch 1, wobei Y der Formel einen -SCH^-Rest, R₁ einen Propyl-Rest, Rp einen CEU-Rest, X ein Chloratom und Z eine Nucleosid-5'-phosphatgruppe, deren Nucleosid Uridin ist, bedeuten.
18 ο Verbindung nach Anspruch 1, wobei Y der Formel " einen -SCfi^-Rest, R₁ einen Propyl-Rest, R„ einen CH,-

Rest, X ein Chloratom und Z eine Nucleosid-5¹-phosphatgruppe, deren Nucleosid G-uanosin ist, bedeuten.
19. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der Formel s

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GH

H(

Γ/

OH

OH

in der R,, Rp, X und Y die in Anspruch 1 angegebene Be deutung haben, in das Fermentationsmedium einer Streptomyces - Fermentation einarbeitet.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung von Verbindungen der Formel

CH,

It

HO /

Cl

SCH.

OH

in der Z eine Mucleosid-S'-phosphatgruppe, deren Nucleosid

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2113636

Adenosin, G-uanosin, Gytidin oder üriciin ist, bedeutet, eine Verbindung der Formel

GH,

n-C

G 0

GH,

Cl

-

OH

OH

in eine Fermentation von Streptomyces coelicolor Müller, NRBL 3532 einarbeitet.
21. Verfahren nach Anspruch 19» dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung von Verbindungen der Formel s

109845/1941

2113636

CH,

Gl

It

HO

f OZ

' 1—ι

och.

OH

in der Z eine Nueleosid-5¹-phosphatgruppe, deren Nucleosid Adenosin, Guanosin, Cytidin oder Uridin ist, bedeutet , eine Verbindung aer Formel

CH

Cl

-N ■„. η ( JMiI OH
- j ,11-C₅H₇ _/ Kj i Il
O HO .Γ*"⁰·, ¹

OH

in eine Fermentation von Streptomycea venezuelae, NRRL 3527 einarbeitet.

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22. Verfahren zur Isolierung einer Verbindung der Formel

NH

in der R-, , Rp, Z, X und Y die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben* aus einem Streptomyces - Fermentationsmedium, dadurch gekennzeichnet, daß man

1. das Fermentationsmedium filtriert;

2. das Filtrat zur Entfernung wasserlöslicher Verunreinigungen an einem geeigneten Mittel absorbiert;

3. das erhaltene Eluat aus dem Absorbens an eine» Anionen -Austauscherharz chromatographiert;

4. die vom Anionen-Austauschharz erhaltenen Fraktionen der Gegenstromverteilung unterwirft, und

5. die einzelnen 3-Nucleotide chromatographisch trennt.

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23· Therapeutisches Präparat, enthaltend eine Verbindung nach Anspruch 1 ode^ihre pharmakologisch verträglichen Salze als Wirkstoff zusammen mit einem pharmazeutischen Träger.
24. Therapeutisches Präparat in Form einer Dosierungseinheit enthaltend etwa 25 bis etwa 500 mg einer Verbindung nach Anspruch 1 oder ihre pharmakologisch verträglichen Salze als -wesentlicher Wirkstoff zusammen mit einem pharmazeutischen Träger.
25. Therapeutisches Präparat, enthaltend 5 bis etwa 82 i» einer Verbindung nach Anspruch 1 oder deren pharmakologiseh zulässigen Salze als wesentlichen Wirkstoff zusammen mit einem pharmazeutischen Vehikel.
26. Steriles Präparat für parenterale Verabrei chung, enthaltend etwa 5 bis etwa 82 ^ (Gew./Vol.) einer Verbindung nach Anspruch 1 oder deren pharmakologisch zulässigen Salze als wesentlichen Wirkstoff zusammen mit einem sterilen Vehikel.
27» Pharmazeutisches Präparat zur Behandlung darauf ansprechender Mikroben-Infektionskrankheiten bei Mensch und Tier, enthaltend eine wirksame Menge einer Verbindung nach Anspruch 1 oder ihrer pharmakologisch zulässigen Salze zusammen mit einem pharmazeutischen Träger.
28. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 27 in Form einer Dosierungseinheit, dadurch gekennzeichnet,

109845/1

2 1 ί ββ3β

daß es etwa 25 bis etwa 500 mg der wirksamen Verbindung oder ihrer pharmakalogisch zulässigen Salze enthält.
29. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß die Dosis der wirksamen Ver bindung pro Tag etwa 1 mg/kg bis etwa 50 mg/kg beträgt.
30, Pharmazeutisches Präparat zur Vorbeugebehand lung darauf ansprechender infektiöser Mikrobenkrankheiten, enthaltend eine wirksame Menge einer Verbindung nach Anspruch 1 oder ihrer pharmakologisch zulässigen Salze zu sammen mit einem pharmazeutischen Träger.
31 ο Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 30 in Form einer Do si e rungs einheit, enthaltend etwa 25 bis etwa 500 mg der wirksamen Verbindung der Formel

H. Q

CH₅

HO /Ί 0

OH

OHKSlNAL INSPECTED 109845/1

in der R,, L₁ Z, X und Y die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben, oaer ihrer pharmakologisch zulässigen Salze.

Für: The Upjohn Company

Rechtsanwalt

^i! ^m'^iUf 109845/1941 „.-■