DE3788828T2

DE3788828T2 - Stabilisierte flüssige Enzymzusammensetzung zur Bestimmung von Glucose.

Info

Publication number: DE3788828T2
Application number: DE87305439T
Authority: DE
Inventors: Thomas H Gawronski
Original assignee: Beckman Instruments Inc
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 1986-07-15
Filing date: 1987-06-19
Publication date: 1994-05-05
Anticipated expiration: 2007-06-20
Also published as: CA1309001C; EP0253520A3; JPS6324900A; JP2539225B2; DE3788828D1; EP0253520A2; ES2061501T3; EP0253520B1; US4897346A

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung der Enzyme Hexokinase und Glucose-6-Phosphatdehydrogenase in einem analytischen Verfahren zur Bestimmung von Glukose.
Bei der Bestimmung von Enzymen und anderen biologischen Bestandteilen sind an der Reaktion allgemein Enzyme, Coenzyme und Substrate beteiligt.
Enzyme sind komplexe Proteine mit großen Molekulargewichten und haben gewöhnlich unbekannte chemische Struktur. Sie werden nach ihrer Substratspezifizität und ihrer katalytischen Aktivität klassifiziert. Enzyme sind biologische Katalysatoren, welche die Reaktion eines einzelnen Substrats oder die Reaktion einer Gruppe von ähnlichen Substraten katalysieren.
Coenzyme sind organische chemische Substanzen mit definierten chemischen Strukturen. Sie haben gewöhnlich niedrigere Molekulargewichte als Enzyme. Sie sind für den spezifischen Enzymtest oder die spezifische Enzymreaktion erforderlich. Coenzyme werden ,in dem Test in nachweisbarer Weise in ihrer Struktur und/oder atomaren Zusammensetzung geändert. Ihre Reaktionen sind stöchiometrisch bezüglich dem Substrat.
Bei bestimmten Coenzymen mit starkem Absorptionsvermögen kann die Bildung oder das Verschwinden der absorbierenden Form photometrisch verfolgt werden. Beispielsweise werden Nicotinamid-adenin-dinucleotid (NAD) und reduziertes Nicodinamid-adenin-dinucleotid (NADH) in vielen wichtigen klinischen Tests verwendet. Beide Substanzen haben ein Molekulargewicht von etwa 700. NADH absorbiert stark bei 340 nm, während NAD nicht absorbiert.
Substrate sind organische chemische Stoffe bekannter Struktur, deren Reaktionen und Interaktionen durch Enzyme katalysiert werden, was zu einer Änderung in der chemischen Struktur, der Atomzusammensetzung oder der Stereochemie des Substrats führt. Im allgemeinen unterliegen Substrate der Zersetzung bzw. dem Abbau, und zwar sowohl chemisch wie mikrobiologisch. Substrate zersetzen sich chemisch oder hydrolisieren in wäßrigen Medien und dienen als Nahrung für Bakterien, Pilze und andere Mikroorganismen. Typische Substrate sind Glukose, Lactat oder Milchsäure, Glukonat und dergleichen.
Wegen ihrer hohen Spezifizität hat die Verwendung von Enzymbestimmungen während der letzten Jahre beträchtlich zugenommen. Gegenwärtig besteht die größte Beschränkung hinsichtlich der Verwendung von Enzymreagenzien in der unstabilen Natur der darin enthaltenen Substanzen. Gewöhnlich sind zahlreiche labile Komponenten im Spiel. Die Sache wird noch dadurch kompliziert, daß die genaue Natur von Enzymen, wie auch die Mechanismen ihrer Wirkung, größtenteils weiterhin unbekannt sind. Daher sind strenge Maßnahmen zur Qualitätskontrolle erforderlich, um genaue und beständige Ergebnisse zu gewährleisten. Derartige Maßnahmen sind jedoch kostspielig.
Nach dem Stand der Technik hat man, um strenge Qualitätskontrolle zu gewährleisten, das Hauptaugenmerk auf eine Stabilisierung der labilen Bestandteile in den Reagenzien gerichtet, d. h. ihren Abbau bzw. ihre Zersetzung zu verhindern. Beispielsweise kann das Enzym oder Coenzym in eine feste Matrix eingeschlossen werden, entweder durch Trockenmischung, Gefriertrocknung oder durch Arretierung der chemischen Struktur des Enzyms auf einer festen Matrix. Diese Verfahren sind teuer, erfordern komplizierte Herstellungsverfahren und sind für den Benutzer weniger bequem. Produkt-Gleichförmigkeit ist mit festen Reagenzien schwierig aufrechtzuerhalten. Beispielsweise wird für viele kommerzielle gefriergetrocknete Bezugsseren eine annehmbare Schwankung von Flasche zu Flasche der Enzymbestandteile mit + 10% um den Mittelwert angegeben. Noch bedeutsamer ist, daß der Benutzer die Bürde der Gewährleistung der Qualitätskontrolle bei der Verdünnung und Anwendung des festen Reagenz tragen muß. Wegen dieser Probleme der Qualitätskontrolle bei festen Enzym- oder Coenzymreagenzien und wegen des Faktors Bequemlichkeit ziehen die Benutzer im allgemeinen flüssige, einfach anwendbare und homogene Reagenzien gegenüber festen (beispielsweise lyophilisierten) Zusammensetzungen vor.

Chemie des Systems Glucose/HK/G-6-PDH

Die hier verwendeten Symbole stellen die folgenden Bestandteile dar:
ADP = Adenosin-5'-diphosphat
ATP = Adenosintriphosphat
HK = Hexokinase
NAD = Nicotinamid-adenin-dinucleotid
NADH = Nicotinamid-adenin-dinucleotid, reduziert
G-6-PDH = Glukose-6-phosphat-Dehydrogenase
G-6-P = Glukose-6-phosphat
Die folgenden Reaktionen veranschaulichen die Bestimmung von Glukose unter Verwendung der Coenzyme ATP und NAD, in Gegenwart der Enzyme HK und G-6-PDH. Primär-Reaktion Glucose + ATP Meß-Reaktion NaDH + 6-Phosphogluconat
In dem vorstehenden Reaktionsschema ist das Enzym, welches die Primärreaktion bewirkt, HK, und das Enzym, welches die Meßreaktion bewirkt, G-6-PDH. Die Glucose wird bestimmt durch Messung der Geschwindigkeit, mit welcher NADH in der Meßreaktion gebildet wird. Das obige Reaktionsschema findet verbreitet Anwendung in klinischen Tests, da von erhöhter Glukosekonzentration in Körperflüssigkeiten, wie beispielsweise Blutserum, Plasma, Gesamtblut, zerebro-spinale Flüssigkeiten und Urin usw. gezeigt wurde, daß sie Diabetes zugeordnet ist.
Bei der quantitativen Bestimmung von Glucose läßt man die oben angegebenen Reaktionen im allgemeinen bis zum Abschluß vollständig ablaufen. Die Menge an gebildetem NADH steht in Korrelation mit dem Anteil von Glucose in der Testprobe. NADH absorbiert stark bei 340 nm, während die anderen Reaktanten und Produkte nicht absorbieren. Die Menge an gebildetem NADH, und damit der Glucoseanteil in der Testprobe, kann bei 340 nm mit einem Spektralphotometer verfolgt werden. Enzymaktivität wird im allgemeinen in Internationalen Einheiten (IU) gemessen. Eine Internationale Einheit ist als diejenige Enzymmenge definiert, welche die Umwandlung eines Mikromols Substrat pro Minute unter definierten Bedingungen katalysiert. Unter Glucosetestbedingungen werden ausreichend Enzyme (HK und G-6-PDH) und Coenzym (ATP und NAD) zugegeben, um relativ hohe Reaktionsgeschwindigkeiten zu gewährleisten. Vorzugsweise laufen die Reaktionen des o.a. Tests innerhalb Minuten, vorzugsweise innerhalb etwa 10 Minuten, im wesentlichen bis zum Abschluß ab.
Wegen der labilen, unbeständigen Natur der an dem oben beschriebenen Glukosetest beteiligten Bestandteile, werden im allgemeinen Komponenten der bestimmenden Reagenzien gesondert gelagert und erst kurz vor der Durchführung des Tests miteinander gemischt. So werden beispielsweise kommerziell verfügbare Reagenzien für den obigen Glucosetest im allgemeinen als ein Zwei-Reagenten-Paket, bestehend aus einem Coenzymreagenz und einem Enzymreagenz angeboten. Die Coenzyme sind nicht so labil wie die Enzyme und werden im allgemeinen aus Gründen der Einfachheit und Zweckmäßigkeit in Lösung gehalten. Das flüssige Coenzym-Reagenz für den Glukosetest enthält im allgemeinen beide Coenzyme ATP und NAD, ein Magnesiumsalz (im allgemeinen Magnesiumazetat), Konservierungsmittel, sowie einen Puffer, um den pH-Wert bei etwa 7,5 zu halten, was der bevorzugte pH-Wert für die Durchführung des Glucosetests ist.
Das Stabilitätsproblem ist kritisch, soweit die Enzyme HK und G-6-PDH betroffen sind. Herkömmlicherweise wird das Enzym-Reagenz für den Glukosetest in Trockenpackform oder in lyophilisierter Form angeboten. Die trockenen Enzyme werden kurz vor der Durchführung des Tests in Lösung gebracht.

Stabilisierung des flüssigen HK/G-6-PDH Enzymsystems

Angesichts all der Nachteile fester Enzymreagenzien wurden Versuche unternommen, die Enzyme HK und G-6-PDH in Lösung zu stabilisieren. Ein übliches Verfahren ist die Verwendung einer hohen Konzentration (beispielsweise 3 Molar) von Ammoniumsulfat als Konservierungsmittel. Die Enzyme HK und G-6-PDH werden zunächst in wäßrige Lösung gebracht und sodann wird das Ammoniumsulfat zugegeben. Zwar ist die Stabilität dieses flüssigen Enzymreagenz zufriedenstellend, jedoch leidet dieses System an ernsthaften Nachteilen. An erster Stelle steht, daß Sulfat ein bekannter Inhibitor für die Reaktionen in dem oben beschriebenen Glucosetest ist. Um die Reaktionen mit annehmbaren Geschwindigkeiten ablaufen zu lassen, ist die Anwendung relativ großer Enzymmengen (HK und G-6-PDH) erforderlich, um die Inhibition zu überwinden. Dies erhöht die Kosten. Zweitens fallen die Enzyme aus der Lösung aus, sobald das Ammoniumsulfat zugegeben wird. Daher ist dieses flüssige Reagenz nicht homogen, sondern stellt tatsächlich ein 'Suspensions'-Reagenz dar. Selbst bei kräftigem Mischen ist es schwierig mit diesem Suspensions- Enzymreagenz reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. Es ist schwierig, genaue Mengen des ausgefällten Enzyms zu messen (beispielsweise durch Pipettieren). Des weiteren muß dieses Suspensions-Enzymreagenz gut gemischt werden, bevor es verwendet werden kann. Dieses Erfordernis stellt ein Hindernis für die Automation dar. Von den derzeit gebräuchlichen Spektralphotometern sind wenn überhaupt dann nur wenige zur Vormischung von Komponentenreagenzien ausgerüstet. Des weiteren ist es, wegen der stark inhibitorischen Wirkungen von Ammoniumsulfat, notwendig, nur ein minimales Volumen dieses Suspensionsenzymreagenz zu verwenden. Typischerweise werden das Enzymreagenz und das Coenzymreagenz in einem Verhältnis von 1 100 oder mehr gemischt. Die Verwendung eines so kleinen Volumens dieses heterogenen Enzymreagenz macht es noch schwieriger, reproduzierbare Testresultate zu erhalten.
Es wurde auch bereits angeregt, daß Enzyme wie beispielsweise HK und G-6-PDH in einem wäßrigen Medium stabilisiert, d. h. ihre Zersetzung oder ihr Abbau verhindert, werden können, indem man 10-50% v/v eines wassermischbaren polyolischen organischen Lösungsmittels (wie beispielsweise Glyzerin) zusetzt. Es wurde jedoch festgestellt, daß in der Praxis dieser Lösungsweg häufig nicht funktioniert. Die Enzyme verschlechtern sich nach wie vor mit der Zeit und das polyol-stabilisierte flüssige Enzymreagenz hat selbst bei der empfohlenen Speichertemperatur im Bereich von 2 bis 8 ºC (b erhöhten Temperaturen nimmt der Enzymabbau rasch zu) nur eine verhältnismäßig kurze Lagerfähigkeit. Selbst soweit die polyolischen Lösungsmittel eine Stabilisierungswirkung haben, ist der Stabilisierungsgrad nicht ausreichend. Die Verschlechterung zeigt sich durch eine Verlangsamung der oben genannten Glucosetestreaktionen.
Die Beeinträchtigung der Enzyme HK und G-6-PDH kann sich auch in Form von Schwankungen von Charge-to-Charge äußern, insbesondere bei über unterschiedliche Zeitdauern gelagerten Reagenzien. Diese Schwankung kann die Zuverlässigkeit des Glucosetests nachteilig beeinflussen.
Es besteht daher ein Bedürfnis nach einem homogenen flüssigen HK und G-6-PDH-Enzymreagenz zur Glucosebestimmung, mit einer langen Lagerfähigkeit, das reproduzierbare Testergebnisse erbringt und eine rasche Glukose-Endpunktbestimmung liefert.

Zusammenfassung

Die vorliegende Erfindung befriedigt diese vorstehenden Bedürfnisse. Die Erfindung bezieht sich auf ein homogenes flüssiges Enzymreagenz mit einer langen Lagerfähigkeit, zur Verwendung bei der quantitativen Bestimmung von Glukose in einem Glukosetest, bei welchem Adenosintriphosphat und Nicotinamid-Adenindinucleotid als Coenzyme verwendet werden und die Coenzyme im Überschuß vorliegen, das Enzymreagenz bei seiner anfänglichen Herstellung umfassend:
(a) wenigstens etwa 60% v/v Wasser
(b) ein mit Wasser mischbares organisches Polyol-Lösungsmittel in einer Menge von 20 bis 40% v/v;
(c) das Enzym Hexokinase
(d) das Enzym Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase
(e) ein Stabilisatorsystem, welches einen Schwermetallion- Chelatbildner in einer Menge von wenigstens etwa 0,5 mM enthält,
derart daß das Enzymreagenz bei Lagerung bei einer Temperatur im Bereich von 2 bis 8ºC eine Lagerfähigkeit von wenigstens 2 Jahren besitzt. Vorzugsweise ist der Chelatbildner EDTA. Vorzugsweise weist das Stabilisatorsystem auch ein Antioxidationsmittel und ein Mikrobiokontrollmittel auf. Das Antioxidationsmittel kann Rinderserumalbumin (BSA, 'bovine serum albumin') oder eine Kombination von Polyvinylpyrrolidon-40 (PVP-40) und N-Acetylcystein (NAC) sein. Das Mikrobiokontrollmittel kann Natriumazid sein.
Vorzugsweise findet das Enzymreagenz in Verbindung mit einem Magnesiumionen und die Coenzyme Adenosintriphosphat und Nicotinamid-adenin-dinuc leotid enthaltenden Coenzymreagenz Anwendung. Wenn das Enzymreagenz mit dem Coenzymreagenz und einer Glukose enthaltenden Testprobe zur Bildung eines Testreaktionsgemischs gemischt wird, beträgt vorzugsweise die Menge des Chelatbildners aus dem Enzymreagenz nicht mehr etwa die Hälfte der Magnesiumionen aus dem Coenzymreagenz, besonders vorzugsweise nicht mehr als etwa ein Zehntel.

Zeichnung

Diese und weitere Merkmale, Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden unter Bezugnahme auf die folgende Beschreibung, angefügten Ansprüche und die beigefügten Zeichnungen besser verständlich; in dieser sind
- die Figg. 1 und 2 Arrhenius-Kurven der Abfallgeschwindigkeit (Neigung) in Abhängigkeit vom Reziprokwert der Temperatur, für die BSA- und PVP-40-Versionen des Enzymreagenz der vorliegenden Erfindung;
- die Figg. 3 bis 6 Linearitätskurven des Enzymreagenz der vorliegenden Erfindung im Zustand (a) wie anfänglich hergestellt; (b) nach Lagerung über 106 Tage bei 25ºC; (c) nach Lagerung bei 4ºC über ein Jahr; und (d) nach Lagerung bei 4ºC über 2 ½ Jahre;
- die Figg. 7 bis 10 zeigen die Auswirkung von Änderungen in der Konzentration von HK, G-6-PDH, ATP bzw. NAD auf die Zeit einer Halb-Reaktion (T(½), während die Konzentrationen der anderen Komponenten konstant gehalten werden;
- und die Figg. 11 bis 15 Reaktionsprofile von Glukosetests unter Verwendung des Enzymreagenz der vorliegenden Erfindung bei Lagerung bei 4ºC über Zeitperioden von 1 bis 2 ½ Jahren.

Beschreibung

Es ist bekannt, daß das Enzym Hexokinase und Glukose-6- Phosphat-Dehydrogenase hoch labil sind, und beide mit der Zeit abbauen, insbesondere bei erhöhten Temperaturen. Es wurde bereits früher angeregt, daß die Gegenwart eines wassermischbaren organischen Polyollösungsmittels, wie beispielsweise Glyzerin, diese Enzyme in wäßriger Lösung stabilisieren kann. Jedoch wurde festgestellt, daß dieser Versuch einer Stabilisierung mit organischen polyolischen Lösungsmitteln keine beständigen Ergebnisse zeitigt, insbesondere bei Verwendung von Lösungsmitteln mit kommerziellem Reinheitsgrad. Auch wurde festgestellt, daß organische polyolische Lösungsmittel, beispielsweise Glyzerin, von kommerziellem Reinheitsgrad, insbesondere bei nicht sachgerechter Handhabung und/oder Lagerung, und das zur Herstellung des Enzymreagenz verwendete Wasser, beide Verunreinigungen enthalten können, welche den Abbau bzw. die Verschlechterung der Enzyme HK und G-6-PDH sogar noch fördern.
Es wurde gefunden, daß ein bestimmtes Stabilisatorsystem in Gegenwart eines organischen polyolischen Lösungsmittels die Stabilität einer die Enzyme HK und G-6-PDH enthaltenden homogenen flüssigen Enzymlösung verbessern kann. Geeignete Komponenten für das Stabilisiersystem werden auf der Grundlage ihrer Wirksamkeit zur Enzymstabilisierung, ihrer Nicht-Beeinträchtigung der Glukoseenzymreaktionen, der Kosten, der Löslichkeit, der Geruchlosigkeit und der einfachen Entsorgung ausgewählt.
Das Stabilisatorsystem weist ein Schwermetallionen-Geliermittel auf. Diese Entdeckung ist überraschend, angesichts der Tatsache, daß Magnesiumionen zur Katalysierung des Primärreaktionsschritts zwischen Glukose und ATP erforderlich sind und Magnesiumionen allgemein als eine Komponente des Coenzymreagenz vorgesehen werden. Man hätte erwarten können, daß das Geliermittel die Magnesiumionen als Katalysator unwirksam macht und den Glukosetest nachteilig beeinflußt. Geeignete Schwermetallionen-Gelierbildner sind unter anderem beispielsweise Äthylendiamintetraessigsäure (EDTA).
Vorzugsweise weist das Stabilisiersystem auch ein Antioxidationsmittel auf. Geeignete Antioxidationsmittel sind unter anderem beispielsweise:
1. L-Cysteinäthylesterhydrochlorid (CEE)
2. N-Acetyl-Cystein (NAC)
3. DL-Homocystein-thiolacton-hydrochlorid (HCTL)
4. L-Cystein
5. Mercaptoäthanel (ME)
6. Dithiothreitol (DTT)
7. Dithioerythritol (DTE)
8. Aminoäthylisothiouroniumbromid (AET)
9. Glutathion (GSH)
10. Thioglycolsäure (TGA)
11. N-Guanyl-L-cystein
12. N-Guanyl-DL-isocyanat
13. N-Acetyl-S-quanyl-L-cystein
14. N-Acetyl-S-benzyl-L-cystein
15. N,S-Diguanyl-L-cystein
16. S-Carbamoyl-L-cystein
17. S-Carboxymethyl-L-cystein
18. L-Thiazolidin-4-carboxylsäure
19. S-Guanyl-L-cysteinhydantoin
20. S-Acetylguanyl-DL-cysteinazlacton
21. 2-Imino-L-cysteinhydantoin
22. N-Acetyl-DL-homocysteinthiolacton
23. 1,3 Dimercapto-2-propanol
24. 2,3 Dimercapto-1-propanol
25. 1,2 Dimercapto-äthan
26. L-Cysteinmethylester
27. L-Cysteinäthylester
28. N-Acetyl-DL-isocystein
29. Polyäthylenglycoldimercaptoacetat
30. Thioglucose
31. Thioglycerol
32. Polyvinylpyrrolidon-40 (PVP-40)
33. Rinderserum-Albumin (BSA)
Vorzugsweise umfaßt das Stabilisiersystem auch ein Mikrobiokontrollmittel, wie beispielsweise ein Microbiostat oder ein Microbiocid. Geeignete Mikrobiokontrollmittel sind unter anderem beispielsweise Natriumazid, Benzoesäure, Phenol, Thymol oder Pentachlorphenol.
Vorzugsweise beträgt in dem Testreaktionsgemisch die Menge an dem Chelatbildner aus dem Enzymreagenz nicht mehr als etwa einhalb, vorzugsweise nicht mehr als ein Zehntel, der Menge der Magnesiumionen aus dem Coenzymreagenz, auf einer molaren Basis.
Wie oben angegeben läßt man die Glukosetestreaktionen im wesentlichen bis zur Vollendung ablaufen. Die Meßreaktion erzeugt NADH, dessen Vorliegen leicht unter Verwendung eines Spektralphotometers verfolgt werden kann. Der Punkt des im wesentlichen vollständigen Ablaufs der Testreaktionen, oder der 'Endpunkt', wird im allgemeinen als der Punkt definiert, bei welchem die NADH-Konzentration wenigstens etwa 98% der endgültigen Gleichgewichts-NADH-Konzentration beträgt. Der Endpunkt kann bei einer Untersuchung der Spektralphotometeranzeige bzw. -ablesung (bei 340 nm) über die Zeit hin beobachtet werden. Das Absorptionsvermögen, und damit die NADH-Konzentration, nimmt anfangs zu, läuft dann jedoch sich allmählich verflachend auf einen relativ konstanten Wert aus. Der Punkt, bei welchem das Absorptionsmögen zuerst abflacht (mehr als 98% des vollständigen Reaktionsablaufs) kann als Endpunkt genommen werden.
Es ist erwünscht, daß der Endpunkt für den Glukosetest in einer möglichst kurzen Zeit erreicht wird. Eine schnelle Endpunktbestimmung ist besonders bedeutsam, wenn der Glukosetest automatisiert wird, da die blockierende Belegung kostspieliger Serumanalysatoren teuer sein kann.
Das Enzymreagenz der vorliegenden Erfindung, welches das oben beschriebene Stabilisiersystem eingelagert enthält, kann eine Lagerfähigkeit von zwei Jahren oder mehr besitzen. Die Lagerfähigkeit eines Enzymreagenz wird im allgemeinen als die Zeitperiode definiert, innerhalb welcher das Enzymreagenz in einem Standardglukosetest noch akzeptable Funktion zeigt. Der Standardglukosetest ist dadurch definiert, daß man ein Teil eines Glukoseenzymreagenz mit zehn Teilen eines Glukosecoenzymreagenz zur Bildung eines kombinierten Reagenz mischt, und sodann 100 Teile des kombinierten Reagenz mit einem Teil einer Glukose enthaltenden Testprobe mischt, unter Bildung eines Testreaktionsgemischs. Alle Teile sind Volumenteile.
Die Spezifikationen für HK/G-6-PDH-Enzymreagenzien für Glukosetests sind im allgemeinen durch die Forderung definiert, daß ein Endpunkt innerhalb einer bestimmten Zeitperiode (beispielsweise 10 Minuten) erreicht wird, vorausgesetzt daß die Glukosekonzentration in der Testprobe innerhalb eines Konzentrationsbereichs liegt, für welchen das Enzymreagenz betriebsfähig ist. Dieser Konzentrationsbereich wird der 'dynamische Bereich' des Enzymreagenz genannt. Die Lagerfähigkeitsdauer für das Enzymreagenz der vorliegenden Erfindung ist so definiert, daß sie einen Endpunkt in 10 Minuten oder weniger für einen dynamischen Bereich von 10 bis 500 mg Glukose pro Deziliter (mg/dL) in der Testprobe für den oben genannten Standardglukosetest gibt. Vorzugsweise wird der Endpunkt in fünf Minuten oder weniger erreicht. Besonders bevorzugt wird der Endpunkt in zwei Minuten oder weniger erreicht.
In alltäglichen Glukosetests ist es übliche Praxis, wesentliche Überschußmengen von Coenzymen in dem Testreaktionsgemisch zu verwenden, relativ bezüglich der Maximalmenge Glukose in dem dynamischen Bereich für das verwendete Enzymreagenz. Vorzugsweise liegt das Mol-Verhältnis von ATP zu Glukose in dem Reaktionsgemisch in dem Bereich von etwa 3 : 1 bis etwa 14 : 1. Vorzugsweise liegt das Mol-Verhältnis von NAD zu Glukose in dem Reaktionsgemisch in der Größenordnung von 5 : 1 oder darüber. Diese Verhältnisse werden berechnet unter Verwendung der oberen Grenze der Glukosekonzentration in dem dynamischen Bereich des Enzymreagenz. Diese Coenzymkonzentrationsbereiche werden in der obigen Definition der Lagerfähigkeit für das Enzymreagenz der vorliegenden Erfindung angenommen. Daher ist die kritische Variable, welche die Geschwindigkeit der Meßreaktion bei einer gegebenen Glukosekonzentration in dem Testreaktionsgemisch bestimmt, die Aktivität der Enzyme in dem Enzymreagenz. Die Zugabe größerer Mengen von Enzymen würde theoretisch die Reaktionsgeschwindigkeit erhöhen und zu einer schnelleren Endpunktbestimmung führen. Jedoch gibt es entgegenwirkende Erwägungen. Die Kosten der Enzyme stehen einer Verwendung von Mengen in wesentlichem Überschuß entgegen. Darüber hinaus ist bekannt, daß in gereinigten Formen von Hexokinase und Glukose-6-phosphatdehydrogenase Kontaminationen und Inhibitorstoffe vorliegen. Beispielsweise ist bekannt, daß der Kontaminant Phosphohexose-isomerase in gereinigter Hexokinase vorliegen kann. Dieser Kontaminant ändert Glukose-6- Phosphat (ein Zwischenprodukt in dem Glukosetest) in Fructose-6-phosphat. Die Glukosetestergebnisse würden so künstlich niedrig erscheinen. Um die Anteile derartiger Kontaminanten und Inhibitoren zu begrenzen, ist es erwünscht, kleinere Mengen der Enzyme HK und G-6-PDH zu verwenden, um die störenden Effekte der Kontaminanten und Inhibitoren möglichst zu verringern.
Die Lagerfähigkeit hängt bedeutsam von der Temperatur ab, bei welcher das Enzymreagenz aufbewahrt wird. Die Enzyme HK und G-6-PDH degradieren sehr rasch bei erhöhten Temperaturen. Die anerkannte Praxis besteht darin, daß man das Enzymreagenz bei einer Temperatur zwischen 2 bis 8ºC, besonders vorzugsweise bei etwa 4ºC, lagert.
Für die oben angegebenen Zusammensetzungsverhältnisse des Glukosetestreaktionsgemischs für einen dynamischen Bereich der Glukosekonzentration mit einer oberen Grenze von 500 mg/dl, wie in Beispiel 3 und den Figg. 7 und 8 weiter unten gezeigt, sind die optimalen Konzentrationsbereiche für HK und G-6-PDH in dem Enzymreagenz wie folgt. Im allgemeinen ist das untere Ende des Bereichs durch die Zeit, innerhalb welcher der Endpunkt erreicht werden kann, und das obere Ende des Bereichs durch die Kosten begrenzt. Bei den unten angegebenen Konzentrationsbereichen ist angenommen, daß ein 10-Minuten- Endpunkt vorzuziehen ist, und daß ein 2-Minuten-Endpunkt besonders vorzuziehen ist. Der bevorzugte Konzentrationsbereich für HK in dem Testreaktionsgemisch in dem Enzymreagenz beträgt von 6 bis 80 KIU pro Liter, mehr bevorzugt von 10 bis 60 KIU pro Liter, und besonders bevorzugt von 15 bis 35 KIU pro Liter. Diese Konzentrationen entsprechen einem bevorzugten Konzentrationsbereich für HK in dem Testreaktionsgemisch von 0,54 bis 7,2 KIU pro Liter, mehr bevorzugt von 0,9 bis 5,4 KIU pro Liter, und am meisten bevorzugt von 1,35 bis 3,15 KIU pro Liter. Der entsprechende optimale Konzentrationsbereich für G-6-PDH in dem Enzymreagenz ist von 3 bis 60 KIU pro Liter, mehr bevorzugt von 15 bis 40 KIU pro Liter, und am meisten bevorzugt von 20 bis 35 KIU pro Liter. Diese Konzentrationen entsprechen einem bevorzugten Konzentrationsbereich für G-6-PDH in dem Testreaktionsgemisch von 0,27 bis 5,4 KIU pro Liter, mehr bevorzugt von 1,35 bis 3,6 KIU pro Liter, und am meisten bevorzugt von 1,8 bis 3,15 KIU pro Liter.
Ein anderes Maß der Stabilität des Glukose HK/G-6-PDH-Enzymreagenz ist die Halbreaktionszeit T(½), d. h. die Zeit, bei welcher die Meßreaktion in dem Glukosetest zur Hälfte abgelaufen ist. Dies kann durch einen Vergleich des abschließenden und des anfänglichen Absorptionsvermögens bei 340 nm für den Glukosetest bestimmt werden. Die Reaktionszeit, bei welcher das Absorptionsvermögen auf halbem Weg zwischen dem Anfangs- und dem End-Absorptionsvermögen liegt, ist die Halbreaktionszeit. Da die Coenzymkonzentrationen im Überschuß vorliegen, hängt die Halbreaktionszeit von den Konzentrationen der Glukose und der undegradierten Enzyme in dem Testreaktionsgemisch ab. Während der Lagerfähigkeitsdauer des Enzymreagenz beträgt vorzugsweise die Halbreaktionszeit für einen Glukosetest, bei Verwendung des gealterten Enzymreagenz der vorliegenden Erfindung, nicht mehr als das etwa 1,5-fache der Halbreaktionszeit für einen identischen Test bei Verwendung des frisch hergestellten Enzymreagenz.
Für den oben beschriebenen Glukosetest entsprechen Halbreaktionszeiten von 30 Sekunden und 1 ½ Minuten grob Endpunkten bei 3 bzw. 10 Minuten.
Alle Glukosetests betreffenden Erörterungen in der vorliegenden Beschreibung nehmen an, daß die Tests bei der optimalen Temperatur und dem optimalen pH-Wert für derartige Tests durchgeführt werden. Es wird allgemein angenommen, daß die Temperatur etwa 37ºC betragen sollte und der pH-Wert etwa 7,5 sein sollte.
In einer bevorzugten Version des Enzymreagenz der vorliegenden Erfindung enthält das Enzymreagenz bei der anfänglichen Herstellung:
(a) wenigstens etwa 60% v/v Wasser
(b) ein mit Wasser mischbares polyolisches, organisches Lösungsmittel in einer Menge von 20 bis 40% v/v;
(c) Hexokinase-Enzym in einer Menge von 6 bis 80 KIU pro Liter;
(d) Glukose-6-phosphat-dehydrogenase-enzym in einer Menge von 3 bis 60 KIU pro Liter;
(e) ein Stabilisatorsystem umfassend:
(i) einen Schwermetallion-Chelatbildner, und zwar Äthylendiamintetraessigsäure (EDTA) in einer Menge von 0,5 bis 5 mM,
(ii) ein Antioxidationsmittel, in Form von Rinderserumalbumin in einer Menge von 2 bis 8 g pro Liter;
(iii) ein Mikrobiokontrollmittel in Form von Natriumazid in einer Menge von 0,25 bis 1,0 g pro Liter;
(f) TRIS-HCl-Puffer in einer Menge von 0,05 bis 0,2 mM; wobei der pH-Wert des Enzymreagenz vorzugsweise auf etwa 7,5 mit Eisessigsäure eingestellt ist.
In einer anderen bevorzugten Version des Enzymreagenz ist Rinderserumalbumin (BSA) durch Polyvinylpyrrolidon-40 in einer Menge von 2 bis 8 g pro Liter und N-Acetylcystein in einer Menge von 0,4 bis 1,6 g pro Liter ersetzt. Alle übrigen Bestandteile sind die selben.
Die vorstehenden bevorzugten Versionen der Enzymreagenzien eignen sich zur Anwendung mit einem dynamischen Bereich der Glukosekonzentration vorzugsweise von 10 bis 1000 mg/dl, besonders bevorzugt von 10 bis 500 mg/dl, in dem oben beschriebenen Standardglukosetest.
Das Enzymreagenz der vorliegenden Erfindung ist zur Verwendung mit einem homogenen Coenzymreagenz bestimmt, welches umfaßt:
(a) wenigstens etwa 80% v/v Wasser;
(b) ein mit Wasser mischbares polyolisches, organisches Lösungsmittel in einer Menge von 5 bis 20% v/v;
(c) Adenosin-triphosphat-Coenzym; und
(d) Nicotinamid-adenin-dinucleotid-Coenzym.
Vorzugsweise enthält das Coenzymreagenz auch Mg++ Ionen. Vorzugsweise ist das Coenzym mit TRIS-HCl gepuffert, und sein pH auf etwa 7,5 eingestellt. Das Coenzymreagenz kann auch ein Mikrobiokontrollmittel enthalten.
Die optimalen Anteilsmengen der Coenzyme Adenosin-triphosphat und Nicotinamid-adenin-dinucleotid in dem Coenzymreagenz sind in den Figg. 9 und 10 gezeigt. Die bevorzugten Konzentrationsbereiche der beiden Coenzyme in dem Coenzymreagenz sind:
ATP von 0,3 bis 6,0 mM; mehr bevorzugt von 1 bis 4,2 mM; NAD von 1,4 bis 4,2 mM, mehr bevorzugt 2,5 bis 3,5 mM. In dem Standard-Glukosetestreaktionsgemisch wäre die entsprechende Konzentration der Coenzyme: ATP von 0,3 bis 5,4 mM, mehr bevorzugt von 0,9 bis 3,8 mM; NAD von 1,3 bis 3,8 mM, mehr bevorzugt von 2,2 bis 3,2 mM. Das Molarverhältnis von ATP zu Glukose in dem Testreaktionsgemisch, bei einer Glukosekonzentration von 500 mg/dl in der Testprobe, läge vorzugsweise in dem Bereich von 1 : 1 bis 20 : 1, und mehr bevorzugt zwischen 3 : 1 bis 14 : 1. Das Molarverhältnis von NAD zu Glukose in dem Testreaktionsgemisch, bei einer Glukosekonzentration von 500 mg/dl in der Testprobe, läge vorzugsweise zwischen 5 : 1 und 13 : 1, mehr bevorzugt zwischen 9 : 1 und 11 : 1.

Beispiele

A. Bezugsquellen

In den folgenden Beispielen wurden, soweit nicht anders angegeben, die folgenden Chemikalien verwendet:
Glukosestandards sind von der Firma New England Reagent Laboratory (NERL), East Providence, Rhode Island, verfügbar. Glukose, Benzoesäure, Glyzerin, Magnesiumacetat, Natriumazid, Eisessigsäure und EDTA sind von der Fa. J.T. Baker Chemicals Co., Phillipsburg, New Jersey erhältlich. TRIS-HCl- Puffer, BSA, PVP-40 und N-Acetylcystein sind von der Firma Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri verfügbar. Die Coenzyme ATP und NAD und die Enzyme HK und G-6-PDH sind von der Firma Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana verfügbar.

B. Zusammensetzungen

In den folgenden Beispielen wurden, soweit nicht anderweitig angegeben, die folgenden Zusammensetzungen verwendet:
(1) Glukose-Standards
Zwei Typen von Glukose-Standards wurden verwendet:
(a) Im Laboratorium hergestellte Glukose-Standards - Feste Glukose wurde 24 Stunden lang in einen Trocknungsofen (80ºC) eingebracht. Sie wurde sodann in einem Dessicator gekühlt. Standardglukoselösungen verschiedener vorgegebener Konzentrationen wurden aus dieser getrockneten Glukose gravimetrisch hergestellt. Die Standards enthielten auch 0,2% Benzoesäure als Konservierungsmittel.
(b) NERL Glukose Standards - NERL-Glukose-Standards wurden wie im Handel erhältlich verwendet. Soweit erforderlich wurde entionisiertes Wasser zum Verdünnen der Standards verwendet (beispielsweise von 50 mg/dl auf 25 mg/dl). NERL-Glukose-Standards sind in den folgenden Konzentrationen verfügbar: 50, 100, 200, 400 und 750 mg/dl.

(2) Coenzym-Lösung

Glyzerin 100 ml
TRIS-HCl 12,5 g
Magnesiumacetat 2,22 g
Natriumazid 0,5 g
Eisessigsäure (auf pH 7,5) 4,6 ml
ATP 2,526 g
NAD 2,026 g
Die Komponenten wurden mit entionisiertem Wasser auf 1 Liter verdünnt.

(3) Enzym-Lösung

(a) BSA Version:
Glyzerin 300 ml
TRIS-HCl 12,11 g
EDTA (freie Säure) 0,29 g
Eisessigsäure (auf pH 7,5) 4,28 g
BSA 4,0 g
HK 19,2 KIU/L
G-6-PDH 30 KIU/L
Die Komponenten wurden mit entionisiertem Wasser auf 1 Liter verdünnt.
(b) PVP-40 Version - gleiche Zusammensetzung wie die BSA-Version, mit der Ausnahme, daß BSA ersetzt wurde durch:
Polyvinylpyrrolidon-40 (PVP-40) 4,0 g
N-Acetyl-Cystein (NAC) 0,815 g

C. Geräteausrüstung

In den folgenden Beispielen wurde ein Beckman Instruments, Inc. Model DU-7 Spektralphotometer verwendet. Die Instrument- Einstellungen waren wie folgt:
Mode : Timedrive
Funktion : Abs
Wellenlänge : 340 nm
Rate : 1200
Gesamtzeit : 5 Minuten
Obere : 3
Untere : 0
Temperatur : 37ºC
Ein Roche Analytical COBAS BIO klinischer Analysator wurde ebenfalls in dieser Untersuchung verwendet. Die verwendeten Instrumenteinstellungen waren wie folgt:
1. UNITS mg/dl Einheiten
2. CALCULATION FACTOR 0
Berechnungsfaktor
3. STANDARD 1 CONC 150
4. STANDARD 2 CONC 150
5. STANDARD 3 CONC 150
6. LIMIT 0
7. TEMPERATUR 37ºC
8. TYPE OF ANALYSIS 1
Analysetyp
9. WAVELENGTH nM 340
Wellenlänge nM
10. SAMPLE VOLUME 3
Probenvolumen ul
11. DILUENT VOLUME ul 10
Verdünnungsmittelvolumen ul
12. REAGENT VOLUME ul 300
Reagenzvolumen ul
13. INCUBATION TIME SEC 180
Inkubationszeit Sek.
14. START REAGENT VOLUME ul 0
Anfangsreagenzvolumen ul
15. TIME OF FIRST READING SEC 180
Zeit der ersten Ablesung Sek.
16. TIME INTERVAL SEC 180
Zeitintervall Sek
17. NUMBER OF READINGS 1
Anzahl der Ablesungen
18. BLANKING MODE 1
Blind-Austast-Mode
19. PRINTOUT MODE 1 und 3
Ausdruckmode

D. Verfahrensweisen

(1) Thermolyse der Enzymlösung

Proben der Enzymlösung wurden in etikettierten Barex-Patronen abgefüllt und in auf unterschiedliche konstante Temperaturen eingestellte Inkubatoren eingebracht. Der Abbau bzw. die Zersetzung wurde bei jeder jeweiligen Temperatur überwacht, durch Verwendung der inkubierten Enzymreagenzien in dem weiter unten angegebenen Glukosetest bei unterschiedlichen Inkubationszeiten. Inkubation bei erhöhten Temperaturen beschleunigt den Abbau und nähert sich dem Abbau bei niedrigeren Temperaturen über eine längere Zeitdauer an.

(2) Glukosetest

(a) DU-7 Spektralphotometer - Das Reagenz wurde zuerst in einer Küvette wie folgt gemischt: 0,181 ml (1 Teil) Enzymlösung und 1,81 ml (10 Teile) Coenzymlösung wurden gemischt. Das kombinierte Reagenz wurde bei 37ºC vier Minuten lang inkubiert. Sodann wurden zwanzig Mikroliter (20 ul) Probe zu der Küvette zugesetzt, um die Reaktion einzuleiten. Gleichzeitig wurde die Probe in die Küvette zugegeben, der RUN-Knopf an dem DU-7-Gerät gedrückt, um das Spektralphotometer in Gang zu setzen. Duplikatproben wurden untersucht.
(b) COBAS BIO - Nach Programmierung der oben angegebenen Einstellungen wurden zwei Replikat-Proben in Probenbecher eingebracht. Die Enzym- und Coenzym-Komponenten des Glukosereagenz wurden in einem COBAS BIO-Reagenztablett wie folgt gemischt: 1 ml Enzymkomponente und 10 ml Coenzymkomponente. Der Beckman ASTRA Calibrierstandard (Part Nr. 888384) wurde in das Standard-Abteil des Tabletts eingebracht.
In beiden vorstehend erwähnten Testverfahren betrug das Verhältnis von Enzymlösung zu Coenzymlösung in dem kombinierten Reagenz 1 : 10. Das Verhältnis von kombiniertem Reagenz zu Testprobe betrug 100 : 1 (Volumen).

E. Berechnungen

(1) Zeit einer Halbreaktion

Die Zeit einer Halbreaktion T(½) ist die Zeit, bei welcher die Meßreaktion in dem Glukosetest halb beendet ist, auf der Grundlage des abschließenden und des anfänglichen Absorptionsvermögens bei 340 nm. Dies wurde wie folgt berechnet. Nach Beendigung der Reaktion wurde das Absorptionsvermögen bei 210 Sek. aus den Ergebnissen an dem DU-7 bestimmt. Das anfängliche Absorptionsvermögen wurde von dem abschließenden Absorptionsvermögen subtrahiert und der Unterschied durch zwei geteilt, wodurch das Absorptionsvermögen bei einer Halbreaktion erhalten wurde. Die entsprechende Zeit (wie von den DU-7 Spektralphotometerergebnissen abgelesen) für dieses Absorptionsvermögen ist die Zeit einer halben Reaktion (Halbreaktionszeit), T(½).

(2) Linearitäts-Untersuchung

Der Grad und das Ausmaß des Abbaus bzw. der Zersetzung der Enzymlösungen steht in einer Beziehung zu der Änderung in der Halbreaktionszeit T(½). Die Ergebnisse von dem COBAS BIO wurden für beide Ausdruckmoden 1 und 3 tabelliert. Aus dem Printout mode 3 wurde jeweils das Delta des Absorptionsvermögens für jede Probe berechnet, indem man den Unterschied zwischen der ersten Ablesung und dem endgültigen Absorptionsvermögen heranzog. Das abschließende oder endgültige Absorptionsvermögen wurde nach 3,5 Minuten gemessen. Dieses Ergebnis wurde gegen die Standardkonzentration in mg/dl aufgetragen.

Beispiel 1

Stabilitätsuntersuchung von HK/G-6-PDH-Enzymlösungen unter Bedingungen beschleunigter Degradation

Proben der BSA-Version und der PVP-40-Version der Enzymlösung wurden der Thermolyse bei den folgenden Temperaturen unterworfen: 4, 15, 25, 32, 37 und 41ºC. Die Aktivität der Enzymlösungen wurde unter Verwendung des oben beschriebenen Glukosetests untersucht, unter Verwendung von im Labor hergestellten Glukosestandards mit einem Glukosegehalt von 650 bzw. 1000 mg/dl. Diese relativ hohen Glukosepegel wurden gewählt, weil der Enzymabbau bei höheren Glukosepegeln schwerwiegendere schädliche Effekte aufweist. Außerdem ergeben diese hohen Glukosekonzentrationen auch leicht zu messende Halbreaktionszeiten T(½).
Die Ergebnisse der Stabilitätsuntersuchung wurden in den Fig. 1 und 2 wiedergegeben, welche die Ergebnisse der BSA- bzw. der PVP-40-Version der Enzymlösung wiedergeben. Beide Figg. 1 und 2 sind Arrhenius-Diagramme, welche die Beziehung zwischen der Abnahmegeschwindigkeit (Neigung) in Abhängigkeit vom Reziprokwert der Temperatur (in ºK) wiedergibt. Die Neigungen wurden jeweils bei jeder Temperatur gemessen, indem man die lineare Funktion in 1/T(½) gegen die Zeit (in Tagen) auftrug. Die beiden jeweils an jedem Arrhenius-Diagramm gezeigten Linien geben die bei diesen Untersuchungen verwendeten beiden Glukosekonzentrationen (Standards) wieder.
Die Tabelle 1 gibt die vorhergesagten Lagerfähigkeitsdauern der Enzymlösungen an, auf der Grundlage der linearen Regressionen, die so definiert sind, daß sie jeweils für jede Temperatur die Zeit wiedergeben, um ein T(½) von 25 Sekunden zu erreichen. Dieses T(½) entspricht grob einer Zeitdauer für vollständigen Reaktionsablauf von etwa 3 bis 4 Minuten. Die Berechnungen wurden auf der Grundlage einer anfänglichen Halbreaktionszeit T(½) von 19 Sekunden für 650 mg/dl und 22 Sekunden für 1.000 mg/dl durchgeführt. Tabelle 1 Vorhergesagte Lagerfähigkeit für stabilisiertes HK/G-6-PDH BSA Version PVP-40 Version Obere Grenze des dynamischen Glukose-Bereichs Temperatur ºC Jahre Monate

Beispiel 2

Linearitätsuntersuchungen von HK/C-6-PDH-Enzymlösungen

Frisch hergestellte Enzymlösungen (Tag 0, 40) wurden in Glykosetests verwendet, unter Verwendung vom im Labor hergestellten Glukosestandards von 25, 50, 100, 150, 200, 400, 500, 650 und 1000 mg/dl. Die Differenz zwischen dem anfänglichen und dem abschließenden Wert des Absorptionsvermögens bzw. der Extinktion (Delta Abs) wurde in Fig. 3 gegen die Glukosekonzentration aufgetragen. Die anfängliche Extinktion betrug etwa 0,06 für beide Versionen der Enzymlösung. Wie ersichtlich weisen sowohl die BSA- wie die PVP-40-Version der Enzymlösung bei Lagerung bei 4ºC am Tag 0 gute Linearität auf.
Das gleiche Verfahren wurde für die beiden Versionen der Enzymlösung wiederholt, wobei beide bei 25ºC 106 Tage lang gelagert wurden. Die Glukosekonzentrationen in den im Labor hergestellten Glukosestandards betrugen 25, 150, 650 bzw. 1.000 mg/dl. Die anfängliche Extinktion betrug etwa 0,1 für beide Versionen des Enzyms am Tage 106. Die Ergebnisse sind in Fig. 4 dargestellt. Auch hier zeigt sich wiederum eine gute Linearität für eine Glukosekonzentration von bis zu 1000 mg/dl.
In einer besonderen Realzeit-Linearitätsstudie wurde das gleiche Verfahren für die beiden Versionen der Enzymlösung wiederholt, nachdem diese bei 4ºC etwa über ein Jahr gelagert worden waren. Obgleich die anfängliche Extinktion auf 0,17 erhöht war, blieb die Linearität ausgezeichnet. Fig. 5 ist eine graphische Darstellung des Werts von Delta Extinktion in Abhängigkeit von der Glukosekonzentration für beide Versionen der Enzymlösung. Die Linearität war bis zu 1.000 mg/dl ausgezeichnet.
In einer Realzeit-Linearitätsuntersuchung über 2 ½ Jahre wurde das gleiche Verfahren für die BSA Version der Enzymlösung wiederholt, bei Lagerung bei 4ºC über etwa 2 ½ Jahre. Es wurden NERL-Glukosestandards mit Glukosekonzentrationen von 25, 50, 150, 450 bzw. 600 mg/dl verwendet. Die anfängliche Extinktion erhöhte sich auf 0,21 (2 ½ Jahre) von 0,17 (ein Jahr). Jedoch ist, wie aus Fig. 6 ersichtlich, die eine graphische Darstellung der Extinktionsdifferenz gegen die Glukosekonzentration ist, die Linearität bis zu 600 mg/dl ausgezeichnet.

Beispiel 3

Optimierung der Reagenzkomponenten

Die Auswirkungen von Änderungen in der Konzentration jedes der Enzyme (HK und G-6-PDH) und Coenzyme (ATP und NAD) auf die Halbreaktionszeit T(½), während die anderen Reagenzkomponenten konstant gehalten wurden (wie in den oben angegebenen Zusammensetzungen vorgesehen), wurde unter Anwendung des o.a. Glukosetests untersucht, wobei ein im Labor hergestellter Glukosestandard mit einem Glukosepegel von 650 mg/dl verwendet wurde. In dieser Optimierungsuntersuchung wurde die BSA-Version der Enzymlösung verwendet.
Die Figg. 7,8,9 und 10 zeigen die Wirkung der Reagenzkomponente auf die Reaktionshalbzeit T(½). Die Ergebnisse zeigten, daß die in den oben angegebenen Formulierungen verwendeten Konzentrationen der Enzyme und der Coenzymkomponenten in den optimalen Bereich fallen. Sowohl für HK wie für G-6-PDH ist die Reaktion um so schneller und damit die Halbreaktionszeit T(½) um so kürzer, je höher die Enzymkonzentration ist. Die Optimierung beruht im wesentlichen auf einer Abwägung zwischen dem Kostengesichtspunkt und der Reaktionsgeschwindigkeit.

Beispiel 4

Realzeit-Stabilitätsuntersuchung

Die beiden Versionen der Enzymlösung wurden bei 4ºC über eine Periode von etwa 2 ½ Jahren gelagert. Glukosetests wurden unter Verwendung der Enzymlösungen nach ein bzw. 2 ½ Jahren durchgeführt. Die Reaktionsprofile wurden durch Bestimmung des Absorptionsvermögens bzw. der Extinktion bei 340 nm über die Zeit hin (Sekunden) verfolgt. Für die Ein-Jahres-Untersuchung wurden im Labor hergestellte Glukosestandards von 150 und 650 mg/dl Glukosekonzentration verwendet. Für die 2 ½-Jahres-Untersuchung wurde ein NERL- Glukosestandard mit einer Glukosekonzentration von 500 mg/dl verwendet. Die Figg. 11 bis 15 sind Reaktionsprofil-Scans bei einem Jahr und 2 ½ Jahren. Die Zeit einer Halbreaktion wurde ebenfalls in allen durchgeführten Tests bestimmt.
In der Tabelle 2 wird die Zeit für eine Halbreaktion, T(½), und die Zeit für im wesentlichen vollständigen Abschluß der Reaktion (Endpunkt) für das erfindungsgemäße Enzymreagenz bestimmt, bei Lagerung bei 4ºC über Perioden von bis zu 2 ½ Jahre. Tabelle 2 Realzeit-Stabilitätsuntersuchung Lagerzeit Stabilisiersystem Glukosekonzentration Anfängliche Extinktion Endpunkt Tag Jahr
Das Enzymreagenz der vorliegenden Erfindung besitzt viele Vorteile. Die projizierte Lagerlebensdauer kann, bei geeigneter Lagerung des Enzymreagenz bei 4ºC mehr als 15 Jahre betragen. Das bedeutet, daß das Reagenz gelegentliche unsachgemäße Behandlung während der Lagerung oder der Überführung überstehen kann. Die Lagerfähigkeit bei Zimmertemperatur kann bis zu 1 ½ Jahren betragen. Die Reaktion ist innerhalb zwei Minuten beendet, für einen 500 mg/dl Glukosestandard. Die Endpunktstabilität beträgt bis zu 5 Minuten. Dies gestattet eine sehr rasche quantitative Glukosebestimmung. Der anfängliche Blank- oder Blindwert ist niedrig, was eine höhere Empfindlichkeit gestattet. Die Linearität des Reagenz ist bis zu etwa 1000 mg Glukose/dl ausgezeichnet. Die berechnete Empfindlichkeit für diese BSA-Version dieses Reagenz unter Verwendung eines 500 mg/dl Standards beträgt 0,0032 Extinktion/mg/dl in einer Küvette mit einer optischen Weglänge von 1 cm, bei 340 nm.
Die Homogenität des stabilen flüssigen Enzymreagenz der vorliegenden Erfindung löst auch die Probleme der Glukoseenzymreagenzien nach dem Stand der Technik, insbesondere die Probleme hinsichtlich der Handhabung des Reagenz und hinsichtlich der Qualitätskontrolle der Tests. Das Enzymreagenz gemäß der vorliegenden Erfindung kann in einfacher Weise pipettiert und unterteilt werden, da keine flüssigen Suspensionen, wie beispielsweise in dem mit Ammoniumsulfat stabilisierten Enzymreagenz, vorliegen. Die unter Verwendung dieses Enzymreagenz erhaltenen Ergebnisse sind reproduzierbar. Das Enzymreagenz der vorliegenden Erfindung läßt sich in einfacher Weise sowohl für manuelle Anwendung wie für automatisierte Analysatoren anpassen.

Claims

1. Homogenes flüssiges Enzymreagenz zur Verwendung für die quantitative Bestimmung von Glukose in einem Glukosetest, bei welchem Adenosintriphosphat und Nicotinamid-Adenindinucleotid als Coenzyme verwendet werden und die Coenzyme im Überschuß vorliegen, das Enzymreagenz bei seiner anfänglichen Herstellung umfassend:

(a) wenigstens etwa 60% v/v Wasser

(b) ein mit Wasser mischbares organisches Polyol-Lösungsmittel in einer Menge von 20 bis 40% v/v;

(c) das Enzym Hexokinase

(d) das Enzym Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase

(e) ein Stabilisatorsystem, welches einen Schwermetallion- Chelatbildner in einer Menge von wenigstens etwa 0,5 mM enthält.

2. Enzymreagenz nach Anspruch 1, bei welchem der Chelatbildner Äthylendiamintetraessigsäure ist.

3. Enzymreagenz nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, bei welchem das Stabilisatorsystem auch ein Antioxydationsmittel enthält.

4. Enzymreagenz nach Anspruch 3, bei welchem das Antioxydationsmittel Rinderserumalbumin in einer Menge von wenigstens 2 g pro Liter ist.

5. Enzymreagenz nach Anspruch 3, bei welchem das Antioxydationsmittel Polyvinylpyrrolidon-40 in einer Menge von wenigstens etwa 2 g pro Liter, und N-Acetylcystein in einer Menge von wenigstens etwa 0,4 g pro Liter aufweist.

6. Enzymreagenz nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei welchem das Stabilisatorsystem auch ein Mikrobio-Kontrollmittel enthält.

7. Enzymreagenz nach Anspruch 6, bei welchem das Mikrobio- Kontrollmittel Natriumazid in einer Menge von wenigstens etwa 0,25 g pro Liter ist.

8. Enzymreagenz nach Anspruch 4, bei welchem das Polyol- Lösungsmittel Glyzerin ist und das Enzymreagenz umfaßt:

(a) Hexokinase-Enzym in einer Menge von etwa 6 bis etwa 80 KIU pro Liter;

(b) Glukose-6-Phosphatdehydrogenase-Enzym in einer Menge von 3 bis 60 KIU pro Liter;

(c) Rinderserumalbumin, in einer Menge von 2 bis 8 g pro Liter

(d) Äthylendiamintetraessigsäure in einer Menge von 0,5 bis 5 mM;

(e) Natriumazid in einer Menge von 0,25 bis 1,0 g pro Liter; und

(f) TRIS-HCl-Puffer in einer Menge von 0,05 bis 0,2 mM; und wobei der Ph-Wert des Enzymreagenz auf etwa 7 ½ eingestellt ist.

9. Enzymreagenz nach Anspruch 5, bei welchem das Polyol- Lösungsmittel Glyzerin ist und das Enzymreagenz umfaßt:

(a) Hexokinase-Enzym in einer Menge von 6 bis 80 KIU pro Liter;

(c) Polyvinylpyrrolidon-40 in einer Menge von 2 bis 8 g pro Liter und N-Acetylcystein in einer Menge von 0,4 bis 1,6 g pro Liter;

(d) Äthylendiamintetraessigsäure in einer Menge von 0,5 bis 5 mM;

(e) Natriumazid in einer Menge von 0,25 bis 1,0 g pro Liter;

(f) TRIS-HCl-Puffer in einer Menge von 0,05 bis 0,2 mM; wobei der Ph-Wert des Enzymreagenz auf etwa 7 ½ eingestellt ist.

10. Enzymreagenz nach Anspruch 8 oder Anspruch 9, des weiteren dadurch gekennzeichnet, daß wenn es während seiner Lagerfähigkeit in einem Glukosetestverfahren verwendet und mit einem Magnesiumionen und die Coenzyme Adenosintriphosphat und Nicotinamid-Adenindinucleotid enthaltenden flüssigen Coenzymreagenz, und mit einer Glukose zur Bildung eines Testreaktionsgemischs gemischt wird, das Volumenverhältnis von Enzymreagenz : Coenzymreagenz Testprobe 100 : 1000 : 11 beträgt, die Glukosekonzentration in der Testprobe zwischen 10 bis 500 Mg pro Deziliter beträgt, die Coenzyme in dem Reaktionsgemisch in substantiellem Überschuß für den Glukosetest relativ bezüglich der Glukosekonzentration in dem Test vorliegen, und die Konzentration des Chelat-Bildners in dem Reaktionsgemisch nicht mehr als etwa 50% der Magnesiumionenkonzentration in dem Gemisch ausmacht, wobei der Endpunkt für den Test in nicht mehr als etwa 10 Minuten erreicht werden kann.

11. Enzymreagenz nach Anspruch 10, bei welchem die Hexokinase in einer Menge von 15 bis 35 KIU pro Liter vorliegt, die Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase in einer Menge von 20 bis 35 KIU pro Liter, bei welchem ferner das Molarverhältnis von Adenosintriphosphat zu Glukose nicht mehr als etwa 3 : 1 in dem Reaktionsgemisch ausmacht und das Molarverhältnis von Nicotinamidadenindinucleotid zu Glukose in dem Reaktionsgemisch mehr als etwa 5 : 1 beträgt, und bei welchem der Endpunkt-für den Test in nicht mehr als etwa 2 Minuten erreicht werden kann.

12. Enzymreagenz nach Anspruch 8 oder Anspruch 9, des weiteren dadurch gekennzeichnet, daß wenn es während seiner Lagerfähigkeit in einem Glukosetestverfahren verwendet und mit einem Magnesiumionen und die Coenzyme Adenosintriphosphat und Nicotinamidadenindinucleotid enthaltenden flüssigen Coenzymreagenz und mit einer Glukose enthaltenden Testprobe zur Bildung eines Testreaktionsgemischs gemischt wird, das Volumenverhältnis von Enzymreagenz : Coenzymreagenz : Testprobe 100 : 1000 : 11 beträgt, die Glukosekonzentration in der Testprobe zwischen 10 bis 500 Mg pro Deziliter beträgt, die Coenzyme in dem Reaktionsgemisch in substantiellem Überschuß für den Glukosetest relativ bezüglich der Glukosekonzentration in dem Reaktionsgemisch vorliegen und die Konzentration des Chelatbildners in dem Reaktionsmittel nicht mehr als etwa 50% der Magnesiumionenkonzentration in dem Reaktionsgemisch ausmacht, und daß die Zeitdauer einer halben Reaktion für den Glukosetest nicht mehr als das etwa 1,5-fache der Zeit einer halben Reaktion für den gleichen Test, wenn das Enzymreagenz frisch hergestellt war, beträgt.

13. Reagenzien-Zusammenstellung ('kit of reagents') zur Verwendung für die quantitative Bestimmung von Glukose in einem Glukosetest, die Zusammenstellung umfassend:

(a) ein homogenes flüssiges Enzymreagenz mit einer langen Lagerfähigkeit, nach einem der vorhergehenden Ansprüche;

(b) ein homogenes flüssiges Coenzymreagenz umfassend: wenigstens etwa 80% v/v Wasser;

(ii) ein mit Wasser mischbares polyolisches organisches Lösungsmittel in einer Menge von 5 bis 20% v/v;

(iii) Adenosintriphosphat-Koenzym;

(iv) Nicotinamidadenindinucleotid-Koenzym; und

(v) Magnesiumionen;

wobei der Ansatz der Enzym- und Coenzymreagenzien so gewählt ist, daß bei ihrer Vermischung zur Bildung eines zur Durchführung des Glukosetests geeigneten kombinierten Reagenz in dem kombinierten Reagenz die Menge des Chelatbildners aus dem Enzymreagenz nicht mehr als etwa die Hälfte der Menge der Magnesiumionen aus dem Coenzymreagenz beträgt, auf molarer Basis.

14. Zusammenstellung nach Anspruch 13, bei welcher das kombinierte Reagenz durch Mischen des Enzym- und des Coenzymreagenz im Verhältnis von 1 : 10 v/v gebildet wird, und bei welcher in dem kombinierten Reagenz die Menge an Chelatbildner aus dem Enzymreagenz nicht mehr als etwa 1/10 der Menge von Magnesiumionen aus dem Coenzymreagenz beträgt.

15. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Glykose, umfassend die Schritte:

(a) Mischen

(i) einer Glukose enthaltenden Testprobe;

(ii) eines homogenen flüssigen Enzymreagenz mit einer langen Lagerfähigkeit, nach einem der Ansprüche 1 bis 12;

(iii) eines homogenen Coenzymreagenz enthaltend:

A. wenigstens etwa 80% v/v Wasser

B. ein mit Wasser mischbares polyolisches organisches Lösungsmittel in einer Menge von 5 bis 20% v/v;

C. das Coenzym Adenosintriphosphat;

D. das Coenzym Nicotinamidadenindinucleotid; und

E. Magnesiumionen

zur Bildung eines Testreaktionsgemischs, wobei die Reagenzien und die Testprobe in solchen Verhältnissen gemischt werden, daß die Menge des Chelatbildners aus dem Enzymreagenz nicht mehr als etwa die Hälfte der Menge von Magnesiumionen aus dem Coenzymreagenz, auf molarer Basis, ausmacht

(b) Messen der Bildung von reduziertem Nicotinamidadenindinucleotid.

16. Verfahren nach Anspruch 15, bei welchem die Verfahrensschritte des Mischens als erstes ein Mischen der Enzym- und der Coenzymreagenzien im Verhältnis von 1 : 10 v/v zur Bildung eines kombinierten Reagenz umfassen, und wobei in dem kombinierten Reagenz der Anteil des Chelatbildners aus dem Enzymreagenz nicht mehr als etwa 1/10 der Menge von Magnesiumionen aus dem Coenzymreagenz ausmacht.