DE1620597A1 - Decoyinintriester und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents

Description

Decoyinintriester und Verfahren zu ihrer Herstellung

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Decoyinin-triester der allgemeinen Formel

H-JST-H

CH

CH₂OR

OR OR
in der R eine Kohlenwasserstoffcarbonsäureacylgruppe mit 2 bis einschliesslich 12 Kohlenstoffatomen, eine Halogen-, Hitro-, Hydroxy-, Amino-, Cyan-, Thiocyan- oder niedrig-alkoxysubstituierte Kohlenwasserstoffcarbonsäureaeylgruppe mit 2 bia einsohliesslich 12 Kohlenstoffatomen oder eine niedere Alkoxycarbonylgruppe bedeutet, sowie ein Verfahren zu

009820/1821 Neu* Unterlagen (Art. /1 τ At», a Nr. ι

SAD OB/G/MAL

deren Herstellung, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man Decoyinin der Formel

OH,

OH

OH ^ÖH2°^H

mit etwa 3 Mol eines Acylierungsmittels, das ein Säureanhydrid- oder Säurehalogenid mit einem Kohlenwasserstoffcarbonsäureacylrest von 2 bis einLchliesolich 12 Kohlenstoffatomen, einem Halogen-, Nitro-, Hydroxy-, Amino-, Cyan-, Thiocyan- oder niedrig—Alkoxy-Kohlenwasserstoffearbonsäureacylrest mit 2 bis einschliesslich 12 Kohlenstoffatomen oder ein niederes Alkoxycarbonylhalogenid ist, bei etwa 4° C •während etwa 10 bis 24 Std, umsetzt.

Das Antibiotikum Decoyinin ist ein Aufbauprodukt von Streptomyces hygroscopicus var» decoyicus, das einen hemmenden Einfluss auf das Wachstum verschiedener Organismen, insbesondere von Bakterien und Fungi, hat. -^s zeichnet sich vor anderen antibakteriellen Mitteln und Antibiotika durch seine charakteristischen Infrarot- und Ultraviolettspektren aus, wie sie in den Figuren 1 bzw. 2 dargestellt werden, ferner durch seinen Elementaraufbau sowie seine chemischen und physikalischen Eigenschaften. Decoyinin besitzt die vorgenannte Strukturformel,

Eine Kultur des lebenden Organismus, der im nachstehenden als Streptomyces hygroscopicus var, decoyicus bezeichnet wird,

00*820/182-3

wurde "bei der Fermentation Division, Northern Utilization Research Branch, U₀S₀-Department of Agriculture, Peoria, Illinois, deponiert und zu deren ständiger Sammlung unter der Hummer NRPlL-2666 zugefügt,

Streptomyees hygroscopicus var„ decoyicus iet eine neue Spielart eines bekannten Actinomyzeten, der aus einer Bodenprobe gewonnen wurde, die in Verdugo City, Kalifornien, entnommen wurde» Seine Kulturen haben ein sich verzweigendes Luftmycel, erzeugen Pilzsporen in eng gewundenen Mycelfäden, die aus dem Luftmycel wachsen und entwickeln mit dem Altern ä der Lultur feuchte schwarze Flecken im Sporenbereich.

Streptomyees hydroscopicus var_o desoyicus weist eine starke Ähnlichkeit mit Streptomyees endus und Streptomyces hydroscopicus CBS auf, wie in tabelle I und II gezeigt wird. In '-tabelle I werden diese Organismen durch das Dietz-Ektachrom-(durchsichtige Farbfilmpositive)~Verfahren verglichen, das in den Annals of the New York Academy of Science, Bd₀ 60, Art 1, Sei'ten 152 und 154, 29. Okt. 1954, beschrieben wird.

BAD OR16«NA1.

009820/1823

Tabelle

	Ektachrom	honig gelb	- Vergleich «	tief- honig gelb	honig gelb	Streptomyces hygroscopious CBS+ Ober- Rück fläche seite	tief honig gelb
Medium	Streptomyces hygroseopicus var, decoyicus NRLL-2666 Ober- Rück fläche seite	honig gelb m. grau	Streptomyces endus IERL 2339 Ober- Rück fläche seite	blass honiggelb m.grauen I1Ie cken	blass honig gelb	grau m, weissen Flecken	blass honig gelb me grauen Flecken
Benett's	grau- weiss	honig gelb m.grau	grau- weiss	weiss honig in, grau- gelb en Pl.	blass honig gelb	hell grau— weiss	tief braun
Czapek's	grau- weiss	honig gelb	hell grau weiss	weiss		grau— weiss	honig gelb
Maltose- trypton	grau- weiss	farblos	weiss		weiss	blass- Ii orii g- gelb
Pepton- eisen	weiss	blass honig gelb	weiss	weiss	grau blass m.weissen hoiiig- 1'1Ie cken gelb ία. grauen Γ1 ecken
Waksman's Tyrosin	weiss
Kasein stärke	grau

+ CBS ist das CentraäLbureau voor Schimmelculture in Baarn, Holland,

SAD

009820/1823

In iüabelle II werden diese Organismen auf ihre Fähigkeit hin verglichen, Kohlenstoffverbindungen nach dem Verfahren von Pridham und Gottlieb /""J. Bact,, Bd. 56, S. 107-114 (1948)__7 aufzunehmen und es werden die in der gedruckten deutschen Patentanmeldung Mr₀ 1 042 841 beschriebenen Modifikationen angegebene

	d-Xylose	Tabelle :	S. endus	S, hygroscop
	IL-Arabinose	ri	URRL-2339	icus CBS
	Ühamnose	Kohlenstoffassimilation	(-)	<-)
	cL-Pructose	Sβ hygroscopicus -	+	+
Kohlenstoff	jl-(H.actose	var0 decoyicus IRRL-2666	+	+
verbindungen	d-Maltose	(-)	+	+
Kontrollverbdg.	d-Mannose	( + )	+	+
1.	(!-Glucose	.( + )	+	+
2.	Saccharose	(-)	+	+
3.	Lactose	(+)	- +	,+
4.	Cellobiose	(+)	+	+
5.	Raffinose	( + )	(+)	( + )
6.	Dextrin	+	+	+
7.	Inulin	(+)	+	. +
8.	Lösliche Stärke	( + )	+
9.	Glycerin	+	+	+
10.	Dulcit	( + )	( + )	( + )
11.	d.-Mannit	" +	( + )	(+)
12.	d-Sorbit	( + )	+	+
13.	dl-Inosit	_ +	( + )	( + )
14.	Sallcin		+	+
15.	Phenol	(-)	( + )	+
16.	( + )	( + )	( + )
17.	( + )	( + ) *	( + )
18.	( + )
19.	( + )
20.	( + )
21.
22.

ougeao/1833

BAD ORIGINAL

23o Cresol

24. Natriumformat

25. Natriumoxalat

26. Natriumtartrat Natriumsalicylat Natriumacetat (+) Natriumeitrat

27 28 29

30 g Natriumsuccinat ( + )■ ( + ) +

+ positive Assimilation;

- negative Assimilation; ■

(-) negative Assimilation, jedoch nur schwaches Wachstum; (+) positive Assimilation, jedoch nur schwaches Wachstum.

Weder S, endus noch S. hygroscopicus CBS erzeugen Decoyinin unter Bedingungen, die für die Erzeugung von Decoyinin günstig sind.

Weitere Charakteristika für Streptomyces hygroscopicus var, werden in Tabelle III aufgeführt, die das charakteristische Wachstum des ^urganismus bei 80 C auf 16 gebräuchlichen Medien zeigt.

Tabelle III

Wachsturnscharakteristika

Medium

1. Bennett's Agar

2. Czapek's Saccharose-Agar

Vegetatives Wachstum

gut

gut

Wachstum an der luft

gut,

weisse bis graue bis schwarze Flecken

gut; zwei Arten von Kolonien;

(a) m. grauem Luftwachstum,

(b) weiss krustig

BAD

Andere

gelbe Rückseite und Pigment

kremfarbene Rückseite,,blaßgelbes Pigment

009820/1821

Tabelle III (Fortsetzung)

1^20597

Medium

3. Maltose-Trypton-Agar

4ο Peptonüisen-Agar

5. 0,1 ^c/o Tyros in-Äirar

6. Kaseinstärke

7. Stärkenähragar

8β Agar aus
Hagermilch

Vegetatives Wachstum

gut

ziemlich gut

ziemlich gut

ziemlich gut

ziemlich gut

gut

9. Galciummalat- ziemlich Agar gut

10. G-lucoseasparagin-Agar

ziemlich gut

11» Flache G-elati- ziemlich ne-Stichkultur gut

Wachstum an der
Luft

gut; zwei Arten
von Kolonien;
(a) m.grauem
Luftwachstum,
("b) weiss krustig

keine Farbe
"bis zu Spuren
von weiss

hellftrau-weiss

Spuren von
grau-weiss

hellweiss

hellweiss

Spuren von
grau-weiss

keins

keins

Andere

gelte bis
graue Rückseite, gelbes Pigment

gelbe Rückseite und Pigment

braune Rückseite und Pigment

farblose Rückseite; gute Stärkehydrolyse

kremfarbene Rückseite; gute Stärkehydrolyse

kremfarbene Rückseite; gute Kaseinhydrolyse

farblose Rückseite

farblose Rückseite

gelbes Pigment; sehr leichte Verflüssigung

12.	Gelatine- Hährkultur	ziemlich gut-	ke ins	gelbes Pigment sehr leichte ^ erflüssigung
13.	Trypton- brüho	ziemlich gut; unten flockig	keins
14.	Lackrnus- railch	ziemlich gut	Spuren von grau-weiss	keine Peptoni- sj erurie;; keine Veränderung
			009820/1823	BAD ORIGINAL
		-		GOPY

Medium

Tabelle III (Fortsetzung)

+ Vegetatives Wachstum an der

Wachstum Luft Andere

15. Nitrat- ziemlich gut; keins keine Reduknährbrühe unten flockig tion

16. Synthetische ziemlich gut; sehr geringe keine Reduk-Hitrafbrülie wenige über- Spuren von tion

flächenkolo- weiss

nien; unten

flockig

Die Medien werden in der gedruckten deutschen Patentanmeldung Nr. 1 042 841 aufgeführt.

Auf Bennett's und Czapek's Saccharose-Agar zeigt S. hygroscopicus var„ decoyicus ein gutes vegetatives und Luftwacjistum bei 18°-28 C₀ Bei 37 C ist das vegetative Wachstum gut, jedoch geschrumpft und pastenartig und es sind Spuren von weissem Luftwachstum vorhanden. Die Kultur weist bei 55°C kein Wachstum auf.

S. hygroscopicus var« decoyicus weist einen deutlichen Unterschied zu den in der Literatur beschriebenen Varianten von S. hygroscopicus auf und zwar sowohl im Hinblick auf die Charakteristika des Organismus als auch auf die erzeugten Antibiotika. Während daher Varianten oder Stämme von S.hygroscopicus, wie beschrieben wird, andere Antibiotika produzieren, nämlich Hygromycine, Marcomycin, Carbomycin, Hygroscopine und Angustmyeine, unterscheiden sich diese Antibiotika deutlich von Decoyinin, wie durch den nachfolgenden Vergleich gezeigt wird:

Tabelle IV

Hygroscopin A ^G13^H24^N2⁰3

Hygroscopin B ^G15^H28^N2°3

Carbomycin C^oH,-„NO., _r

42 67 16 _BAD ORIGINAL

flygromycin , ^Gi9^H9_QN0_iQ

009820/1823 ^{9 12}

1820597

Tabelle IV (PortSetzung)

^G15^H28^F2°9"1O

^G15^H18

Hygromycin B Marcomycin Angustmycin A Angustmycin C Decoyinin

Die Angustmycine A und C, die von S. hygroscopicus 6A-704-erzeugt und von H. Yüntsen u.a. in Japan Journal of Antibiotics, Reihe A, Bd₀ 7, Nr. 4, August 1954, Seiten 113 und 116 und in Japan Journal of Antibiotics, Reihe A, Dezember 1956, S. 195, sowie von Bull in Agr. öhern» Soc. Japan, Bd. 21, Nr. 4, Seiten 261-262 beschrieben werden, unterscheiden sich auch in anderer bedeutender Hinsicht, wie in der nachfolgenden Tabelle Y gezeigt wird:

Tabelle V

Verbindung Charakteristikum

Empirische Formel

Stickstoff des wasserfreien Kristalls

Schmelzpunkt des wasserK

Decoyinin Angustmycin Angustmycin

α σ

25,03

23,60

23,19

freien Kristalls	183-186"C	169,5-171 C	202-204 c
Optische Eigenschaften	aktiv	aktiv	inaktiv
Titrationsäquivalent	283	340	307
Molekulargewichts- bestimmung	215-216	350-352	297
Wahrscheinlicher Zuckeranteil	O6H12O5	C8H19°5 '	nicht bekannt oder be schrieben

009820/1&2I

Tabelle V (Fortsetzung)

Verbindung
Charakteristikum

Formen nach der
Acetylierung

Formen nach der
Hydrierung

	Decoyinin	Angustmycin Angustmvcin A C
	Pentaacetyl S chniel zpunkt	Triacetyl nicht bekannt Schmelzpunkt " oder beschrie
	152-153°C;	188-188,5°C; ben
	Tetraacetyl Schmelzpunkt	Tetraacetyl S chme1zpunkt
	650C; Triacetyl	188-189°C
	188-189°0
	f dihydro, Schmelzpunkt	nur dihydro, Schmelzpunkt
b	205-2080C,	153-1540C
e i i d	deoxydihy dro, Schmelz-
e	Dunkt 150-153	0C

Der Organismus S„ hygroscopicus -Hr. 6A-706, der die Angustmycine erzeugt, unterscheidet sich ebenfalls deutlich von S, hygroscopicus var. decoyicus. Die Unterschiede bei der Kohlenstoffassimilation werden in Tabelle VI gezeigt.

Tabelle VI

S. hygroscopicus S, hygroscopicus

var. 6A-704

var. deooyicus

Kontrollverbindung

d-Xylose

1-Arabinose

Rhamnose

d-G-alactose

d_-Grlucose

Suorose

009820/182$

BAD ORIGINAL

Tabelle VI (Fortsetzung)

S_e hygro.seopicus S_e hygroscopicus

var_e 6A—704 var_e decoyicus

Lactose + +

Raffinose + (-) +

d-Mannit + (+)

dl-Inosit - (+)

Salicin - (+) λ

Zeichenerklärung :

++ gutes Wachstum und positive Aufnahme;

+ massiges Wachstum und positive Assimilation;

+ schwaches Wachstum, wahrscheinlich mögliche Assimilation;

(-) manchmal kein Wachstum, nicht "bestimmbare Aufnahme;

- kein Wachstum, keine Aufnahme.

L I

Zeichenerklärung :

+ positive Assimilation;

- negative Assimilation, kein Wachstum;

(-) schwaches Wachstum, keine Assimilation; - A

( + ) positive Assimilation, nur schwaches Wachstum,,

Die Unterschiede "bei den Wachstums Charakter ist ika werden in der tabelle VII gezeigt.

009820/182S bad original

Organismus Medium

Tabelle VII WachstumsCharakteristika

S__e hygroscopicus
var, decoyicus
MRRI-2666

Glucose-Asparagin-Agar

Tyrosin-Agar G-elatine-Stichkultur

Bennett's Agar kein Luftwachstum

Pigment

gelbes Pigment

gelbe Rückseite
und Pigment

S_-. hygroscopicus var. 6A-704

weisses Luftwachstum, pulverförmig

kein lösliches Pigment

es bildete sich kein lösliches Pigment

Wachstum braun, kein lösliches Pigment

Decoyinin hat ein antibakterielles Spektrum in vivo, wie in Tabelle YIII gezeigt wird:

Tabelle VIII

Therapeutische Wirkung von Decoyinin bei Mäusen, die im Versuch infiziert wurden

rganismus

S.

S₀ aureus

p_. pneumoniae 1 D, pneumoniae

Verabre ichungswe ise	GD50	in mg/kg	(14,8-30,2) (39,0-61,0)
	Decoyinin	200 (57-109)
subkutan oral	22,5 50,0	400 800
subkutan oral	83	400 800
subkutan oral
subkeutan oral

09 820/1823

Tabelle VIII (Fortsetzung)

Organismus	pneumoniae	Verabreichungsweise	CJD50 in mg/kg Decoyinin
K.	multocida	subkutan oral	400 800
P.		subkutan	305 (225-385)
	vulgaris	oral	238 {163-313)
I»	aeruginosa	subkutan oral	400- 800
P.	paratyphi B	subkutan oral	355 (287-423) • 161 (96-226)
S.	typhi	subkutan oral	482 404
S0	coli	subkutan oral	400 800
S-	subkutan oral	119 86

Decoyinin wies eine ausgeprägte Wirksamkeit gegen nachfolgende Mikroorganismen auf:

Bakterien!

Mycobacterium ranae ; Mycobacterium phlei ; Diplococous pneumoniae ; Streptococcus hemolyticus ; Staphylococcua aureus ; Pseudomonas aeruginosa ,

Aktinomyzeten:

Nocardia asteroides. Pungi ί

'•Prichophyton rubrum } Hiatoplasma capsulatum j Blastomyces dermatitidie

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Decoyinin kann durch, eine Kultur von S_e hygroscopicüs var. decoyicus oder einer Decoyinin erzeugenden Varianten derselben produziert werden und zwar in einem wässrigen Nährmedium unter -submergen aeroben Bedingungen, vorzugsweise in einem Nährmedium, das ein agg-jj^üerbares Kohleethydrat sowie eine Stickstoffverbindung oder proteinhaltigen Stoff enthält. Obgleich eine Anzahl geeigneter Medien vorhanden ist (bestimmte Kulturmedien werden bevorzugt), sind aus Gründen der wirtschaftlichen Herstellung, der maximalen Ausbeute sowie leichten Abtrennung die zur Zeit bevorzugten Kohlehydratquellen Glucose, Dextrin, Molassen, Maismehl (raffiniert und nicht raffiniert) und Stärke (gesiebt und löslich) einschliesslich Kombinationen derselben,, Andere geeignete Kohlenstoffquellen sind Maltose, Galactose, Mannit, Sojabohnenöl, tierische und pflanzliche Öle und dergleichen. Die bevorzugten Stickstoffquellen sind Proteinquellen, wie beispielsweise Baumwollsamenmehl, Sojabohnenmehl, Fißchnehl, entfettetes Sojabohnenmehl, Pepton und dergleichen. Andere geeignete Quellen sind Brdnussmehl, Br-auereihefe (getrocknete Hefe, die aus einer Biergärung erhalten wird) oder Hefeextrakt, Maisglutenmehl, Maisquellmasse, Fischgrätenmark, Tierknochenmark, lösliche Destillationsprodukte, Tryptixase, Trypton, Rind er extrakt, N— Z-Aniin^A, N— Z-Amin B, proteolysierte Milch- und Eierprodukte und dergleichen. Kombinationen von zwei oder mehreren dieser Stickstoffquellen können vorteilhafterweise verwendet werden.

Anorganische Nährsalze, beispielsweise Salze, die Ionen erzeugen können, wie beispielsweise Kalium, Natrium, Calcium, Phosphat, Sulfat und dergleichen, können vorteilhafterweise dem Medium beigegeben werden. Wichtige Spurenelemente, wie z.B« Zink, Magnesium, Mangan, Kobalt, Eisen und dergleichen können ebenfalls im Kulturmedium enthalten sein, um ein Wachstum von Streptomyces hygroscopicüs var. decoyicus zu bewirken. Derartige Spurenelemente werden im allgemeinen als zufällige Verunreinigungen mit der Zugabe von Bestandteilen zum Medium zugesetzt.

009820/1821 ^ßAD original

Bei einem "bevorzugten Fermentationsverfahren des Mikroorganismus So hygroscopicus var« decoyicus wird das Kulturmedium bei einer Temperatur zwischen etwa 24 und etwa 37 C gehalten. Vorzugsweise wird der Impfstoff bei etwa 28⁰C bebrütet und der eingeimpfte Vergärer wird bei etwa 28° bis 32⁰O während etwa zwei bis sieben Tagen bebrütet, ä±e bis sich eine zur Gewinnung ausreichende Menge Decoyinin in der Gärbrühe befindete ' .

Zur Erzielung eines maximalen Wachstums und zur Entwicklung von S. hygroscopicus var. decoyicus sollte das Kulturmedium vor der Impfung mit dem I'likr ο Organismus auf einen pH-./ert ™ zwischen etwa 6^5 und etwa 7,6 eingestellt werden. Vorteilhafterweise wird der pH_W'ert während der Ferment ie rung nahe der .Neutralität gehalten.

Submerge, aerobe Kulturbedingungen sind für die Produktion, grosser Mengen Decoyinin erwünscht. Zur Herstellung begrenzter Mengen können Kolben in Schüttelvorrichtungen sowie Kulturen in i'lascheh verwendet werden. Wird das Wachstum in ^rossen Gefässen und Tanks vorgenommen, so wird vorzugsweise die vegetative Form des Mikroorganismus zur Impfung verwendet, um eine starke Verzögerung bei der Herstellung von Decoyinin und die damit verbundene Nichtausnutzung der Anlage zu.ver- * meiden. Aus diesem ^runde ist es erwünscht, zuerst einen vegetativen Impfstoff des Mikroorganismus dadurch herzustellen, dass man eine verhältnismässig geringe Menge des Kulturmediums mit Stoff, den man von einem Agarschrägnährboden des Mikroorganismus abschabt, oder mit einem entsprechenden Stoff einer Bodenkultur impft und wenn ein junger aktiver, vegetativer Impfstoff entstanden war, diesen vegetativen Impfstoff unter aseptischen bedingungen in grosse Gefässe oder Tanks überführt. Daa Medium, in dem der vegetative Impfstoff erzeugt wiru, kann das gleiche sein wie das zur Herstellung von Decoyinin verwendete iiedium, oder es kann verschieden von demselben sein.

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Die Geschwindigkeit der Erzeugung von Decoyinin sowie die Konzentration von Decoyinin in dem Kulturmedium können leicht während der Wachstumsperiode des Mikroorganismus dadurch verfolgt werden, dass man ^xroben des Kulturmediums auf ihre antibakterielle Wirksamkeit gegen einen ^ürganismus, der bekannterweise gegen Decoyinin empfindlich ist, z.B. Mycobacter^ium phlei, durch übliche Agar-Diffusion, durch i'rübungsmessung oder durch Papierchromatographie und anschiiessender Ultraviolett-Probe testet, Ira allgemeinen erhält man eine maximale Erzeugung von Decoyinin nach der Impfung des Kulturmediums nach etwa zwei bis 10 Tagen, wenn unter submergen, aeroben Bedingungen gezüchtet wird.

S, hygroscopicus var. decoyinus erzeugt bei der Gärung Decoyinin, Psicofuranin und Adenin, Adenin ist eine altbekannte Verbindung, die keine antibiotische Wirkung besitzt,. Psicofuranin ist ein neuer antibiotischer Stoff, der eine.

__2 R ο

optische Drehung von 1^7-q in Dimethylformamid von -68 und die folgende Strukturformel hat:

EH₀ ι ^- JJE

HOGH₂ C^ry ,τ ™ ^CH2^0H

OH OH

Wegen seiner biologischen Wirkung sowohl in vitro als auch in vivo ist Decoyinin als Antibiotikum bei vielen nichtmenschlichen Infektionen geeignet.

Decoyinin kann zur Verhinderung des Wachstums von Mikroorganismen, die in verschiedenartigen Umgebungen anwesend sind, oder zur Verringerung deren Anzahl verwendet werden,

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BAD ORSGiNAL

1820597

Beispielsweise sind Waschlösungen, die Decoyinin enthalten, geeignet für sanitäre Zwecke, wie z.B. zum Händewaschen und Reinigen von Geräten, Böden oder Einrichtungsgegenständen von verunreinigten Räumen oder Laboratorien» Sie können auch ais industrielles Schutzmittel Verwendung finden, beispielsweise als bakteriostatisches Spülmittel für gewaschene Bekleidung sowie zum Imprägnieren von Papieren und Stoffen_e

Decoyinin kann ferner als Futtermittelzusatz zur Forderungdes Wachstums von Zuchtvieh und Geflügel, entweder für sich allein oder in Kombination mit anderen Antibiotika, verwendet werden« Ausserdem Wird auf seine Verwendung als Zusatz für Kontrastmittel bei Uierenbeckenaufnahnien und zur Sterilisation von 'Räumen und Instrumenten bei Tuberkulose hingewiesen sowie auf die Verwendung in biologischen" Mitteln. Decoyinin kann auch im Unterrieht, bei Forschung und Analyse verwendet werden.

Die IJDr-r. bei Mäusen ist bei oraler sowie subkutaner Verabreichung höher als 2.500 mg/kg. Die maximale verträgliche orale Dosis liegt über 800 mg/kg pro Tag und die subkuta_ne Dosis über 320 mg/kg pro Tag bei einem VersuchsZeitraum von mindestens 4 Tagen.

Die erfindungsgemässen Verbindungen sind wie Decoyinin zur Bekämpfung von Krankheiten geeignet, die durch bakterielle und fungale Infektionen bei Tieren verursacht werden· Zu diesem Zweck werden die Produkte mit einem pharmazeutischen Träger vereinigt, der entweder ein fester Stoff, ein Pulver oder eine Flüssigkeit sein kann. Die Präparate können in Form von Tabletten, Brausetabletten, Pulvern, Granulaten, Kapseln (sowohl mit harter als auch mit weicher Umhüllung), Suspensionen in Speiseölen, wässrigen Suspensionen oder anderen Dosxerungsforraen hergestellt werden, die besonders für die orale Verabreichung geeignet sind. Flüssige Verdünnungsmittel werden in sterilem Zustand zur parenteralen Verabreichung verwendet. Ein derartiges Medium kann ein sterine Lösunge-

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mittel oder ein steriler Träger sein, wie z.B. ein injizierbares Öl oder Wasser mit oder ohne hydrophile Kolloide, beispielsweise Natriumcarboxy_methylzellulose, Polyvinylpyrrolidon, Gelatine, Alginate, Tragacanthgummi und ähnliche suspensierende und/oder dispergierende iiittel. Verschiedene feste pharmazeutische Präparate können durch Vermischen der Produkte mit festen Verdünnungsmitteln und/oder l'ablettierungshilfsstoffe, -wie beispielsweise Maisstärke, Lactose, Talkum, SterarLnsäure, Dicalciumphosphat, Magnesiumstearat, Kautschuke und dergleichen hergestellt werden. Alle Ein— kapselungs- oder Tablettierungsstoffe, die in der pharmazeutischen Praxis üblich sind, können verwendet werden, wenn keine Unverträglichkeit mit den Stoffen besteht. Die Stoffe können in Tabletten verarbeitet oder in die übliche Kapsel von absorbierebarem Material, wie z.B. die üblichen &elatinekapseln, eingearbeitet und in dieser Form verabreicht werden« Die neuen Verbindungen können in Form einer Suse^/pnsion in einem geeigneten festen öl, das etwa 2 $ Aluminiummonostearat als Suspendierungsmittel enthält, hergestellt werden. Eine derartige Suspension kann oral so·, wie sie ist, oder aber in einer Kapsel verarbeitet, verabreicht werden. Die Stoffe sind in Form von Salben, die auf einer Fettbasis vom -t'etrolattyp, wasserlöslicher Polyäthylenglycol-Wasser-Basis, Kreme und Wasser-Öl-Emulsionen und -lotionen aufgebaut sind, für die lokale Anwendung geeignet. In der Veterinärmedizin können sie in Form von Zäpfchen, Mastitissalben, Ölsuspensionen, wässrigen Lösungen und- Suspensionen und dergleichen verabreicht werden.

Der Prozentsatz des aktiven Bestandteils kann je nach dem Präparat und der beabsichtigten Verwendung variiert werden. Ein geringerer Prozentsatz kann dann verwendet werden, wenn mehBBre Einheitsdosierungsformen zur gleichen ^eit verabreicht werden sollen. Obgleich, insbesondere bei einer intravenösen Injektion, ein Prozentsatz von weniger als etwa 0,10 $ des Antibiotikums verwendet werden kann, ist es vorzu-

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ziehen, nicht -weniger als etwa 0,10 fo desselben zu verwenden, da die Wirksamkeit des Antibiotikums mit der Menge des verabreichten Antibiotikums zunimmt« Tabletten oder Kapseln, die etwa 50 bsji etwa 500 mg Decoyinin oder dessen Derivate enthalten, sind geeignet. Es können eine oder mehrere Tabletten oder Kapseln auf einmal genommen werden_e

Wegen ihrer ausgeprägten bakteriziden Wirkung und sehr niedrigen Toxizität sind die erfindungsgemässen Decoyinintriester als Mittel für die Behandlung verschiedener Krankheiten geeignet. So zeigte es sich beispielsweise, dass Mäuse, ^ die subkuten mit einer CDj-Q-Dosis von 77 mg/kg behandelt wurden, gegen eine Streptococcus hämolytiens-Infektion geschützt waren.

Man kann die neuen Verbindungen entweder allein oder in Kombination mit SuIfonamidverbindungen wie z.B, Sulfadiazin, Sulfamerazin, Sulfanilamid, Sulfamethazin, Sulfacetamid, Sulfamethylthiadiazol (in einem "Verhältnis von etwa 1 Teil der erf indungsgemässen Verbindung pro 2 Teile der G-esamtmenge an Sulfonamid) und dergleichen oder mit anderen Antibiotika, Wie Z₈B, Tetracyclin, Oxytetracyclin, Chlortetracyclin, Penicillinen, Novobiocin, Neomycin, Erythromyzin, Streptomycin, Bacitracin, Polymyxin, Chloramphenicol, Psicofuramin, ä Kanamycin, Nystatin, Streptozotocin oder dergleichen bei der .behandlung von vielen Infektionen, insbesondere von durch Streptococcus und Staphylococcus-Organismen erzeugten Infektionen, verabreichen· Sie sind ferner in Kombination mit. verschiedenen Vitaminen, wie z.B_e Thiamin, Riboflavin, Ascorbinsäure, Niacinamid, Pyridoxin, Pantothensäure oder Pantothenatsalzen, Vitamin B^ρ» Folsäure und dergleichen von Wert. Andere therapeutisch wertvolle Stoffe können gleichfalls mit den vorliegenden Stoffen kombiniert werden. Sie sind ebenfalls in Kombination mit Corticoiden, wie z.B. Cortison, Hydrocortison, Prednison und Prednisolon einschiiessiich deren Ester z.B. dem Acetat, Cyclopentylpropionat, Succinat und aern iJatriumsalz und der Fluor-, Methyl- und Hydroxyanalogen der-

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seifen, wie z.B. 6a«-3?luorhydrocortison, 16-Hydroxy-9oc-fluorhydrocortison und 16-Methyl-9a-fluor~prednisolon und dex^en Ester wertvoll«

Decoyinin kann aus dem Kulturmedium durch Extraktions- und

Adsorptionsverfahren, wie z.^B° Adsorption auf Kohle oder einem ähnlichen kapillaren Adsorptionsmittel und Auswaschen aus demselben mit einem geeigneten Waschmittel gewonnen werden. Für die industrielle Produktion werden Extraktionsverfahren bevorzugt, da sie weniger zeitraubend und kost-P spielig sind und zu höheren Ausbeuten führen.

Bei einem Ext rvlit ions verfahr en zur G-ewinnung von Decoyinin aus dem vsrgorenen Nährmedium wird die gesamte Brühe bei einem sauren pH-Wert vorzugsweise bei etwa einem pH-Wert von 2 filtriert. Das klare Piltrat wird alkalisch gemacht, vorzugsweise auf einen pH-Wert von 10 un^/:. auf einem Adsorptionsmittel, vorzugsiveise Kohle mit bis zu etwa 1 ^c/o Aktivkohle adsorbiert, Der Kuchen wird in einem organischen Lösungsmittel, wie z.B. Aceton aufgeschlämmt, das Lösungsmittel von dem Kuchen getrennt und dann das Lösungsmittel zu einem wässrigen Konzentrat destilliert, das filtriert, neutralisiert und gefriergetrocknet wird. Der gefriergetrocknete Stoff wird bei ™ etwa 50 wieder m Wasser gelöst, auf Raumtemperatur abgekühlt, worauf Kristallisation einsetzt.

Decoyinin kann weiterhin durch G-egenstromverteilung, tiegenstrom-Flüssigkeits-Flüssigkeitsextraktion oder durch andere Verfahren gereinigt und aus einem geeigneten Lösungsmittel umkristallisiert werden.

Decoyinin zeigt in einem bio auto graphisch em J-apierchromatogramm mit 6 Lösungsmittelsystemen das nachfolgende typische Bild. Die Zonenvez'teilung wird durch Bioautographie mit Mycobacterium phlei oder M, ranae erzielt.

BAD ORIGINAL

0 0 9 8 2 0/1823

Nachfolgend werden die sechs LÖsungsmittelsysteme und R_f-Werte angegeben (der Rest ist Wasser):

1. 81 °ß> n-Butanol, R_f= 0,30;

2. 81 °/o n-Butanol, 0,25 f" p-Toluolsulfonsäure,

3. n-Butanol-Essigsäure-Wasser (2; 1 :1), R~= 0,55;

4. 81 °/o n-Butanol, 2 $> Piperidin,' R_f= 0,37;

5. 96 "/o Wasser, 4 fo n-Butanol] R_f= 0,63;

6. 96 Jo Wasser, 4 $ n-Butanol, 0,25 /^ p-Toluolsulfonsäure, R^ = 0,64.

Der R^-Wert von 6-Amino-9-D-psicofuranosylpurin oder Psicofuranin, das gleichfalls durch S hygrosQOpicus,HRRL 2666 erzeugt wird, beträgt im Lösungsmittelsystem Nr₀ 4 0,13« Der R -Wert "von Decoyinin ist 2,85 (p ist die BezugSYerbindung Psicofuranin)·

Decoyinin sowie Psicofuranin werden durch fermentation von S. hygroscopicus var. decoyicus erzeugt, Decoyinin kann von ■^sicofuranin durch ^©genstromverteilung nach Craig unter Verwendung eines Losungsmittelsystems von gleichen Teilen n-Butanol und Wasser abgetrennt werden,, Durch die Verteilung erhält man eine Fraktion bei K= 0,3» die Psicofuranin ist, und eine Fraktion bei K = 0,7» die Decoyinin ist_e Sowohl Decoyinin als auch Psicofuranin ergeben Adenin bei Säurehydrolyse, decoyinin ist im Bereich von 1 bis 10 mg/ccm in Wasser, niederen Alkanolen, wie z.B. Äthanol, Methanol und Butanol, niederen Alkanonen, wie z.B. Aceton und Estern, wie beispielsweise Äthylacetat löslich und noch besser löslich in organischen Lösunegsmitteln, wie z.B, Dimethylformamid, Diefhthylsulfoxyd und Diinethylacetamid.

Durch Acylierung von Decoyinin erhält man bekanntlich, je nach der gewählten Methode, die tri- oder tetra- und penta-Acylderivate. Beispielsweise ergibt die Aoetylieming von Decoyinin nach dem Verfahren von Yuntsen zwei Produkte, nämlich Decoyinin

009820/1Ö23

tetraacetat (C

und Decoyininpentaacetat

Demgegenüber erhält man durch selektive Acetylierung von Decoyinin gemäss vorliegendem "Verfahren "bei einer niedrigen Temperatur mit einer Minimalmenge Essigsäureanhydrid "bei einer minimalen Reaktionszeit Decoyinintriacetat.

Die neuen Triacylderivate können durch die folgende allgemeine Formel dargestellt werden:

OR ^ÖH2^0R

in der R eine Kohlenwasserstoffcarbonsäureacylgruppe mit 2 Ms einschliesalich 12 Kohlenstoffatomen, eine halogen-, Nitro-, Hydroxy-, Amino-, Cyan-, Thiocyan- oder niedrig-alkoxysubstituierte Kohlenwasserstoffcarbonsäureacylgruppe mit 2 Ms einschliesslich 12 Kohlenstoffatomen oder eine niedere AIkoxycarbonylgruppe i st.

Demgegenüber weisen die tetra- und penta-Acylderivate folgende allgemeine Formel auf:

BAD ORIGfNAL

0 0 9 8 2 0/1823

R-IT-R

OR

GH₂OR

in der R die vorgenannte Bedeutung besitzt, und R' ein ^asserstoffatom .oder R gleich ist«,

Decoyinintriacylat" kann gegebenenfalls mit Ammoniak zur Erzeugung von gereinigtem Decoyinin deacyliert werden. Beispielsweise kann es von Decoyinin durch G-egenstromverteilung auf G-rund der Verschiedenheit der "K"-Werte abgetrennt werden,. Nach der Abtrennung kann es in seine Mutterverbindung, wie vorstehend beschrieben, zurück verwandelt werden, was deren -Reinigung zur Folge hat.

Der Ausdruck "Kohlenwasserstoffcarbonsäureacyl mit 2 bis 12 Kohlenstoffatomen" soll in der vorliegenden Anmeldung oder in den Ansprüchen eine Aeylgruppe bezeichnen, die einer Kohlenwasserstoffcarbonsäure mit 2 bis einschliesslich 12 Kohlenstoffatomen entspricht. Geeignete Säuren dieser Art sind z.B. (a) gesättigte oder ungesättigte, gerad- oder verzweigtkettige aliphatisch^ Carbonsäuren, wie z.B. Essig-, Propion-, Butter-, Isobutter-, tert.-Butylessig-, Valerian-, Isovalerian-, Caoron-, Capryl-, Decan-, Dodecan-, Acryl-, Croton-, Hexin-, Heptin-, Octinsäure etc., (b) gesättigte oder ungesättigte cycloaliphatische Carbonsäuren, beispielsweise Cyclobutancarbonsäure, Cyclopentancarbonsäure, Methy1-cyclopentencarbonnäure, Cyclohexancarbonsäure, Dimethyl-

und ei G pp*_Lg i. oh en cyclohexencarbonsäure, Dipropylcyclohexancarbonsäuref (c) ge-

009820/182 J ^{BAD of}*^eWW"

sättigte oder ungesättigte cycloaliphatische-substituierte aliphatisch^ Carbonsäuren, wie z.B. Cyclopentanessigsäure, Cyclopentanpropionsäure, Cyclopentenessigsäure, Cyclohexanbuttersäure, Methylcyclphexanessigsäure und dergleichen;

(d) eine aromatische Carbonsäure, wie beispielsweise Benzoesäure, Toluylsäure, Naphthoesäure, Ä'thy !benzoesäure, Isobutylbenzoesäure, I>lethylbutylbenzoesäure oder dergleichen;

(e) eine aromatisch-aliphatische Carbonsäure, beispielsweise Phenylessigsäure, Hieny!propionsäure, Phenylvaleriansäure, Zimtsäure, Phenylpropiolsäure, Maphthylessigsäure oder dergleichen.

Die Bezeichnung "Halogen-, Eitro-, Hydroxy-, Amino-, Cyan-, Thiocyan- und niedrig-alkoxysubstituierte Kohlenwasserstoffcar bonsäure acyl gruppe mit 2 bis einschliesslich 12 Kohlenstoffatomen" soll eine Kohlenwasserstoffcarbonsäureacylgruppe bedeuten, wie sie vorstehend definiert wird, die durch ein oder mehrere Halogenatome, iiitro-, Hydroxy-, Amino-, Cyan-, Thiocyan- oder niedere Alkoxygruppen substituiert ist. Eine "nieder Alkoxygruppe" bedeutet eine Alkoxygruppe mit 1 bis einschliesslich 6 Kohlenstoffatomen, wie beispielsweise eine Hethoxy-, Äthoxy-, iropoxy-, Butoxy-, -tentyloxy-, Hexyloxygruppe und deren isomere formen, Beispiele für substituierte Kohlenwasserstoffcarbonsäureacylgruppen, die durch die vorstehende Definition erfasst werden, sind die Acylgruppen, die der Chloressigsäure, Chlorpropionsäure, Brombuttersäure, Jodvaleriansäure, Chlorcyclohexancarbonsäure, o-, m- und p-Chlorbenzoesäure, Anissäure, Salicylsäure, p-Hydroxybenzoesäure, o-, m- und p-Nitrobenzoesäure, Cyanessigsäure, Thiocyanessigsäure, Cyanpropionsäure, Milchsäure, Glycin oder Äthoxyameisensäure (Äthylhemicarbonat) entsprechen.

Bei der Hydrolyse von Decoyinin spaltet sich der Zuckeranteil des Moleküls ab. Der aus dem Decoyinin abgespaltene Suckeranteil hat drei acylierbare Hydroxyle; Diese neuen Sucker können nach der vorstehend für -^ecoyinin beschriebenen Weise acyliert werden, um ^ster zu ergeben, die aur Verbesserung des "uckera

^009820/1823 BADORK₃₁NAL

oder zum Schutz der Hydroxyle geeignet sind, -wenn der Zucker als ^wischenprodukt, beispielsweise zur Herstellung anderer if-Glycoside, verwendet wird.

Heue Polyöle werden erhalten, wenn der Zuckeranteil von Decoyinin unter Verwendung von Raney-Nickel als Katalysator hydriert wird. Diese neuen Polyole können anstelle von Substanzen, wie z.B. Sorbit, Mannit und Pentaerythrit als pulverisierende Mittel in pharmazeutischen Zusammensetzungen, als Lösungsmittel und Weichmacher für Tabek, Leim, Lotionen und Krems und dergleichen sowie als plastizierende Mittel verwendet werden. Wie die bisher bekannten Arten von Polyolen ™ können auch diese neuen. Polyole zu oberflächenaktiven Mitteln, die als Detergentien und Netzmittel geeignet sind, durch Monoacylierung mit langkettigen lettsäureestern, beispielsweise Laurinsäure, Plamitinsäure, Stearinsäure un-d Ölsäure umgewandelt werden. Wie die Polyacylate können beispielsweise die Distearate als Grundlage für die Salbenherstellung verwendet werden. Die Gaprinsäuremonoester ist, wenn er nach dem. U.S.-Patenten Nr₀ 2 357 077 und 2 357 078 hergestellt- und formuliert wird, als Schädlingsbekämpfungsmittel geeignet. Die Ester mit trocknenden ülsäuren, wie z.B. Leinsamenölsäure, sind, wenn sie nach dem in "Industrial and Engineering Chemistry, Bd. 37, S. 809-12 (1945) beschriebenen Verfahren hergestellt | werden,als trocknende Öle in Lacken und dergleichen wertvoll.

Durch Methylieren wird Adenin von Decoyinin abgespalten. Die vorliegenden Daten zeigen, dass der Zuckeranteil von.Decoyinin (J6^12^5 ist, während man bei Angustmyoin A CqH₁₀Oj- erhält. Durch Itfatriumborhydrid wird Decoyinin nicht reduziert und dadurch wird die Abwesenheit eines Aldo-Ketose-Zuckers angezeigt, wie er in Hygromycin gefunden wurde,.

Decoyinin erscheint als kristallines Hydrat, Präparat 20, mit einem Schmelzpunkt von 124°-126°C und _als.wasserfreies Kristall, Präparat 2f mit einem Schmelzpunkt von 183°-186°0_f Decoyinin wird ferner durch ein Ultraviolettmaximum bei 258

009820/1823

Millimikron, a=56, des wasserfreien kristallinen S-toffes in alkoholischer 0,01 η Schwefelsäure charakterisiert, wie in Fig. 2 gezeigt wird; Z^Tn ⁼ + 18,6° in Dimethylformamid und + 37° in Dimethylsulfoxyd«

Das Infrarotspektrum zeigt vielfache OH/KK—Banden sowie eine Reihe von Banden, die eine Purinringstruktur anzeigen, wie an dem wasserfreien kristallinen -^ecoyinin in Pig. 1 gezeigt wird« Das Infrarotabsorptionsspektrum von Deco^^inin in einer Mineralölsuspension weiste charakteristische Absorptionsbande auf, die in reziproken cm bei den nachfolgenden Frequenzen ausgedrückt werden: 3420, 3390, 3300, 3170, 3070, 2710, 2640, 1690, 1672, 1655, 1645, 1605, 1573, 1565, 1515, 1420, 1335, 1310, 1300, 1280, 1238, 1218, 1181, 1143, 1102, 1094, 1085, 1073, 1060, 1047, 1013, 985, 965, 915, 883, 838, 815, 790, 772, 746 und 725.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Produkte der vorliegenden Erfindung und das Verfahren zu deren-Herstellung» Alle Prozentsätze sind auf das Gewicht bezogen, und alle Lösungsmittelgemisch-Mengenanteile sind, wenn nicht anderweitig angegeben, auf das Volumen bezogen.

Beispiel 1

Fermentation in Laboratoriumsmengen.

hygroscopicus var» decoyicus, MRRL 2i auf einem sterilen Schrägnährboden des nachstehenden Mediums:

S« hygroscopicus var» decoyicus, MRRL 2666, wurde bei 28⁰C

Maltose	10 g	BAD ORJG«NAL
Trypton	5 g
Sek» Kaliumphosphat	0,5 g
Natriumchlorid	0,5 g
Hydriertes Eisensulfat	Spuren
Agar	15 g
destilliertes Wasser,
bis zu einer Menge von	1 Liter
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sieben Tage lang gezüchtet, "bis die Sporenbildung abgeschlossen war. Die Sporen eines derartigen Agar-Schrägnährbodens wurden zum Impfen von 100 ecm des nachfolgenden Impfmedrums in einem 500 ecm fassenden Kolben verwendet:

Glucose 25 g

Sojapepton 10 g

Maisquellmasse 3g

Hefeextrakt 3g

H-Z-Amin A⁺ 2g

Ammoniumsulfat 3- g

I-iagne s iumsulf at 0,2 g

Natriumchlorid 0,1 g

hydriertes Eisensulfat 0,02 g

" Mangansulfat 0,003 g

" Zinksulfat 0,004 g

Prim« Kaliumphosphat 1,9 g

see. Kaliumphosphat 1,1 g

Einstellung auf einen
pH—Viert von 7,2 vor der
Sterilisation 1 Liter

enzymatisches Digest von Kasein_e

Dieses Impfmedium wurde 72 Stunden bei 28°G auf einer Rotations schüttelmaschine bei 250 U/Min, bebrütet.

Die auf diese V*eise erhaltene Kultur -wurde zum Impfen des nach folgenden stei'ilen Gärmediums verwendet:

Kay-Sojabohnenmehl'⁺ 30 g
Amnioniumsulfat 5 g

Glycerin 40 g

Gerelose 20 g
Calciumcarbonat 4 g

Wasser 1 Liter

(Der pH-Wert wurde vor dor Sterilisation auf 7,2 eingestellt)

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Fettextrahiertes Sojabohnenmehl, das fein gemahlen und dann in 100 ecm Mengen in 500 ecm fassenden Erlenmeyer-Kolben 5 Tage (bei 30 C) auf einer Ro tat ions schüttelrnas chine bei 250 XJ/i'iin« bebrütet worden waren.

Eine aus der gesamten Brühe entnommene Probe wurde durch Papierchromatographie fraktioniert. Die Decoyinin-Zone ■ wurde durch Bioautographie mit Mycobacterium phlei festgelegt. Die Psicofuranin- und Adeninzonen, die gleichfalls in der gesamten ^rühe vorhanden waren, wurden mittels eines Cary-Spektrophotometers durch ihre Absorption bei 262 mu festgelegt. Die relativen Wanderungsgeschwindigkeiten (R_f) der Fraktionen in einem Lösungsmittelsystem aus 81 ^cß> n-Butanol, 2 i<> Piperidin und 17 i° Wasser betragen für Decoyinin Rf. = 0,37 ₉ Psicof uranin R. = 0,13 und Adenin R- = 0,25.

Beispiel 2

A. Industrielle Fermentation:

Das in Beispiel 1 beschriebene in einem 500 ecm fassenden Impfkolben befindliche geimpfte Medium wurde 48 Std₀ bei 30 C bebrütet. Dann wurden 75 ecm davon zur Impfung von

12 Litern des gleichen Mediums in einer ImpffI P Die Impfflasche wurde mit einem Rührer bei 280 U/Min, gerührt, mit 6 Liter Luft pro Minute belüftet und bei 30⁰O zwei Tage fermentiert, wonach es als Impfstoff für 250 Liter eines endgültigen sterilen Gärmediums der gleichen Zusammensetzung wie in Beispiel 1 in einem 378 Liter fassenden Tank verwendet wurde. Das Medium wurde mit UaOH auf einem pH-Wert von 7,2 eingestellt und dann sterilisiert. Wach der Sterilisieruiif; war der pH-Wert 7,8. Der Vergärer wurde mit einem offenen Rührwerk bei 280 U/Min, gerührt, mit 100 Liter Luft/Minute belüftet und bei 3O⁰O vier Tage vergoren, während welcher Zeit Decoyinin erhalten wurde.

BAD ORIGINAL

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B. Extraktion von rohem kristallinen Decoyinin.

Jjie gesamte Brühe, 250 Liter, wurde mit Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 2,0 eingestellt, 9»98 kg Diatomeenerde wurden zugegeben und der Stoff wurde filtriert. Das Filtrat wurde mit 5 kg Aktivkohle und 7»7 kg Diatomeenerde gemischt und das Gemisch wurde filtriert. Das klare liltrat wurde ausgeschieden, während Decoyinin in dem Kohlekuchen enthalten war. Der Kohlekuchen wurde dreimal mit je 18,9 Liter Aceton ausgewaschen, um das "-Decoyinin zu entfernen« Die Acetonlösung wurde bei 38° bis 48⁰C auf eine wässrige Lösung von 4 Liter eingeengt. Die wässrige Lösung wurde mit¹ 1j ecm fj

konzentrierter Schefelsäure auf einen pH-Wert von 7>0 eingestellt und dann gefriergetr-aknet wobei man 414 g festes rohes Decoyinin erhielt. Der gefriergetrocknete Stoff wurde in 2 Liter Wasser gelöst bei 50 C und auf Raumtemperatur gekühlt, um die kristallisation des rohen kristallinen Decoyinin zu bewirken, und zwar das Präparat 2a, dessen Schmelzpunkt bei 198° bis 200⁰C lag.

C. Fraktionierung von rohem kristallinem Decoyinin.

1 g des -Präparates 2a wurde durch ^"egenstromver teilung nach Craig in 150 Durchgängen unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems fraktioniert, das aus gleichen Teilen n-Butanol und Wasser bestand. Drei Fraktionen wurden erhalten, die bei Verdampfen des Lösungsmittels die in Tabelle X gezeigten kristallinen -Produkte ergaben.

009820/1823 BAD

	Tabelle X	Mono hy drat d.es Decoyinins Präparat 2c	Adenin Präparat 2d
	Ps icofuranin, Präparat 2b	• zweite	dritte
"Fraktion	erste	K = 0,705	K = 1,5
	K = 0,282	260 mg	110 mg
erhaltenes Gewicht	388 mg	34 °ß>	22 #
berechne$-Satz des t'räp. 2a	44 $	124-125	292-295
Schmelzpunkt, 0C	209-210	a = 57	a = 105
UV-Maxima bei 262 mu in Wasser	a = S)	-41°	-
/α/-ρ in Wasser	-46
Elementaranaly s e		44,32
σ	45,82	4,94
H	5,18	26,67
0	28,63	23,55	49,5
	23,04

D, Andere Fraktionen des rohen kristallinen Decoyinins,

Eine 1 g schwere ^x robe des nach dem Verfahren des Teil B gewonnenen rohen kristallinen Decoyinins wurde in einer Gegenstromverteilungsmaschine nach Craig mit 200 Rohren bei 200 Durchgängen in dem gleichen Lösungsmittelsystem wie in Teil C fraktioniert. Die Fest st off toes timmung zeigte drei Fraktionsmaxima: K = 0,29, Psicofuranin, K = 0,73, Decoyinin und K = 1,69, Adenin. Jede der Fraktionen wurde zur Trockne eingedampft. Das Decoyinin wurde aus ^wasser umkristallisiert, um 210 mg wasserhaltiges kristallines Decoyinin zu ergeben, und zwar das -Präparat 2e, dessen Schmelzpunkt bei 124° bis 126⁰O lag. Die Elementaranalyse für Präparat 2e ergab noch dem trocknen bei 60⁰O folgende Werte!

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BAD ORIGiNAL

Berechnet für CL^IL,,N₁-O,:

C 46,97; H 5,38; If 22,75; O 24,92; gefunden: C 46,02; H 5,16; Ii 23,29; O 24,90

(direkt)«

Das UT-Sρektrum des Präparates 2e zeigte I-Iaxima "bei 261 rau , a= 53,2 in 0,01 η Kaliumhydroxyd und bei 259 ψ&, a= 50,8 in 0,01 η Schwefelsäure.

Bei einer anderen Fraktionierung erhielt man aus 40 g rohem Decoyinin, die nach dem Verfahren des Teil B gewonnenen worden waren, 7,3 g wasserhaltiges kristallines Decoyitin entsprechend Präparat 2e. 1 g desselben wurde aus 40 ecm absolutem Äthanol uinkristallisiert, um wasserfreies kristallines Decoyinin, Präparat 2f, zu ergeben, dessen Schmelzpunkt bei 183° bis 186°C lag. Mach dem ^xrocknen bei 60⁰C ergab das Präparat 2f die folgende Elementaranalyse:

0= 47,11; H= 5,03; K= 25,03; 0= 23,01 (direkt).

Das Inirarotabsorptionsspektrum und das UV-Spektrum des Präparats 2f werden in den zeichnungen in Pig. 1 bzw. I¹Ig₀ 2 gezeigt.

E. Fraktionierung durch Flüssigkeits-JTüssigkeits-Extraktion.

Bach dem Verfallbi des ^eils B erhaltenes rohes kristallines Decoyinin wurde durch i'lüssigkeits-Flüssigkeits-Gegenstrom-Extraktion fraktioniert. Das Lösungsmittelsystem bestand aus gleichen teilen n-Butanol und Wasser. 100 g rohes kristallines Decoyinin wurde in 1 Liter des aus der heissen oberen und der unteren Phase bestehenden Lösungsmittelsystems gelöst. Diese Lösung wurde als Einsatzmaterial für die Kolonne verwendet* Dem Abfluss aus der HTüssigkeits-Flüssigkeits-Gegenstrom-Extraktionskolonne folgte UV-Analyse, Bestimmung des Feststoffgehaltes und seiner biologischen Aktivität. Aus der biologisch aktiven Fraktion des Abflusses wurden 2^,5 Decoyinin, Präparat 2e, erhalten, dessen Schmelzpunkt bei

009820/1823

125 "bis 130° lag und das eine optische Drehung von f&Jjy = + 35,6 (1 °/o in Wasser) hatte,

Beispiel 3

Zu einer lösung von 2 g des Präparates 2f in 50 ecm Pyridin wurden 25 ecm Essigsäureanhydrid zugegeben. Das Gemisch wurde 7 Tage bei 25 C stehengelassen. 18 g zer— stossenes Bis wurden zu dem Gemisch, das 1 1/2 Std. gerührt wurde, zugegeben; dann wurde es zu einem dicken Syrup unter hohem Vakuum eingedampft. Der Syrup wurde in Chloroform gelöst, mit Wasser und 0,03 η Schwefelsäure gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne eingedampft. Der getrocknete Syrup wurde in Äther gelöst und aus demselben durch Zugabe von Hexan ausgefällt, wobei man 1,7 g eines weissen feststoffs, präparat 3a erhielt. Das j-'räparat 3a wurde weiter durch Gegenstromverteilung nach Craig gereinigt, wobei das Lösungsmittelsystem aus Wasser : Äthanol : Acetat : Cyclohexan in einem Volumenverhältnis von 30 : 20 : 25 : 25 verwendet wurde« !lach 1000 Durchgängen wurden awei Fraktionen erhalten. Die erste bei K = 1,86 erhaltene Fraktion wurde aus Wasser auskristallisiert, wobei man 4-20 mg eines Stoffes, Präparat 3b erhielt, dessen ochraelsxDunkt bei 152° bis 153°'J lag und dessen ülementaranalyse dem des Decoyininpentaacetats ent sprach:

Berechnet für Cp-]EU^eOq:

C = 51,32; H = 5,13; N = 14,25; 0 = 29,32; gefunden: G = 51,80; H = 4,71; N = 13,84} 0 = 30,50;

-(direkt).

Die sweite bei K = 0,5 erhaltene rraktion wurde aus Äthylacetathexan auskristallisiert, wobei man 600 mg eines Stoffes, Präparat 3c, erhielt, dessen Schmelzpunkt bei etwa 65⁰C Ia^ und des.en ülementaranalyse dem Decoyinintetraacetat entsprach.

009820/1823 BAD ORIG<NAL

Berechnet für C₁ gH„.jIJj-Og:

C = 50,76; H = 5,16; N = 15,58; 0 = 28,48; gefunden: C = 50,95; H = 4,59; N = 15,24; 0 = 28,81;

(direkt).

Auf ähnliche Weise können andere Acylierungen des Decoyinins vorgenommen v/erden, insbesondere mit den acylierenden niederen Kohlenwasserstoffcarbonsäuren durch Umsetzung des entsprechenden Säureanhydrids oder Säurehalogenids, wie ζ„ 16. l'ropionsäureanhydrid, Acrylsä,ureanhydrid, Buttersäure— anhj/dx'id, Benzoesäureanhydrid, iienzoylchlorid, Acetylchlorid, ™ Gap^oylbromid mit Decoyinin in PyridinlÖGung. Die niederen Kohlenwasserstoffcarbonsäureacylate können anstelle des Decoyinins verwendet werden.

Die Acylierung kann bei rohen Decoyinin-Präparaten vorteilhaft erweise als Verbesserungsmittel des Decoyinins angewandt werden. Das acylierte Decoyinin kann aus dem Reaktionsgemir.ch abgetrennt, gereinigt und dann mit einem verdünnten wässrigen Alkali hydrolysiert werden, wobei man gereinigtes Decoyinin erhält. Auf diese Weise wird DecoyMn leicht von nicht acylierbaren Verunreinigungen getrennt, unter Ausnutzung der veränderten physikalischen Eigenschaften infolge der M

Acylierungο

■Beispiel 4

10.000 orale Tabletten mit einem Gehalt von jeweils"500 mg Decoyinin wurden aus den folgenden Stoffarten und· -anteilen hergestellt:

1. DecoyMn, kristallin 5.000 g

2. Lactose 1.500 g 3« Maisstärke 250 g

4. Talkum 100 g

5. Magneslumstearat 50 g

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Die fein pulverisierten Stoffe 1, 2 und 3 wurden gründlich gemischt, zer^tossen und dann granuliert. Die Granulate wurden mit den Stoffen 4- und 5 gemischt und tablettiert,, Bei der Verabreichung, waren die Tabletten "beständig und zeigten eine ausgesprochene antibiotische Aktivität.

Ähnliche Ergebnisse wurden bei Tabletten erhalten, die unter Verwendung von 2500 g Decoyinin und 2500 g Psicofuranin anstelle von 5000 g Decoyinin hergestellt worden waren»

Ähnliche Ergebnisse wurden ferner bei Tabletten erhalten, die unter Verwendung von 2500 g Decoyinin und 2500 g Erythromycin anstelle von 5000 g Decoyinin hergestellt worden waren.

Ähnliche Ergebnisse wurden auch bei T-abletten erzielt, die unter Verwendung von 2500 g Decoyinin und 2500 g Nystatin anstelle von 5000 g Decoyinin hergestellt worden waren.

Beispiel 5
Decoyinintriacetat«

Zu einer Lösung von 2,5 g Decoyinin (Präparat 2f, beschrieben in Beispiel 2, Teil D) in 20 ecm Pyridin wurden bei 4°C 8 ecm Essigsäureanhydrid zugegeben. Das G-emiuch wurde über Nacht bei Haumtemperatur stehengelassen. Bei Zugabe von 3 Volumen Eiswasser (1° bis 3⁰C) zu dem Gemisch fand eine Kristallisation statt, wobei man 1,65 g Decoyinintriacetat-Kristalle erhielt, deren Schmelzpunkt bei 171° bis 185⁰C lag. Die Umkristallisation aus 25 ecm Äthanol führte zu 1,05 g Decoyinintriacetatkristallen, deren Schmelzpunkt zwischen 188° und 190⁰C lag. Ein UV-Maximum a= 56,7 in alkoholischer 0,01 n-Schwefelsäure lag bei 258 Millimikron. Die folgende Elementaranalyse wurde erhalten:

Berechnet für C₁₇H₁₉N₅O₇:

C = 50,37} H = 4,72; N = 17,28; 0 = 27,63; gefunden: 0 = 50,47; H = 4,62; N - 17,59; 0 = 27,50.

0 0 98 2 0/1823 bad

Claims (5)

PATENT AIfSfEUCHE ϊ

1. Oecoyinin-triester der allgemeinen Pormel

H-U-H

GH,

OH₂OR

in der E eine Kohlenwasserstoffcarbonsäureacylgruppe mit

2 "bis einBchliesslich 12 Kohlenstoffatomen, eine Halogen-, JTitro-, Hydroxy-, Amino-, Cyan-, Thiocyan- oder niedrigalkoxysubstituierte Kohlenwasserstoffcarbonsäureacylgruppe mit 2 bis einachlieeslieh 12 Kohlenstoffatomen oder eine niedere Alicoxycarbonylgruppe "bedeutet«

2. Decoyinin—triester niederer Carbonsäuren,

3 ο Decoyinintriacetat«

4. Verfahren zur Herstellung von Decoyinin-triestern gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man Decoyinin der I'ormel

.K^. VaQGVi (Art. / i, 1 .,.,■;. 2 Nr. 1 Satz 3 d«e Änderune««&V. A.A.ISfiZI

0 0 9 8 2 0/1823

OH ^0H2^0H

mit etwa 3 I-iol eines Acylierungsmittels, das ein Säureanhydrid- oder Säurehalogenid mit einem Kohlenwasserstoffearbonsäureacylrest von 2 bis einr.chliesslich 12 Kohlenstoffatomen, einem Halogen-, Hitro-, Hydroxy-, Amino-, Cyan-, Ihiocyan- oder niedrig-Alkoxy__Kohlenwasserstoffcarbonsäureacylrest mit 2 bis einschliesslich 12 Kohlenstoffatomen ocier ein niederes Alkoxycarbonylhalogenid ist, bei etwa 4 C v.'shrend etwa 10 bis 24 Std. umsetzt.

5. Verfahren nach Anspruch 4_f dadurch gekennzeichnet, dass man zur Herstellung eines Decoyinintriacetats mit einem

Schmelzpunkt von 188

bis 190⁰C

_scoyinin mit etwa 3

Essigsäureanhydrid bei etwa 4 C während etwa 1ü bis 24 Std. umsetzt.

Für

The Upjohn Company Kalamazoo (Michigan, TStA)

Rechtsanwalt

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BAD ORIGINAL

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