DE2323609A1 - Verfahren zur quantitativen bestimmung von triglycerid - Google Patents
Verfahren zur quantitativen bestimmung von triglyceridInfo
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Description
Hamburg, den 7. Mai 197 3 13Θ973
Prioritäten: 25. 12. 1972, Japan Nr. 48-2389
und
27. 2. 1973, Japan Nr. 48-23592
Anmelder:
Ono Pharmaceutical Company Limited
No.14, 2-chome, Dosho-machi,
Higashi-ku
Osaka-shi, Japan
No.14, 2-chome, Dosho-machi,
Higashi-ku
Osaka-shi, Japan
Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Triglycerid
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung
von in Blutserum oijr in Gevsbeflüssigkeit enthaltenem
Tr L'jlvc'iriu.
409826/0662
Die bisherige quantitative Bestimmung durch Analyse von Triglycerid,
das in Serum oder Gewebeflüssigkeit enthalten ist, wurde so durchgeführt, dass zunächst die Fettstoffe mit einem Lösungsmittel, beispielsweise
einem Misch-Lösungsmittel aus Methylchlorid und Methanol,
extrahiert, dann die extrahierten Fettstoffe alkalisch hydrolysiert wurden, wobei das Glycerin freigesetzt wurde, und anschliessend dieses
in der Flüssigkeit enthaltene Glycerin quantitativ, enzymatisch oder mit chemischen I4ethoden, bestimmt wurde. Diese bisher benutzten
Bestimmungsverfahren sind vergleichsweise aufwendig und umständlich,
und darüber hinaus ist diese Art der quantitativen Analyse von j.'riglycerid
in Geweben weitgehend abhängig von dem Ausmaß der Extraktion des Fettes vor der Hydrolyse. Darüber hinaus ist eine chemische Verseifung nicht für Fett spezifisch, so dass die analytischen
Ergebnisse unter Umständen ungenau ausfallen können.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, diese bisherigen Nachteile
der Bestimmung von Triglycerid in Blut und Körper- bzw. Gewebefliissigkeiten zu vermeiden und ein einfaches und rasch durchführbares Bestimmungsverfahren
zu schaffen, das eine sichere quantitative Analyse von Triglycerid in solchen Flüssigkeiten erlaubt.
Diese Aufgabe wird gelöst mittels eines Verfahrens der angegebenen
Art zur quantitativen Bestimmung von in Blutserum und in Gewebeflüssigkeit enthaltenem Triglycerid, das erfindungsgemäss dadurch
gekennzeichnet ist, dass das Triglycerid mittels einer Lipoprotein-Lipase-Aktivität
aufweisenden Lipase, die aus einem Mikroorganismus Pseudomonas, Mucor, Streptomyces oder Serratia gewonnen wird, in dem
Serum oder Gewebe hydrolysiert und Fettsäure und Glycerin freigesetzt und mindestens eine der freigesetzten Komponenten analytisch
bestimmt wird.
Es wurde überraschend gefunden, dass es möglich ist, ein TriglycerLd
in einem Serum oder Gewebe analytisch quantitativ zu bestimmen, ohne dass eine Extraktion aus dem homogenisierten Serur oder Gewebe vorgenommen
wird, wenn man die Hydrolyse des Priglycerids zu Glycerin
und Fettsäure unter Benutzung von Lipoprotein-Lin ise-^.zcivit^t -~uf
409826/0662
weisender Lipase, die aus einem der genannten Mikroorganismen gewonnen
wird, vornimmt. Die beim erfindungsgemässen Verfahren verwendete
Lipase, die eine Lipoprotein-Lipase-Aktivität besitzt, wird nachstehend als "Lipoprotein-Lipase" bezeichnet. Die Hydrolyse mittels
einer solchen Lipoprotein-Lipase verläuft, wie gefunden wurde, rasch und quantitativ, und die dabei freiwerdende Fettsäure und/oder
das Glycerin lassen sich in einfacher Weise bestimmen.
In der beiliegenden Zeichnung, in der in Form eines Diagramms die
llydrolyseergebnisse nach bekanntem Verfahren (Acetyl-Aceton-Methode)
in Vergleich gesetzt sind mit den Hydrolyseergebnissen bei der erfindungsgemässen
Arbeitsweise (LPL-Hydrazon-Methode),erkennt man, dass das erfindungsgemässe Verfahren zuverlässig und exakt arbeitet.
In der Zeichnung sind auf der Abszisse die Hydrolyse-Ergebnisse mittels der bekannten Acetyl-Aceton-Methode und auf der Ordinate die
Hydrolyse-Ergebnisse mit der beim erfindungsgemässen Verfahren verwendeten LPL-Hydrazon-Methode abgetragen.
Beispiele für die beim erfindungsgemässen Verfahren verwendbaren Lipoprotein-Lipase produzierenden Mikroorganismen der Arten Pseudomonas,
Hucor, Streptomyces und/oder Serratia sind nachfolgend aufgeführt:
Pseudomonas fluoresens IAM 1057
Pseudomonas schuylkilliensis IAM 1053
Pseudomonas saccharophila IAM 1504
Pseudomonas aeruginosa IAI-I 109 5
Mucor hiemalis IAM 6088
ilucor javanicus . IAM 6108
Hucor flavus IAM 6143
Ilucor circinelloides IAM 6148
Mucor mandschuricus IAM 6118
Streptomyces aureofaciens IAM 0087
Streptomyces parvus IAIl 0013
Serratia marcescens IAM 1065
Serratia marcescens IAM 1067
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—■ 4 —
Durch die Wirkung der aus einem der zuvor genannten IliJcroorganismen
erhaltenen Lipoprotein-Lipase-Produkt auf in Serum oder Gewebe vorhandenem
Triglycerid werden Fettsäure und Glycerin freigesetzt. Die freigesetzte Fettsäure lässt sich durch Titration oder coloriraetrische
Bestimmung analysieren, und aus den erhaltenen Werten kann die Menge an Triglycerid errechnet v/erden. Das freigesetzte Glycerin
lässt sich mittels verschiedener Methoden analysieren, beispielsweise durch chemische Analyse, colorimetrisch dadurch, dass Formalin, das
durch Perjodatoxydation aus Glycerin gebildet wird, mit Chromotropsäure
oder mit Acetylaceton in Gegenwart von Ammoniumionen behandelt
und zu einer gefärbten Substanz umgebildet wird.
Ferner kann man das Glycerin mit enzymatischer "lethode, beispielsweise
durch Einwirkung eines Enzym-Systerns, die Glycerin-Kinase
(nachstehend als G.K bezeichnet) - Pyruvat-Kinase (nachstehend als
P.K bezeichnet) - Lactat-Dehydrogenase (nachstehend als LDH bezeichnet)
prüfen, wobei verursacht durch eine Abnahme an reduziertem Hikotinamidadenindinukleotid (NADH - WAD) eine Abnahme des Wertes
der ultravioletten Absorption stattfindet, die als Prüfwert dient. Ein solches konjugiertes Enzymsystem lässt sich wie folgt veranschau
lichen:
LDH
G.K 1
Lactat
Glycerin
Glycerin-1-phosphat
Glycerin-1-phosphat
NAD
ί . * ATPf^ >7Pyruvatr^ ^- NADH
^ ADP —' ^* Phosphoenolpyruvat
ρ ' ν Es ist so eine quantitative Bestimmung möglich.
Weiterhin kann die Menge an vorhandenem Triglycerid quantitativ
nach folgenden Methoden ermittelt werden:
Glycerin-1-phosphat, das durch Einwirkung von G.K auf Glycerin gebildet
worden ist, wird durch Glycerin-l-phosphat-Dehydrogenase
(G-I-DH) umwandelndes HAD, ein Koenzym von G-I-DH, zu NADH oxidiert,
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und dabei wird die Zunahme an so gebildetem reduziertem Nikotinamidadenindinukleotid
durch Ermittlung das Ultraviolett-Absorptionswertes gemessen. Oder man kann das Glycerin durch Glycerin-Dehydrogenase
(GDH) zu Dihydroxyaceton umwandeln und durch Ultraviolett-Absorption
die Zunahme an NADH von mAü als Prüfwert messen.
Eine coIorimetrisehe Messung kann auch in der Weise vorgenommen wurden,
dass die Schiffsche Basenverbindung zwischen der Ketogruppe in Pyruvat, Dihydroxyacetonphosphat oder Dihydroxyaceton, das bei
der enzymatischen Prüfung gebildet wird, und einem Hydrazin-Reagens,
wie beispielsweise 2,4-Dinitrophenylhydrazin, meßtecMschrermittelt
wird.
der Fluorescsns-vlethode kann man die Systeme NAD —=*■ NADH
quantitativ analysieren. Diese Systeme NAD NADH ^*
können auch colorimetrisch oder durch Fluorescens-Analyse unter Verwendung von Resazurin oder Tetrazoliumchlorid durchgeführt werden,
woüei der Wasserstoff in NADH überführt wird, so dass sich Resorzin
oder Formazan in Anwesenheit von Diaphorase oder Phenazinmethosulfat
bilden.
Die bei der Hydrolyse von Triglycerid entstehende Fettsäure kann in
einfacher Weise mittels Heptan extrahiert werden, und man kann die Bestimmung durch Neutralisationstitration mittels Alkali unter Verwendung
von Thymolblau als Indikator vornehmen.
ilan kann auch durch Zugabe einer Lösung von Phenolrot-Barbitalnfctrium
in die Heptanschicht den Farbumschlag, der durch pH-Änderung infolge der Einwirkung von Phenolrot auf Fettsäurl^IS elef Kurvenänderum bei
570 m,u unter Verwendung von Standardvergleichskurven für Palmitinsäure
bestimmen.
Eine weitere colorimetrische Bestimmung kann in der Weise durchgeführt
werden, dass man eine Metallkomplex-Verbindung von Fettsäure, beispielsweise nach der Kupferseifen-Methode oder der Kobaltseifen-Methode,
meßtechnisch ermittelt, oder ein Komplexsalz aus Fettsäure und Rhodamin 6G bzw. Rhodamin B quantitativ bestimmt.
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Wie bereits zuvor erwähnt, ist das erfindungsgemässe Verfahren im
Vergleich mit den bisher bekannten Untersuchungsverfahren für Triglyceride
sehr viel einfacher und weniger aufwendig durchführbar, da die Verseifung und die Nachbehandlung äusserst vereinfacht sind.
Es ist lediglich eine milde enzymatische Behandlung erforderlich,
und dies stellt einen erheblichen Vorteil für eine klinische Diagnose dar. Es entfällt ferner der bei den bekannten Untersuchungsmethoden vorhandene Nachteil, der darin bestand, dass die Verseifung
unter Verwendung von starkem Alkali, das Korrosionserscheinungen an Behältnissen, Tuben und dergleichen, wie sie an automatisch
arbeitenden Analysengeräten vorhanden sind, bewirkt. Es entfällt ferner der bei der bisher bekannten Acetylaceton- lethode erforderliche
Zentrifugier-Vorgang, der insbesondere dann technisch schwierig ist, wenn die Triglycerid-Untersuchung autonatisch durchgeführt
wird. Bisher war diese Zentrifugier-Zwischenstufe ein
"Engpass" für die Automation dieses Untersuchungsverfahrens.
Das erfindungsgemässe Verfahren hat darüber hinaus den Vorteil, dass
eine kurzzeitige Arbeitsweise darstellt, die einfach durchführbar ist. So sind beispielsweise zahlreiche, nachstehend veranschaulichte
Vorteile gegenüber der bekanrban Acetylaceton-*lethode (vergl. i.J.
Eletcher; Clin.Chim.Acty 22, 393 (1968)) und gegenüber der enzymatischen
Methode vorhanden:
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_ *7 —
ACETYLACETON - METHODL· ERFINDUNGSGEMaSSE METHODE
Serum
Isopropanol-Extraktion (IO IUn.)
Mischen mit Absorbens (16 Min.)
Zentrifugieren (2000 UpM
15 Min.)
Verseifen
(KOH)
(KOH)
Oxidation
(H1-JO6)
(H1-JO6)
(15 Min.)
(15 Min.)
Farbreaktion (Acetylaceton)
(40 Min.)
Kochen
(3 Min.)
Colorimetrische Untersuchung
Für die Gesamtuntersuchung erforderliche Zeit: 114 Min.
Serum
ATP-PEP-Lösung
PK-GK-Lösung 37°C (10 Min.)
LPL-Lösung
DNP-Hydrazin-hydrochlorid
(15 Min.)
NaOH
(20 Min.)
Prüfung bei 450 m ,u
aforderliche Gesamtzeit:
45 Hin.
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Beispiel 1
Be;: Zimmertemperatur wurde Linase, die aus einer Pseudomonas- Kultur
(spez. Aktivität 50.000 Einheiten/g) gewonnen v/orden war, in 0,1 >·ο1
Phosphatpuffer oder Citratnuffer, pH 7,0, mit einer Konzentration
von 500 - 1.000 Einheiten/ml, gelöst. Die Lösung wurde zur Aufbewahrung
gefriergetrocknet. Bevor sie für die untersuchungszwecke
lyophilisiert wurde, brachte man sie in eier gleichen Konzentration
wieder in Lösung.
In zwei Teströhrchen wurden je 0,5 ml der zu untersuchenden Proben
gegeben. Dazu wurden 0,5 ml an Pufferlösung ( pH 7,0) gegeben, und
dann wurde 5 Minuten lang bei 37°C bebrütet. In eines der Teströhrchen
wurden 0,5 ml an Fnzymlösung als Arbeitslösung hinzugefügt,
und dem anderen Teströhrchen wurden als Kontrolluntersuchung 5 ml eines Stoppers, bestehend aus Isopropanol-n-IIeptan-2 η H-SO.
(400 : 100 : 10 V/V%) beigegeben. Beide Röhrchen wurden unter Schütteln 10 Minuten bei 37 C bebrütet. Dann wurden 5 ml des
Stoppers zu der Arbeitslösung hinzugegeben, und der Kontrollprobe wurden 0,5 ml Enzynlösung zugefügt, und danach wurde sofort gut
durchgemischt. Schliesslich wurden sowohl der Arbeitslösung als
auch der Kontrollprobe 3 ml n-IIeptan und 2 ml Wasser zugegeben,
es wurde kräftig geschüttelt und dann einige Minuten stehen gelassen.
Die oberen Heptan-Schichten wurden ?bninettiert und titrimetrisch
oder colori™.etrisch untersucht.
(I) Reagentien:
Ls wurden für die Untersuchung die folgenden Reagentien zubereitet:
(1) ATP-Na 20 ng
PEP-2Na 50 ng
PEP-2Na 50 ng
gelöst in 100 rü nit der nachstehend unter (4) angegebenen
Pufferlösung.
(2) Pyruvat-Kinase 120 Einheiten
Glycerin-Kinase 500 Einheiten
Glycerin-Kinase 500 Einheiten
gelöst in 100 ^l mit der nachstehend um. ei. (4) angegebenen
Pufferlösung.
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(3) Lipase, erhalten aus eLiar Kultur von Pseudomonas, 25ΟΟ Einheiten
cjelöst in 1OO ml mit der nachstehend an_pgebenen Pufferlösung.
(4) Pufferlösung:
0,05 Mole Phosphatpuffer, ph 7,2, worin 0,003 ^ole an Ilagneniumchlorid
enthalten waren.
(5) 2,4-uinitrophenylhydrazin
gelöst in 1 η HCl-Lösung mit einer Konzentration von 0,02 Molen.
(II) Prüfung:
Probe (Blutserum) 0,05 ml
Lipase-Lösung 0,5 ml
ATP-PEP-Lösung 0,2 ml
Pyruvat-Kinase - Glycerin-Kinase- ■
Lösung O,O2 nl.
Die oben angegebene Probe und die Reagentien wurden miteinander vermischt
und 10 Minuten lang bei 37°C bebrütet. Dazu wurde 1,0 ml 2 ,'I-Dinitrophenylhydrazin-Kydrochioridlösung gegeben, und man liess
das Gemisch 15 Minuten lang bei Zimmertemperatur stehen. Anschlies-3end wurden 5,0 ml an 0,6 η NaOH ~ Lösung hinzu gegeben.
Wach weiteren 20 Minuten bei Zimmertemperatur wurde die Untersuchung
bei 450 m,u durchgeführt.
Mittels der in Beispiel 2 beschriebenen untersuchungsinethode wurden
40 Einzel oestiinnungen von menschlichem Blutserum durchgeführt. Es
wurden dabei die Acetylaceton-Methode und das erfindungsgemässe Verfahren
mit der Enzym-Methode in Paralleluntersuchungen gleicher Proben durchgeführt. Aus den erhaltenen Versuchsergebnissen wurde ein
Korrelationskoeffizient von r = 0,3 89 und eine Relationsgleichung
y = 1,03 χ + 5,6 ermittelt. Die Ergebnisse sind in dem beiliegenden
Diagramm graphisch veranschaulicht.
Beisniel 4
us ''urde wie in Beispiel 2 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde an-.stelle
von aus Pseudomona.i-Kultur gewonnener lipase eine Lipase ein-
40982b'/066 2
- ίο -
gesetzt, die durch Züchtung von "ikxoorganisvten i.T "\rt ' ucor υ zw..
der Art Streptor.ycen gewonnen '-/orden x-'ar. Aus den Ergebnissen -urden Korrelationskoeffizienten von r = 0,97-j hzv/. o,9c3 ermitteLt.
der Art Streptor.ycen gewonnen '-/orden x-'ar. Aus den Ergebnissen -urden Korrelationskoeffizienten von r = 0,97-j hzv/. o,9c3 ermitteLt.
L·s wurde wie in Beispiel 2 bescririeben gearbeitet, jedoch wurrlc- als
Lipase eine solche verv/enclet, die durch Züchtung des UkroorcranisFu
der Art Serratia gewonnen worden war. Die Untersuchungen wurden nit
einen automatisch arbeitenden Analysator durch :!es.sung der
von iJ'ADH zu MAD bei 340 ni ,u durchgeführt.
2 6/0. t> -
Claims (5)
- ί> a \. ■.? η \ a η :3 η r i c h cμ,1 7.->ria;ircn zur quanti tat i V3n r*3r;t i.» * 'un<i τόπ in I-lutnerum oder in (-<·■> · ,JX.-A lüGsig'voit enthaltener.. Tric/lvcfiri ο , .ladurc'i qekennzcichnot, ii.13'5 -las Triq3vcori 1 nittels einer Lipo^rot «?i n-Lipase-Aktivii."it aufweisenden ioa;;e, dia au? einen ''ikroor ianisinus der ArLe Pseuciononas, -lucoi , .Strepto iyces und/oder Scrratia gewonnen wird, hydrolysiert und I'iittsrure unJ Glycerin freigesetzt und mindestens eine der freigesetzten Komponenten analysiert wird.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als j-akroorganisnus der Art Pseudomonas einer der folgenden eingesetzt wi rd:Pseudomonas fluorescens ΙΛΜ 105 7Pseudononas schuylkxlliensis IAM 105 3Pseudoiiionas saccherophila IAM 1504Pseudoinonas aeruginosa IA'l 1095
- 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadixrca gekennzeichnet, dass als Mikroorganismus der Art Mucor einer der folgenden eingesetzt wird: 'lucor hiemalis IAM 6088*'ucor javanicus IAH 6108!ucor flavus IAM 614 3-iUcor circinelloides 1ΛΓΊ 614 8"ucor mandschuricus IAM 6118.
- 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als .dkroorganismus der Art Streptom'Tes canar der folgenden eingesetzt wird:Streptoniycei; a'n.:cftcienr, J.^:-? OD87Strcpto/n/oeL; τ> η νη.· ΙΛΜ 0013
- 5. Verfahren y.ar.n :n-5pruch 1, dadurch gekennzeichnet., da^s als ikroorganisnu , .'·,: Art Serratia einir der folgenden einqeretzt wird::.;rrratia marcc ~ ? ns ]Λ : 1065■"erratia marrt «: nmf? 1."" 1OG7.40982 6/Of ' xBAD Of=UCHNALLeerse ite
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- 1973-07-09 GB GB2219873A patent/GB1441642A/en not_active Expired
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