DE202014011600U1

DE202014011600U1 - Markierte Inhibitoren des prostataspezifischen Membranantigens (PSMA), deren Verwendung als bildgebende Mittel und pharmazeutische Wirkstoffe für die Behandlung von Prostatakrebs

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Publication number: DE202014011600U1
Application number: DE202014011600.8U
Authority: DE
Original assignee: Universitaet Heidelberg Koerperschaft Des Oeffentlichen Rechts; Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ; Universitaet Heidelberg
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2013-10-18
Filing date: 2014-10-17
Publication date: 2023-05-31
Anticipated expiration: 2024-10-18
Also published as: CA2924360A1; MY188934A; JP2019011368A; GEAP202215720A; AU2014336638A1; FR24C1028I2; LTPA2024522I1; US20260007784A1; US20190336622A1; SA516370842B1; JP2024028742A; GEP20217330B; HUE066137T2; EP3456700A1; JP2019218351A; JP6556805B2; KR102282378B1; KR20210013350A; KR102210931B1; PH12016500656B1

Abstract

Verbindung der Formel (la)wobein 0 oder 1 ist,m 1, 2, 3 oder 4 ist,Z -CO2H, -SO2H, -SO3H, -SO4H, -PO2H, -PO3H oder -PO4H2ist,X Naphthyl, Phenyl, Biphenyl, Indolyl (=2,3-benzopyrrolyl) oder Benzothiazolyl ist,Y Aryl, Alkylaryl, Cyclopentyl, Cyclohexyl oder Cycloheptyl ist undder Chelator Folgendes ist:1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-N,N',N'',N'''-tetraessigsäure (DOTA),N,N''-Bis[2-hydroxy-5-(carboxyethyl)benzyl]ethylendiamin-N,N''-diessigsäure (HBED-CC),1,4,7-Triazacyclononan-1,4,7-triessigsäure NOTA),2-(4,7-Bis(carboxymethyl)-1,4,7-triazonan-1-yl)pentandisäure (NODAGA),2-(4,7,10- Tris(carboxymethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan-1-yl)pentandisäure (DOTAGA),1,4,7-Triazacyclononan-phosphinsäure (TRAP),1,4,7-Triazacyclononan-1-[methyl(2-carboxyethyl)phosphinsäure]-4,7-bis[methyl(2-hydroxymethyl)phosphinsäure] (NOPO),3,6,9,15-Tetraazabicyclo[9.3.1.]pentadeca-1(15),11,13-trien-3,6,9-triessigsäure (PCTA)oderDiethylentriaminpentaessigsäure (DTPA)oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon oder ein Solvat davon oder ein Solvat des Salzes davon.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Radiopharmaka und deren Verwendung in der Nuklearmedizin als Tracer, bildgebende Mittel und für die Behandlung verschiedener Erkrankungsstadien von Prostatakrebs.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Prostatakrebs (PCa) ist die häufigste Krebserkrankung in der US-amerikanischen und europäischen Bevölkerung. Mindestens 1 bis 2 Millionen Männer in der westlichen Hemisphäre leiden an Prostatakrebs, und es wird geschätzt, dass die Krankheit jeden sechsten Mann zwischen 55 und 85 Jahren treffen wird. In den USA werden jedes Jahr mehr als 300.000 neue Fälle von Prostatakrebs diagnostiziert. Nur Lungenkrebs hat eine höhere Sterblichkeitsrate. Derzeit überwiegen anatomische Methoden wie die Computertomographie (CT), Magnetresonanztomographie (MRT) und Ultraschall bei der klinischen Bildgebung von Prostatakrebs. Weltweit werden aktuell schätzungsweise 2 Milliarden Dollar für chirurgische, medikamentöse und minimalinvasive Behandlungen sowie Strahlenbehandlungen ausgegeben. Gegenwärtig gibt es jedoch keine wirksame Therapie für rezidivierenden, metastasierenden, androgenunabhängigen Prostatakrebs.
Eine Vielzahl experimenteller niedermolekularer PCa-bildgebender Mittel wird derzeit klinisch erprobt, darunter die radioaktiv markierten Cholinanaloga [¹⁸F]Fluordihydrotestosteron ([¹⁸F]FDHT), anti-1-Amino-3-[¹⁸F]fluorcyclobutyl-1-carbonsäure (anti[¹⁸F]F-FACBC, [¹¹C]Acetat und 1-(2-Desoxy-2-[¹⁸F]fluor-L-arabinofuranosyl)-5-methyluracil (-[^[18F]FMAU) (Scher, B.; et al. Eur J Nucl Med Mol Imaging 2007, 34, 45 - 53; Rinnab, L.; et al. BJU Int 2007, 100, 786,793; Reske, S.N.; et al. J Nucl Med 2006, 47, 1249-1254; Zophel, K.; Kotzerke, J. EurJNucl Med Mol Imaging 2004, 31, 756 - 759; Vees, H.; et al. BJU Int 2007, 99, 1415 - 1420; Larson, S. M.; et al. J Nucl Med 2004, 45, 366 - 373; Schuster, D.M.; et al. J Nucl Med 2007, 48, 56 - 63; Tehrani, O.S.; et al. J Nucl Med 2007, 48, 1436 - 1441). Jedes dieser bildgebenden Mittel hat einen anderen Wirkmechanismus und bestimmte Vorteile, z. B. die geringe Ausscheidung von [¹¹C]Cholin über den Urin, und Nachteile, wie die kurze physikalische Halbwertszeit der Positronen emittierenden Radionuklide.
Es ist weithin bekannt, dass Tumore einzigartige Proteine exprimieren können, die mit ihrem bösartigen Phänotyp verbunden sind, oder dass sie Proteine mit normalen Konstituenten in größerer Zahl als normale Zellen überexprimieren können. Die Expression bestimmter Proteine auf der Oberfläche von Tumorzellen bietet die Möglichkeit, Krankheiten zu diagnostizieren und zu charakterisieren, indem die phänotypische Identität sowie die biochemische Zusammensetzung und Aktivität des Tumors untersucht werden. Radioaktive Moleküle, die selektiv an spezifische Oberflächenproteine von Tumorzellen binden, bieten einen attraktiven Weg für die Bildgebung und Behandlung von Tumoren unter nicht-invasiven Bedingungen. Eine vielversprechende neue Reihe niedermolekularer bildgebender Mittel steuert das prostataspezifische Membranantigen (PSMA) an (Mease R.C. et al. Clin Cancer Res. 2008, 14, 3036 - 3043; Foss, C.A.; et al. Clin Cancer Res 2005, 11, 4022 - 4028; Pomper, M.G.; et al. Mol Imaging 2002, 1, 96 - 101; Zhou, J.; et al. Nat Rev Drug Oiscov 2005, 4, 1015 - 1026; WO 2013/022797 ).
PSMA ist ein transmembranes Glykoprotein vom Typ-II mit 750 Aminosäuren, das auf der Oberfläche von PCa, insbesondere bei androgenunabhängigen, fortgeschrittenen und metastasierten Erkrankungen, in großen Mengen und beschränkt exprimiert wird (Schulke, N.; et al. Proc Natl Acad Sci U S A 2003, 100, 12590 - 12595). Letzteres ist wichtig, da fast jeder PCa im Laufe der Zeit androgenunabhängig wird. PSMA erfüllt die Kriterien eines vielversprechenden Therapieziels, d. h. es wird in allen Krankheitsstadien in großen Mengen und (auf die Prostata) beschränkt exprimiert, es wird auf der Zelloberfläche präsentiert, aber nicht in den Blutkreislauf abgegeben, und es ist mit enzymatischer oder signalisierender Aktivität verbunden (Schulke, N.; et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003, 100, 12590 - 12595). Das PSMA-Gen ist auf dem kurzen Arm von Chromosom 11 lokalisiert und fungiert sowohl als Folathydrolase als auch als Neuropeptidase. Es hat eine Neuropeptidase-Funktion, die der Glutamat-Carboxypeptidase II (GCPII) entspricht, welche im Englischen als „brain PSMA“ bezeichnet wird, und kann die glutamaterge Übertragung durch Spaltung von N-Acetylaspartylglutamat (NAAG) in N-Acetylaspartat (NAA) und Glutamat modulieren (Nan, F.; et al. J Med Chem 2000, 43, 772 - 774). Es gibt pro Krebszelle bis zu 10⁶ PSMA-Moleküle, ein weiterer Hinweis darauf, dass es ein ideales Ziel für die Bildgebung und Therapie mit radionuklidbasierten Methoden darstellt (Tasch, J.; et al. Crit Rev Immunol 2001,21,249 - 261).
Das Radioimmunkonjugat des monoklonalen Anti-PSMA-Antikörpers (mAb) 7E11, bekannt als PROSTASCINT®-Scan, wird derzeit eingesetzt, um Metastasen und Rezidive von Prostatakrebs zu diagnostizieren. Allerdings neigt dieses Mittel dazu, Bilder zu erzeugen, die schwierig zu interpretieren sind (Lange, P.H. PROSTASCINT scan for staging prostate cancer. Urology 2001, 57, 402 - 406; Haseman, M.K.; et al. Cancer Biother Radiopharm 2000, 15, 131 - 140; Rosenthal, S.A.; et al. Tech Urol 2001, 7, 27 - 37). In jüngerer Zeit wurden monoklonale Antikörper entwickelt, die an die extrazelluläre Domäne von PSMA binden. Sie wurden radioaktiv markiert und es wurde gezeigt, dass sie sich in PSMA-positiven Prostatatumormodellen bei Tieren anreichern. Die Diagnose und der Nachweis von Tumoren mithilfe von monoklonalen Antikörpem war jedoch durch die geringe Durchlässigkeit der monoklonalen Antikörper in soliden Tumoren eingeschränkt.
Das gezielte Ansteuern von Krebszellen mit Radiopharmazeutika, sei es für bildgebende oder therapeutische Zwecke, ist eine Herausforderung. Es ist bekannt, dass eine Vielzahl von Radionukliden für die Strahlenbildgebung oder die Strahlentherapie von Krebs nützlich sind, darunter ¹¹¹In, ⁹⁰Y, ⁶⁸Ga, ¹⁷⁷Lu, ^99mTc, ¹²³I und ¹³¹I. Unlängst wurde gezeigt, dass einige Verbindungen, die ein Glutamat-Harnstoff-Glutamat (GUG)- oder ein Glutamat-Harnstoff-Lysin (GUL)-Erkennungselement enthalten, das mit einem Radionuklid-Liganden-Konjugat verbunden ist, eine hohe Affinität für PSMA aufweisen.
Es werden neue Mittel benötigt, die eine rasche Visualisierung von Prostatakrebs und ein spezifisches Targeting für eine Strahlentherapie ermöglichen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, Liganden zu entwickeln, die mit PSMA wechselwirken und geeignete Radionuklide tragen, welche eine vielversprechende und neuartige Targetingoption für die Erkennung, Behandlung und Therapie von Prostatakrebs darstellen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Lösung der besagten Aufgabe wird durch die Bereitstellung der in den Schutzansprüchen charakterisierten Ausführungsformen erreicht.
Die Erfinder entdeckten neue Verbindungen, die als Radiopharmaka nützlich sind, sowie deren Verwendung als Tracer und bildgebende Mittel in der Nuklearmedizin und für die Behandlung verschiedener Erkrankungsstadien von Prostatakrebs.
Die neuartigen bildgebenden Mittel mit strukturellen Modifikationen in der Linker-Region haben verbesserte Tumortargeting-Eigenschaften und eine verbesserte Pharmakokinetik. Das Pharmakophor weist drei Carboxylgruppen auf, die mit den jeweiligen Seitenketten von PSMA und einem Sauerstoff als Teil der Zinkkomplexierung im aktiven Zentrum wechselwirken können. Neben diesen obligatorischen Wechselwirkungen konnten die Erfinder auch die lipophilen Wechselwirkungen in der Linker-Region optimieren.
Figurenliste

1: PET-Bildgebung von MB17 Koronale mikro-PET Ganzkörper-Bilder einer athymischen männlichen Nacktmaus mit LNCaP-Tumorxenotransplantaten. Die Tumortargeting-Effizienz und die pharmakokinetischen Eigenschaften von [⁶⁸Ga]MB17 wurden durch dynamische mikro-PET-Scans bewertet. Es wurden ca. 15 MBq pro Maus injiziert. Diagramm A zeigt die jeweiligen Zeit-Aktivitäts-Kurven von Niere und Blase, und Diagramm B die jeweiligen Zeit-Aktivitäts-Kurven von Herz, Muskeln und Tumor. Die Werte sind als mittlere standardisierte Aufnahmewerte (SUV) ausgedrückt.
2: Organverteilung 1 Stunde nach der Injektion Organverteilung eine Stunde nach Injektion von 0,06 nmol des mit ⁶⁸Ga markierten PSMA-Inhibitors MB17. Die Blockierung von PSMA durch die gleichzeitige Verabreichung von 2 mg 2-PMPA/kg Körpergewicht zeigt eine PSMA-spezifische Aufnahme im Tumor und in den Nieren. Die Daten sind als Mittelwert in % ID/g Gewebe ± SD (n=3) angegeben.
3: PET-Bildgebung von MB4 Koronale mikro-PET Ganzkörper-Bilder einer athymischen männlichen Nacktmaus mit LNCaP-Tumorxenotransplantaten. Die Tumortargeting-Effizienz und die pharmakokinetischen Eigenschaften von [⁶⁸Ga]MB4 wurden durch dynamische mikro-PET-Scans bewertet. Es wurden ca. 15 MBq pro Maus injiziert. Diagramm A zeigt die jeweiligen Zeit-Aktivitäts-Kurven von Niere und Blase, und Diagramm B die jeweiligen Zeit-Aktivitäts-Kurven von Herz, Muskeln und Tumor. Die Werte sind als mittlere standardisierte Aufnahmewerte (SUV) ausgedrückt.
4: Organverteilung, ausgedrückt als % ID/q Gewebe ± SD (n=5) 24 Stunden nach Injektion von 0,06 nmol des mit ¹⁷⁷Lu markierten MB17 Die Organverteilung mit ¹⁷⁷Lu zeigt, dass die anfänglich hohe Aufnahme in den Nieren nach 24 Stunden fast vollständig verschwunden ist (2,13 ± 1,36 % ID/g), während die Aufnahme im Tumor hoch blieb und sogar noch zunahm (10,58 ± 4,50 % ID/g). Andere Organe wie Leber (0,08 ± 0,03 % ID/g), Lunge (0,11 ± 0,13 % ID/g) und Milz (0,13 ± 0,05 % ID/g) zeigten eine sehr geringe Aufnahme. Die günstige Pharmakokinetik führte zu extrem hohen Tumor-Hintergrund-Verhältnissen (Tumor/Blut: 1058; Tumor/Muskel: 529) nach 24 Stunden.
5: PET-Bildgebung von MB2 Koronale mikro-PET Ganzkörper-Bilder einer athymischen männlichen Nacktmaus mit LNCaP-Tumorxenotransplantaten. Die Tumortargeting-Effizienz und die pharmakokinetischen Eigenschaften von [⁶⁸Ga]MB2 wurden durch dynamische mikro-PET-Scans bewertet. Es wurden ca. 15 MBq pro Maus injiziert.
6: PET-Bildgebung von MB3 Koronale mikro-PET Ganzkörper-Bilder einer athymischen männlichen Nacktmaus mit LNCaP-Tumorxenotransplantaten. Die Tumortargeting-Effizienz und die pharmakokinetischen Eigenschaften von [⁶⁸Ga]MB3 wurden durch dynamische mikro-PET-Scans bewertet. Es wurden ca. 15 MBq pro Maus injiziert.
7: PET-Bildgebung von MB10 Koronale mikro-PET Ganzkörper-Bilder einer athymischen männlichen Nacktmaus mit LNCaP-Tumorxenotransplantaten. Die Tumortargeting-Effizienz und die pharmakokinetischen Eigenschaften von [⁶⁸Ga]MB10 wurden durch dynamische mikro-PET-Scans bewertet. Es wurden ca. 15 MBq pro Maus injiziert.
8: PET-Bildgebung von MB17.D Koronale mikro-PET Ganzkörper-Bilder einer athymischen männlichen Nacktmaus mit LNCaP-Tumorxenotransplantaten. Die Tumortargeting-Effizienz und die pharmakokinetischen Eigenschaften von [⁶⁸Ga]MB17.D wurden durch dynamische mikro-PET-Scans bewertet. Es wurden ca. 15 MBq pro Maus injiziert. MB17.D: Stereoisomer von MB17(L); Synthese basierend auf Fmoc-3(2-Naphthyl)-D-alanin
9: PET-Bildgebung von MB22 Koronale mikro-PET Ganzkörper-Bilder einer athymischen männlichen Nacktmaus mit LNCaP-Tumorxenotransplantaten. Die Tumortargeting-Effizienz und die pharmakokinetischen Eigenschaften von [⁶⁸Ga]MB22 wurden durch dynamische mikro-PET-Scans bewertet. Es wurden ca. 15 MBq pro Maus injiziert.
10: PET-Bildgebung von MB24 Koronale mikro-PET Ganzkörper-Bilder einer athymischen männlichen Nacktmaus mit LNCaP-Tumorxenotransplantaten. Die Tumortargeting-Effizienz und die pharmakokinetischen Eigenschaften von [⁶⁸Ga]MB24 wurden durch dynamische mikro-PET-Scans bewertet. Es wurden ca. 15 MBq pro Maus injiziert.
11: PET-Bildgebung von MB25 Koronale mikro-PET Ganzkörper-Bilder einer athymischen männlichen Nacktmaus mit LNCaP-Tumorxenotransplantaten. Die Tumortargeting-Effizienz und die pharmakokinetischen Eigenschaften von [⁶⁸Ga]MB25 wurden durch dynamische mikro-PET-Scans bewertet. Es wurden ca. 15 MBq pro Maus injiziert.
12: PET-Bildgebung von MB31 Koronale mikro-PET Ganzkörper-Bilder einer athymischen männlichen Nacktmaus mit LNCaP-Tumorxenotransplantaten. Die Tumortargeting-Effizienz und die pharmakokinetischen Eigenschaften von [⁶⁸Ga]MB31 wurden durch dynamische mikro-PET-Scans bewertet. Es wurden ca. 15 MBq pro Maus injiziert.
13: PET-Bildgebung von MB33 Koronale mikro-PET Ganzkörper-Bilder einer athymischen männlichen Nacktmaus mit LNCaP-Tumorxenotransplantaten. Die Tumortargeting-Effizienz und die pharmakokinetischen Eigenschaften von [⁶⁸Ga]MB33 wurden durch dynamische mikro-PET-Scans bewertet. Es wurden ca. 15 MBq pro Maus injiziert.
14: PET-Bildgebung von MB35 Koronale mikro-PET Ganzkörper-Bilder einer athymischen männlichen Nacktmaus mit LNCaP-Tumorxenotransplantaten. Die Tumortargeting-Effizienz und die pharmakokinetischen Eigenschaften von [⁶⁸Ga]MB35 wurden durch dynamische mikro-PET-Scans bewertet. Es wurden ca. 15 MBq pro Maus injiziert.
15: PET-Scan einer Maus, der ⁶⁸Ga-CHX-DTPA injiziert wurde Links die kaudale Ansicht, in der Mitte die dorsale Ansicht und rechts die Seitenansicht. Die Bilder umfassen die Zeitspannen von 20 - 40 min (oben), 40 - 60 min (Mitte) und 120 - 140 min (unten).
16: MB17 vs. MB17.D Koronale mikro-PET Ganzkörper-Bilder von athymischen männlichen Nacktmäusen mit LNCaP-Tumorxenotransplantaten. Die Tumortargeting-Effizienz und die pharmakokinetischen Eigenschaften der Stereoisomere MB17 und MB17.D wurden 2 Stunden nach der Injektion direkt verglichen.
17: PET/CT-Bildgebung mit ⁶⁸Ga-markiertem MB17 beim Menschen
1. (a) Erste klinische Erfahrungen mit ⁶⁸Ga-markierter MB17-PET/CT zeigen, dass kleine Lymphknotenmetastasen 1 Stunde nach der Injektion nachgewiesen werden können, was in erster Linie auf eine hohe Aufnahme des Radiotracers zurückzuführen ist. Rote Pfeile zeigen eine Stunde nach der Injektion auf eine repräsentative Läsion mit einem SUVmax von 36,5 und einem Tumor-Hintergrund-Verhältnis von 52,1. MIP = Projektion der maximalen Intensität der PET 1 Stunde nach der Injektion.
2. (b) Der wesentliche Vorteil der ⁶⁸Ga-markierten MB17-PET/CT ist der empfindliche Nachweis von Läsionen selbst bei niedrigem PSA-Wert.
18: PET-Bildgebung eines Patienten mit mehreren Prostatakrebsmetastasen
1. (a) Der erste Scan zeigt das erste PET-Bild des Patienten mit mehreren Prostatakrebsmetastasen und einem PSA-Wert von 14 im Blut. Zwei Monate später wurden 3,3 GBq von ¹⁷⁷Lu-markiertem MB17 verabreicht. Zu diesem Zeitpunkt erreichte der PSA-Wert im Blut einen Wert von 38. Nach dem ersten Zyklus sank der PSA-Wert auf 8. Drei Monate nach dem ersten Zyklus wurden weitere 4 GBq von ¹⁷⁷Lu-markiertem MB17 verabreicht. Der Kontroll-PET-Scan wurde einen Monat nach dem zweiten Zyklus durchgeführt. Die Behandlung zeigte eine wesentliche Wirkung auf die Tumorläsionen und den PSA-Wert und führte zu einer Verringerung der Knochenschmerzen.
2. (b) Das Diagramm zeigt die wesentliche Auswirkung auf den PSA-Wert, der nach der ersten Verabreichung der therapeutischen Dosis von ¹⁷⁷Lu-markiertem MB17 abnahm.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Radiopharmazeutika und deren Verwendung in der Nuklearmedizin als Tracer, bildgebende Mittel und für die Behandlung verschiedener Erkrankungsstadien von Prostatakrebs.

Daher betrifft die vorliegende Erfindung Verbindungen, die durch die allgemeinen Formeln (la) oder (Ib) dargestellt werden:

oder

wobei:

n:	0,1
m:	1,2,3,4
Z:	-CO₂H, -SO₂H, -SO₃H, -SO₄H, -PO₂H, -PO₃H, -PO₄H₂
X:	Naphthyl, Phenyl, Biphenyl, Indolyl (=2,3-benzopyrrolyl), Benzothiazolyl
Y:	Aryl, Alkylaryl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, Cyctoheptyl
Chelator:	1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-N,N',N'',N'''-tetraessigsäure (= DOTA),
	N, N''-Bis[2-hydroxy-5-(carboxyethyl)benzyl]ethylendiamin-N, N''-diessigsäure (= HBED-CC),
	1 ,4,7-Triazacyclononan-1 ,4,7-triessigsäure (= NOTA),
	2-(4,7-Bis(carboxymethyl)-1,4,7-triazonan-1-yl)pentandisäure (NODAGA),
	2-(4,7,10-Tris(carboxymethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan-1-yl)pentandisäure (DOTAGA),
	1,4,7-Triazacyclononan-phosphinsäure (TRAP),
	1,4,7-Triazacyclononan-1-[methyl(2-carboxyethyl)phosphinsäure]-4,7-bis[methyl(2-hydroxymethyl)phosphinsäure] (NOPO),
	3,6,9,15-Tetraazabicyclo[9,3,1,]pentadeca-1(15),11,13-trien-3,6,9-triessigsäure (= PCTA),
	N'-{5-[Acetyl(hydroxy)amino]pentyl}-N-[5-({4-[(5-aminopentyl)(hydroxy)amino]-4-oxobutanoyl}amino)pentyl]-N-hydroxysuccinamid (DFO),
	Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA)
	Trans-cyclohexyl-diethylentriaminpentaessigsäure (CHX-DTPA)
	1-Oxa-4,7,10-triazacyclododecan-4,7,10-triessigsäure (oxo-Do3A)
	p-Isothiocyanatobenzyl-DTPA (SCN-Bz-DTPA)
	1-(p-lsothiocyanatobenzyl)-3-methyl-DTPA (1 B3M)
	2-(p-Isothiocyanatobenzyl)-4-methyl-DTPA (1M3B)
	1-(2)-Methyl-4-isocyanatobenzyl-DTPA (MX-DTPA)

oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon oder ein Solvat davon oder ein Solvat des Salzes davon.

Sofern nicht anders angegeben, kann in der vorliegenden Erfindung der „Alkyl“-Rest (bevorzugt: C₁ bis C₁₀) linear oder verzweigt, unsubstituiert oder substituiert sein. Bevorzugte Alkylreste sind Methyl, Ethyl, n-Propyl, iso-Propyl, n-Butyl, tert-Butyl, n-Pentanyl, n-Hexanyl. Dies gilt auch für die entsprechenden Cycloalkylverbindungen, die bevorzugt 3 bis 10 Kohlenstoffatome aufweisen.
„Aryl“ bezieht sich auf ein aromatisches monocyclisches oder polycyclisches Ringsystem mit 6 bis 14 Kohlenstoffatomen, bevorzugt 6 bis 10 Kohlenstoffatomen. Die Arylgruppe kann gegebenenfalls mit einem oder mehreren Ringsubstituenten, wie z. B. Alkylgruppen, substituiert sein. Bevorzugte Arylgruppen sind Phenyl, Benzyl oder Naphthyl.
Obwohl es bevorzugt wird, dass die Z-Gruppe -CO₂H ist, kann sie leicht durch biosterische Ersatzstoffe wie -SO₂H, -SO₃H, -SO₄H, -PO₂H, -PO₃H, -PO₄H₂ ersetzt werden, siehe z. B. „The Practice of Medicinal Chemistry“ (Academic Press New York, 1996), Seite 203.
Im Sinne der Erfindung werden alle Reste als kombinierbar angesehen, sofern in der Definition der Reste nichts anderes angegeben ist. Alle denkbaren Untergruppierungen davon gelten somit als offenbart.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Motiv, das spezifisch an Zellmembranen neoplastischer Zellen bindet, ein Motiv, das spezifisch an Zellmembranen von Krebszellen bindet, wobei das Motiv bevorzugt ein prostataspezifisches Membranantigen (PSMA) umfasst, insbesondere wobei das PSMA ein Glutamat-Harnstoff-Lysin-Motiv nach der folgenden Formel in Schema 1 umfasst.
So bestehen bevorzugte Moleküle der vorliegenden Erfindung aus drei Hauptkomponenten (Schema 1): dem hydrophilen PSMA-Bindungsmotiv (Glu-Harnstoff-Lys; = Glu-NH-CO-NH-Lys), einem variablen Linker und dem Chelator, welcher bevorzugt DOTA ist.
Die verschiedenen bevorzugten Linker sind nachstehend dargestellt, wobei R=Glu-Harnstoff-Lys und R'=DOTA (als bevorzugtes Beispiel für den Chelator) ist, wie oben dargestellt.
Bevorzugte Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind z. B.
oder
Die Erfindung betrifft auch pharmazeutisch verträgliche Salze der Verbindungen der allgemeinen Formel (la) und/oder (Ib). Die Erfindung betrifft auch Solvate der Verbindungen, einschließlich der Salze sowie der aktiven Metaboliten davon und gegebenenfalls der Tautomere davon nach der allgemeinen Formel (la) und/oder (Ib), einschließlich Prodrug-Formulierungen.
Ein „pharmazeutisch verträgliches Salz“ ist ein pharmazeutisch verträgliches, organisches oder anorganisches saures oder basisches Salz einer Verbindung der Erfindung. Zu den repräsentativen pharmazeutisch verträglichen Salzen gehören z. B. Alkalimetallsalze, Erdalkalisalze, Ammoniumsalze, wasserlösliche und wasserunlösliche Salze wie Acetat, Carbonat, Chlorid, Gluconat, Glutamat, Lactat, Laurat, Malat oder Tartrat.
Der Begriff „Prodrug“ bezieht sich auf eine Vorstufe eines Arzneimittels, d .h. eine Verbindung, die bei der Verabreichung an einen Patienten durch Stoffwechselprozesse chemisch umgewandelt werden muss, bevor sie zu einem aktiven pharmakologischen Wirkstoff wird. Veranschaulichende Pro-Pharmaka von Verbindungen nach Formel (la) und/oder (Ib) sind Ester und Amide, bevorzugt Alkylester von Fettsäureestern. Zu den Prodrug-Formulierungen gehören alle Substanzen, die durch einfache Umwandlung, einschließlich Hydrolyse, Oxidation oder Reduktion entweder enzymatisch, metabolisch oder auf andere Weise, gebildet werden. Ein geeignetes Prodrug enthält z. B. eine Substanz der allgemeinen Formel (la) und/oder (Ib), die über einen enzymatisch spaltbaren Linker (z. B. Carbamat, Phosphat, N-Glykosid oder eine Disulfidgruppe) an eine lösungsverbessernde Substanz (z.B. Tetraethylenglykol, Saccharide, Ameisensäuren oder Glucuronsäure, etc.) gebunden ist. Ein solches Prodrug einer erfindungsgemäßen Verbindung kann einem Patienten verabreicht werden, und dieses Prodrug kann in eine Substanz der allgemeinen Formel (la) und/oder (Ib) umgewandelt werden, um die gewünschte pharmakologische Wirkung zu erzielen.
Einige Verbindungen der Formel (la) und/oder (Ib) sind in Form der Racemate, ihrer Enantiomere und wahlweise in Form ihrer Diastereomere und aller möglichen Gemische davon eingeschlossen.
Erfindungsgemäß sollen alle chiralen C-Atome eine D- und/oder L-Konfiguration haben; auch sollen Kombinationen innerhalb einer Verbindung möglich sein, d. h. einige der chiralen C-Atome können eine D-Konfiguration und andere können eine L-Konfiguration haben.
Die erhaltenen Verbindungen können wahlweise nach bekannten Verfahren (z. B. Allinger, N. L. undEllielE. L. in „Topics in Stereochemistry" Vol. 6, Wiley Interscience, 1971) in ihre Enantiomere und/oder Diastereomere getrennt werden. Ein mögliches Verfahren zur Enantiomerentrennung ist der Einsatz der Chromatographie.
Die Erfindung betrifft auch pharmazeutische Zubereitungen, die eine therapeutisch wirksame Menge der Wirkstoffe (erfindungsgemäße Verbindung der Formel (la) oder (Ib)) zusammen mit organischen oder anorganischen festen oder flüssigen, pharmazeutisch verträglichen Trägerstoffen enthalten, die für die beabsichtigte Verabreichung geeignet sind und die mit den Wirkstoffen ohne Nachteile wechselwirken.
Der Ausdruck „pharmazeutisch verträglich“ wird hier verwendet, um auf jene Verbindungen, Materialien, Zusammensetzungen und/oder Darreichungsformen Bezug zu nehmen, die im Rahmen eines vernünftigen medizinischen Verständnisses für die Verwendung in Kontakt mit dem Gewebe eines Patienten geeignet sind, ohne übermäßige Toxizität, Reizung, allergische Reaktionen oder andere Probleme bzw. Komplikationen in Übereinstimmung mit einem angemessenen Nutzen/Risiko-Verhältnis.
Der Begriff „Patient“ umfasst auch Tiere, z. B. einen Menschen, einen Affen, eine Kuh, ein Pferd, eine Katze oder einen Hund. Bei dem Tier kann es sich um ein Säugetier wie einen Nichtprimaten oder einen Primaten (z. B. einen Affen oder einen Menschen) handeln. In einer Ausführungsform ist ein Patient ein Mensch.
Im Allgemeinen können die Verbindungen der Formel (la) oder (Ib) oder pharmazeutische Zusammensetzungen davon oral oder parenteral, in der Regel durch Injektion oder Infusion, verabreicht werden.
Ein „parenteraler Verabreichungsweg“ bezeichnet andere Verabreichungsarten als die enterale und topische Verabreichung, in der Regel durch Injektion, und umfasst unter anderem die intravenöse, intramuskuläre, intraarterielle, intrathekale, intrakapsuläre, intraorbitale, intrakardiale, intradermale, intraperitoneale, transtracheale, subkutane, subkutikuläre, intraartikuläre, subkapsuläre, subarachnoidale, intraspinale und intrasternale Injektion und Infusion.
Die Dosierung der erfindungsgemäßen Verbindungen wird vom Arzt auf der Grundlage der patientenspezifischen Parameter wie Alter, Gewicht, Geschlecht, Schweregrad der Erkrankung usw. festgelegt. Die Dosierung liegt bevorzugt bei 0,00001 mg/kg bis 100 mg/kg Körpergewicht, bevorzugt bei 0.001 bis 50 mg/kg Körpergewicht und besonders bevorzugt bei 0,01 bis 10 mg/kg Körpergewicht.
Entsprechend der Art der Verabreichung wird das Arzneimittel in geeigneter Weise formuliert, z. B. in Form von Lösungen oder Suspensionen, einfachen Tabletten oder Dragees, Hart- oder Weichgelatinekapseln, Suppositorien, Ovula, Injektionspräparaten, die nach üblichen galenischen Verfahren hergestellt werden.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können, wo angemessen, zusammen mit weiteren Wirkstoffen und mit in pharmazeutischen Zusammensetzungen üblichen Hilfs- und Trägerstoffen formuliert werden, z. B. -je nach herzustellendem Präparat-Talkum, Gummi arabicum, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Kakaobutter, wässrige und nichtwässrige Trägerstoffe, Fettkörper tierischen oder pflanzlichen Ursprungs, Paraffinderivate, Glykole (insbesondere Polyethylenglykol), verschiedene Weichmacher, Dispergiermittel oder Emulgatoren, pharmazeutisch verträgliche Gase (z. B. Luft, Sauerstoff, Kohlendioxid etc.), Konservierungsmittel.
Um flüssige Präparate herzustellen, können Zusatzstoffe wie Natriumchloridlösung, Ethanol, Sorbitol, Glycerin, Olivenöl, Mandelöl, Propylenglykol oder Ethylenglykol verwendet werden.
Werden Infusions- oder Injektionslösungen verwendet, so handelt es sich bevorzugt um wässrige Lösungen oder Suspensionen, die vor der Anwendung hergestellt werden können, z. B. aus lyophilisierten Präparaten, die den Wirkstoff als solchen oder zusammen mit einem Trägerstoff wie Mannit, Lactose, Glucose, Albumin und dergleichen enthalten. Die fertigen Lösungen werden sterilisiert und gegebenenfalls mit Hilfsstoffen gemischt, z. B. mit Konservierungsmitteln, Stabilisatoren, Emulgatoren, Lösungsvermittlem, Puffern und/oder Salzen zur Regulierung des osmotischen Drucks. Die Sterilisation kann durch Sterilfiltration unter Verwendung von Filtern mit kleiner Porengröße erfolgen, wonach die Zusammensetzung gegebenenfalls lyophilisiert werden kann. Zur Aufrechterhaltung der Sterilität können auch geringe Mengen an Antibiotika hinzugegeben werden.
Die Ausdrücke „wirksame Menge“ oder „therapeutisch wirksame Menge“, wie sie hier verwendet werden, bedeuten diejenige Menge einer Verbindung, eines Materials oder einer Zusammensetzung, die eine erfindungsgemäße Verbindung enthält, oder eines anderen Wirkstoffs, die wirksam ist, um eine gewünschte therapeutische Wirkung in mindestens einer Teilpopulation von Zellen bei einem Tier zu erzielen, wobei das Nutzen/Risiko-Verhältnis, das für jede medizinische Behandlung gilt, dabei angemessen ist. Eine therapeutisch wirksame Menge in Bezug auf eine erfindungsgemäße Verbindung ist diejenige Menge eines Therapeutikums, die allein oder in Kombination mit anderen Therapien einen therapeutischen Nutzen bei der Behandlung oder Prävention einer Krankheit bietet. Im Zusammenhang mit einer erfindungsgemäßen Verbindung kann der Begriff eine Menge umfassen, die die Therapie insgesamt verbessert, Krankheitssymptome oder -ursachen vermindert oder vermeidet oder die therapeutische Wirksamkeit eines anderen Therapeutikums oder Synergien mit diesem verstärkt.
Die hier verwendeten Begriffe „behandeln“ oder „Behandlung“ sollen auch Diagnose, Prophylaxe, Prävention, Therapie und Heilung umfassen.
Die Begriffe „vorbeugen“, „Vorbeugung“ und „Prävention“ beziehen sich auf die Verhinderung des Auftretens, des Wiederauftretens oder der Ausbreitung der Krankheit bei einem Patienten infolge der Verabreichung eines Prophylaktikums oder Therapeutikums.
Je nachdem, ob die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel (la) und/oder (Ib) als radiologische bildgebende Mittel oder als Radiopharmazeutika verwendet werden sollen, werden unterschiedliche Radionuklide mit dem Chelator komplexiert. Veranschaulichende Radionuklide sind unter anderem beispielsweise ⁸⁹Zr, ⁴⁴Sc, ¹¹¹In, ⁹⁰Y, ⁶⁶Ga, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ¹⁷⁷Lu, ^99mTc, ⁶¹Cu, ⁶²CU, ⁶⁴CU, ⁶⁷Cu, ¹⁴⁹Tb, ¹⁵²Tb, ¹⁵⁵Tb, ¹⁶¹Tb, ¹⁵³Gd, ¹⁵⁵Gd, ¹⁵⁷Gd, ²¹³ Bi, ²²⁵Ac, ²³⁰U, ²²³Ra, ¹⁶⁵Er und Fe. Nach einem Aspekt dieser Erfindung ist das Radionuklid ¹¹¹In, ⁹⁰Y, ⁶⁸Ga, ⁶⁴Cu, ¹⁵³Gd, ¹⁵⁵Gd, ²¹³Bi, ²²⁵Ac, Fe oder ¹⁷⁷Lu.
Wie bereits erwähnt, können Komplexe der Verbindungen nach Formel (la) oder (Ib) ein oder mehrere Radionuklide enthalten, die sich für die Verwendung als radiologische bildgebende Mittel oder als Therapeutika für die Behandlung von schnell proliferierenden Zellen, z. B. PSMA-exprimierenden Prostatakrebszellen, eignen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden sie als „Metallkomplexe“ oder „Radiopharmazeutika“ bezeichnet.
Bevorzugte Bildgebungsverfahren sind die Positronen-Emissions-Tomographie (PET) oder die Einzelphotonen-Emissions-Computertomographie (SPECT).
Dementsprechend wird in einer Ausführungsform eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, die einen Komplex einschließt, welcher ein Radionuklid und eine Verbindung der Formel (la) oder der Formel (Ib), ein Salz, Solvat, Stereoisomer oder Tautomer davon und einen pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff beinhaltet.
Gemäß einem anderen Aspekt wird eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, die für die In-vivo-Bildgebung und Strahlentherapie geeignet ist. Geeignete pharmazeutische Zusammensetzungen können ein radiologisches bildgebendes Mittel oder ein Radiotherapeutikum enthalten, das ein Radionuklid entweder als ein Element, d. h. radioaktives Jod, oder als einen radioaktiven Metallchelatkomplex der Verbindung der Formel (la) und/oder (Ib) in einer für die Bildgebung ausreichenden Menge, zusammen mit einer pharmazeutisch verträglichen radiologischen Trägersubstanz enthält. Die radiologische Trägersubstanz sollte zur Injektion oder Aspiration geeignet sein, wie z. B. Humanalbumin; wässrige Pufferlösungen, z. B. Tris(hydromethyl)aminomethan (und seine Salze), Phosphat, Citrat, Bicarbonat usw.; physiologische Kochsalzlösung mit sterilem Wasser; und ausgewogene ionische Lösungen, die Chlorid- und/oder Dicarbonatsalze oder normale Blutplasmakationen wie Calcium, Kalium, Natrium und Magnesium enthalten.
Die Konzentration des bildgebenden Mittels oder des Therapeutikums in der radiologischen Trägersubstanz sollte ausreichend sein, um eine zufriedenstellende Bildgebung zu ermöglichen. Wird beispielsweise eine wässrige Lösung verwendet, beträgt die Dosierung etwa 1,0 bis 100 Millicurie. Jedoch wird die tatsächliche Dosis, die einem Patienten zu bildgebenden oder therapeutischen Zwecken verabreicht wird, von dem behandelnden Arzt festgelegt. Das bildgebende Mittel oder das Therapeutikum sollte so verabreicht werden, dass es etwa 1 Stunde bis 10 Tage im Patienten verbleibt, wobei sowohl längere als auch kürzere Zeiträume akzeptabel sind. Daher können praktische Ampullen mit 1 bis 10 ml wässriger Lösung vorbereitet werden.
Die Bildgebung kann auf die übliche Art und Weise erfolgen, z. B. durch Injektion einer ausreichenden Menge des bildgebenden Mittels, um eine angemessene Bildgebung zu erhalten, und anschließendes Scannen mit einem geeigneten Bildgebungs- oder Scan-Gerät, z. B. einem Tomographen oder einer Gammakamera. In bestimmten Ausführungsformen umfasst ein Verfahren zur Bildgebung einer Region bei einem Patienten die folgenden Schritte: (i) Verabreichen einer diagnostisch wirksamen Menge einer mit einem Radionuklid komplexierten Verbindung an einen Patienten; Exponieren einer Region des Patienten vis-á-vis dem Scan-Gerät; und (ii) Erhalten einer Bildgebung der Region des Patienten. In bestimmten Ausführungsformen ist die abgebildete Region der Kopf oder der Brustkorb. In anderen Ausführungsformen steuern die Verbindungen und Komplexe der Formel I(a) und/oder (Ib) das PSMA-Protein an.
So wird in einigen Ausführungsformen ein Verfahren zur Bildgebung von Gewebe wie Milzgewebe, Nierengewebe oder PSMA-exprimierendem Tumorgewebe bereitgestellt, das das Inkontaktbringen des Gewebes mit einem Komplex umfasst, der synthetisiert wurde, indem ein Radionuklid mit einer Verbindung der Formel (la) und/oder Formel (Ib) in Kontakt gebracht wurde.
Die einem Patienten zu verabreichende Menge der Verbindung der vorliegenden Erfindung oder einer Formulierung, die einen Komplex aus einem Metall und einer Verbindung nach Formel (la) und/oder (Ib) oder deren Salz, Solvat, Stereoisomer oder Tautomer umfasst, hängt von mehreren physiologischen Faktoren ab, die vom Arzt routinemäßig verwendet werden, einschließlich der Art der durchzuführenden Bildgebung, des für die Bildgebung oder Therapie anvisierten Gewebes sowie des Körpergewichts und der Krankengeschichte des Patienten, der mit einem Radiopharmazeutikum abgebildet oder behandelt werden soll.
Dementsprechend stellt die Erfindung in einem anderen Aspekt ein Verfahren zur Behandlung eines Patienten bereit, bei dem einem Patienten eine therapeutisch wirksame Menge einer Verbindung der Formel (la) und/oder (Ib), die mit einem Radionuklid komplexiert ist, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz oder Solvat des Komplexes verabreicht wird, um einen Patienten zu behandeln, der an einer zellproliferativen Krankheit oder Störung leidet. Konkret handelt es sich bei der zellproliferativen Krankheit oder Störung, die unter Verwendung einer Verbindung, einer pharmazeutischen Zusammensetzung oder eines Radiopharmazeutikums gemäß dieser Erfindung behandelt oder abgebildet werden soll, um einen Krebs, z. B. Prostatakrebs und/oder Prostatakrebsmetastasen in z. B. Lunge, Leber, Niere, Knochen, Gehirn, Rückenmark, Blase usw.
Die Synthese der erfindungsgemäßen Verbindungen wird im Abschnitt „Beispiele“ ausführlich beschrieben. Ein Überblick über die Synthese ist beispielhaft in Schema 2 anhand von DOTA-konjugierten PSMA-Inhibitoren dargestellt. Der Fachmann wäre jedoch in der Lage, die Reaktionen zu modifizieren, z. B. durch Verwendung eines anderen Chelators. Dieses Schema ist also nicht so zu verstehen, dass die Verbindungen der vorliegenden Erfindung nur auf den DOTA-Chelator beschränkt wären.
Die synthetisierten Verbindungen werden mittels RP-HPLC, MS und/oder NMR chemisch charakterisiert.
Die neuartigen Chelator-konjugierten bildgebenden Mittel mit strukturellen Modifikationen in der Linker-Region haben verbesserte Tumortargeting-Eigenschaften und eine verbesserte Pharmakokinetik. Das Pharmakophor enthält drei Carboxylgruppen, die mit den jeweiligen Seitenketten von PSMA wechselwirken können, und einen Sauerstoff als Teil der Zinkkomplexierung im aktiven Zentrum. Neben diesen obligatorischen Wechselwirkungen konnten die Erfinder auch die lipophilen Wechselwirkungen in der Linker-Region optimieren.
Die präklinische Bewertung umfasst In-vitro-Assays (Affinität, Internalisierung) und In-vivo-Versuche (µPET-Screening und Organverteilung).
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind im Hinblick auf die Nierenclearance und die Anreicherung im Tumor besser als bekannte Referenzverbindungen. Die Bindungsaffinität von PSMA-Inhibitoren der vorliegenden Erfindung kann durch Linker-Modifikationen beeinflusst werden. Zwei zyklische Motive und mindestens ein aromatischer Teil in der Linker-Region der Substanz scheinen vorzuziehen zu sein und führten zu den hochaffinen Verbindungen MB4 und MB17. Ein sehr vielversprechender Wirkstoff ist in diesem Zusammenhang MB17.
Somit stellen die Verbindungen der vorliegenden Erfindung neuartige PSMA-Targeting-Sonden mit optimalen Eigenschaften dar, was auch durch die Organverteilung und die PET-Bildgebung bei Kleintieren bestätigt wurde. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung zeigen eine hohe PSMA-spezifische Aufnahme im Tumor. Darüber hinaus zeichnen sie sich durch eine frühe Anreicherung in der Blase und die maximale Aufnahme in der Niere aus. Im Hinblick auf den therapeutischen Einsatz ergeben sich daraus klare klinische Vorteile für die Verbindungen der vorliegenden Erfindung im Vergleich zu anderen PSMA-Inhibitoren. In den PET-Diagrammen zeigen die Verbindungen der vorliegenden Erfindung, insbesondere MB17, eine rasche Hintergrundausscheidung sowie eine erhebliche Verringerung der Anreicherung in der Niere nach 2 Stunden, während sie sich im PSMA-exprimierenden Tumor weiteranreichern und halten. Erste In-vivo-Behandlungen mit MB17 zeigten ebenfalls vielversprechende Ergebnisse (vgl. 17 und 18).
Die folgenden Ausführungsformen erläutern die Erfindung im Detail, sind aber nicht so auszulegen, dass sie die Erfindung in irgendeiner Weise auf die beispielhaften Ausführungsformen beschränken.
Beispiele
Beispiel 1: Synthese von DOTA-konjugierten Inhibitoren
Die DOTA-konjugierten PSMA-Inhibitoren werden mittels Festphasen-Peptidsynthese synthetisiert (vgl. Schema 2). In einem ersten Schritt wurde das Isocyanat des Glutamylteils in situ erzeugt, indem ein Gemisch aus 3 mmol Bis(tert-butyl)-L-glutamat-hydrochlorid und 3 ml N-Ethyldiisopropylamin (DIPEA) in 200 ml trockenem CH₂Cl₂ zu einer Lösung von 1 mmol Triphosgen in 10 ml trockenem CH₂Cl₂ bei 5 °C über 3 Stunden hinzugegeben wurde. Nach der Reaktion wurden 0,5 mmol eines auf Harz (2-Chlortritylharz) immobilisierten, mit ε-Allyloxycarbonyl geschützten Lysins hinzugegeben und 16 Stunden lang unter leichtem Agitieren umgesetzt. Das Harz wurde abfiltriert und die Allyloxy-Schutzgruppe wurde unter Verwendung von 50 mg Tetrakis-(triphenyl)palladium und 400 µl Morpholin in 4 ml CH₂Cl₂ über 2 Stunden entfernt.
Die anschließende Synthese des peptidomimetischen PSMA-Bindungsmotivs wurde nach dem Standard-Fmoc-Protokoll durchgeführt. Die anschließende Kopplung des Linkerteils erfolgte unter Verwendung von 2 mmol der entsprechenden Fmoc-geschützten Säure, 3,96 mmol HBTU und 2 mmol N-Ethyl-diisopropylamin in einem Endvolumen von 4 ml DMF. Nach einer 2-stündigen Aktivierung mit 3,95 Äquivalenten HBTU und DIPEA wurden 4 Äquivalente Tris(t-bu)-DOTA (CheMatech), bezogen auf die Harzbeladung, in einem Endvolumen von 3 ml DMF umgesetzt. Das Produkt wurde in einem 2-ml-Gemisch bestehend aus Trifluoressigsäure, Triisopropylsilan und Wasser (95:2,5:2,5) vom Harz abgespalten.
Der Chelator wurde ebenfalls unter Verwendung von HBTU-aktiviertem DOTA-NHS-Ester (CheMatech) oder DOTA-TFP-Ester konjugiert (Mier W., Hoffend J., Krämer S., Schuhmacher J., Hull W. E., Eisenhut M., Haberkorn U., Bioconjugate Chem. 2005, 16: 237 - 240).
Die Analyse der synthetisierten Moleküle erfolgte mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC; Chromolith RP-18e, 100x4,6 mm; Merck, Darmstadt, Deutschland) mit einem linearen A-B-Gradienten (0 % B bis 100 % B in 6 min) bei einer Durchflussrate von 4 ml/min (Analyse) bzw. 6 ml/min (Reinigung). Das Lösungsmittel A bestand aus 0,1 % wässrigem TFA und das Lösungsmittel B aus 0,1 % TFA in CH₃CN. Das HPLC-System (L6200 A; Merck-Hitachi, Darmstadt, Deutschland) war mit einem UV- und einem Gamma-Detektor (Bioscan; Washington, USA) ausgestattet. Die UV-Absorption wurde bei 214 nm gemessen. Die Massenspektrometrie wurde mit einem MALDI-MS Daltonics Microflex System (Bruker Daltonics, Bremen, Deutschland) durchgeführt.
Beispiel 2: Radioaktive Markierung
Typischerweise wurden 1,5 nmol einer synthetisierten Verbindung aus Beispiel 1 (aufgelöst in 0,1 M HEPES-Puffer, pH-Wert 7,5) in einem Volumen von 100 µl zu einem Gemisch aus 10 µl 2,1 M HEPES-Lösung und 40 µl [⁶⁸Ga]Ga³⁺-Eluat (40 MBq) hinzugegeben. Der pH-Wert der Markierungslösung wurde auf 4,5 eingestellt.
Die radioaktive Markierung der Verbindungen ergab eine radiochemische Ausbeute von > 97 % nach 15 Minuten bei 95 °C und wurde mittels RP-HPLC und TLC bestimmt. Die anschließende Reinigung erfolgte mit Sep-Pak C18-Kartuschen.
Beispiel 3: Synthese der Verbindungen MB4 und MB17
Das Isocyanat des Glutamylteils wurde in situ erzeugt, indem ein Gemisch aus 3 mmol Bis(tert-butyl)-L-glutamat-hydrochlorid und 1,5 ml N-Ethyldiisopropylamin (DIPEA) in 200 ml trockenem CH₂Cl₂ zu einer Lösung von 1 mmol Triphosgen in 10 ml trockenem CH₂Cl₂ bei 0 °C über 4 Stunden hinzugegeben wurde. Nach 1-stündigem Agitieren des Reaktionsgemischs bei 25 °C wurden 0,5 mmol des auf Harz (2-Chlortritylharz) immobilisierten, mit ε-Allyloxycarbonyl geschützten Lysins in 4 ml DCM hinzugegeben und 16 Stunden lang unter leichtem Agitieren umgesetzt. Das Harz wurde abfiltriert und die Allyloxy-Schutzgruppe wurde mit 30 mg Tetrakis-(triphenyl)palladium(0) und 400 µl Morpholin in 4 ml CH₂Cl₂ über 3 Stunden entfernt. Die anschließende Kopplung von 3-fach 4-(Fmoc-aminomethyl)benzoesäure (im Falle von MB4) bzw. Fmoc-3-(2-naphthyl)-L-alanin und trans-4-(Fmoc-Aminomethyl)cyclohexancarbonsäure (im Falle von MB17) erfolgte schrittweise unter Verwendung von 2 mmol der Fmoc-geschützten Säure, 1,96 mmol HBTU und 2 mmol N-Ethyldiisopropylamin in einem Endvolumen von 4 ml DMF. Nach einer 2-stündigen Aktivierung mit 3,95 Äquivalenten HBTU und DIPEA wurden 4 Äquivalente Tris(t-bu)-DOTA (CheMatech), bezogen auf die Harzbeladung, über 3 Stunden in einem Endvolumen von 3 ml DMF umgesetzt. Das Produkt wurde in einem 2-ml-Gemisch bestehend aus Trifluoressigsäure, Triisopropylsilan und Wasser (95:2,5:2,5) vom Harz abgespalten. Die Reinigung erfolgte mittels RP-HPLC, und das gereinigte Produkt wurde mittels analytischer RP-HPLC und MALDI-MS analysiert.
Für die Herstellung von MB17.D, dem Stereoisomer von MB17(L), basierte die Synthese auf Fmoc-3(2-naphthyl)-D-alanin. Sofern nicht anders angegeben, ist mit MB17 in dieser Beschreibung das L-Stereoisomer gemeint.
Beispiel 4: Kopplung an verschiedene Chelatoren
Die Chelatoren (DOTA, NOTA, NODAGA, DTPA, CHX-DTPA, PCTA, Do3A) wurden mittels Festphasensynthese an den MB17-Linker gekoppelt. Im Allgemeinen wurden 13 µmol Harz, das mit dem PSMA-Bindungsmotiv gekoppelt war, in einer Spritze mit Filter mit DCM gequollen. Nach 5-maligem Waschen des Harzes mit DMF wurde es 2 Mal für 5 Minuten mit 20 % Piperidin in DMF inkubiert, um den N-Terminus zu entschützen. Es folgte ein weiteres 5-maliges Waschen mit DMF.
Zwischen 1,5 und 4 Äquivalente des Chelators (je nach Chelator), 0,98 x n_Chelator HATU (falls erforderlich) und 10 Äquivalente von DIPEA wurden in 500 µl DMF aufgelöst, die Lösung wurde in die Spritze aufgezogen, die das Harz enthielt, und über Nacht inkubiert. Anschließend wurde das Harz je 5 Mal mit DMF, Methanol, DCM und Diethylether gewaschen und im Vakuum getrocknet.
Der Zustand der Reaktion wurde mithilfe von Testtrennungen geprüft. Dazu wurde eine kleine Menge Harz mit DCM in eine Filterspitze gewaschen und 100 µl einer Trennlösung, die 95 % TFA, 2,5 % Wasser und 2,5 % TIPS enthielt, hinzugegeben. Nach 30 Minuten Inkubation wurde die Lösung in eiskalten Diethylether pipettiert und zentrifugiert. Der Diethylether wurde dekantiert und das verbleibende Pellet wurde in 35 µl ACN:H₂O (1:1) aufgelöst und mittels HPLC (0 - 100 % ACN in Wasser innerhalb von 5 min) und LC/MS analysiert. Sofern das gewünschte Produkt erhalten wurde, wurde das komplette Peptid vom Harz getrennt. Das getrocknete Harz wurde 2 Stunden lang mit 500 µl der Trennlösung (95 % TFA, 2,5 % H₂O, 2,5 % TIPS) inkubiert. Die resultierende Lösung wurde mit eiskaltem Diethylether gemischt und zentrifugiert (4000 min^-1, 5 min). Der Überstand wurde verworfen, neuer Diethylether wurde hinzugegeben und das Gefäß wurde kräftig geschüttelt, um das Pellet zu resuspendieren. Die Lösung wurde erneut zentrifugiert (4000 min^-1, 5 min) und der entstandene Überstand verworfen. Das Pellet wurde dann im Vakuum getrocknet und schließlich in 1 ml ACN:H₂O (1:1) resuspendiert.
Die Reinigung erfolgte mittels präparativer HPLC, die Peaks wurden mittels analytischer HPLC (0 - 100 % ACN in Wasser innerhalb von 5 min) und LC/MS analysiert, und die Peaks, die das Produkt enthielten, wurden gepoolt und lyophilisiert.
Beispiel 5: Radioaktive Markierung
¹⁷⁷Lu-Markierung
¹⁷⁷Lu (ca. 100 MBq) wurde mit 200 µl 0,4 M Natriumacetatpuffer, der Chelex enthielt, gemischt (pH-Wert = 5). 10 µl einer 1-mM-Lösung der Verbindung in 10 % DMSO in Wasser, 2 µl einer gesättigten Lösung von Ascorbinsäure und 40 µl der ¹⁷⁷Lu enthaltenden Lösung wurden gemischt und 10 Minuten lang auf 95 °C erhitzt. Die Markierung wurde mittels Radio-HPLC (0 - 100 % ACN in Wasser innerhalb von 5 min, Monolith-Säule) überprüft.
⁶⁸Ga-Markierung
Für den PET-Scan wurde CHX-DTPA mit ⁶⁸Ga markiert. 1 ml ⁶⁸Ga wurde aus einem ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga-Generator mit 0,6 M HCl eluiert. 298 µl NaOAc-Puffer und 1 µl einer 10-mM-Lösung von CHX-DTPA in DMSO wurden hinzugefügt und 5 Minuten lang inkubiert. Anschließend wurde das Produkt mit einer SOLA-Kartusche gereinigt. Das Waschen erfolgte mit einer 0,9%igen NaCl-Lösung und zur Elution wurde Ethanol verwendet. Anschließend wurde das Ethanol verdampft und das verbleibende Produkt in 100 µl einer 0,9%igen NaCl-Lösung und 10 µl Phosphatpuffer aufgelöst.
Beispiel 6: Bestimmung des IC₅₀-Wertes
Eine Filterplatte MultiScreen_HTS-DV wurde bei Raumtemperatur mit 100 µl PBS mit 1 % BSA pro Vertiefung 30 Minuten lang inkubiert. Nach Entfernen der PBS/BSA-Lösung wurden 10⁵ LNCaP-Zellen in 50 µl Opti-MEM in jede Vertiefung gegeben. Verschiedene Konzentrationen der Verbindungen (mit resultierenden Konzentrationen von 0, 0,5, 1, 2,5, 5, 10, 25, 50, 100, 500, 1000 und 5000 nM in jeder Vertiefung) in 300 µl Opti-MEM wurden mit 3 µl einer 150-nM-Lösung von ¹²⁵I-markiertem MIP-1466 in Opti-MEM gemischt. 50 µl der resultierenden Lösung wurden in jede Vertiefung gegeben, jede Konzentration wurde in vierfacher Ausführung pipettiert. Jede Vertiefung enthielt nun den radioaktiv markierten Liganden in einer Konzentration von 0,75 nM und den kompetitiven, nicht markierten Liganden in der oben genannten Konzentration. Die Platte wurde dann 45 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Schüttelapparat inkubiert.
Nach der Inkubation wurden die Zellen 2 Mal mit 100 µl eiskalter PBS und 1 Mal mit 200 µl eiskalter PBS gewaschen. Schließlich wurden die Filter gesammelt und die verbleibende Radioaktivität mit einem Gamma-Zähler gemessen. Jedes Röhrchen wurde 5 Minuten lang gemessen.

Die mit dem Gamma-Zähler gemessenen Daten wurden mit GraphPad Prism ausgewertet, um eine Hemmkonzentration 50 (IC₅₀) gegen das radioaktiv markierte MIP-1095 zu erhalten.

Konjugat	IC₅₀ [nM]
MB17-DOTA	0,13 ± 0,08
MB17-NOTA	0,14 ± 0,08
MB17-DTPA	0,12 ± 0,05
MB17-CHX-DTPA	0,06 ± 0,04
MB17-PCTA	0,10 ± 0,06
MB17-DO3A	0,10 ± 0,05
MB17-NODAGA	0,09 ±0,08

Beispiel 7: µPET-Bildgebung mit CHX-DTPA-MB17
Vor der Injektion in die Maus wurde die Lösung, die den gereinigten ⁶⁸Ga-CHX-DTPA-gekoppelten PSMA-Inhibitor enthielt, sterilfiltriert. 100 µl dieser Lösung wurden in eine Spritze aufgezogen und dann in ein LNCaP-Xenotransplantat einer BALB/c-Nacktmaus injiziert, und zwar intravenös in die Schwanzvene. Der PET-Scan wurde 140 Minuten lang mit einem Siemens Inveon PET aufgezeichnet (15)
Beispiel 8: Bestimmung der kompetitiven Bindungsaffinität
Zum Vergleich der Reihe von neuartigen Verbindungen wurden die kompetitive Bindungsaffinität und die spezifische Internalisierung anhand der PSMA-exprimierenden Zelllinie LNCaP analysiert. Um die spezifische zelluläre Aufnahme zu bestimmen, wurden Zellen mit 2-(Phosphonomethyl)-pentandisäure (PMPA) blockiert. Die Wirksamkeit der Hemmung wurde auch mit dem enzymbasierten NAALADase-Assay untersucht.
Zellkultur
Für Bindungsstudien und In-vivo-Experimente wurden LNCaP-Zellen (metastatische Läsion des menschlichen Prostata-Adenokarzinoms, ATCC CRL-1740) in RPMI-Medium, das mit 10 % fötalem Kälberserum und Glutamax (PAA, Österreich) angereichert war, gezüchtet. Während der Zellkultur wurden Zellen bei 37 °C in einem Inkubator mit befeuchteter Luft, die mit 5 % CO₂ äquilibriert war, gezüchtet. Die Zellen wurden unter Verwendung von Trypsinethylendiamintetraessigsäure (Trypsin-EDTA; 0,25 % Trypsin, 0,02 % EDTA, alle von PAA, Österreich) entnommen und mit PBS gewaschen.
Zellbindung und Internalisierung
Der kompetitive Zellbindungs-Assay und die Internalisierungsexperimente wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt (Eder et al., 2012). Kurz gesagt, die entsprechenden Zellen (10⁵ pro Vertiefung) wurden mit dem Radioliganden (⁶⁸Ga-markierter [Glu-Harnstoff-Lys(Ahx)]2-HBED-CC (Schafer et al., 2012) in Anwesenheit von 12 verschiedenen Analytkonzentrationen (0 - 5000 nM, 100 µl/Vertiefung) inkubiert. Nach der Inkubation erfolgte das Waschen unter Verwendung eines Multiscreen-Vakuumverteilers (Millipore, Billerica, MA). Die zellgebundene Radioaktivität wurde mit einem Gamma-Zähler (Packard Cobra II, GMI, Minnesota, USA) gemessen. Die 50%ige Hemmkonzentration (IC50) wurde durch Anpassen der Daten mithilfe eines nichtlinearen Regressionsalgorithmus (GraphPad Software) berechnet. Die Experimente wurden dreimal durchgeführt.
Um die spezifische Aufnahme in Zellen und die Internalisierung zu bestimmen, wurden 10⁵ Zellen 24 Stunden vor der Inkubation in mit Poly-L-Lysin beschichtete Zellkulturplatten mit 24 Vertiefungen ausgesät. Nach dem Waschen wurden die Zellen mit 25 nM der radioaktiv markierten Verbindungen 45 Minuten lang bei 37 °C bzw. 4 °C inkubiert. Die spezifische Aufnahme in den Zellen wurde durch kompetitive Blockierung mit 2-(Phosphonomethyl)pentandisäure (500 µM Endkonzentration, PMPA, Axxora, Lörrach, Deutschland) bestimmt. Die zelluläre Aufnahme wurde durch 4-maliges Waschen mit 1 ml eiskalter PBS beendet. Anschließend wurden die Zellen 2 Mal mit 0,5 ml Glycin-HCl in PBS (50 mM, pH-Wert = 2,8) für 5 Minuten inkubiert, um die oberflächengebundene Fraktion zu entfernen. Die Zellen wurden mit 1 ml eiskalter PBS gewaschen und unter Verwendung von 0,3 N NaOH (0,5 ml) lysiert. Die oberflächengebundenen und die internalisierten Fraktionen wurden in einem Gamma-Zähler gemessen. Die Aufnahme in den Zellen wurde als Prozentsatz der an 10⁶ Zellen gebundenen ursprünglich hinzugegebenen Radioaktivität berechnet [% ID/10⁶ Zellen].
NAALADase-Assay
Rekombinantes humanes PSMA (rhPSMA, R&D Systems, Wiesbaden, Deutschland) wurde in Assay-Puffer (50 mM HEPES, 0,1 M NaCl, pH-Wert 7,5) auf 0,4 µg/ml verdünnt. Das Substrat Ac-Asp-Glu (Sigma, Taufkirchen, Deutschland, 40 µM) Endkonzentration) wurde mit natGamarkiertem Analyt in Konzentrationen im Bereich von 0,05 nM bis 1000 nM in einem Endvolumen von 125 µl Assay-Puffer gemischt. Die Gemische wurden mit 125 µl der rhPSMA-Lösung (0,4 µg/ml) kombiniert und eine Stunde lang bei 37 °C inkubiert. Die Reaktion wurde durch 5-minütiges Erhitzen auf 95 °C gestoppt. 250 µl einer 15-mM-Lösung von Orthophthaldialdehyd (Sigma, Taufkirchen, Deutschland) wurden zu allen Ampullen hinzugegeben und 10 Minuten lang bei Umgebungstemperatur inkubiert. Schließlich wurden 200 µl der Reaktionslösungen in eine schwarze F16 Maxisorp-Platte (Nunc, Langenselbold, Deutschland) geladen und bei Anregungs- und Emissionswellenlängen von 330 nm bzw. 450 nm mit einem Mikroplatten-Lesegerät (DTX-880, Beckman Coulter, Krefeld, Deutschland) abgelesen. Die Daten wurden mit einem Bindung-Gesamtbindung Regressionsalgorithmus von GraphPad (GraphPad Software, Kalifornien, USA) analysiert.
Biodistribution
7 bis 8 Wochen alten männlichen BALB/c nu/nu-Mäusen (Charles River Laboratories) wurden 5 × 10⁶ LNCaP-Zellen (in 50 % Matrigel; Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland) subkutan in den rechten Rumpf geimpft. Man ließ die Tumore auf eine Größe von etwa 1 cm³ heranwachsen. Die radioaktiv markierten Verbindungen wurden in die Schwanzvene injiziert (ca. 1 MBq pro Maus; 0,06 nmol). 1 Stunde nach der Injektion wurden die Tiere geopfert. Die fraglichen Organe wurden seziert, trocken getupft und gewogen. Die Radioaktivität wurde mit einem Gamma-Zähler gemessen und in % ID/g berechnet.
Mikro-PET

Für die mikro-PET-Studien wurden 10 - 25 MBq der radioaktiv markierten Verbindungen in einem Volumen von 0,15 ml (~ 0,5 nmol) über eine seitliche Schwanzvene in Mäuse mit LNCaP-Tumorxenotransplantaten injiziert. Die betäubten Tiere (2 % Sevofluran, Abbott, Wiesbaden, Deutschland) wurden in Bauchlage in den Kleintier-PET-Scanner Inveon (Siemens, Knoxville, Tenn, USA) gelegt, um dynamische mikro-PET-Scans und 20-minütige statische Scans durchzuführen; vgl. 1, 3, 5- 14 Tabelle A

Substanz	IC ₅₀ [nM]	Internalisierung [%IA/10⁶ Zellen]
MB2	2,75 ± 0,82	8,78 ± 3,96 für Ga-68
		5,22 ± 0,67 für Lu-177
MB3	10,51 ± 6,06	3,65 ± 1,32 für Lu-177
MB4	0,74 ± 0,50	14,18 ± 0,98 für Ga-68
		14,25 ± 4,61 für Lu-177
MB10	8,67 ± 1,58	6,96 ± 3,90 für Lu-177
MB17	0,13 ± 0,08	17,02 ± 4,36 für Ga-68
		17,51 ± 3,99 für Lu-177
MB17.D	12,41 ± 5,10	2,60 ± 0,14 für Lu-177
MB22	52,80	1,15 ± 0,19 für Lu-177

Substanz	IC ₅₀ [nM]	Internalisierung r%IA/10⁶ Zellen
MB24	3,33	7,26 ± 2,76 für Lu-177
MB25	6,64	3,91 ± 0,54 für Lu-177
MB31	91,80	0,53 ± 0,48 für Lu-177
MB33	59,33	1,96 ± 0,20 für Lu-177
MB35	26,18	0,97 ± 0,17 für Lu-177

Das vorliegende Beispiel zeigt, dass die Bindungsaffinität von PSMA-Inhibitoren durch Linker-Modifikationen beeinflusst werden kann. Zwei zyklische Motive und mindestens ein aromatischer Teil in der Linker-Region der Substanz scheinen vorzuziehen zu sein und führten zu den hochaffinen Verbindungen MB4 und MB17. Diese neuartigen Varianten zeigen eine niedrige nanomolare Affinität zur LNCap-Zelllinie und wurden spezifisch internalisiert bei 37 °C, bis zu 48 %ID/10⁶ Zellen. Frühere Studien haben gezeigt, dass neben der Bindungsaffinität auch die Internalisierungseigenschaften von PSMA-Targeting-Sonden von großer Bedeutung sind und hohe Internalisierungsraten für eine hohe In-vivo-Aufnahme und -Retention im Tumor entscheidend sind. Somit stellt MB17 eine neuartige PSMA-Targeting-Sonde mit optimalen Eigenschaften dar, was auch durch die Organverteilung und die PET-Bildgebung bei Kleintieren bestätigt wurde. MB17 zeigt eine hohe PSMA-spezifische Aufnahme im Tumor (2). Darüber hinaus zeigt die dynamische PET-Bildgebung von MB17 (2) eine frühzeitige Anreicherung in der Blase, und auch das Aufnahmemaximum in der Niere (höchster Punkt in der Zeit-Aktivitäts-Kurve) liegt bereits 15 Minuten nach Injektion des Radiotracers vor und nimmt schon nach 20 Minuten deutlich ab. Im Hinblick auf den therapeutischen Einsatz ergeben sich daraus klare klinische Vorteile für MB17 im Vergleich zu anderen PSMA-Inhibitoren. In den PET-Diagrammen (1) zeigt MB17 eine rasche Hintergrundausscheidung sowie eine erhebliche Verringerung der Anreicherung in der Niere nach 2 Stunden, während es sich im PSMA-exprimierenden Tumor weiter anreichert und hält.
Darüber hinaus zeigte die Organverteilung mit ¹⁷⁷Lu (4), dass die anfänglich hohe Aufnahme in der Niere nach 24 Stunden fast vollständig ausgewaschen ist (2,13 ± 1,36 % ID/g), während die Aufnahme im Tumor hoch blieb und sogar noch zunahm (10,58 ± 4,50 % ID/g). Andere Organe wie Leber (0,08 ±0,03 % ID/g), Lunge (0,11 ±0,13 % ID/g) und Milz (0,13 ±0,05 % ID/g) zeigten eine sehr geringe Aufnahme. Die günstige Pharmakokinetik führte zu extrem hohen Tumor-Hintergrund-Verhältnissen (Tumor/Blut: 1058; Tumor/Muskel: 529) nach 24 Stunden.
Tabelle A bestätigt eindeutig, dass die chemischen Modifikationen in der Linker-Region des Moleküls die biologischen Eigenschaften, z. B. die Affinität und die Intemalisierungseffizienz, beeinflussen. MB17 und MB4 zeigen die vielversprechendsten Bindungseigenschaften an Zellen.
Beispiel 9: Klinische Daten zu MB17
Für die PET/CT-Bildgebung wurde der mit Ga-68 markierte Radiotracer MB17 verwendet (vgl. 17).
Der für die radiopharmazeutische Herstellung verwendete ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga-Generator wurde von IDB-Holland bv (Baarle-Nassau, Niederlande) erworben. Die für die Radiosynthese verwendeten Einwegkassettenkits und Chemikalien einschließlich der Vorstufe in GMP-konformer Qualität wurden von ABX advanced biochemical compounds (Radeberg, Deutschland) bezogen. Ein Ultimate 3000 HPLC-System (Dionex) (Acetonitril (A), Wasser + 0,1 % TFA (B); Gradient: 0,5 min 95 % B, 10,0 min 80 % A, Durchflussrate: 2 ml/min), ausgestattet mit einer Chromolith Performance RP-18e-Säule (100 x 4,6 mm, Merck) und einem Nal-Radiodetektor (Raytest), wurde verwendet, um die radiochemische Reinheit zu bestimmen. Restlösungsmittel wurden mit einem Gaschromatographen der Serie 6850 (Agilent Technologies) bestimmt. Die Endotoxin-Tests wurden mit einem Endosafe®-PTS-Gerät (Charles River) durchgeführt.
2 µg MB17 wurden in 1,5 M Acetatpuffer, pH-Wert 4,5, (1 ml) und 1 M Ascorbinsäure (10 µl) aufgelöst und in das Reaktionsgefäß überführt. Der ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga-Generator wurde mit 10 ml 0,6 M HCl eluiert und das Eluat mit 9 ml Reinstwasser verdünnt. Das Gemisch wurde dann in eine Kationenaustauscher-Kartusche (Macherey-Nagel, PS-H+, Größe M) überführt und mit 5 M NaCl-Lösung (1,2 ml) in das vorgewärmte Reaktionsgefäß (100 °C) eluiert. Das Reaktionsgemisch wurde 10 Minuten lang erhitzt. Das rohe Reaktionsgemisch wurde dann aus dem Reaktionsgefäß entfernt und in eine vorkonditionierte (10 ml EtOH/10 ml Reinstwasser) C18-Kartusche (Waters, Sep-Pak light) überführt. 9 ml Reinstwasser wurden zur Spülung des Reaktionsgefäßes verwendet und in die C18-Kartusche überführt. Die C18-Kartusche wurde mit weiteren 5 ml Reinstwasser gewaschen. Das Endprodukt wurde mit 2 ml EtOH/H₂O (v:v 1:1) aus der C18-Kartusche eluiert, sterilfiltriert (Millipore, Cathivex-GV, 0,22 µm) und mit 10 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH-Wert 7,4, verdünnt (gemäß Eur. Ph. 8.0 (4005000)). Die ⁶⁸Ga-MB17-Komplexlösung wurde Patienten über einen intravenösen Bolus verabreicht.
Beispiel 10: Humantherapie mit ¹⁷⁷Lu-markiertem MB17
Für die Therapie wurde der PSMA-Ligand MB17 mit Lu-177 radioaktiv markiert. ¹⁷⁷LuCl₃ wurde von Perkin Elmer bezogen (4 GBq, NEZ307D, 0,04 M HCl). 80 nmol MB17 wurden in 400 µl Natriumacetatpuffer (0,4 M, pH-Wert 5) aufgelöst, mit weiterer Zugabe von 5 µl 20%iger Ascorbinsäure. Die Lösung wurde in das ¹⁷⁷LuCl₃ überführt und 10 Minuten lang bei 95 °C inkubiert. Schließlich wurden 2 ml 0,9 % NaCl hinzugegeben. Zur Qualitätskontrolle wurden ITLC und Radio-HPLC durchgeführt.
Das mit ¹⁷⁷Lu markierte MB17 wurde Patienten über einen intravenösen Bolus (5 ml, langsam innerhalb von 30 Sekunden) verabreicht. Die intravenöse Verabreichung wurde von einer Infusion von 0,9 % NaCl über 4,5 Stunden begleitet, die 0,5 Stunden vor der Injektion begann. Es wird auf 18 Bezug genommen.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

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Claims

Verbindung der Formel (la)
wobei n 0 oder 1 ist, m 1, 2, 3 oder 4 ist, Z -CO₂H, -SO₂H, -SO₃H, -SO₄H, -PO₂H, -PO₃H oder -PO₄H₂ ist, X Naphthyl, Phenyl, Biphenyl, Indolyl (=2,3-benzopyrrolyl) oder Benzothiazolyl ist, Y Aryl, Alkylaryl, Cyclopentyl, Cyclohexyl oder Cycloheptyl ist und der Chelator Folgendes ist: 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-N,N',N'',N'''-tetraessigsäure (DOTA), N,N''-Bis[2-hydroxy-5-(carboxyethyl)benzyl]ethylendiamin-N,N''-diessigsäure (HBED-CC), 1,4,7-Triazacyclononan-1,4,7-triessigsäure NOTA), 2-(4,7-Bis(carboxymethyl)-1,4,7-triazonan-1-yl)pentandisäure (NODAGA), 2-(4,7,10- Tris(carboxymethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan-1-yl)pentandisäure (DOTAGA), 1,4,7-Triazacyclononan-phosphinsäure (TRAP), 1,4,7-Triazacyclononan-1-[methyl(2-carboxyethyl)phosphinsäure]-4,7-bis[methyl(2-hydroxymethyl)phosphinsäure] (NOPO), 3,6,9,15-Tetraazabicyclo[9.3.1.]pentadeca-1(15),11,13-trien-3,6,9-triessigsäure (PCTA) oder Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon oder ein Solvat davon oder ein Solvat des Salzes davon.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei X Naphthyl ist, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon oder ein Solvat davon oder ein Solvat des Salzes davon.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei Y Cyclohexyl ist, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon oder ein Solvat davon oder ein Solvat des Salzes davon.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei n 1 ist, oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon oder ein Solvat davon oder ein Solvat des Salzes davon.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Verbindung die folgende Struktur hat:
oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon oder ein Solvat davon oder ein Solvat des Salzes davon.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Verbindung die folgende Struktur hat:
oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon oder ein Solvat davon oder ein Solvat des Salzes davon.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Verbindung die folgende Struktur hat:
Verbindung oder pharmazeutisch verträgliches Salz davon oder Solvat davon oder Solvat des Salzes davon nach einem der vorhergehenden Ansprüche und ein Radionuklid, wobei das Radionuklid mit dem Chelator komplexiert ist.
Verbindung oder pharmazeutisch verträgliches Salz davon oder Solvat davon oder Solvat des Salzes davon nach Anspruch 8, wobei das Radionuklid ausgewählt ist aus ⁸⁹Zr, ⁴⁴Sc, ¹¹¹In, ⁹⁰Y, ^ssGa, ⁶⁷ Ga, ⁶⁸Ga, ¹⁷⁷Lu, ^99mTc, ⁶¹Cu, ⁶²Cu, ⁶⁴CU, ⁶⁷Cu, ¹⁴⁹Tb, ¹⁵²Tb, ¹⁵⁵Tb, ¹⁶¹Tb, ¹⁵³Gd, ¹⁵⁵Gd, ¹⁵⁷Gd, ²¹³Bi, ²²⁵Ac, ²³⁰U, ²²³Ra, ¹⁶⁵Er oder Fe.
Verbindung oder pharmazeutisch verträgliches Salz davon oder Solvat davon oder Solvat des Salzes davon nach Anspruch 9, wobei das Radionuklid ausgewählt ist aus ¹¹¹In, ⁹⁰Y, ⁶⁸Ga, ⁶⁴CU, ¹⁵³Gd, ¹⁵⁵Gd, ²¹³Bi, ²²⁵Ac, Fe oder ¹⁷⁷Lu.
Verbindung oder pharmazeutisch verträgliches Salz davon oder Solvat davon oder Solvat des Salzes davon nach Anspruch 10, wobei das Radionuklid ¹⁷⁷Lu ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend die Verbindung oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon oder ein Solvat davon oder ein Solvat des Salzes davon oder den Metallkomplex nach einem der vorhergehenden Ansprüche und einen pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff.
Verbindung oder pharmazeutisch verträgliches Salz davon oder Solvat davon oder Solvat des Salzes davon nach einem der Ansprüche 1 bis 11 oder die pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 12 zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung von Prostatakrebs und/oder Metastasen davon.
Verbindung oder pharmazeutisch verträgliches Salz davon oder Solvat davon oder Solvat des Salzes davon nach einem der Ansprüche 1 bis 11 oder die pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 12 zur Verwendung in einem Verfahren zur Bildgebung eines Patienten.
Verbindung oder pharmazeutisch verträgliches Salz davon oder Solvat davon oder Solvat des Salzes davon nach einem der Ansprüche 1 bis 11 oder die pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 12 zur Verwendung in einem Verfahren zur Diagnose von Prostatakrebs und/oder Metastasen davon.