DE2020506A1

DE2020506A1 - Mittel und Verfahren zur Bestimmung einer Dehydrogenase-Aktivitaet

Info

Publication number: DE2020506A1
Application number: DE19702020506
Authority: DE
Inventors: Guillermo Anido; De Velasco Francisco Antonio; Plaut David Shyne
Original assignee: American Hospital Supply Corp
Current assignee: American Hospital Supply Corp
Priority date: 1969-07-09
Filing date: 1970-04-27
Publication date: 1971-01-21
Also published as: FR2053897A5

Description

Seh/GKL M 2TO3

Anerican Hospital Supply Corporation, Evanston, 111. / USA Mittel und Verfahren zur Bestimmung einer Dehydrogenase-

Aktivität

Es besteht seit langen ein Bedarf nach einer.schnellen, . genauen und reproduzierbaren Methode zur Bestimmung der Eonsentration der sechs diagnostisch wiohtigen Dehydrogenase in Blutserum oder in anderen Körperfltiesigkeiten, wobei eine derartig© Methode routinemäßig durchgeführt werden soll, ohne das« dabei eine teure UV-Anlage und ein gut ausgebildete β Personal erforderlich sind.

Ziel der Erfindung ist die Schaffung eines farbreagenses aur schnellen genauen und reprodusierbaren Bestimmung einer

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Dehydrogenase-Aktivität und damit einer Dehydrogenase-Konaentration, wobei diese beiden Begriffe direkt miteinander in Verbindung stehen, ferner fällt in den Rahmen der Erfindung die Schaffung von Methoden zur Beetimmung der Aktivität der diagnostisch wichtigen Dehydrogenasen im Blutserum sowie in anderen KÖrperflüssigkeiten.

Ein weiteres wichtiges Merkmal der Erfindung ist in der Schaffung eines Earbreagenses au sehen» das zur !Durchführung von Methoden verwendet werden kann, bei denen bekannte Mengen an Dehydrogenase eingesetst werden» um unbekannte Mengen von Blutzucker-, Seruntrlgljctrid- und BIutalkoholkonsen trationen su bestimmen, Dies erfolgt duroh die Binmengung bekannter Mengen an Ölucose-Dehydrogenaee (in Falle einer Blutzuckerbestimmung)» Ölyoerin-Debjdrogenase (im lalle einer Serumtrlglyoeridbeetlmmung) und Alkohol-Behydrogenase (im Falle : •iner Blutalkoholbestimeung) in die ßeafctionssysteme, und «war in die Glucose is Blut» das Glycerin, das durch Verseifung von Serumtriglyoeriden erseugt wird» und den Alkohol, welcher die Substrate XOr die Gluoose-Dehydrogenase, Glycerin-Dehydrogenaee bsw, Alkohol-Dehydrogenaee bildet.

Die vorliegende Erfindung betrifft daher ein Parbreagens und ein Verfahren aur Bestimmung der Aktivität von Enssyaen mir Übertragung von Wasserstoff (Dehydrogenase), wobei alle diese Bneyme Ooensyn I oder HAD als Wasserstoffakesptor benötigen, und zwar sram Zweck der qualitativen Messung einer Unbekannten in einer Körperflüssigkeit» wobei es sich bei dieser Unbekannten um eine der bereite beschriebenen Sehydrogenasen handeln kann oder um ein Substrat in einer Probe einer Körperflüssigkeit, mit weloher eine Dehydrogenaee reagiert. In jedem falle besteht das Tarbreagene aus likotinamidademin-Dinukleotid (IAD) ml· Waeeerstoffakmeptor, fnenasinmethoeulfat al· Elektronenträger

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und einem farbbildenden Xetrazoliumsaiz, welches mit dem reduBierten fhenazismethOBulfat unter Bildung eines deutlich gefärbten Formazane reagiert. Sie Tiefe der Farbe des erzeugten Formazane ist proportional der Aktivität der Dehydrogenase, aus welcher entweder die Konzentration der Dehydrogenase berechnet werden kann, oder aus welcher sich der (rehalt an Serumtriglyceriden, Blutglucose oder Blutalkohol bestimmen lässt, und zwar je nach den Reak*tanten sowie je nach dem jeweils durchgeführten Test.

Die AusfUhrungsform der Erfindung, welche mit den Reagentien und der Methode zur Bestimmung der Konzentration der diagnostisch wichtigen Dehydrogenaßen, die in kleinen Proben von Blutserum oder anderen Körperflüssigkeiten enthalten sind, befasst ist, wird zuerst beschrieben. Die andere Ausführungsform der Erfindung, welche im wesentlichen die gleiche Methode und das gleiche Farbreagess zum Zwecke der Bestimmung der Konzentration von Serumtriglyceriden, Blutzucker und Blutalkohol betrifft, wird anschliessend erläutert.

Alle sechs diagnostisch wichtigen Dehydrogenasen, welche vorstehend beschrieben worden sind, sind auf den gemeinsamen Nenner zu bringen, dass in dem Reaktionssintern, wenn die Dehydrogenase auf dem Substrat wirkt, die oxydierte Form von Coenzym I (HAD) als Wasserstoffakzeptor wirkt, welcher anschliessend das Elektron an einen Elektronenträger, und zwar Phenazinmethosulfat, leitet. Phenazinmethosulfat macht seinerseits das Elektron einem Xetrazolium-Farbstoff verfügbar. Der Xetrazolium-Farbstoff wird in quantitativer Weise zu dem Formazan reduziert, das eine von dem Farbstoff verschiedene Farbe besitzt, wobei die liefe der Farbe des erzeugten Formazane proportional der Aktivität und Konzen-

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- 4 tration der Dehydrogenase in der Körperflüssigkeit ist.

Die sich abspielenden Reaktionen lassen sich wie folgt zusammenfassen:

(Dehydrogenase

im Körper» Flttssigkeitsprobe)

(1) Substrat + NAD < r> Oxydiertes Substrat + RADH₂

(2) NADHg + Phenazinmethosulfat (IMS)—>NAD + BiSH₂ (5) EMSH₂ + Tetrazoliumsala > PMS + Formazan

Am zweckmässigsten sind das Nikotinamidädemin-Dinukleotid (NAD), das Phenazinmethosulfat (PMS) und das !tetrazoliumsalz jeweils Komponenten eines einzigen umfassenden färbreagenses. Die Menge eines jeden, der drei Bestandteile des umfassenden Farbreagenses ist nicht kritisch, vorausgesetzt, dass in jedem Falle ein merklicher Überschuss vorliegt, um die Reaktion mit der Dehydrogenase in der Probe der zu testenden Körperflüssigkeit zur Beendigung zu bringen.

Ein Gefriertrocknen des umfassenden Farbreagenses konser- ' viert seine Aktivität während längerer Zeitspannen, wobei jedoch darauf hinzuweisen ist, dass ein Gefriertrocknen nicht zur Durchführung der vorliegenden Erfindung wesentlich ist. Wird ein gefriergetrocknetes Reagens verwendet, dann muss ein derartiges Farbreagens zur Durchführung des Tests wieder in seinen ursprünglichen Zustand überführbar sein. Zur Konservierung des Farbreagenses kann ein Stabilisator, wie beispielsweise Gammaglobulin, in die Reagensformulierung eingemengt werden. Die Menge des auf diese Weise zugesetzten Gammaglobulins kann innerhalb eines breiten Be-

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reiches schwanken. Se ist darauf hinzuweisen, dass das Ausnaß der Stabilisierung in einer Beziehung zu der Stabilisatormenge in der Formulierung steht, wobei jedoch überschüssige Sengen, obwohl sie keine merkliche Erhöhung der Stabilisierung bewirken, nicht in nachteiliger Weise die Heaktion beeinflussen. Zufriedenstellende Ergebnisse konnten mit Mengen an Gammaglobulin zwischen 20 und 60 # erzielt werden, wobei ein bevorzugter Bereich zwischen 40 und 50 j£, bezogen auf das Gewicht, liegt·

Bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens wird das gefriergetrocknete Reagens mit einer abgemessenen Menge des entsprechenden gepufferten Substrats erneut In seinen ursprünglichen Zustand überführt. Sie Eneymaktivität in der Probe der Körperflüssigkeit mit der zu untersuchenden Dehydrogenase wird in der Weise bestimmt, dass eine gemessene Menge der Körperflüssigkeit dem umfassenden Farbreagene zugesetzt wird, das in entsprechender Welse erneut mit des entsprechenden Substrat In seinen ursprunglichen Zustand überführt worden ist und auf eine Temperatur zwischen ungefähr 25 und ungefähr 40^βC erhitzt worden ist. Die bevorzugte temperatur betragt 37*C In jedem Falle 1st es von Bedeutung, dass die ausgewählte !temperatur während der Inkubationszeit aufrecht erhalten wird, wobei die Inkubationszeit genau bestimmt werden muse* Je nach der zu testenden Dehydrogenase kann die Inkubationszeit im allgemeinen zwischen 5 und 60 Minuten liegen. Bei Einhaltung von tieferen Temperatüren sind längere Zeiten erforderlich, während höhere Temperaturen eine schnellere Reaktion bewirken.

Wie aus dea oben angegebenen Gleichungen hervorgeht, nehmen an des Beaktiontn, welche durch die Dehydrogenaee katalysiert

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werden, Substrate tell, welche dazu in der Lage sind, oxydiert zu werden, wenn sie mit Nikotinamidademin-Dinukleotid (NAD) in Gegenwart der entsprechenden Dehydrogenase umgesetzt werden. Bei einem Test zur Bestimmung der Milchsäure-Dehydrogenase-Aktivität besteht das Substrat aus einer wässrigen Lösung eines Salzes von Milchsäure, während bei der Durchführung eines Apfelsäure-Dehydrogenase-Xests eine wässrige Lösung eines Salzes von Apfelsäure verwendet wird. Bei der Ausführung eines Glutaminsäure-Jtohydrogenaae-Sests wird eine wässrige Lösung eines Salzes von Glutaminsäure verwendet usw. Jedes der Substrate sum Testen der Aktivität der sechs diagnostisch wichtigen Dehydrogenasen sollte mit einem geeigneten alkalischen Puffer auf einen pH zwischen ungefähr 7 und9 gepuffert werden, wobei der jeweilige pH bei einem gegebenen Test von dem jeweiligen Enzym abhangt. Iris-(hydroxymetbyl)-aminomethan wird bevorzugt, wobei jedoch auch ander· alkalische Puffer, wie beispielsweise Hatriumbarbital, Trinatriumphoephat oder dergleichen verwendet werden können.

Die farbänderung in dem Heaktionesyetem erfolgt dann, wenn der Tetrasolium-Farbstoff su seinem Pormasan reduziert wird. Jeder geeignete Xetrasolius-farbstoff, der dazu in der Lage ist, mit reduziertem Phenazinmetbosulfat unter Gewinnung von Foraazan mit einer Farbe, die von derjenigen des Farbstoffs verschieden ist, zu reagieren, kann verwendet werden. In frage kommen beispielsweise blaues p-Nitrotetrazoliumehlorid, Jodnitrotetrazolium-Violett, Thiaeolyl-Blau, blaues m-Hitrotetrazoliumohlorid oder dergleichen. Blaues p-Nitrotetraaoliumchlorid hat sich als besonders wirksam erwiesen·

Das erfindungigemasee Verfahren eignet eioh zur Beetineung

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der Dehydrogenasen in beliebigen Xörperflüseigkeiten, wie beispielsweise Blutserum, Rückenmarksflüssigkeit, serosalen Ergüssen oder dergleichen. Die Geschwindigkeit der Reaktion zwischen den Substraten und NAD, die durch jede der sechs diagnostisch wichtigen Dehydrogenasen katalysiert wird, die in einer Probe einer derartigen Körperflüssigkeit vorliegen, lässt sich in der Weise bestimmen, dass die Tiefe der Farbe . bestimmt wird, welche durch die Reduktion des Tetrazoliumfarbstoffe erzeugt wird, und zwar im Vergleich gegenüber der Farbtiefe, die durch die Reduktion desselben Farbstoffe erzielt wird, wenn ein Standard parallel untersucht wird, der eine bekannte Konzentration der in Frage stehenden Dehydrogenase enthält. Einheiten der untersuchten Dehydrogenase können von einer konstruierten Kurve abgelesen oder aus einem Grund-Formazan-Standardversuch berechnet werden, wobei sich die Unbekannte gernäss folgender Formel ermitteln lässt:

QD der Probe X Internationale

OD des Grund- Einheiten = Internationale Ein-Standards (Standard) heiten in der Probe

Bemerkung: In der vorstehenden Formel ist der Einheitswert

eine Funktion des jeweiligen Dehydrogenase-Testo.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, und zwar im Hinblick auf die Bestimmung der Enzymaktivität einer Dehydrogenase in unbekannten Proben von Körperflüssigkeiten.

Beispiel 1

Ein umfassendes Farbreagens zur Bestimmung von Dehydrogenasen kann unter Verwendung der folgenden Bestandteile pro Testeinheit in der nachstehend beschriebenen Weise hergestellt werden;

0 0 9 8 iU / U ? 8

Gewicht in ψψ:

Blaues p-Nitrotetrassolium-

chlorid 3,00

Nikotinamidademin-Dinukleo-

Ud (MSl) 2,00

Phenassinmethosulfat 0,03

Gammaglobulin (Bovin) 4,00

g eines kristallinen Bovins (Gammaglobulin) werden in Wasser unter Rühren aufgelöst. Diese Lösung wird durch ein Eilterpolster unter Saugen filtriert. Dann werden dieser Lösung 1,6 g des Tetrazoliumfarbstoffe (vorzugsweise blaues p-Nitrotetrazolium) ssugesetzt, worauf nach einem Rühren die !lösung erneut filtriert wird. 11g Nikotinamidademin-Dinukleotid werden zugesetzt. Die Lösung, die nunmehr auf 1000 ml aufgefüllt wird, wird durch Lagerung in einer mit einer Aluminiumfolie umwickelten Flasche aufbewahrt, um die Lichteinwirkung abzuschirmen. Unmittelbar vor dem Einfüllen werden 160 mg Phenazinmethosulfat zugesetzt, worauf die Mischung gerührt wird. Die Lösung wird in bernsteinfarbene Phiolen abgefüllt, und zwar in einer Menge von 2,2 ml pro Phiole. Unmittelbar nach dem Füllen der Phiolen werden diese in Trokkeneis gelegt, um sie vor der Gefriertrocknung einzufrieren.

Das umfassende Reagens wird anschliessend zur Konservierung seiner Aktivität während längerer Zeitspannen gefriergetrocknet. In dieser Weise hergestellt, ist das gefriergetrocknete Farbreagens bei 4 - 8°C stabil, und zwar während Zeitspannen von mehr als 1 Jahr, wie sich durch Stabilitätsteste ermitteln lässt.

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Beispiel 2

Gepufferte Substrate zur Bestimmung der Enzymaktivität einer jeden der sechs diagnostisch wichtigen Dehydrogenasen können wie folgt hergestellt werden:

(a) Milchsaure-DetLvdrogenaee (U)H)

Zusammeneetsung des gepufferten

Substrate,

für jeden Test

Gewicht in mg

Idthiumlac tat 6,000

Magnesiumlactat 0,500

Triehydroiyaethylaminomethan,

3-fach kristallisiert

(eingestellt auf einen pH von 8,2) 6*0^0

(to) q-Hydroxybtttterflänre-ltehTdrogenaae (HHD)

Zusammeneetsung des gepufferten

Substrats,

für jeden Seat

gewicht in mg

a-gydroxylmtterfläure 20,000

Triehydroxjeethylaminomethan,

3-faoh krietallieiert

(eingestellt auf einen pH von 8,2) 6,050

(o) ATpfelfläure-Dehydrogenase (MD)

Zueammeneetzung des gepufferten

Substrate,

für jeden !Seat

Gewloht in tag Natriuaaalat 718?0 Triehjdroaysaethylaiiinooethan,

3-faoh krietalllfliert

(•inge·teilt auf tin·» pH τοη S₉4} 6,050

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(d) glutaiaiiiBäure-Dehydrogenaee (SPH)

Zusammensetzung dea gepufferten

Substrate,

fOr jeden Test

Batriumglutamat
Adenosintriphosphat Epridoxy !phosphat

Xrishydroxy methylaminomethan, 3-faoh kristallisiert (eingestellt auf einen pH von 7,3 und gefriergetrocknet zur erneuten überführung in den ursprünglichen Zustand mit 1 ml Wasser)

Gewicht in mg

9,400
1,400
0,002

6,050

(e) 8orpitol-Psh3rdrogenasa (SPH)

Zusamensetsung des gepufferten

Substrate,

für Jeden fest

d~Sorbitol

teiehydroxymethylaminoeethan, 3-faoh kristallisiert (eingestellt auf einen pH von 8,0) Gewicht in 1,000

6,050

(f) Alkohol-Petodrogenaa» (APH)

Zusaaraeneetsung des gepufferten

Substrats,

fUr jeden fest

Äthylalkohol

Triflhydroaymethylaminoiaethan, 5-faoh kristallisiert (elngtstellt auf einen pH von 8,8) Qewioht in ag 100,000

6,050

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Beispiel 3

Sie quantitative Untersuchung von sechs diagnostisch wichtigen Dehydrogenasen lässt sich nach der folgenden Methode durchführen, wobei das umfassende Farbreagens und eines der in den Beispielen 1 und 2 angegebenen gepufferten Substrate verwendet werden. Alle Substrate von Beispiel 2, mit Ausnahme des Substrats für Glutaminsäure-Dehydrogenase, befinden sich in einem flüssigen Zustand, der sich unmittelbar für eine Verwendung eignet. Das Substrat für Grlutaminsäure-Dehydrogenase erfordert eine Überführung in den ursprünglichen Zustand unter Verwendung einer vorherbestimmten Menge (1 ml) Wasser,

Bei der Durchführung eines jeden Tests wird das gefriergetrocknete farbreagens zuerst mit der entsprechenden Menge der gepufferten Substratlösung in seinen ursprünglichen Zustand zurückgeführt. Das Farbreagens und der Puffer werden durch Schütteln des Behälters vermischt und ansohliessend 5 Minuten lang unter Rühren stehen gelassen. Eine gemessene Menge des Sarbreagenses und der gepufferten Substratlösung (0,5 - 2,0 ml) wird anschlieesend jeweils in zwei 16 χ 125 mm-Reagensgläser pipettiert, die mit "unbekannt" und "Blindprobeⁿ markiert sind. Beide Reagensgläser werden in einem Wasserbad bei einer Temperatur von 37°C während einer Zeitspanne von 5 Minuten vorgewärmt, unter Verwendung einer "To Contain"-Pipette werden 0,01 - 0,50 ml der zu testenden Körperflüssigkeit dem Reagensglas zugegeben, das mit "unbekannt" gekennzeichnet ist, während 30 Sekunden später 6,01 - 0,05 ml destilliertes Wasser dem Reagensglas zugeführt werden, das mit "Blindprobe" bezeichnet ist. Die Inhalte eines jeden Rohres werden anschlieesend in dem Wasserbad bei einer Temperatur von 57⁰C während einer bestimmten Zeitspanne inku-

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biert, "und zwar während einer Zeitspanne» die dazu erforderlich ist, dass jede der verschiedenen Dehydrogenasen seine Aktivität entwickelt. Die Inkubationszeiten für jede der Haupt-Dehydrogenasen sind wie folgt: laotat-Dehydrogenase (IlDH) 5-20 Minuten, a-Hydroxybuttersäure-Dehydrogenase (HHD) 10 - 30 Minuten, Apfelsäure-Dehydrogenase (MDH) 10 bis 30 Minuten, Glutaminsäure-Dehydrogenase (GDH) 10-30 Minuten» Sorbitol-Dehydrogenase (SDH) 10-30 Minuten und Alkohol-Dehydrogenase (ADH) 10-30 Minuten.

Ansohliessend an eine derartige Inkubation werden unter Einhaltung des vorstehend beschriebenen 30 Sekunden-Inter-. vallzeitplanes 2 - 5 ml einer 0,In-Ohlorwasserstoffsäurelösung einem jeden Rohr zugesetzt, und zwar zuerst dem mit "unbekannt" markierten Rohr und dann dem mit "Blindprobe" beschrifteten Rohr, worauf die Inhalte zum Abstoppen der Ensymreaktion vermischt werden. 30 Minuten nach der Zugabe der Chlorwasserstoffsäure Wird unter Verwendung eines' Spektrophotometers bei einer Wellenlänge von 500 bis 560 nm die unbekannte Probe gegenüber der Blindprobe abgelesen, und zwar bei einer 100 ^igen Durchlässigkeit oder bei einer optischen Dichte von 0. Die Einheiten der untersuchten Dehydrogenase werden anschliessend von einer konstruierten Kurve abgelesen oder aus einem Dehydrogenase-Grrundstandard-Versuch mit der unbekannten errrechnet. Ein derartiger Grundstandard besteht aus einer stabilen gefriergetrockneten Mischung eines Xetrazolium-Parbstoffs,, Phenazinmethosulfat und einem Stabilisierungsmittel (wie beispielsweise Gammaglobulin). Dieser Standard stellt nach seiner Überführung in seinen ursprünglichen Zustand eine Lösung mit einer bekannten Tetrazolium-Konzentration dar und liefert bei einer entsprechenden Behandlung eine Färb-

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intensität, die einem bekannten Gehalt einer Dehydrogenase-Aktivität proportional ist.

Wie vorstellend erwähnt, betrifft eine andere Ausführungsform der Erfindung ein ähnliches Reaktionssystem, in welchem das Substrat die Substanz mit unbekanntem Wert enthält, Daher besteht das Substrat aus der zu testenden Kurperflüssigkeitsprobe, wobei jede derartige Probe eine unbekannte Menge an Glucose, Serumtriglyoeriden, Blutalkohol oder dergleichen enthält.

Die Bestimmung der Blutgluoose gemäss der Methode dieser AusfUhrungsform besteht darin, die Glucose und Nikotinamidademin-Dinukleotid (SAD) unter Bildung des reduzierten Coenzyme I (NADH₂) und d-Gluconolacton in Gegenwart von Glucose-Dehydrogenase als Katalysator umzusetzen. Das Nikotinamidademin-Dinukleotid ist ein Seil eines umfassenden Farbreagenses, das, wie bereits erwähnt, auch Phenazinmethosulfat und ein Xetrazoliumsalz enthält, welohes dazu in der Lage ist, mit reduziertem Phenazinmethosulfat unter Erzeugung eines Formazane mit einer anderen farbe zu reagieren. Das Farbreagens enthält ferner ein Stabilisierungsmittel, wie beispielsweise Gammaglobulin, und wird vorzugsweise zur Ermöglichung einer längeren Lagerung gefriergetrocknet.

Zur Bestimmung des Glucosegehaltes einer Blutprobe wird das umfassende Farbreagens zuerst in seinen ursprünglichen Zustand zurückgeführt, vorzugsweise mittels einer Lösung, die eine bekannte Menge Glucose-Dehydrogenaee und einen alkalisehen Puffer enthält· Diese Lösung wird anschliessend mit einer Blutprobe vermischt, die eine unbekannte Menge Gluoose enthält. Die Reaktanten werden bei einer Temperatur zwisohen 25 und 4O⁰C

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(vorzugsweise 37⁰C) während einer Zeitspanne von 5-30 Minuten Inkubiert. Die Glucose in der Blutprobe wird durch das Enzym beeinflusst» was zur Folge hat, dass das Coenzym I (SAD) reduziert wird, wodurch das Phenazinmethosulfat reduziert wird» das seinerseits das Tetrazoliumsalz zu seinem 3?omnazan reduziert. Die Intensität der farbreaktion ist proportional der Konzentration der Glucose in der Blutprobe· Wird der lest parallel zu einem Standard mit einer bekannten Glucosekonzentration durchgeführt, dann kann die Konzentration der Glucose in der Testprobe berechnet werden.

Ein ähnlicher Test kann zur Bestimmung der Konzentration von Xriglyoeriden in einer Serumprobe durchgeführt werden. Die Triglyceride werden zuerst in bekannter Weise verseift, worauf das in Freiheit gesetzte Glycerin in Glyceraldehyd in Gegenwart von Glyoerin-Dehydrogenas® und des beschriebenen umfassenden Farbreagenses umgewandelt wird. Das Setrazoliumsalz des umfassenden Farbreagenses wisd zu seinem Formazan bei der Reaktion reduziert, die dann stattfindet, wenn die Glycerin-Dehydrogenase zur Katalysierung der Umwandlung von Glyoerin in Glyoeraldehyd verwendet wird.

Das umfassende Farbreagens wird zuerst in seinen ursprünglichen Zustand überführt, und zwar vorzugsweise mit einer üösung, die Glyoerin-Dehydrogenase und einen alkalischen Puffer enthält. Eine derartige Lösung wird anschliessend mit einem Substrat vermischt, das Glycerin enthalt, welches durch Verseifung von Triglyceriden in einer Probe des zu testenden Serums erzeugt worden 1st· Die durch die Glyoerin-Dehydrogenase katalysierte Reaktion wird naoh einem genauen^Zeitplan durchgeführt, wobei die Temperatur konstant auf einem Wert zwisohen 25 und 40^ö0 gehalten wird. Führt man den Test parallel zu einem Standard mit bekannter Glyoerinkonzentration durch, dann können die Kon««n-

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tration des durch die Verseifung der Serumtriglyceride erzeugten Glycerins und folglich die Kongentration der GIyceride in der ursprünglichen Serumprobe berechnet werden.

Zur Bestimmung von Blutalkohol wird das umfassende-PaCbreagenß zuerst in seinen ursprünglichen Zustand überführt, und zwar vorzugsweise mit einer Lösung, die Alkohol-Dehydrogenase und einen alkalischen Puffer enthäTt. Sine derartige Lösung wird mit einem Substrat vermischt, gewöhnlich einem Serum, das Alkohol enthält. Die Reaktion, welche durch die Alkohol-Dehydrogenase katalysiert wird, wird nach einem exakten Zeitplan durchgeführt, wobei die Temperatur auf einer konstanten Höhe gehalten wird, die innerhalb des Bereiches von 25 - 4O°G liegt. Führt man den Test parallel mit einem Standard mit einer bekannten Alkoholkonzentration durch, dann kann die Konzentration des Alkohols in dem Serum berechnet werden.

Die folgenden Beispiele erläutern die Anwendung der Methode sowie das umfassende Farbreagens, und zwar im Hinblick auf die Bestimmung von Blutgluoose-, Serumtriglycerid- und Blutalkoholgehalten:

Beispiel 4

Zur Durchführung eines jeden Bests wird das gefriergetrocknete Farbreagens zuerst mit einer Pufferlösung (vorzugsweise einer Lösung, die Glucose-Dehydrogenase enthält) in seinen ursprünglichen Zustand überführt. Die Mischung wird stehen gelassen. Nach einem geeigneten Intervall wird eine abgemessene Menge des Farbreagenses sowie der Pufferlösung (0,5 - 2,0 ml) jeweils in zwei 16 χ 125 mm-Reagensgläser pipettiert, die mit "unbekannt" bzw. "Blindprobe" markiert

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sind. Beide Reagensgläser werden in ein Wasserbad (22 - 37°0) während einer Zeitspanne von 5 Minuten vorerwärmt. Unter Verwendung einer "Io Contain"-Pipette werden 0,01 - 0»50 ml der zu testenden Körperflüssigkeit dem mit "unbekannt" markierten Reagensglas zugesetzt, worauf 30 Sekunden später O_fO1 -0,50 ml eines destillierten Wassers dem mit »Blindprobe " markierten Reagensglas zugegeben werden. Die Inhalte der Reagensgläser werden anschliessend in dem Wasserbad (22 - 37°C) während einer bestimmten Zeitspanne inkubiert, und zwar währdnd einer Zeitspanne, die dazu erforderlich ist, dass die Gluoose-Dehydrogenase vollständig die Glucose in der Körperflüssigkeit oxydiert.

Anschileesend an die Inkubation werden unter Einhaltung des gleichen 30 Sekunden-Intervallzeitplanea 2 - 5 ml einer 0,InChlorwasserstoff säure einem jeden Reagensglas zugesetzt, und zwar zuerst dem mit "unbekannt" markierten Reagensglas und dann dem mit "Blindprobe" markierten Reagensglas. 50 Hinuten nach der Zugabe der Säure wird unter Verwendung eines Spektrophotometers bei einer Wellenlänge von 500 - $60 um die unbekannte gegenüber der Blindprobe abgelesen, und zwar bei einer Durchlässigkeit von 100 f* oder einer optischen Dichte von 0, Die Menge der Glucose in der Körperflüssigkeit wird ansohliessendvon einer konstruierten Kurve abgelesen oder aus einem Glucose-Grundstandard-Versuch mit der Unbekannten errechnet.

Beispiel 5

Zur Durchführung des Tests werden die Triglyceride in einem Aliquot eines Serums zuerst in bekannter Weise verseift. Ein Seil des verseiften Serums und ein Seil des nioht-verseiften Serums werden ansohlieesend wie folgt verarbeitet:

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Zur Durchführung eines jeden Seats wird daß gefriergetrocknete ParbreagenB zuerst mit einer Pufferlösung in seinen, ursprünglichen Zustand überführt, wobei vorzugsweise eine Lösung verwendet wird, die Glycerin-Dehydrogenaee enthält. Die Mischung wird stehen gelassen. Nach einem geeigneten Intervall wird eine gemessene Menge des Sarbreagenses und der Pufferlösung (0,5 -2,0 ml) in jedes von drei 16 χ 125 mm-Reagensgläsern einpipettiert, die mit "unbekannter Test", "unbekannte Blindprobe ^R und "Reagens-Blindprobe" markiert sind. Alle Reagensgläser werden in einem Wasserbad (22 - 37⁰C) während einer Zeitspanne von 5 Minuten vorgewärmt. Unter Verwendung einer "To Contain"-Pipette werden 0,01 - 0,50 ml des verseiften Serums, das getestet werden soll, dem Reagensglas zugegeben, das mit "unbekannter Test" markiert ist. 30 Sekunden später werden 0,01 - 0,50 ml des unbehandelten Serums dem Reagensglas zugesetzt, das mit "unbekannte Blindprobe" besohriftet ist, während 30 Sekunden später 0,01 - 0,50 ml destilliertes Wasser dem Reagensglas zugefügt werden, das mit "Reagens-Blindprobe » bezeichnet ist. Die Inhalte der Reagensgläser werden anschliessend in dem Wasserbad (22 - Y(⁰O) während einer bestimmten Zeitspanne inkubiert, und zwar während einer solchen Zeitspanne, die dazu erforderlich ist, dass die GIycerln-Dehydrogenase vollständig das Glycerin in der Körperflüssigkeit oxydiert.

Anschliessend an eine derartige Inkubation werden unter Einhaltung des gleichen 30 Sekunden-Intervallzeitplanes 2 - 5 ml einer 0,1»-Chlorwasserstoffsäure einem jeden Reageneglao zugesetzt (zuerst dem mit "unbekannter Test" bezeichneten Rohr, dann dem mit "unbekannte Blindprobe¹¹ bezeichneten Rohr und aneohlieeeend dem mit "Reagene-Blindprobe" markierten Reageneglas), worauf die Inhalte vermischt werden. 30 Hinuten

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nach der Zugabe der Säure wird unter Verwendung eine» Spektrophotometers bei einer Wellenlänge von 500 - 560 nm die unbekannte gegenüber der Blindprobe abgelesen, und zwar bei einer 100 $igen Durchlässigkeit oder bei einer optischen Dichte von 0. Die Menge an Triglyoeridglycerin in der Körperflüssigkeit wird ansohliessend von einer konstruierten Kurve abgelesen oder aus einem ßlyoerin-Grundstandard-Versuch mit der Unbekannten berechnet.

Beispiel 6

Zur Burohfuhxuxtg eines jeden ffiests wird das gefriergetrocknete Farbreagens zuerst unter Verwendung einer Pufferlösung in seinen ursprünglichen Zustand Überführt, wobei vorzugsweise eine Lösung verwendet wird, die Alkohol-Sehydrogenase enthält. Sie Mischung wird stehen gelassen. Mach einem geeigneten Zeitintervall wird ©ine abgemessene Menge des Farbreagenses und der Pufferlösung (0,5 - 2,0 ml) in jedes von zwei 16 ζ 125 mm~ Reagensgläeern elnplpettiert, die mit "unbekannt" und "Blindprobe" markiert sind· Beide Reagensgläser werden in ein Wasserbad (22 - 57 ⁰C) während einer Zeitspanne von 5 Minuten vorgewärmt. Unter Verwendung einer "So Contain"-Pipette werden 0,01 - 0,50 ml der zu testenden Körperflüssigkeit dem Reagensglas zugesetzt, das mit "unbekannt" markiert ist, während 30 Sekunden später 0,01 - 0,50 ml destilliertes Wasser in das Reagensglas gegeben werden, das mit "Blindprobe" bezeichnet ist. Die Inhalte der Reagensgläser werden dann in dem Wasserbad (22 - 37⁰O) während einer bestimmten Zeltspanne Inkubiert, und zwar während einer Zeltspanne, die dazu erforderlich ist, dass die Alkohol-Behydrogenase vollständig den Alkohol in der Körperflüssigkeit oxydiert·

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Anschliessend an diese Inkubation werden unter Einhaltung dee vorstehend geschilderten 30 Selcunden-IntervalLBeitplanes 2 - 5 ml einer O, In-Ohlorwasserstoffsäure einem jeden Beagensglas zugesetzt, und «war zuerst dem mit "unbekannt" bezeichneten Reagensglas und ansohliessend dem mit "Blindprobe" markierten Beagensglas, worauf die Inhalte vermischt werden. 30 Minuten nach der Zugabe der Säure wird unter Verwendung eines Spektrophotometers bei 500 - 560 nm die unbekannte gegenüber der Blindprobe abgelesen, und zwar bei einer Durchlässigkeit von 100 56 oder einer optischen Dichte von 0. Die Alkoholmenge in der Körperflüssigkeit wird ansohliessend von einer konstruierten Kurve abgelesen oder aus einem Alkohol-.erundstandard-Versuch mit der Unbekannten berechnet.

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Claims

- 20 Patentansprüche

/ IyUmfassendes Farbreagens zur quantitativen Ermittlung einer Enzymaktivität ssvriechen einer ausgewählten Dehydrogenase und einem ausgewählten Substrat, das durch die Dehydrogenase in Gegenwart von Nikotlnasddademin-Dinukleotid oxydiert werden kann, gekennzeichnet durch eine Mischung aus ifikotinamidademin-Dinukleotid, Phenazlnmethosulfat und einem farbbildenden Tetrazoliumsalz, das mit reduziertem Phena κ .tnmetho sulfat unter Gewinnung eines Formazane mit einer Farbe zu reagieren vermag, die von derjenigen des Salzes verschieden ist.
2. Farbreagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es ausserdem Gammaglobulln als Stabilisierungsmittel enthält.
3. Farbreagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Mischung gefriergetrocknet ist.
4. Farbreagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es die Aktivität einer Dehydrogenase anzeigt, die aus Milch» säure-Dehydrogenase, a-Hydroxybutteroäure-Dehydrogenase, Apfel· säure-Uehydrogenaee, Glutamineäure-Dehydrogonaee, Sorbitol*- Dehydrogenase oder Alkohol-Dehydrogenase besteht.
5. Farbreagens nach Anspruch 1, daduroh gekennzeichnet, dass es die Bnzymaktivitat zwischen einem Substrat bekannter Zusammensetzung und einer Dehydrogenase unbekannter Menge in einer Probe einer Körperflüssigkeit anzugeben vermag, wobei die Dehydrogenase dazu in der lage ist, das ausgewählte Substrat in Gegenwart von Nikotinamidademin-Dinukleotid zu oxydieren.

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6. Farbreagens nach. Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet» dass das farbgebende Tetrazoliumsalz aus blauem p-Nltrotetrazolium- . Chlorid, Jodnitrotetrazolium-Violett, Thiazolyl-Blau oder blauem m-ffitrotetrazoliumchlorld besteht.
7. larbreagens nach Anspruoh 6, dadurch gekennzeichnet, dass das farbbildende Tetrazoliumsalz aus blauem p-ffitrotetrazoliumchlorid besteht·
8. Farbreagens nach Anspruch. 5, dadurch gekennzeichnet_t dass

es die Aktivität einer Dehydrogenase mit einer gepufferten wässrigen Substratlösung anzuzeigen vermag, wobei die Subs trat lösung aus einer Natriumlactat-, a-Hydroxybuttersäure-, ffatriumoalat-, Hatriumglutamat-, d-Sorbitol- oder Äthylalkohollösuag besteht.
9. Parbreagens nach Anspruch t, dadurch gekennseichnet, dass

es die enzymatisch© Aktivität zwischen der erwähnten Dehydrogenase und einem Subs-teat anzuzeigen vermag, das aus einer Probe einer Körperflüssigkeit besteht, die eine unbekannte Menge einer Substanz enthält, welche sich aus einem Serumtriglycerid, Glucose oder einem Alkohol zusammensetzt.
10. Verfahren zur quantitativen Hessung der Umsetzung zwischen einer ausgewählten Dehydrogenaoe und einem ausgewählten Substrat, das dazu in der lege 1st, durch die Dehydrogenäse in Gegenwart von Hikotinamidademin-Dinukleotld oxydiert zu werden, dadurch gekennzeichnet, dass die Dehydrogenase und eine wässrige Löeung des Substrats mit einem Farbreagens vermischt werden, das aus einer Mischung aus Hikotlnamidademin-Dinulcleotld, Phenaainnethosulfat und einem farbbildenden Xetrazollumsalz besteht« welche· dazu in der Lag· ist, mit dem reduzierten Phenazinmethoeulfat unter Erzeugung eines Formazans zu reagieren, das in

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seiner Farbe von derjenigen des Salzes verschieden ist, und die Mischung bei einer gleichmäeaigen temperatur zwischen ungefähr 25 und 40⁹C !fahrend einer Zeitspanne von ungefähr 10-60 Minuten zur Entwicklung einer sichtbaren Farbe mit einer Tiefe, welohe der Intensität der Reaktion proportional 1st, inkubiert wird.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass auaserdem die Tiefe der Farbe zur Bestimmung der Intensität der leaktlon gemessen wird.
12. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die verwendete Dehydrogenase aus Milchaäure-Dehydrogenase besteht, wahrend das eingesetzte Substrat eine gepufferte wässrige lösung eines Alkali- oder Brdalkalisalzes von Milchsäure 1st.
13. Verfahren nach Anspruch 10, daduroh gekennzeichnet, dass die eingesetzte Dehvdrogenase aus a-Hjdroxybuttereäuro-Sehydrogenase besteht und das verwendete Substrat aus α-Ifydroxybttttersäure besteht.
14· Verfahren nach Anspruch 10, daduroh gekennzeichnet, dass die eingesetzte Dehydrogenase Apfeleäure-Dehydrogenaae 1st, während eich das verwendete Substrat aus einer wässrigen !lösung von Batriunoalat zusawensetzt.
15. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die verwendete Dehydrogenase aus Glutaminaäure-Dehydrogenae« besteht, während sich das eingesetzte Substrat aus einer wässrigen Lösung von Katriumglutaoat susasnensetst«

§09884/1428
16. Verfahren nach. Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die verwendete Dehydrogenase Sorbitol-Dehydrogenase ist, während sich das verwendete Substrat aus einer wässrigen Lösung von d-Sorbitol zusammensetzt.
17. Verfahren naoh Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die eingesetzte Dehydrogenase eine Alkohol-Dehydrogenase ist, während es sich bei dem Substrat um Äthylalkohol handelt.
18. Verfahren naoh Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die eingesetzte Dehydrogenase aus Crlucose-Behydrogenase besteht, während es sich bei dem eingesetzten Substrat um eine Probe einer Körperflüssigkeit handelt, die eine unbekannte Konzentration von d-Glucoae enthält.
19· Verfahren naoh Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die verwendete Dehydrogenase aus £Lycerin~Dehydrogenase besteht, während es sich bei dem Substrat um eine Probe einer Flüssigkeit handelt, die eine unbekannte Konzentration an Glycerin enthält, welches bei der Verseifung von Serumtriglyoeriden angefallen ist.
20. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die verwendete Dehydrogenase eine Alkohol-Dehydrogenase ist, während es eich bei dem Substrat um eine Probe einer flüssigkeit handelt, die eine unbekannte Alkoholkonzentration enthält.

009884/U28