JP2010509570A - エクスビボフローサイトメトリーの方法および装置 - Google Patents

Abstract

本発明は、病原性細胞によって仲介される病状を診断する方法に関する。本方法は、一般式（Ｉ）Ａ_ｂ−Ｘ（基Ａ_ｂは病原性細胞に結合するリガンドを含み、基Ｘは造影剤を含む）の結合体または複合体を含む組成物を、エクスビボ患者サンプルと混合する工程、および、フローサイトメトリーを使用して、リガンドに対する受容体を発現する病原性細胞を検出する工程を含む。
【選択図】図１９

Description

本発明は、患者体液のエクスビボサンプル中で、体液中に存在する病原性細胞集団を検出および／または定量するための光学的方法、ならびにそのための装置に関する。より詳細には、本発明は、細胞の検出および／または定量のための光学的方法における病原性細胞に結合するリガンド−造影剤結合体の使用、ならびにこの方法で使用される装置に関する。

血流などの体液中での病原性細胞の存在、または他の部位からの血流への病原性細胞の伝播は、病気の患者が生存するかどうかを決定する重要な要素の１つである。例えば、原発性新生物からの遠隔臓器への悪性細胞の伝播は、癌患者が生存するかどうかの決定において重要な要素である。疾患の最も初期のステージで、循環病原性細胞（転移細胞などの）および血管中の他のタイプの病原性細胞を、検出および／または定量化できる、高感度の方法が開発されなくてはならない。この目的の達成には、病原性細胞に対する選択性を備えた高度に感度がよく生体適合性のあるプローブが必要とされる。

現在のところ、ＣＴ、ＭＲＩ、組織／センチネルリンパ節生検および血清癌マーカー分析は、癌患者においてある程度のレベルの残存病変を検出することができる。しかし、癌の予後および転移と最も感度よく相関するのは、循環している腫瘍細胞の存在（ＣＴＣ）である。さらに、高特異性および低バックグラウンドの測定をもたらす蛍光プローブを用いる、標的細胞集団の検出および定量のために使用される方法として、フローサイトメトリーがある。フローサイトメトリー分析は、患者サンプルを取得することなくインビボで、または患者から取得した患者体液のサンプルを使用してエクスビボで実行することができる。しかしながら、以前の従来のエクスビボ技術には多くの欠陥がある。例えば、この方法は、典型的には方法が低感度であるために、多量のサンプルの使用を必要とする。

最近になって、インビボでフローする腫瘍細胞のリアルタイム検出のための、共焦点顕微鏡を利用する概念的インビボフローサイトメトリー技術が記述されている（Georgakoudi, et al. (2004) Cancer Res., 64, 5044-5047; Novak, et al. (2004) Optics Lett., 29, 77-79）。

しかしながら、患者の体液のエクスビボサンプル中での病原性細胞の検出および定量化の実行のために必要とされる感受性および生体適合性を備えた利用可能な方法はない。本出願において、出願人は、患者体液のエクスビボサンプルを使用し、フローサイトメトリーに基づいた技術を使用する、患者体液中に見出される病原性細胞の検出および定量化について記述する。

１つの実施形態において、病原性細胞によって仲介される病状の診断のための方法が記述される。この方法は、一般式 Ａ_ｂ−Ｘ（基Ａ_ｂは病原性細胞に結合するリガンドを含み、基Ｘは造影剤を含む）の結合体または複合体を含む組成物を、エクスビボ患者サンプルと混合する工程、および、フローサイトメトリーを使用して、リガンドに対する受容体を発現する病原性細胞を検出する工程を含む。

他の実施形態において、エクスビボの患者サンプル中の癌細胞の検出によって、癌の予後を決定するための方法が記述される。この方法は、フローサイトメトリーによってエクスビボの患者サンプル中の癌細胞を検出する工程、および癌の予後を決定する工程を含む。

他の実施形態において、病原性細胞を定量するための方法が記述される。この方法は、一般式Ａ_ｂ−Ｘ（基Ａ_ｂは病原性細胞に結合するリガンドを含み、基Ｘは造影剤を含む）の結合体または複合体を含む組成物を、エクスビボの患者サンプルと混合する工程、および、フローサイトメトリーを使用して、エクスビボの患者サンプル中の病原性細胞を定量する工程を含む。

〔関連出願の相互参照〕
本出願は、２００６年１１月３日に出願された米国仮特許出願第６０／８５６，６６７号および２００７年８月１７日に出願された米国仮特許出願第６０／９５６，５６２号に対する優先権を主張し、これらの開示全体は参照することにより本明細書に組み入れられる。

抗フォレート受容体ポリクローナル抗体と比較した、フォレート結合体による、フォレート受容体陽性の腫瘍細胞の標識を示した図である。 フォレート−アレクサフルオル（AlexaFluor）４８８による腫瘍細胞の標識前に行った、全血の赤血球濃縮画分から腫瘍細胞濃縮画分を分離する方法の比較を示した図である。 全血検体からの循環腫瘍細胞の濃縮のための方法を示す概略図である。 卵巣癌患者からの血液サンプル中の循環腫瘍細胞の検出および定量化を示した図である。バーは、２つ（患者１および２）または３つ（患者３〜６）の独立した測定からの平均値を表わす。 エクスビボフローサイトメトリーを使用する、卵巣癌患者の血液中の循環腫瘍細胞の検出および定量化を示した図である。 パネルＡおよびＢは、卵巣癌患者からの末梢血中の循環腫瘍細胞の共焦点画像を示した図である。赤色（ローダミン−Ｘ標識抗サイトケラチン抗体）蛍光との緑色（フォレート−アレクサフルオル ４８８）の重複は、黄色蛍光として示される（スケールバー、１０μｍ）。 健康なドナーの血液中の循環ＦＲ発現細胞の定量化を示した図である。 本明細書において記述される方法を行うための装置を示した図である。 ＦＡＣＳを使用する蛍光団依存解析を示した図である（２原子スペーサー）。図９（ａ）は、ＬＮＣａＰ細胞単独（陰性対照）のヒストグラム（ｉ）およびドットプロット（ｉｉ）を示す。図９（ｂ）は、ＰＣ０１ＳＫ５９と共にインキュベートしたＬＮＣａＰ細胞のヒストグラム（ｉ）およびドットプロット（ｉｉ）を示す。 ＦＡＣＳを使用する蛍光団依存解析を示した図である。図１０（ａ）は、ＬＮＣａＰ細胞単独（陰性対照）のヒストグラム（ｉ）およびドットプロット（ｉｉ）を示す。図１０（ｂ）は、ＰＣ０１ＳＫ５８と共にインキュベートしたＬＮＣａＰ細胞のヒストグラム（ｉ）およびドットプロット（ｉｉ）を示す。 ＦＡＣＳを使用するアレクサフルオル６４７−依存解析を示した図である（２４原子スペーサー）。図１１（ａ）は、ＬＮＣａＰ細胞単独（陰性対照）のヒストグラム（ｉ）およびドットプロット（ｉｉ）を示す。図１１（ｂ）は、ＰＣ０１ＳＫ５１と共にインキュベートしたＬＮＣａＰ細胞のヒストグラム（ｉ）およびドットプロット（ｉｉ）を示す。 ＦＡＣＳを使用するオレゴングリーン４８８依存解析を示した図である（２７原子スペーサー）。図１２（ａ）は、ＬＮＣａＰ細胞単独（陰性対照）のヒストグラム（ｉ）およびドット・プロット（ｉｉ）を示す。図１２（ｂ）は、ＰＣ０１ＳＫ５６と共にインキュベートしたＬＮＣａＰ細胞のヒストグラム（ｉ）およびドットプロット（ｉｉ）を示す。 ＦＡＣＳを使用するボディピー（BODIPY）５０５依存解析を示た図である（２４原子スペーサー）。図１３（ａ）は、ＬＮＣａＰ細胞単独（陰性対照）のヒストグラム（ｉ）およびドットプロット（ｉｉ）を示す。図１３（ｂ）は、ＰＣ０１ＳＫ４５と共にインキュベートしたＬＮＣａＰ細胞のヒストグラム（ｉ）およびドットプロット（ｉｉ）を示す。 ＦＡＣＳを使用するオレゴングリーン４８８依存解析を示した図である（２４原子スペーサー）。図１４（ａ）は、ＬＮＣａＰ細胞単独（陰性対照）のヒストグラム（ｉ）およびドットプロット（ｉｉ）を示す。図１４（ｂ）は、ＰＣ０１ＳＫ４９と共にインキュベートしたＬＮＣａＰ細胞のヒストグラム（ｉ）およびドットプロット（ｉｉ）を示す。 共焦点顕微鏡を使用する蛍光標識解析を示した図である。図１５（ａ）は、共焦点顕微鏡を使用するＦＩＴＣ４８８標識解析を示す。ＰＣ０１ＳＫ５８と共にインキュベートしたＬＮＣａＰ細胞のイメージングを、共焦点顕微鏡（ｉ）および位相差顕微鏡（ｉｉ）によって示す。ＰＭＰＡと共に、次にＰＣ０１ＳＫ５８と共にインキュベートしたＬＮＣａＰ細胞を、共焦点顕微鏡（ｉｉｉ）によって示す。図１５（ｂ）は、共焦点顕微鏡を使用するオレゴングリーン４８８標識解析を示す。ＰＣ０１ＳＫ４９と共にインキュベートしたＬＮＣａＰ細胞のイメージングを、共焦点顕微鏡（ｉ）および位相差顕微鏡（ｉｉ）によって示す。ＰＭＰＡと共に、次にＰＣ０１ＳＫ４９と共にインキュベートしたＬＮＣａＰ細胞を、共焦点顕微鏡（ｉｉｉ）によって示す。図１５（ｃ）は、共焦点顕微鏡を使用するアレクサフルオル６４７マレイミド標識解析を示す。ＰＣ０１ＳＫ５１と共にインキュベートしたＬＮＣａＰ細胞のイメージングを、共焦点顕微鏡（ｉ）および顕微鏡（ｉｉ）によって示す。ＰＭＰＡと共に、次にＰＣ０１ＳＫ５１と共にインキュベートしたＬＮＣａＰ細胞を、共焦点顕微鏡（ｉｉｉ）によって示す。 ＦＡＣＳを使用する血液スパイキング解析を示した図である。図１６（ａ）は２原子スペーサーを示し、（ｉ）ＰＣ０１ＳＫ６４（陰性対照）により標識した血液サンプルのドットプロット図表を示し、（ｉｉ）最初にＤＩＤにより、次にＰＣ０１ＳＫ６３により標識したＬＮＣａＰ細胞のドットプロット図表を示す。図１６（ｂ）は７原子スペーサーを示し、（ｉ）ＰＣ０１ＳＫ６４（陰性対照）により標識した血液サンプルのドットプロット図表を示し、（ｉｉ）最初にＤＩＤにより、次にＰＣ０１ＳＫ６３により標識したＬＮＣａＰ細胞のドットプロット図表を示す。図１６（ｃ）は１６原子スペーサーを示し、（ｉ）はＰＣ０１ＳＫ６４（陰性対照）により標識した血液サンプルのドットプロット図表を示し、（ｉｉ）は最初にＤＩＤにより、次にＰＣ０１ＳＫ６４により標識したＬＮＣａＰ細胞のドットプロット図表を示す。図１６（ｄ）は２４原子スペーサーを示し、（ｉ）はＰＣ０１ＳＫ６４（陰性対照）により標識した血液サンプルのドットプロット図表を示し、（ｉｉ）は最初にＤＩＤにより、次にＰＣ０１ＳＫ５８により標識したＬＮＣａＰ細胞のドットプロット図表を示す。 ＦＡＣＳを使用する血液スパイキング解析の要約（蛍光・対・スペーサー長（原子）のプロット）を示す。 前立腺癌患者サンプル中のＣＴＣの検出を示した図である。図１８（ａ）は、ＣＤ４５−アレクサフルオル（Alexa Fluor）により標識し、次にＰＣ０１ＳＫ６４（１６原子スペーサー）と共にインキュベートした健康なドナー血液サンプルのドットプロットを示す。パネル（Ｉ）は健康な男性ドナー１（ＳＫ）についてのすべての領域中の細胞を示し、パネル（ＩＩ）は健康な男性ドナー１（ＳＫ）についての領域２中の細胞を示し、パネル（ＩＩＩ）は女性ドナー３（ＥＶ）についての領域２中の細胞を示し、パネル（ＩＶ）は健康な男性ドナー２（ＪＧ）についての領域２中の細胞を示す。図１８（ｂ）は、ＣＤ４５−アレクサフルオルにより標識し、次にＰＣ０１ＳＫ６４（１６原子スペーサー）と共にインキュベートした前立腺癌患者血液サンプルのドットプロットを示す。パネル（Ｉ）は健康な男性ドナー１（ＳＫ）についての領域２中の細胞を示し、パネル（ＩＩ）は患者１（ＪＬＡ−０４９−１）についての領域２中の細胞を示し、パネル（ＩＩＩ）は患者２（ＬＪＫ−６６５−１）についての領域２中の細胞を示し、パネル（ＩＶ）は患者３（ＲＲＬ−３３０−１）についての領域２中の細胞を示す。 ＣＴＣ解析の要約（循環腫瘍細胞／ｍＬ・対・被験者識別番号のプロット）を示した図である。

病原性細胞によって仲介される（例えば、引き起こされるか、または増大される）病状の診断のための方法が提供される。１つの実施形態において、病原性細胞は癌細胞であってもよい。他の実施形態において、病原性細胞は転移性癌細胞であってもよい。１つの態様において、病状は、一般式Ａ_ｂ−Ｘ（基Ａ_ｂは病原性細胞に結合するリガンドを含み、基Ｘは造影剤を含む）の結合体または複合体を含む組成物を、患者体液のエクスビボサンプルと混合することによって診断することができる。他の例示的な実施形態において、本方法は、病原性細胞の存在を定量および／または検出する工程をさらに含む。さらに他の実施形態において、多光子フローサイトメトリーを、病原性細胞を定量および／または検出するために使用することができる。本明細書において使用されるように、病原性細胞によって仲介される疾患に関する「によって仲介される」は、によって引き起こされること、または、によって増大されること、を意味する。

１つの実施形態において、造影剤（例えばレポーター分子）は、例えば、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、フィコエリトリン、オレゴングリーン、アレクサフルオル４８８（モレキュラー・プローブ（Molecular Probes）社、ユージーン、オレゴン）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ７、および同種のものなどの発色団を含むことができる。

他の態様において、造影剤は、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５１４および同種のものを含むがこれらに限定されないオレゴングリーン蛍光剤、アレクサフルオル４８８、アレクサフルオル６４７および同種のものを含むがこれらに限定されないアレクサフルオル蛍光剤、フルオレセインおよび関連する類縁体、テトラメチルローダミンおよび同種のものを含むがこれらに限定されないローダミン蛍光剤、ダイライト（DyLight）６８０および同種のものを含むがこれらに限定されないダイライト蛍光剤、ＣＷ ８００、テキサスレッド、フィコエリトリン、ならびに他のものから選択される蛍光剤である。例示的な蛍光剤は以下の例示的な一般的な構造で示される。

（式中、Ｘは酸素、窒素または硫黄であり、ＸはリンカーＬに結合し；ＹはＯＲ^ａ、ＮＲ^ａ _２またはＮＲ^ａ _３ ^＋であり；Ｙ’はＯ、ＮＲ^ａまたはＮＲ^ａ _２ ^＋であり；ここで各Ｒは、Ｈ、フルオロ、スルホン酸、スルホネートおよびその塩、ならびに同種のものから各場合で独立して選択され；Ｒ^ａは水素またはアルキルである）および、他の実施形態において、

（式中、Ｘは酸素、窒素または硫黄であり、ＸはリンカーＬに結合し；各Ｒは、Ｈ、アルキル、ヘテロアルキルおよび同種のものから各場合で独立して選択され；ｎは０〜約４の整数である）。

診断は典型的には治療の前に行なわれる。しかしながら、本明細書において記述される診断法において、用語「診断」は、病状の進行を決定するために、治療の前、治療の間または治療の後の病状のモニタリングもまた意味することができる。治療法の有効性を決定するか、または疾患の今後の症状の出現を予測するために、治療の前、治療の間、もしくは治療の後、またはそれらの組合せで、モニタリングを行なうことができる。

本明細書において開示された方法は、ヒト臨床医学および獣医学の適用の両方のために使用することができる。したがって、病状があり診断を必要とする患者は、ヒトであってもよく、または獣医学の適用の場合においては、実験動物、農耕動物、家畜または野生動物であってもよい。

様々な例示的な実施形態において、循環病原性細胞を検出するおよび／または定量化するために使用することができる体液は、尿、鼻分泌物、鼻洗液、気管支洗浄物、気管支洗液、髄液、喀痰、胃液分泌物、生殖器官分泌（例えば精液）、リンパ液、粘液および血液を含むが、これらに限定されない。これらのサンプルは本明細書において記述されるように検査するために調製できる。

様々な実施形態において、病原性細胞は本明細書において記述される方法を使用して定量できる。様々な態様において、病原性細胞は、１００μｌ、２００μｌ、３００μｌ、４００μｌ、５００μｌ、１ｍｌ、２ｍｌ、３ｍｌ、４ｍｌ、５ｍｌ、６ｍｌまたは８ｍｌの患者の体液で定量できる。様々な例示的な実施形態において、病原性細胞は、患者サンプルあたり約１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜５０、１〜１００、１〜２００または１〜５００の病原性細胞、または患者サンプルあたり約０〜１０、０〜１５、０〜２０、０〜５０、０〜１００、０〜２００または０〜５００の病原性細胞を含む値のこれらの容量のいずれかで定量することができる。

一般式Ａｂ−Ｘのリガンド結合体において、基Ａｂは、結合体が病状を診断するために使用されるときに病原性細胞に結合するリガンドである。病原性細胞は、転移癌細胞などの循環病原性細胞、および疾患の様々なステージの患者の体液中で見出すことができる他のタイプの癌細胞であってもよい。幅広い数のリガンドを用いることができる。

１つの実施形態において、リガンド結合体は病原性細胞を検出するために使用することができ、リガンドは、葉酸、葉酸類縁体、または他のフォレート受容体結合分子であってもよい。使用できるフォレートの類縁体は、フォリン酸、プテロポリグルタミン酸（pteropolyglutamic acid）、およびテトラヒドロプテリンなどのフォレート受容体結合プテリジン、ジヒドロフォレート、テトラヒドロフォレート、ならびにそれらのデアザ類縁体およびジデアザ類縁体を含む。用語「デアザ」類縁体および「ジデアザ」類縁体は、天然に存在する葉酸構造中の１つまたは２つの窒素原子を炭素原子で置換した、当技術分野で認められている類縁体を指す。例えば、デアザ類縁体は、１−デアザ類縁体、３−デアザ類縁体、５−デアザ類縁体、８−デアザ類縁体および１０−デアザ類縁体を含む。ジデアザ類縁体は、例えば、１，５ジデアザ類縁体、５，１０−ジデアザ類縁体、８，１０−ジデアザ類縁体および５，８−ジデアザ類縁体を含む。前述の葉酸類縁体は、フォレート受容体に結合するそれらの能力を反映して、慣習的に「フォレート」と呼ばれる。他のフォレート受容体結合類縁体は、アミノプテリン、アメトプテリン（メトトレキサート）、Ｎ１０−メチルフォレート、２−デアミノ−ヒドロキシフォレート、デアザ類縁体（１−デアザメトプテリンまたは３−デアザメトプテリンなど）および３’，５’−ジクロロ−４−アミノ−４−デオキシ−Ｎ１０−メチルプテロイルグルタミン酸（ジクロロメトトレキセート）を含む。

１つの実施形態において、リガンド結合体は癌細胞を検出するために使用することができ、リガンドは前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）標的リガンドまたは他の前立腺癌特異的結合分子であってもよい。他の例示的な実施形態において、ＰＳＭＡのＮ−アセチルα−結合酸性ジペプチダーゼ（ＮＡＡＬＡＤＡＳＥ）活性のインヒビターは、Tang et al.、「Ｎ−アセチルα−結合酸性ジペプチダーゼに基づく前立腺標的リガンド（Prostate-targeting ligands based on N-acetylated a-linked acidic dipeptidase)」、Biochemical and Biophysical Research Communications, 307: 8-14 (2003)（参照することにより本明細書に組み入れられる）において記載されるように、前立腺癌細胞を標的として検出するために使用することができる。

例えば、リガンドは、リンカーが少なくとも７原子、少なくとも１４原子、少なくとも７原子〜約２０原子、または約１４原子〜約２４原子の直鎖を含むリンカーを介して造影剤に結合されるＰＳＭＡのリガンドであってもよい。１つの実施形態において、リガンドは、

からなる群から選択された化合物である。

他の実施形態において、リガンドは式

（式中、Ｒ^１およびＲ^２は、各々、水素、任意に置換されたカルボン酸（チオ酢酸など）、チオールプロピオン酸および同種のもの；マロン酸、コハク酸、グルタミン酸、アジピン酸および同種のもの、ならびに他のものから選択される）の化合物であってもよい。他のＰＳＭＡリガンドは、「ＰＳＭＡ結合リガンド−リンカー結合体および使用法（PSMA Binding Ligand-Linker Conjugates and Methods for Using）」というタイトルの仮特許出願第６０／９５６，４８９号（その全体を参照することにより本明細書に組み入れられる）中に記載される。

他の実施形態において、他のビタミンを、病原性細胞の検出におけるリガンドとして結合体を使用するために用いることができる。本明細書において記述される方法に従って使用することができるビタミンは、ナイアシン、パントテン酸、葉酸、リボフラビン、チアミン、ビオチン、ビタミンＢ_１２、ビタミンＡ、Ｄ、ＥおよびＫ、他の関連したビタミン分子、それらの類縁体および誘導体、ならびにそれらの組合せを含む。他の実施形態において、リガンドは、癌細胞上で発現または過剰発現される受容体に結合する任意のリガンドであってもよい。

様々な例示的な実施形態において、病原性細胞上でリガンドに対する受容体が優先的に発現し、リガンド結合のために接近しやすいことに起因して、リガンドは、患者における病原性細胞の集団に特異的に結合可能であってもよい。許容できるリガンドは、ライブラリースクリーニングから同定されるペプチドリガンド、腫瘍特異的ペプチド、腫瘍特異的アプタマー、腫瘍特異的炭水化物、組合わせライブラリーに由来する低分子有機分子、増殖因子（ＥＧＦ、ＦＧＦ、インスリンおよびインスリン様増殖因子および相同ポリペプチド、ソマトスタチンおよびその類縁体など）、および癌細胞の表面上で優先的に発現される受容体に特異的に結合する他の分子、またはこれらの分子の任意のフラグメントを含む。

基Ａｂが、葉酸、葉酸類縁体または他の葉酸受容体結合リガンドである、病原性細胞を検出するために使用される結合体について、これらの結合体は米国特許第５，６８８，４８８号（その明細書は参照することにより本明細書に組み入れられる）中に詳細に記載される。その特許は、関連する米国特許第５，４１６，０１６号および第５，１０８，９２１号（各々は参照することにより本明細書に組み入れられる）と共に、本明細書において記述される方法に従う有用な結合体の調製のための方法および実施例について記述する。本リガンド−造影剤結合体は、それらの以前の特許中に記載される一般的なプロトコールに従って、および本明細書において記述されたプロトコールにより、調製および使用することができる。

本明細書において記述される方法で使用される結合体は、複合体形成のための任意の当技術分野で認められている方法を使用することによって、結合体化することができる。これは、リガンドの造影剤に対する、直接的な、または、二価リンカーなどの結合基を介する間接的な、共有結合、イオン結合または水素結合を含んでもよい。結合体は典型的には、複合体のそれぞれの構成分子上の酸性基、アルデヒド基、ヒドロキシ基、アミノ基またはヒドラゾ基との間のアミド結合、エステル結合またはイミノ結合の形成を介する造影剤へのリガンドの共有結合によって、または例えばジスルフィド結合の形成によって、形成される。

病原性細胞が検出される場合の本発明の１つの実施形態において、リガンドは、葉酸、葉酸の類縁体または他のフォレート受容体結合分子であり、フォレートリガンドは、トリフルオロ酢酸無水物を利用して、プテロイルアジド中間体を経由する葉酸のγ−エステルを調製する手順によって造影剤と結合体化される。この手順は、フォレートのグルタミン酸基のγ−カルボキシ基を介してのみ造影剤と結合体化されるフォレートリガンドの合成をもたらす。あるいは、葉酸類縁体は、グルタミン酸基のα−カルボキシ部分またはαおよびγカルボン酸構成要素の両方を介してカップリングすることができる。

例示的に、様々なフォレートの類縁体および誘導体は、フォレートリンカー結合体を形成して、フォレート自体を置換できる。それらの類縁体および誘導体、またはその保護された型は、本明細書において記述される合成プロトコール中に含まれうる。例えば、フォレートの類縁体および誘導体は、Westerhof, et al., Mol. Pharm. 48: 459-471 (1995)（参照することによって本明細書に組み入れる）中に記載されるものなど、当技術分野において周知である。

加えて、結合体のリンカー部の構造修飾は、本明細書において検討される。例えば、多数のアミノ酸置換は、従来の合成方法から利用可能なアミノ酸に加えて、天然に存在するアミノ酸を含むがこれらに限定されずに、結合体のリンカー部に対して行なってもよい。１つの態様において、ベータ、ガンマ、およびより長鎖のアミノ酸を、１つまたは複数のアルファアミノ酸の代わりに使用できる。他の態様において、かかる分子中で見出されるキラル中心の立体化学は、全体の分子の、または存在するキラル中心のサブセットの混合物のみの、様々な光学純度の混合物を形成するように選択できる。他の態様において、リンカー中に含まれるペプチド鎖の長さは、その中に含まれるアミノ酸の数を変化させることによって、または多くのもしくは少ないベータ、ガンマ、またはより長鎖のアミノ酸を含むことによって、短くもしくは長くできる。他の態様において、ペプチド部分中のアミノ酸側鎖の選択は、特異的にリンカー部分の、または一般的に全体的な分子の相対的な親水性を増加または減少させるように行うことができる。

同様に、本明細書において記述されるリンカーの他の化学的フラグメントの長さおよび形状は修飾してもよい。１つの態様において、リンカーはアルキレン鎖を含む。アルキレン鎖は、長さを変化させることができるか、分岐基を含むことができるか、環状部を含むことができ、それはアルキレン鎖に対して、直線状またはスピロであってもよい。他の態様において、リンカーがベータチオールの遊離可能なフラグメントを含む場合には、ヒドロキシ末端または炭酸末端へチオール末端を結合する他の介在基は、ヒドロキシ末端がベンジル炭素で結合され、チオール末端がフェニルのオルト位またはパラ位を介して結合される、およびその逆で結合される、エチレン架橋（任意に置換されたベンジル基などであるが、これらに限定されない）の代わりに使用できることが理解される。

式Ａｂ−Ｘの本明細書において記述される方法に従って使用される結合体は、患者サンプルとの混合のために、組成物が有効量の結合体およびそのための許容される担体を含む診断用組成物を製剤化して、１つの態様において使用される。様々な実施形態において、本明細書において記述される方法に従う使用のために効果的な結合体の量は、約１ｎＭ〜１００ｎＭ、１ｎＭ〜２００ｎＭ、１ｎＭ〜５００ｎＭ、１ｎＭ〜１０μＭ、１ｎＭ〜１ｍＭ、１０ｎＭ〜２００ｎＭ、１０ｎＭ〜５００ｎＭ、１００ｎＭ〜５００ｎＭ、１０ｎＭ〜１０μＭ、または１００ｎＭ〜１ｍＭであってもよい。様々な例示的な実施形態において、結合体は、１００μｌ、２００μｌ、３００μｌ、４００μｌ、５００μｌ、１ｍｌ、２ｍｌ、３ｍｌ、４ｍｌ、５ｍｌ、６ｍｌまたは８ｍｌの患者の体液と混合される。

ここで図８を参照して、１つの実施形態において、本明細書において記述されるエクスビボ多光子フローサイトメトリープロセスの実行のためのフローサイトメーターシステム１０は、第１のレーザー１２、第２のレーザー１４および第３のレーザー１６を含む。レーザー１２、１４、１６の各々は、所定の波長を有するレーザー光線を生じるように構成される。例えば、図８中で示される実施形態において、第１のレーザー１２は約４８８ナノメーターの波長を有するレーザー光線を生じるように構成され、第２のレーザー１４は約６３３ナノメーターの波長を有するレーザー光線を生じるように構成され、第３のレーザー１６は約３２５ナノメーターの波長を有するレーザー光線を生じるように構成される。

第１のレーザー１２の出力レーザー光線は、第１のダイクロイックミラー１８を介して導かれる。第１のダイクロイックミラー１８は、前もって定義した第１の波長または波長の範囲の光線を透過するが、第２の波長または波長の範囲の光線を反射するように構成される。例示的な実施形態において、第１のダイクロイックミラー１８は、約４８８ナノメーターの波長を有する光線を透過するが、約６３３ナノメーターの波長を反射するように構成される。それゆえ、第１のダイクロイックミラー１８は、第１のレーザー１２の出力レーザー光線が第１のダイクロイックミラー１８を介して透過されるが、第２のレーザー１４の出力レーザー光線が第１のダイクロイックミラー１８によって反射されるように位置する。それゆえ、結果として生じるレーザー光線１９は、第１のレーザー１２の出力レーザー光線の波長、および第２のレーザー１４の出力レーザー光線の波長を含んでいる。

光線１９は第２のダイクロイックミラー２０に向けられ、続いてこのダイクロイックミラーによって反射される。第１のダイクロイックミラー１８と同様に、第２のダイクロイックミラー２０は前もって定義した第１の波長または波長の範囲の光線を透過するが、第２の波長または波長の範囲の光線を反射するように構成される。図８の例示的な実施形態において、第２のダイクロイックミラー２０は、光線２７の波長（すなわち第１のレーザー１２および第２のレーザー１４の出力レーザー光線の波長）を反射し、第３のレーザー１６の出力レーザー光線の波長を透過するように構成される。すなわち、図８中で示された実施形態において、第２のダイクロイックミラー２０は、約４８８ナノメーターおよび約６３３ナノメーターの波長を有する光線を反射するが、約３２５ナノメーターの波長を有する光線を透過するように構成される。第２のダイクロイックミラー２０は、光線１９が第２のダイクロイックミラー２０によって反射されるが、第３のレーザー１６の出力レーザー光線が第２のダイクロイックミラー２０を介して透過するように位置する。それゆえ、結果として生じるレーザー光線２１は、第１のレーザー１２の出力レーザー光線の波長、第２のレーザー１４の出力レーザー光線の波長、および第３のレーザー１６の出力レーザー光線の波長を含む。

フローサイトメーター１０はさらに集束レンズ２２を含み、それはレーザー１２、１４、１６によって生じたレーザー光線２１を受け取るように位置する。集束レンズ２２は、解析されるサンプル（例えば血液サンプル）が位置するフローセル２４の上にレーザー光線２１を集束させるように構成される。いくつかの実施形態において、フローセル２４を、サンプルが流れる経路として具現できることが認識されるべきである。１つの特定の実施形態において、フローセル２４は幅が約１００ナノメーターである経路として具現されるが、他の大きさを有する経路も他の実施形態において使用できる。

フローセル２４の上に導かれたレーザー光線２１の一部は、サンプルによって散乱される。レーザー光線２１の散乱は、前方散乱光（ＦＳＣ）検知器２６によって受け取られる前方散乱光（ＦＳＣ）光線２５を形成する。前方散乱光は、細胞表面の面積または大きさに一般的に比例する、回折光の量の測定である。レーザー光線２１は、散乱に加えて、サンプル中に含まれるリガンド結合体を励起する。レーザー光線２１に反応して、リガンド結合体の蛍光分子は、エピ蛍光経由で多数の異なる波長を有する光を放射する。蛍光分子から放射された光の一部は蛍光収集レンズ２８を介して導かれる。

蛍光収集レンズ２８は、蛍光分子から放射された光を第３のダイクロイックミラー３０に導く。第１および第２のダイクロイックミラー１８、２０と同様に、第３のダイクロイックミラー３０は、前もって定義した第１の波長または波長の範囲の光を透過するが、第２の波長または波長の範囲の光を反射するように構成される。図８の例示的な実施形態において、第３のダイクロイックミラー２０はショートパスダイクロイックミラーであり、それは約６２０ナノメーター以下の波長を有する光を透過し、約６２０ナノメーターよりも大きな波長を有する光を反射するように構成される。

約６２０ナノメーターよりも大きな波長を有する光は、第４のダイクロイックミラー３２へ反射される。第４のダイクロイックミラー３２はロングパスダイクロイックミラーであり、それは約６７０ナノメーター以上の波長を有する光を透過し、約６７０ナノメーター未満の波長を有する光を反射するように構成される。第４のダイクロイックミラー３２によって透過される光（すなわち約６７０ナノメーター以上の波長を有する光）は、第１の光学フィルター３４によって受け取られる。第１の光学フィルター３４はロングパス光学フィルターであり、前もって定義した波長に等しいかまたはそれ以上の波長を有する光を透過するが、前もって定義した波長未満の波長の光を遮断するように構成される。例示的な実施形態において、第１の光学フィルター３４は、約６７０ナノメーター以上の波長を有する光を透過し、約６７０ナノメーター未満の波長を有する光を遮断するように構成される。第１の光学フィルター３４から透過される光は、光電子増倍管（ＰＭＴ）などの第１の検知器３６へ導かれる。いくつかの実施形態において、第１の検知器３６は受け取る光をアナログ信号に変換するように構成される。

第４のダイクロイックミラー３２へ戻って参照すると、ミラー３２によって反射された光（すなわち約６７０ナノメーター未満の波長を有する光）は、第２の光学フィルター３８へ導かれる。第２の光学フィルター３８はバンドパス光学フィルターであり、波長の所定範囲内の波長を有する光を透過するが、前もって定義した範囲以外の波長の光を遮断するように構成される。例示的な実施形態において、第２の光学フィルターは、約６６０ナノメーター±１３ナノメーターの波長を有する光（すなわち約６４７ナノメーター〜約６７３ナノメーターの範囲内の波長を有する光）を透過するように構成される。第２の光学フィルター３８から透過される光は、光電子増倍管（ＰＭＴ）などの第２の検知器４０へ導かれる。いくつかの実施形態において、第２の検知器４０は、受け取る光をアナログ信号に変換するように構成される。

第３のダイクロイックミラー３０へ戻って参照すると、ミラー３０を介して透過される光（すなわち約６２０ナノメーター以下の波長を有する光）は、第５のダイクロイックミラー４２へ導かれる。第５のダイクロイックミラー４２は、前もって定義した第１の波長または波長の範囲の光を透過するが、第２の波長または波長の範囲の光を反射するように構成される。図８の例示的な実施形態において、第５のダイクロイックミラー４２はロングパスダイクロイックミラーであり、それは約５１０ナノメーター以上の波長を有する光を透過し、約５１０ナノメーター未満の波長を有する光を反射するように構成される。

約５１０ナノメーター未満の波長を有する光は、第６のダイクロイックミラー４４へ反射される。第６のダイクロイックミラー４４もまたロングパスダイクロイックミラーとして具現され、それは約４７０ナノメーター以上の波長を有する光を透過し、約４７０ナノメーター未満の波長を有する光を反射するように構成される。第６のダイクロイックミラー４４によって透過される光（すなわち約４７０ナノメーター以上の波長を有する光）は、第３の光学フィルター４６によって受け取られる。第３の光学フィルター４６は、第２の光学フィルター３８に類似するバンドパス光学フィルターである。第３の光学フィルター４６は、前もって定義した波長の範囲内の波長を有する光を透過するが、前もって定義した範囲以外の波長の光を遮断するように構成される。例示的な実施形態において、第３の光学フィルター４６は、約５１０ナノメーター±１０ナノメーターの波長を有する光（すなわち約５００ナノメーター〜約５２０ナノメーターの範囲内の波長を有する光）を透過するように構成される。第３の光学フィルター４６から透過される光は、光電子増倍管（ＰＭＴ）などの第３の検知器４８に導かれる。いくつかの実施形態において、第３の検知器４８は、受け取る光をアナログ信号に変換するように構成される。

第６のダイクロイックミラー４４へ戻って参照すると、ミラー４４によって反射された光（すなわち約４７０ナノメーター未満の波長を有する光）は、第４の光学フィルター５０に導かれる。第４の光学フィルター５０はロングパス光学フィルターであり、前もって定義した波長に等しいかまたはそれ以上の波長を有する光を透過するが、前もって定義した波長未満の波長の光を遮断するように構成される。例示的な実施形態において、第４の光学フィルター５０は、約３８０ナノメーター以上の波長を有する光を透過し、約３８０ナノメーター未満の波長を有する光を遮断するように構成される。第４の光学フィルター５０から透過される光は、光電子増倍管（ＰＭＴ）などの第４の検知器５２に導かれる。やはりまた、いくつかの実施形態において、第４の検知器５２は、受け取る光をアナログ信号に変換するように構成される。

ここで第５のダイクロイックミラー４２へ戻って参照すると、ミラー４２によって透過される光（すなわち約５１０ナノメーターよりも大きな波長を有する光）は、第７のダイクロイックミラー５４に導かれる。第７のダイクロイックミラー５４は、前もって定義した第１の波長または波長の範囲の光を透過するが、第２の波長または波長の範囲の光を反射するように構成される。図８の例示的な実施形態において、第７のダイクロイックミラー５４はロングパスダイクロイックミラーであり、それは約５５５ナノメーター以上の波長を有する光を透過し、約５５５ナノメーター未満の波長を有する光を反射するように構成される。

第７のダイクロイックミラー５４によって透過される光（すなわち約５５５ナノメーター以上の波長を有する光）は、第５の光学フィルター５６によって受け取られる。第５の光学フィルター５６はバンドパス光学フィルターであり、前もって定義した波長の範囲内の波長を有する光を透過するが、前もって定義した範囲以外の波長の光を遮断するように構成される。例示的な実施形態において、第５の光学フィルター５６は、約５７５ナノメーター±２５ナノメーターの波長を有する光（すなわち約５５０ナノメーター〜約６００ナノメーターの範囲内の波長を有する光）を透過するように構成される。第５の光学フィルター５６から透過される光は、光電子増倍管（ＰＭＴ）などの第５の検知器５８に導かれる。いくつかの実施形態において、第５の検知器５８は、受け取る光をアナログ信号に変換するように構成される。

第７のダイクロイックミラー５４へ戻って参照すると、ミラー５４によって反射された光（すなわち約５５ナノメーター未満の波長を有する光）は、第６の光学フィルター６０に導かれる。第６の光学フィルター６０もまたバンドパス光学フィルターであり、前もって定義した波長の範囲内の波長を有する光を透過するが、前もって定義した範囲以外の波長の光を遮断するように構成される。例示的な実施形態において、第６の光学フィルター６０は、約５３０ナノメーター±２８ナノメーターの波長を有する光（すなわち約５０２ナノメーター〜約５５８ナノメーターの範囲内の波長を有する光）を透過するように構成される。第６の光学フィルター６０から透過される光は、光電子増倍管（ＰＭＴ）などの第６の検知器６２に導かれる。いくつかの実施形態において、第６の検知器６２は、受け取る光をアナログ信号に変換するように構成される。

さらに、いくつかの実施形態において、フローサイトメーター１０は、蛍光収集レンズ２６、第３のダイクロイックミラー３０および第５のダイクロイックミラー４２経由で側方散乱光（ＳＳＣ）を受け取るように構成される、第７の光学フィルター６４を含んでもよい。側方散乱光（ＳＳＣ）は、フローセル２４中に位置するサンプルの細胞粒度または内部複雑度に比例する。第７の光学フィルターはバンドパス光学フィルターであり、前もって定義した範囲内の波長を有する光を透過するが、前もって定義した範囲以外の波長の光を遮断するように構成される。例示的な実施形態において、第７の光学フィルター６４は、約４８８ナノメーター±２５ナノメーターの波長を有する光（すなわち約４６３ナノメーター〜約５１３ナノメーターの範囲内の波長を有する光）を透過するように構成される。第７の光学フィルター６４から透過される光は、光電子増倍管（ＰＭＴ）などの第７の検知器６６に導かれる。いくつかの実施形態において、第７の検知器６６は、受け取る光をアナログ信号に変換するように構成される。

フローサイトメーター１０は、検知器２６、３６、４０、４８、５２、５８、６２、６６によって生じられるシグナルの調節、増幅および／または提示のための、追加の回路もまた含んでもよい。例えば、フローサイトメーター１０は、生じたシグナルの増幅および調節のための前置増幅器（図示せず）および／またはフィルターブロック（図示せず）を含んでもよい。さらに、検知器２６、３６、４０、４８、５２、５８、６２、６６がアナログ信号を生じるように構成される実施形態において、フローサイトメーター１０は、アナログ信号を、例えばコンピューターシステム（図示せず）によって使用可能なデジタル信号に変換するための、アナログ−デジタル変換器（図示せず）を含んでもよい。かかるコンピューターシステム５４は、プロセッサー、およびコンピューターシステムのディスプレイ装置上で視認可能な画像（カラー画像など）へデジタル信号を処理するように構成される他の回路を含んでもよい。

１つの例示的なフローサイトメーターが本明細書において記述されてきたが、他の実施形態において、他のタイプのフローサイトメーターを、本明細書において記述されたエクスビボ多光子フローサイトメトリープロセスを実行するために使用してもよいことが理解されるべきである。さらに、ダイクロイックミラーおよび光学フィルターは、特定の波長の値に関して記述されてきたが、他の実施形態において、他の波長規格と共に使用可能なダイクロイックミラーおよび／または光学フィルターが他の実施形態において使用されてもよいことは認識されるべきである。

以下の実施例は例示的な実施形態のみであり、限定するようには意図されない。

（実施例１）
＜材料＞
Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−ワング樹脂、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ、ＨＯＢＴ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）およびＨＢＴＵ（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート）を、ノバビオケム（Novabiochem）社（サンディエゴ）から購入した。ピペリジン、ＤＩＰＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）、ローダミンＢイソチオシアネート（Ｒｄ−ＩＴＣ）およびトリイソプロピル生理食塩水（ＴＩＰＳ）は、アルドリッチ（Aldrich）社（ミルウォーキー）からであった。ＤｉＩＣ_１８（３）およびフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）は、モレキュラー・プローブ（Molecular Probes）社（インビトロゲン（Invitrogen）社）から購入した。ＰＤ−１０カラム（セファデックスＧ−２５Ｍ）は、アマシャム（Amersham）社からであった。ＥＣ１７（フォレート−ＦＩＴＣ）、ウサギ血清およびフォレート結合カラムは、エンドサイト（Endocyte）社によって提供された。

（実施例２）
＜細胞培養＞
鼻咽頭癌細胞（ＫＢ細胞）を、フォレート欠損ＲＰＭＩ１６４０（ギブコ（Gibco）社）プラス１０％ウシ胎仔血清（または子ウシ血清）中でｐＨ７で培養し、３７℃でインキュベートした。

（実施例３）
＜フォレート結合体の固相合成＞
フォレートの前駆体（Ｎ^１０−ＴＦＡ−プテロイン酸）を標準手順に従って合成した。Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−ワング樹脂を、反応の前に窒素バブリングと共に２０分間ＤＭＦ中に浸漬した。２０％ピペリジンを追加してＦｍｏｃ保護基を切断した。４当量のＤＩＰＥＡに加えて、ＤＭＦ中に溶解した２．５当量のＦｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ、ＨＯＢＴおよびＨＢＴＵも、反応漏斗に追加した。室温での２時間の窒素バブリング後に、Ｆｍｏｃ切断工程は、２０％ピペリジンにより繰り返された。次に、４当量のＤＩＰＥＡに加えて、１：１のＤＭＦ／ＤＭＳＯ（ジメチルホルムアミド／ジメチルスルホキシド）中に溶解した、１．５当量のＮ^１０−ＴＦＡ−プテロイン酸および２．５当量のＨＯＢＴおよびＨＢＴＵも、窒素によるバブリングと共に、４時間かけて反応に追加した。次に生成物を、ＤＭＦ、ＤＣＭ（ジクロロメタン）、メタノールおよびイソプロピルアルコールにより完全に洗浄し、窒素下で乾燥した。１％ＴＦＡ／ＤＣＭ（トリフルオロ酢酸／ジクロロメタン）を使用してＭｔｔ（Ｍｔｔ＝４−メチル−トリチル）基を切断した。２．５当量のＲｄ−ＩＴＣ（ＤＭＦ中に溶解した）および４当量のＤＩＰＥＡを樹脂に追加し、反応を減光条件下で室温で一晩行なった。結合体の切断をＴＦＡ：ＴＩＰＳ：Ｈ_２Ｏ（９５：２．５：２．５）によって行なった。粗製生成物を冷エーテルによる沈殿によって回収した。粗製生成物を一晩凍結乾燥した。第２日目に、粗製生成物を、窒素バブリングと共に１０％水酸化アンモニウム（ｐＨ＝１０）を使用して４５分間加水分解した。生成物を凍結乾燥によって回収した。分取ＨＰＬＣ（リゲル（Rigel））を使用して、精製を実行した。

（実施例４）
＜抗体精製および結合体化＞
抗フォレート受容体ポリクローナル抗体のＰＵ９、ＰＵ１０およびＰＵ１７は、フォレート親和性カラムを使用して、抗ウサギ血清から精製した。サンプルはＰＤ−１０カラムを使用して脱塩し、次にサンプルはＰＢＳ（ｐＨ８．０）中で緩衝した。結合体化は、抗体１ｍｇあたり８０μｇのＦＩＴＣの比率で減光条件下で室温で４時間かけて実行した。結合体化後に、標識抗体を親和性カラムクロマトグラフイーによって精製した。サンプルはＰＤ−１０カラムを使用して脱塩し、次にサンプルはＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）中で緩衝した。抗体濃度およびＦＩＴＣ対タンパク質比率は、以下のように、ＵＶ／可視光線吸光度を使用してそれぞれ計算した：Ｃ（ｍｇ／ｍｌ）＝［Ａ（２８０）−０．３１＊Ａ（４９５）］／１．４、Ｆ／Ｐ比率＝３．１＊Ａ（４９５）／［Ａ（２８０）−０．３１＊Ａ（４９５）］。

（実施例５）
＜血液サンプル＞
多光子フローサイトメトリー分析を実行するために、卵巣癌患者から抗凝血剤中に回収した新鮮血サンプルを使用して、実験を実行した。血液サンプルは、フローサイトメトリーによる検査の前にフォレート−アレクサフルオル４８８により処理した。

（実施例６）
イメージングフローサイトメトリーは、共焦点イメージング、非共焦点イメージングおよび２光子励起蛍光（ＴＰＥＦ）イメージングを可能にするレーザー走査顕微鏡（ＩＸ７０／ＦＶ３００、オリンパス（Olympus）社）により実行された。５４３ｎｍのヘリウム‐ネオンレーザーを、対物レンズからの１ｍＷの出力で、非共焦点イメージングおよび共焦点蛍光イメージングのために使用した。フェムトセカンドチタンサファイアレーザー（Ｍｉｒａ９００、コヒレント（Coherent）社）を、対物レンズからの３５ｍＷの出力で、ＴＰＥＦのために使用した。パルス継続期間は８００ｎｍで１００ｆｓであり、反復率は７７ＭＨｚである。データーは、血液サンプルの二次元ＸＹスキャニング、または一次元スキャニングによって得られた。

（実施例７）
＜フォレート結合体および抗フォレート受容体ポリクローナル抗体を使用するフォレート受容体陽性腫瘍細胞の標識同士の比較＞
フォレート−ＦＩＴＣ（１）、およびＦＩＴＣと結合体化した３つの異なる抗ＦＲポリクローナル抗体（ＰＵ９（２）、ＰＵ１０（３）およびＰＵ１７（４））の標識強度のフローサイトメトリー分析を実行した。未標識ＫＢ細胞（５）、および５０ｎＭフォレート−ＦＩＴＣプラス５μＭ葉酸と共にインキュベートしたＫＢ細胞（６、完全に競合させた）を、陰性対照とした。培養したＫＢ細胞は、フローサイトメトリーによる分析の前に上述のプローブの各々と共に３７℃で３０分間インキュベートした。フォレート−ＦＩＴＣ標識ＫＢ細胞の平均蛍光強度は、任意の抗フォレート受容体（ＦＲ）ポリクローナル抗体標識ＫＢ細胞よりも２桁高い大きさである（図１）。フォレート−ＦＩＴＣはただ１つのＦＩＴＣを保有するが、抗体は複数のＦＩＴＣ分子で標識できるので、この結果は意外なものであった。さらに、ポリクローナル抗体はＦＲ上の複数のエピトープに結合することができるが、フォレート−ＦＩＴＣは単一部位のみに結合する。この結果は、蛍光抗腫瘍細胞抗体による任意のＣＴＣの検出がうまくいかないことについて説明する（データー不掲載）。

（実施例８）
＜フォレート−アレクサフルオル４８８による腫瘍細胞標識の前に、全血の赤血球濃縮画分から腫瘍細胞濃縮画分を分離する方法の比較＞
全血サンプル中の他のすべての細胞（すなわち腫瘍細胞画分）から赤血球を分離する方法を解析した。これらの方法は以下の通りであった：１）実施例９および図３中に詳細に記載される抗体カクテル法、２）白血球からの分離をよりよくするために、ＲＢＣを収縮させることができるカルシウムイオノフォアであるＡ２３１８７の使用、３）赤血球から白血球を分離するために一般に使用されるフィコール密度分離、４）全血中の他の細胞集団を溶解せずに、ＲＢＣを破裂させる十分な浸透圧を生じることができる塩化アンモニウム溶解、５）癌患者の末梢血サンプルからのＣＴＣの迅速な分離のために市販で入手可能な濃縮キット（オンコクイック（Oncoquick）、グライナー・バイオワン（Greiner Bio-One）社）、６〜８）異なる平衡密度による異なるタイプの密度遠心分離溶媒、９）フィルターの上の白血球を保持するが、赤血球の濾過を可能にする、下部から〜３ｍｌの多孔質膜インサートを備えた遠心分離チューブである、スピンディスク（Spin Disk）チューブ（グライナー・バイオワン社）。結果を図２中に示す。フィコール密度分離プラス抗体カクテル法により最良の％回収が得られた。

（実施例９）
＜循環腫瘍細胞濃縮の手順：抗体カクテル法＞
図３において、以下の略語を使用する。ＣＴＣ：循環腫瘍細胞、ＭＮＣ：単核細胞、ＧＮＣ：顆粒球、ＲＢＣ：赤血球、フィコール：分離溶媒、Ａｂカクテル：上皮性ＣＴＣ濃縮抗体のカクテル。抗体カクテル中の四量体の抗体複合体は、両方の細胞タイプを枯渇させるように不要な白血球を赤血球に架橋し、癌細胞がより純粋な集団であることを可能にする。

以下のパラメーターを、濃縮手順のために最適化した。遠心分離速度、希釈係数、遠心分離時間および分離溶媒のｐＨ。これらのパラメーターの評価を表１〜４中に示す。一般的に、２０分間でおよそ１０００ｇの遠心分離速度が至適である。一般的に全血は、効率的なＣＴＣ濃縮のためにはあまりにも粘性があり粘着性があり過ぎる。そのため、２％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＰＢＳ中での全血の異なる希釈を調べた。一般的に、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ中の全血の１：１比率が、ｐＨ７のＰＢＳによる至適希釈であり、至適標識効率がもたらされた。

〔遠心分離速度の評価〕

〔希釈係数の評価〕

〔遠心分離時間（１０００ｇで）の評価〕

〔ｐＨの影響の評価〕

（実施例１０）
＜検出のためのエクスビボ患者サンプルの調製、およびフローサイトメトリー分析による病原性細胞の定量化＞
癌患者からの２ｍｌの血液サンプルを３０分間室温で暖めた。５０μＬ／ｍＬのロゼットセップ（RosetteSep）（商標）の循環ヒト上皮性腫瘍細胞広汎濃縮カクテル（Circulating Human Epithelial Tumor Cell Extensive Enrichment Cocktail）（ステムセル・テクノロジーズ（StemCell Technologies）社）を全血サンプルに追加し、穏やかに混合し、次に室温で２０分間インキュベートした。サンプルをＰＢＳＦ（ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ）の等容量で希釈し、十分に混合した。３：４の容量比率で希釈したサンプルの下にフィコール−パック（Ficoll-Paque）を重層した。次にサンプルは、ブレーキはオフにして室温４００ｇで３０分間遠心分離した。上清を、フィコール−パックから他のチューブへと移した。６〜８ｍｌのＰＢＳＦを追加して細胞を洗浄し、次に細胞を５００ｇ１５分間の遠心分離によりペレットにした。およそ５００〜１０００μｌの液体をサンプル中に残して細胞およびフォレート−造影剤４８８（１００ｎＭ）を再懸濁した。ＣＤ４５−Ｃｙ５（１：３００）およびヘキスト（Hoechst）（５μｇ／ｍｌ）をサンプルに追加した。１時間氷上でサンプルをインキュベートした。５ｍｌの容量に達するようにＰＢＳＦをサンプルに追加した。次に細胞を２００ｇ１０分間の遠心分離によりペレットにした。１０倍容量のＰＢＳＦを追加して色素を洗浄した。フローサイトメトリー分析を実行するために１ｍｌのＰＢＳＦ中に細胞を再懸濁した。すべての細胞がフローサイトメーターによりカウントされることを確実にするために、さらに５００μｌのＰＢＳＦを追加してフローサイトメトリー分析の実行前にチューブを洗浄した。上述のプロトコールを実行するときに、すべての薬剤は滅菌されるべきである。チューブを移すときに、すべての細胞の回収を促進するためにチューブを数回洗浄するべきである。プラスチック壁に対する細胞の非特異的吸着を減少させるために、新しいチューブはＰＢＳＦで洗い流されるべきである。

（実施例１１）
＜フローサイトメトリーおよび共焦点顕微鏡によるエクスビボ患者サンプル中の循環腫瘍細胞の検出＞
新鮮血サンプルを６人の卵巣癌患者から抗凝血剤中に回収し、実施例１０中に記載される手順を使用して処理した。卵巣癌患者サンプルからの５００マイクロリットルの全血を、フローサイトメトリーによる分析の前に、１００ｎＭフォレート−アレクサフルオル４８８と共に３７℃で３０分間インキュベートした。図４中で見られるように、６つのサンプルはすべて、１５〜２１０細胞／５００μｌの範囲の測定可能なＣＴＣを示した。これとは対照的に、３人の健康なドナーからの同種のサンプルは５００μｌ中に蛍光粒子を含まないことが見出された。卵巣癌患者における標識細胞が悪性であることを確実にするために、同一の末梢血サンプルを、ローダミン−Ｘと結合体化した適切な二次抗体を加えた抗ヒトＣＡ１２５モノクローナル抗体により標識した。図６中に示される卵巣癌患者からの血液塗抹標本の共焦点顕微鏡によって示されるように、フォレート−アレクサフルオル４８８の緑色蛍光は、ローダミン−Ｘの赤色蛍光と共局在することが見出され、フォレート−アレクサフルオル標識細胞が確かに卵巣癌に由来することが実証される。赤色（ローダミン−Ｘ標識抗サイトケラチン抗体）蛍光と緑色（フォレート−アレクサフルオル４８８）の重複は、黄色蛍光として表示され、パネルＡおよび図６のＢにおいて見られる。

（実施例１２）
＜エクスビボフローサイトメトリーを使用する卵巣癌患者における循環腫瘍細胞の定量化＞
卵巣癌患者からの血液サンプルをフローサイトメトリーによって解析した。実施例１０中に記載されるように、サンプルを処理した。次に、患者１〜１１からの５００μｌの全血を、フローサイトメトリーによる分析の前に、１００ｎＭフォレート−アレクサフルオル４８８と共に３７℃で３０分間インキュベートした。各患者サンプルのための対照サンプルは、上述される同一の処理の前に、１０μＭ葉酸と共に３７℃３０分間インキュベートした。患者１２〜１７については、２ｍｌの全血を抗体カクテル（上皮性ＣＴＣ濃縮抗体カクテル）により処理し、赤血球をフィコール分離媒質の使用によって除去した。次に濃縮腫瘍細胞画分をフローサイトメトリー分析の前に洗浄し、フォレート−アレクサフルオル４８８により４℃で３０分間標識した。結果を図５中に示す。黒いドットは各分析におけるＣＴＣカウントを表わす。バーは、同一の血液サンプルに対する２つまたは３つの独立した測定において得られたＣＴＣの平均数を表わす。上部の点線は、すべての患者についての平均ＣＴＣカウントを表わす。中央の点線は、すべての患者についての中央値ＣＴＣカウントを表わす。下部の黒い点線は、すべての健康なドナーについての平均ＣＴＣカウントを表わす。癌患者についての血液の平均ＣＴＣ／２ｍｌは、約１０３のＣＴＣ／２ｍｌであり、中央値は約４５ＣＴＣ／２ｍｌである。約５から１０ＣＴＣ／２ｍｌが検出される、ＣＴＣの最低数は患者３、５および６で観察された。これらの数は、正常な血液において見出されるバックグラウンドレベル（平均１．２５ＣＴＣ／２ｍｌ）以上である。

（実施例１３）
＜健康なドナーの血液中の循環腫瘍細胞の定量化＞
フィコール＋Ａｂカクテル法を使用して、８人の健康なドナーからの６ｍｌの全血から赤血球を除去し、白血球／癌細胞画分を洗浄し、１．５ｍｌＰＢＳ（２％ＰＢＳ）中に再懸濁した。１つの小分け（５００μｌの細胞懸濁物）を標識せずに、陰性対照（右に向いた三角形）とした。第２の小分け（上に向いた三角形）を、フローサイトメトリーの前に、１００ｎＭフォレート−アレクサフルオル４８８と共に４℃で３０分間インキュベートした。第３の小分け（左に向いた三角形）は、ＦＲ特異的結合をブロックするために、フォレート−アレクサフルオル４８８によるインキュベーションの前に、１０μＭ葉酸と共に４℃で３０分間インキュベートした。これらのデーターは、６／２ｍｌまでのＣＴＣカウント（ＦＲ発現細胞のカウント）が正常となりえることを示唆する（図７）。

（実施例１４）
＜フォレート−Ｃｙｓ−テキサスレッドの合成＞
テキサスレッドＣ_２−マレイミド（モレキュラー・プローブ社、ユージーン、オレゴン）を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（２００μｌのＤＭＳＯ中に１ｍｇ）中に溶解した。１．４モル当量（１ｍｇ）のフォレート−システインを溶液に追加し、室温で４時間混合した。フォレート−Ｃｙｓ−テキサスレッド（フォレート−テキサスレッド）を、Ｃ１８カラム上で逆相ＨＰＬＣによって１ｍｌ／分の流速で精製した。１０ｍＭのＮＨ_４ＨＣＯ_３バッファー（ｐＨ７．０）（溶出液Ａ）およびアセトニトリル（溶出液Ｂ）からなる移動相を、最初の５分間はＡ：Ｂが９９：１の比率で維持し、その後次の３０分にわたり直線的勾配でＡ：Ｂは７０：３０へ、続いて最後の１５分にわたり直線的勾配でＡ：Ｂは１：９９へ変化させた。フォレート−Ｃｙｓ−テキサスレッドは４４．５分および４５．８分で２つの異性体ピークとして溶出された。生成物を質量分析法によって確認し、生物学的活性を、培養におけるフォレート受容体陽性のＭ１０９細胞上の細胞表面のフォレート受容体に対するその結合の蛍光測定によって確認した。

（実施例１５）
＜フォレート−オレゴングリーン５１４の合成＞
標準的なＦｍｏｃペプチド化学を使用して、葉酸のγ−ＣＯＯＨへ結合したオレゴングリーン（モレキュラー・プローブ社、ユージーン、オレゴン）へ結合されたフォレートペプチドを合成した。配列Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−プテロイン酸（フォレート−Ｃｙｓ）は、塩基としてジイソプロピエチルアミン、およびＦｍｏｃ基の脱保護のためにジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の２０％のピペリジンに加えて、ＨＢＴＵおよび活性化剤としてＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールによるＦｍｏｃ化学によって構築された。α−ｔ−Ｂｏｃ−保護Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−Ｌ−グルタミン酸、続いてＮ^１０−トリフルオロアセチルプテロイル酸を、ε−アミン上に４−メチルトリチル保護基を含むＦｍｏｃ−保護リジンワング樹脂へ結合した。リジンのε−アミン上のメトキシトリチル保護基をジクロロメタン中の１％トリフルオロ酢酸により除去し、オレゴングリーンを結合させた（フォレート−オレゴングリーン）。１．５モル当量のオレゴングリーンカルボン酸を、ペプチドと共にスクシンイミジルエステルを一晩反応させ、その後ペプチド樹脂ビーズから完全に洗浄した。次に、フォレート−オレゴングリーンを、９５％トリフルオロ酢酸−２．５％水−２．５％トリイソプロピルシラン溶液により樹脂から切断した。ジエチルエーテルを使用して生成物を沈殿させ、沈殿物を遠心分離によって回収した。生成物をジエチルエーテルにより２回洗浄し、真空下で一晩乾燥した。Ｎ^１０−トリフルオルアセチル（trifluoracetyl）保護基を除去するために、生成物を１０％水酸化アンモニウム溶液中に溶解し、室温で３０分間撹拌した。生成物を、イソプロパノールおよびエーテルの組み合わせにより沈殿させ、沈殿物を遠心分離によって回収した。

（実施例１６）
＜フォレート−Ｒ−フィコエリトリンの合成＞
フォレート−フィコエリトリンを、Pharmaceutical Research, Vol. 20(5); 2003中のKennedy M.D.らによって出版された手順に従って合成した。簡潔には、１０倍過剰量のフォレート−システインを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）中のＲ−フィコエリトリンピリジルジスルフィド（シグマ（Sigma）社、セントルイス、ミズーリ）の溶液へ追加した。溶液を一晩４℃で反応させ、標識タンパク質（分子量約２６０ｋＤａ）を、Ｇ−１５脱塩カラムを使用するゲル濾過クロマトグラフィーによって精製した。１００倍過剰量の葉酸の存在下および非存在下においてフォレート−フィコエリトリンと共にインキュベートしたＭ１０９細胞の蛍光顕微鏡によって、フォレート標識を確認した。１時間のインキュベーションおよびＰＢＳによる３回の細胞洗浄後に、処理された細胞は強度に蛍光性であったが、過剰の葉酸の存在下におけるサンプルは細胞蛍光をほとんど示さなかった。

（実施例１７）
＜フォレート−フルオレセインの合成＞
Pharmaceutical Research, Vol. 20(5); 2003中にKennedy, M.D.らによって記載されるように、フォレート−ＦＩＴＣを合成した。

（実施例１８）
＜循環前立腺癌細胞検出のための化合物例＞
本明細書において記述された化合物は、従来の有機合成法によって調製できる。加えて、以下に示されるように、本明細書において記述される化合物は調製できる。特別の指示の無い限り、出発材料および試薬はすべて市販の供給から入手可能である。すべてのアミノ酸出発材料はケム−インペクス・インターナショナル（Chem-Impex Int）社（シカゴ、イリノイ）から購入した。^１Ｈ ＮＭＲスペクトルは、特別の指示の無い限りブルカー（Bruker）社５００ＭＨｚのクリオプローブを使用して得た。

実施例Ａ。結合体化のためのＰＳＭＡインヒビター中間体の一般的合成。ＤＵＰＡ誘導体２−［３−（１，３−ビス−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−プロピル）−ウレイド］−ペンタン２酸１−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（Ｉ）の特異的合成について図示する。

ＰＣ０１ＳＫ０９。−７８℃まで冷却したＣＨ_２Ｃｌ_２（２５．０ｍＬ）中のＬ−グルタミン酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチルエステルＨＣｌ（１．０ｇ、３．３９ｍｍｏｌ）およびトリホスゲン（３２９．８ｍｇ、１．１２ｍｍｏｌ）の混合物へ、トリエチルアミン（１．０ｍＬ、８．１９ｍｍｏｌ）を追加した。窒素下で−７８℃、２時間の撹拌後に、ＣＨ_２Ｃｌ_２（５．０ｍＬ）中のＬ−Ｇｌｕ（ＯＢｎ）−Ｏ−ｔｅｒｔ−Ｂｕ（１．２ｇ、３．７２ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（６００μＬ、４．９１ｍｍｏｌ）の混合物を追加した。１時間にわたって反応混合物を室温までにし、室温で一晩撹拌し続けた。反応混合物を１Ｎ ＨＣｌ、ブラインにより洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４の上で乾燥させた。フラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝１：１、Ｒ_ｔ＝０．６７）を使用して粗製生成物を精製し、ＰＣ０１ＳＫ０９（１．７６ｇ、９０．２％）を生じた。Ｃ_３０Ｈ_４６Ｎ_２Ｏ_９；分子量＝５７８．６９ｇ／ｍｏｌ；無色油脂；^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３） δ １．４３ （ｓ， ９Ｈ， ＣＨ_３−^ｔＢｕ）； １．４４ （ｓ， ９Ｈ， ＣＨ_３−^ｔＢｕ）； １．４６ （ｓ， ９Ｈ， ＣＨ_３−^ｔＢｕ）； １．８５ （ｍ， １Ｈ， Ｇｌｕ−Ｈ）； １．８７ （ｍ， １Ｈ， Ｇｌｕ−Ｈ）； ２．０６ （ｍ， １Ｈ， Ｇｌｕ−Ｈ）； ２．０７ （ｍ， １Ｈ， Ｇｌｕ−Ｈ）； ２．３０ （ｍ， ２Ｈ， Ｇｌｕ−Ｈ）； ２．４４ （ｍ， ２Ｈ， Ｇｌｕ−Ｈ）； ４．３４ ［ｓ （ｂｒｏａｄ）， １Ｈ， αＨ］； ４．３８ ［ｓ （ブロード）， １Ｈ， α−Ｈ］； ５．１０ （ｓ， ２Ｈ， ＣＨ_２−Ａｒ）； ５．２２ ［ｓ （ブロード）， ２Ｈ， 尿素−Ｈ）； ７．３４ （ｍ， ５Ｈ， Ａｒ−Ｈ）。 ^１３Ｃ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３） δ ２８．１６； ２８．２５； ２８．５４； ２８．６０； ３０．５２； ３１．７３； ５３．１３； ５３．２２； ６６．５８； ８０．７１； ８２．２５； ８２．３５； １２８．３９； １２８．７１； １３６．０３； １５６．９６； １７２．０１； １７２．１６； １７２．６５； １７３．１３： ＣＩ−ＭＳ＝５７９ （Ｍ＋Ｈ）^＋， ＥＳＩ−ＭＳ＝５７９ （Ｍ＋Ｈ）^＋， ６０１ （Ｍ＋Ｎａ 付加物）。

ＰＣ０１ＳＫ２３。ＣＨ_２Ｃｌ_２中の化合物ＰＣ０１ＳＫ０９（２５０ｍｇ、４３２ｍｍｏｌ）の溶液へ、３０％Ｐｄ／Ｃ（５０ｍｇ）を追加した。反応混合物を１気圧２４時間室温で水素化した。Ｐｄ／Ｃはセライトパッドを介して濾過し、ＣＨ_２Ｃｌ_２により洗浄した。粗製生成物をフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝４０：６０、Ｒ_ｔ＝０．５８）を使用して精製し、ＰＣ０１ＳＫ２３（１６９ｍｇ、８０．２％）を生じた。Ｃ_２３Ｈ_４０Ｎ_２Ｏ_９；分子量＝４８８．５７ｇ／ｍｏｌ；無色油脂；^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３） δ １．４６ （ｍ， ２７Ｈ， ＣＨ_３−^ｔＢｕ）； １．９１ （ｍ， ２Ｈ，Ｇｌｕ−Ｈ）； ２．０７ （ｍ， １Ｈ， Ｇｌｕ−Ｈ）； ２．１８ （ｍ， １Ｈ， Ｇｌｕ−Ｈ）； ２．３３ （ｍ， ２Ｈ， Ｇｌｕ−Ｈ）； ２．４６ （ｍ， ２Ｈ， Ｇｌｕ−Ｈ）； ４．３１ （ｓ （ブロード）， １Ｈ， αＨ）； ４．３５ （ｓ （ブロード）， １Ｈ， α−Ｈ）； ５．０５ （ｔ， ２Ｈ， 尿素−Ｈ）； ＣＩ−ＭＳ＝４８９ （Ｍ＋Ｈ）^＋， ＥＳＩ−ＭＳ＝４８９ （Ｍ＋Ｈ）^＋， ５１１ （Ｍ＋Ｎａ 付加物）， ４８７ （Ｍ−Ｈ）⁻。

実施例Ｂ。結合体化のためのＰＳＭＡインヒビター中間体の一般的合成。三級ブチル保護ＭＵＰＡ誘導体２−［３−（１−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−２−メルカプト−エチル）−ウレイド］−ペンタン２酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（ＩＩ）の特異的合成について図示した。

ＰＣ０１ＳＫ１５。−７８℃へ冷却したＣＨ_２Ｃｌ_２（５．０ｍＬ）中のＬ−グルタミン酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチルエステルＨＣｌ（２００ｍｇ、０．６７６ｍｍｏｌ）およびトリホスゲン（６７ｍｇ、０．２２８ｍｍｏｌ）の混合物へ、トリエチルアミン（５０μＬ（０．４１０ｍｍｏｌ））を追加した。窒素下で−７８℃、２時間の撹拌後に、ＣＨ_２Ｃｌ_２（１．０ｍＬ）中のＤ−ＣｙＳ（Ｆｍ）−ＯｔＢｕ（２９１．４ｍｇ、０．７７４ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（３０μＬ、２４０ｍｍｏｌ）の混合物を追加した。１時間にわたって反応混合物を室温までにし、室温で一晩撹拌し続けた。反応混合物を１Ｎ ＨＣｌ、ブラインにより洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４の上で乾燥した。粗製生成物はフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝５０：５０、Ｒ_ｔ＝０．６）を使用して精製し、ＰＣ０１ＳＫ１５（３７４ｍｇ、８６．４％）を生じた。Ｃ_３５Ｈ_４８Ｎ_２Ｏ_７Ｓ；分子量＝６４０．８３ｇ／ｍｏｌ；薄いヤロウ（yallow）油脂；^１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３） δ １．４５ （ｓ， ２７Ｈ， ＣＨ_３−^ｔＢｕ）； １．８８ （ｍ， １Ｈ， Ｇｌｕ−Ｈ）； ２．１０ （ｍ， １Ｈ， Ｇｌｕ−Ｈ）； ２．３２ （ｍ， ２Ｈ， Ｇｌｕ−Ｈ）； ２．９７ （ｍ， ２Ｈ， Ｆｍ−ＣＨ２）； ３．１３ （ｍ， ２Ｈ， Ｃｙｓ−Ｈ）； ４．０９ （ｔ， １Ｈ， Ｆｍ−Ｈ）； ４．３８ （ｍ， １Ｈ， αＨ）； ４．６６ （ｍ， １Ｈ， α−Ｈ）； ５．５５ （ｄ， １Ｈ， 尿素−Ｈ）； ５．６７ （ｄ， １Ｈ， 尿素−Ｈ）； ７．３０ （ｑ， ２Ｈ， Ａｒ− Ｈ）； ７．３６ （ｑ， ２Ｈ， Ａｒ−Ｈ）； ７．７３ （ｍ， ４Ｈ， Ａｒ−Ｈ）。 ^１３Ｃ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ_３） δ ２８．０５； ２８．１４； ２８．４２； ３１．６４； ３６．２７； ３７．２５； ５３．０７； ５３．７３； ８０．５１； ８１．９８； ８２．４２； １１９．８５； １２４．９５； １２５．０９； １２７．０９； １２７．５１； １４１．０９； １４５．９９； １５６．７６； １７０．８０； １７２．１５； １７２．４３； ＣＩ−ＭＳ＝６４１ （Ｍ＋Ｈ）^＋， ＥＳＩ− ＭＳ＝６４１ （Ｍ＋Ｈ）^＋。

実施例Ｃ。ユニバーサルＰＳＭＡ（ＤＵＰＡ）樹脂、２原子スペーサーおよびＦＩＴＣを使用する、ＰＣ０１ＳＫ５９について図示されるＰＳＭＡ造影剤結合体の一般的合成。この結合体もまた前立腺癌患者中の循環腫瘍細胞の検出について使用できる。

ＰＳＭＡユニバーサル樹脂およびＰＣ０１ＳＫ５９の合成。ユニバーサルＰＳＭＡリガンド（ＤＵＰＡ）樹脂を、ユニバーサルノバタッグ（NovaTag）（商標）樹脂（ノバビオケム（Novabiochem）社；カタログ番号０４−１２−３９１０）を使用して合成した。ＤＣＭ（ＣＨ_２Ｃｌ_２）およびＤＭＦにより樹脂を膨潤した後に、Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）を使用して脱保護した。ｔｅｒｔ−ブチル保護ＤＵＰＡは、ＤＭＦ中のＨＡＴＵ［２−（１Ｈ−７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート］およびＤＩＰＥＡ（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン）を使用してカップリングした。ペンダントＭｍｔ（４−メトキシトリチル）を、ＤＣＭ／ＴＦＥ（トリフルオロエタノール）中の１Ｍ ＨＯＢＴ（１−ヒロキシベンゾトリアゾール（Hyroxybenzotriazole））により除去した。樹脂中間体をＤＭＦにより洗浄し、後続する合成の工程において直ちに使用するか、またはＤＣＭ／ＤＭＦおよび次にＭｅＯＨにより洗浄し、後の使用のために乾燥した。

ＤＭＦ中のＤＩＰＥＡ（４当量）の存在下において、市販で入手可能なＦＩＴＣ（１．２５当量）とユニバーサルＰＳＭＡ樹脂を反応させ、ＰＣ０１ＳＫ５９（２原子スペーサー）コンストラクトを産出した。最終化合物は、ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）、ＴＩＰＳ（トリイソプロピルシラン）および水の混合物を使用して、樹脂から切断した。精製は逆相分取ＨＰＬＣ（ウォーターズ（Waters）社、ｘテラ（xTerra）Ｃ_１８５μｍ；１９×１５０ｍｍ）によって行い、Ａ＝１０ｍＭ ＮＨ_４ＯＡｃ、Ｂ＝ＡＣＮ；λ＝４８８ｎｍ；溶媒勾配：１％Ｂ〜５０％Ｂを２５分間、８０％Ｂによる洗浄を４０分実行、（６３％）。ＰＣ０１ＳＫ５９は、逆相分析ＨＰＬＣ（ウォーターズ社、Ｘ−ブリッジ（X-Bridge）Ｃ_１８５μｍ；３．０×１５ｍｍ）を使用して解析した；Ａ＝１０ｍＭ ＮＨ_４ＯＡｃ、Ｂ＝ＡＣＮ；λ＝４８８ ｎｍ、１％Ｂ〜５０％Ｂを１０分間、８０％Ｂによる洗浄を１５分実行；Ｃ_３４Ｈ_３３Ｎ_６Ｏ_１３Ｓ；分子量＝７５１．７２ｇ／ｍｏｌ；橙色固体（Ｒ_ｔ＝７．２分）；ＥＳＩ−ＭＳ＝７５２ （Ｍ＋Ｈ）^＋； ７７４ （Ｍ＋Ｎａ）^＋； ７５０ （Ｍ−Ｈ）⁻。

実施例Ｄ。ユニバーサルＰＳＭＡ（ＤＵＰＡ）樹脂、１６原子スペーサーおよびＦＩＴＣを使用する、ＰＣ０１ＳＫ６４について図示されるＰＳＭＡ造影剤結合体の一般的合成。

ユニバーサルＰＳＭＡ樹脂は、標準的なＦｍｏｃ ＳＰＰＳを使用して、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−（ＯｔＢｕ）−ＯＨおよびＦｍｏｃ−ＥＡＯＡ（８−アミノオクトン酸（aminooctonoic acid））とカップリングした。ＤＭＦ中のＤＩＰＥＡ（４当量）の存在下におけるフルオロイソチオシアナート（１．２５当量）との結合体化後に、ＰＣ０１ＳＫ６４（１６原子スペーサー）化合物は、ＴＦＡ／ＴＩＰＳ／Ｈ２Ｏを使用して樹脂から切断した。精製は、逆相分取ＨＰＬＣ（ウォーターズ社、ｘテラＣ１８ ５μｍ；１９×１５０ｍｍ）を使用して実行し、Ａ＝１０ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ、Ｂ＝ＡＣＮ；λ＝４８８ｎｍ；溶媒勾配：１％Ｂ〜５０％Ｂを２５分間、８０％Ｂによる洗浄を４０分実行、（５７％）。ＰＣ０１ＳＫ６４は、逆相分析ＨＰＬＣ（ウォーターズ社、Ｘ−ブリッジＣ１８ ５μｍ；３．０×１５０ｍｍ）を使用して解析した；Ａ＝１０ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ、Ｂ＝ＡＣＮ；λ＝４８８ｎｍ、１％Ｂ〜５０％Ｂを１０分間、８０％Ｂによる洗浄を１５分実行；Ｃ４７Ｈ５５Ｎ７Ｏ１７Ｓ；分子量＝１０２２．０４ｇ／ｍｏｌ；橙色固体（Ｒｔ＝７．８分）；ＥＳＩ−ＭＳ＝１０２２ （Ｍ＋Ｈ）＋； １０２０ （Ｍ−Ｈ）−。

実施例Ｅ〜Ｆ。以下の化合物は本明細書において記述される合成プロセスを使用して調製した。

ＰＣ０１ＳＫ６３（７原子スペーサー、Ｃ_３９Ｈ_４０Ｎ_６Ｏ_１７、分子量：８６４．７６）は、ユニバーサルＰＳＭＡ樹脂、およびＦｍｏｃ−Ｇｌｕ−（ＯｔＢｕ）−ＯＨにより結合体化する標準的なＦｍｏｃ ＳＰＰＳを使用して調製した。ＦＩＴＣによるカップリング後に、化合物は、ＴＦＡ／ＴＩＰＳ／Ｈ_２Ｏカクテルを使用して樹脂から切断し、逆相分取ＨＰＬＣ（ウォーターズ社、ｘテラＣ_１８５μｍ；１９×１５０ｍｍ）により精製し、Ａ＝１０ｍＭ ＮＨ_４ＯＡｃ、Ｂ＝ＡＣＮ；λ＝４８８ｎｍ；溶媒勾配：１％Ｂ〜５０％Ｂを２５分間、８０％Ｂによる洗浄を４０分実行、（６５％）；逆相分析ＨＰＬＣ（ウォーターズ社、Ｘ−ブリッジＣ_１８５μｍ；３．０×１５０ｍｍ）を使用して解析し；Ａ＝１０ｍＭ ＮＨ_４ＯＡｃ、Ｂ＝ＡＣＮ；λ＝４８８ｎｍ、１％Ｂ〜５０％Ｂを１０分間、８０％Ｂによる洗浄を１５分実行；ＰＣ０１ＳＫ６３：Ｃ_３９Ｈ_４０Ｎ_６Ｏ_１６Ｓ；分子量＝８８０．８３ｇ／ｍｏｌ；橙色固体（Ｒ_ｔ＝６．８分）；ＥＳＩ−ＭＳ＝８８１ （Ｍ＋Ｈ）^＋； ９０３（Ｍ＋Ｎａ）＋；８６３（Ｍ−Ｈ）−。

ＰＣ０１ＳＫ５８（２４原子スペーサー、Ｃ_４９Ｈ_６２Ｎ_６Ｏ_２０Ｓ、分子量：１０８７．１１）を、ユニバーサルＰＳＭＡ樹脂、およびＦｍｏｃ−（ＰＥＧ）_６−ＯＨにより結合体化する標準的なＦｍｏｃ ＳＰＰＳを使用して調製し、２５分間で１％Ｂ〜６０％ＢのＨＰＬＣによって精製し、８０％Ｂによる洗浄を４０分実行、（６５％）；逆相分析ＨＰＬＣ（ウォーターズ社、Ｘ−ブリッジＣ_１８５μｍ；３．０×１５０ｍｍ）を使用して解析し；Ａ＝１０ｍＭ ＮＨ_４ＯＡｃ、Ｂ＝ＡＣＮ；λ＝４８８ｎｍ、１％Ｂ〜６０％Ｂを１０分間、８０％Ｂによる洗浄を１５分実行；Ｃ_４９Ｈ_６０Ｎ_６Ｏ_２０Ｓ；分子量＝１０８７．１１ｇ／ｍｏｌ；橙色固体（Ｒ_ｔ＝７．３分）；ＥＳＩ−ＭＳ＝１０８７ （Ｍ＋Ｈ）^＋； １１０９ （Ｍ＋Ｎａ）＋； １０８５（Ｍ−Ｈ）⁻。

実施例Ｇ。ワングＰＳＭＡ（ＤＵＰＡ）樹脂、２４原子スペーサーおよびオレゴングリーン４８８を使用する、ＰＣ０１ＳＫ５６について図示されるＣｙｓ−マレイミドＰＳＭＡ造影剤結合体の一般的合成（式中、ｎ＝３）。

ｎが４〜約３０の整数である関連した類縁体もまた、本明細書において記述されるプロセスに従って調製できる。

ＰＣ０１ＳＫ５４を、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ワング樹脂（ノバビオケム社；カタログ番号０４−１２−２０５０）からスタートする標準的なＦｍｏｃ ＳＰＰＳを使用して調製し、逆相分取ＨＰＬＣ（ウォーターズ社、ｘテラＣ_１８１０μｍ１９×２５０ｍｍ）を使用して精製し、Ａ＝０．１ＴＦＡ；Ｂ＝ＡＣＮ；λ＝２５７ｎｍ；溶媒勾配：１％Ｂ〜６０％Ｂを２５分間、８０％Ｂによる洗浄を４０分実行、（６３％）、逆相分析ＨＰＬＣ（ウォーターズ社、Ｘ−ブリッジＣ_１８５μｍ；３．０×５０ｍｍ）を使用して解析し；Ａ＝１０ｍＭ ＮＨ_４ＯＡｃ、Ｂ＝ＡＣＮ；λ＝２５７ｎｍ、１％Ｂ〜５０％Ｂを１０分間、８０％Ｂによる洗浄を１５分実行；Ｃ_３８Ｈ_５９Ｎ_５Ｏ_１８Ｓ、分子量＝９０５．９６ｇ／ｍｏｌ；無色固体；Ｒ_ｔ＝９．２分、ＬＣ−ＭＳ＝９０６．３ｇ／ｍｏｌ；ＥＳＩ−ＭＳ＝９０６ （Ｍ＋Ｈ）^＋； ９０４ （Ｍ−Ｈ）⁻。

ＰＣ０１ＳＫ５６（２４原子スペーサー）。ＨＰＬＣグレードのミリ−Ｑ水および飽和ＮａＨＣＯ_３をアルゴンにより１０分間パージした。ＰＣ０１ＳＫ５４は、アルゴンをバブリングさせながら、１．０ｍＬのアルゴンでパージした水中に溶解した。溶液のｐＨを６．８まで増加させ、１．０ｍＬのＴＨＦ中に溶解したオレゴングリーン４８８マレイミドを反応混合物に追加した。反応は、分析ＨＰＬＣ（１０ｍＭ ＮＨ_４ＯＡｃ（ｐＨ＝７．０）；１０分間で１％Ｂ〜５０％Ｂ、８０％Ｂによる洗浄を１５分実行）によってモニタリングし、反応は１０分以内に完了した。ＴＨＦを蒸発させ、反応混合物は５．０ｍＬの７ｍＭリン酸緩衝液により希釈した。精製は、逆相分取ＨＰＬＣ（ウォーターズ社、ｘテラＣ_１８１０μｍ；１９×２５０ｍｍ）を使用して実行し、Ａ＝７ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．２）、Ｂ＝ＡＣＮ；λ＝４８８ｎｍ；溶媒勾配：１％Ｂ〜５０％Ｂを２５分間、８０％Ｂによる洗浄を４０分実行、（８９％）；逆相分析ＨＰＬＣ（ウォーターズ社、Ｘ−ブリッジＣ_１８５μｍ；３．０×１５０ｍｍ）を使用して解析され；Ａ＝１０ｍＭ ＮＨ_４ＯＡｃ、Ｂ＝ＡＣＮ；λ＝４８８ｎｍ、１％Ｂ〜５０％Ｂを１０分間、８０％Ｂによる洗浄を１５分実行；Ｃ_６２Ｈ_７０Ｆ_２Ｎ_６Ｏ_２５Ｓ；分子量＝１３６９．３１ｇ／ｍｏｌ；橙色固体（Ｒ_ｔ＝７．０分）；ＬＣ−ＭＳ＝１３７０．２； ＥＳＩ−ＭＳ＝Ｉ ３９１ （Ｍ＋Ｎａ）^＋。

以下の２４原子スペーサー化合物は、本明細書において記述される一般的な合成を使用して、本明細書において記述される化合物に類似する様式で調製した。

実施例Ｈ。以下のアレクサフルオル４８８結合体化合物は、ＰＣ０１ＳＫ５５でスタートし、本明細書において記述されるプロセスに従って調製した（式中、ｎ＝３）。

ｎが４〜約３０の整数である関連した類縁体もまた、本明細書において記述されるプロセスに従って調製できる。

実施例Ｉ〜Ｋ。以下のＤＵＰＡ造影剤結合体化合物（ＰＣ０１ＳＫ５１、ＰＣ０１ＳＫ４５およびＰＣ０ＳＫ４９）を、本明細書において記述されるプロセスに従って調製した（式中、ｎは５である）。

ＰＣ０１ＳＫ５１（２４原子スペーサーおよびアレクサフルオル６４７、分子量−２３００（インビトロゲン社から市販で入手可能））
ｎが０〜約１２の整数である関連した類縁体もまた、本明細書において記述されるプロセスに従って調製できる。

ＰＣ０１ＳＫ４５（２４原子スペーサーボディピー５０５、Ｃ６７Ｈ８７ＢＦ２Ｎ１３Ｏ２０Ｓ、分子量：１４７５．３５）
ｎが０〜約１２の整数である関連した類縁体もまた、本明細書において記述されるプロセスに従って調製できる。

（２４原子スペーサー−オレゴングリーン４８８、Ｃ７１Ｈ７６Ｆ２Ｎ１０Ｏ２４、分子量：１５２３．４８）
ｎが０〜約１２の整数である関連した類縁体もまた、本明細書において記述されたプロセスに従って調製できる。

リンカーの合成。前述の実施例の各々において、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ワング樹脂（ノバビオケム社；カタログ番号０４−１２−２０５０）からスタートする標準的なＦｍｏｃ ＳＰＰＳを使用して、リンカーを合成した；Ｃ_４７Ｈ_６５Ｎ_２Ｏ_１７Ｓ；分子量＝１０６０．１３ｇ／ｍｏｌ；白色固形物；Ｒ_ｔ＝７．７分；^１Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ_６／Ｄ_２Ｏ） δ０．９３ （ｍ， ２Ｈ）； １．０８ （ｍ， ５Ｈ）； １．２７ （ｍ， ５Ｈ）； １．６９ （ｍ， ２Ｈ）； １．９０ （ｍ， ２Ｈ）； １．９４ （ｍ， ２Ｈ）； ２．１０ （ｍ， ２Ｈ）； ２．２４ （ｑ， ２Ｈ）； ２．６２ （ｍ， ２Ｈ）； ２．７８ （ｍ， ４Ｈ）； ２．８８ （ｄｄ， １Ｈ）； ２．９６ （ｔ， ２Ｈ）； ３．０１ （ｄｄ， １Ｈ）； ３．３１ （ｄｄ， １Ｈ）； ３．６２ （ｄｄ， １Ｈ）； ３．８０ （ｑ， １Ｈ， αＨ ）； ４．０７ （ｍ， １Ｈ， αＨ）； ４．３７ （ｍ， １Ｈ， αＨ）； ４．４２ （ｍ， ２Ｈ， αＨ）； ４．６６ （ｍ， １Ｈ， αＨ）； ７．１８ （ｍ， １０Ｈ， Ａｒ−Ｈ）： ＬＣ−ＭＳ＝１０６１ （Ｍ＋Ｈ）_＋； ＥＳＩ−ＭＳ＝１０６１ （Ｍ＋Ｈ）^＋。

ＰＣ０１ＳＫ５１（アレクサフルオル６４７結合体）、ＰＣ０１ＳＫ４５（ボディピー結合体）およびＰＣ０１ＳＫ４９（オレゴングリーン４８８結合体）の合成。ＨＰＬＣグレードのミリ−Ｑ水および飽和ＮａＨＣＯ_３を１０分間アルゴンでパージした。リンカーは、アルゴンをバブリングさせながらアルゴンパージした１．０ｍＬ中のものに溶解した。溶液のｐＨを６．８まで増加させ、１．０ｍＬのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中に溶解した、アレクサフルオルマレイミド、ボディピーマレイミドまたはオレゴングリーン４８８マレイミドをそれぞれ、反応混合物に追加した。反応の進行を、分析ＨＰＬＣ（１０ｍＭ ＮＨ_４ＯＡｃ（ｐＨ＝７．０）；１０分間で１％Ｂ〜５０％Ｂ、８０％Ｂによる洗浄を１５分実行）によってモニタリングし、反応は１０分以内に完了した。ＴＨＦを蒸発させ、反応混合物を５．０ｍＬの１ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．２）で希釈した。

化合物は、逆相分取ＨＰＬＣ（ウォーターズ社、ｘテラＣ_１８５μｍ；１８×１５０ｍｍ）を使用して精製し、Ａ＝１ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ＝７．２、Ｂ＝ＡＣＮ；λ＝６４７または４８８ｎｍ；溶媒勾配：１％Ｂ〜５０％Ｂを２５分間、８０％Ｂによる洗浄を４０分実行；逆相分析ＨＰＬＣ（ウォーターズ社、Ｘ−ブリッジＣ_１８５μｍ；３．０×５０ｍｍ）を使用して解析した；Ａ＝１０ｍＭ ＮＨ_４ＯＡｃ、Ｂ＝ＡＣＮ；λ＝５８８または４８８ｎｍ、１％Ｂ〜５０％Ｂを１０分間、８０％Ｂによる洗浄を１５分実行。

ＰＣ０１ＳＫ５１：分子量〜２３６０．１３ｇ／ｍｏｌ；青色固体（Ｒ_ｔ＝６．７分）；（アレクサフルオル６４７の構造は公知でない）；
ＰＣ０１ＳＫ４５：Ｃ_６７Ｈ_８７ＢＦ_２Ｎ_１３Ｏ_２０Ｓ；分子量＝１４７５．３５ｇ／ｍｏｌ；橙色固体（Ｒ_ｔ＝７．６分）；ＬＣ−ＭＳ＝１４７５．３ （Ｍ＋Ｈ）^＋；
ＰＣ０１ＳＫ４９：Ｃ_７１Ｈ_７６Ｆ_２Ｎ_１０Ｏ_２４Ｓ；分子量＝１５２３．４８ｇ／ｍｏｌ；橙色固体（Ｒ_ｔ＝６．７分）；ＬＣ−ＭＳ＝Ｉ ５２４ （Ｍ＋Ｈ）^＋。

実施例Ｌ。ＰＣ０１ＳＫ６８について図示される結合体化のためのＰＳＭＡジスルフィドリンカー中間体の一般的合成。

ＰＣ０１ＳＫ６８は、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ワング樹脂（ノバビオケム社；カタログ番号０４−１２−２０５０）からスタートする標準的なＦｍｏｃ ＳＰＰＳを使用して合成し、逆相分取ＨＰＬＣ（ウォーターズ社、ｘテラＣ_１８１０μｍ；１９×２５０ｍｍ）を使用して精製し、Ａ＝０．１ＴＦＡ、Ｂ＝ＡＣＮ；λ＝２５７ｎｍ；溶媒勾配：１％Ｂ〜５０％Ｂを３０分間、８０％Ｂによる洗浄を４０分実行、（６８％）；逆相分析ＨＰＬＣ（ウォーターズ社、Ｘ−ブリッジＣ_１８５μｍ；３．０×１５ｍｍ）を使用して解析した；Ａ＝０．１ＴＦＡ、Ｂ＝ＡＣＮ；λ＝２５７ｎｍ、１％Ｂ〜５０％Ｂを１０分間、８０％Ｂによる洗浄を１５分実行。Ｃ_３２Ｈ_４２Ｎ_６Ｏ_１７Ｓ；分子量＝８１４．７７ｇ／ｍｏｌ；白色固形物；Ｒ_ｔ＝８．２分；^１Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＯＳ−ｄ_６／Ｄ_２Ｏ） δ １．７０ （ｍ， ３Ｈ）； １．９０ （ｍ， ３Ｈ）； ２．１０ （ｍ， ２Ｈ）； ２．１７ （ｍ， ２Ｈ）； ２．２３ （ｍ， ２Ｈ）； ２．３６ （ｍ， １Ｈ）； ２．５９ （ｄｄ， １Ｈ）； ２．７９ （ｍ， ３Ｈ）； ３．０４ （ｄｄ， １Ｈ）； ４．０７ （ｍ， ２Ｈ， αＨ）； ４．１３ （ｍ， １Ｈ， αＨ）； ４．３７ ［ｍ， １Ｈ， α−Ｈ］； ４．４７ （ｍ， ２Ｈ， α−Ｈ）； ７．１９ （ｍ， ５Ｈ， Ａｒ−Ｈ）； ７．８７ （ｄ ， Ｕｒｅｓ−ＮＨ）； ８．２０ （ｄ， １Ｈ， 尿素−ＮＨ）； ＬＣ−ＭＳ＝８１５．３ （Ｍ＋Ｈ）^＋。

実施例Ｍ。ＰＣ０１ＳＫ２８Ｌについて図示される結合体化のためのＰＳＭＡジスルフィドリンカー中間体の一般的合成。

ＰＣ０１ＳＫ２８は、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ワング樹脂（ノバビオケム社；カタログ番号０４−１２−２０５０）からスタートする標準的なＦｍｏｃ−ＳＰＰＳを使用して合成し；逆相分取ＨＰＬＣ（ウォーターズ社、ｘテラＣ_１８１０μｍ；１９×２５０ｍｍ）を使用して精製し、Ａ＝０．１ＴＦＡ、Ｂ＝ＡＣＮ；λ＝２５７ｎｍ；溶媒勾配：５％Ｂ〜８０％Ｂを２５分間、８０％Ｂによる洗浄を３０分実行、（６１％）；逆相分析ＨＰＬＣ（ウォーターズ社、Ｘ−ブリッジＣ_１８５μｍ；３．０×１５ｍｍ）を使用して解析した；Ａ＝０．１ＴＦＡ、Ｂ＝ＡＣＮ；λ＝２５７ｎｍ、５％Ｂ〜８０％Ｂを１０分間、８０％Ｂによる洗浄を１５分実行。ＰＣ０１ＳＫ２８Ｌ：Ｃ_４７Ｈ_６５Ｎ_２Ｏ_１７Ｓ；分子量＝１０６０．１３ｇ／ｍｏｌ；白色固形物；Ｒ_ｔ＝７．７分；^１ Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳＯ−ｄ_６／Ｄ_２Ｏ） δ ０．９３ （ｍ， ２Ｈ）； １．０８ （ｍ， ５Ｈ）； １．２７ （ｍ， ５Ｈ）； １．６９ （ｍ， ２Ｈ）； １．９０ （ｍ， ２Ｈ）； １．９４ （ｍ， ２Ｈ）； ２．１０ （ｍ， ２Ｈ）； ２．２４ （ｑ， ２Ｈ）； ２．６２ （ｍ， ２Ｈ）； ２．７８ （ｍ， ４Ｈ）； ２．８８ （ｄｄ， １Ｈ）； ２．９６ （ｔ， ２Ｈ）； ３．０１ （ｄｄ， １Ｈ）； ３．３１ （ｄｄ， １Ｈ）； ３．６２ （ｄｄ， １Ｈ）； ３．８０ （ｑ， １Ｈ， αＨ ）； ４．０７ （ｍ， １Ｈ， αＨ）； ４．３７ （ｍ， １Ｈ， αＨ）； ４．４２ （ｍ， ２Ｈ， αＨ）； ４．６６ （ｍ， １Ｈ， αＨ）； ７．１８ （ｍ， １０Ｈ， Ａｒ−Ｈ）： ＬＣ−ＭＳ＝１０６１ （Ｍ＋Ｈ）_＋； ＥＳＩ−ＭＳ＝１０６１ （Ｍ＋Ｈ）^＋。

前述の例示的な実施形態は本発明の例証となるように意図されているのであって、いかなる方法でも本明細書において記述される本発明を限定するように説明または解釈されるべきでない。

（実施例１９）
＜蛍光励起細胞分取装置（ＦＡＣＳ）を使用する蛍光団依存解析＞
ＬＮＣａＰ細胞をＴ７５フラスコ中に播種し、３７℃、５％−ＣＯ_２雰囲気中で、グルタミン含有ＲＰＭＩ（２ｍＭ、ギブコ社ＲＰＭＩ培地１６４０、カタログ番号２２４００）プラス１０％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）、１％ピルビン酸ナトリウム（１００ｍＭ）および１％ＰＳ（ペニシリン・ストレプトマイシン）中で接着単層に４８時間増殖させた。細胞をトリプジナイス（ｔｒｙｐｚｉｎｙｓｅｄ）し、等量の細胞（５０，０００細胞／チューブ）を７本の遠心分離チューブへ移した。
チューブ番号 基質
１ 基質なし；１．０ｍＬの培地＝＞陰性対照（図９ａ）
２ １．０ｍＬの培地中の１μＭのＰＣ０１ＳＫ５９（図９ｂ）
３ １．０ｍＬの培地中の１μＭのＰＣ０１ＳＫ５８（図１０ｂ）
４ １．０ｍＬの培地中の１μＭのＰＣ０１ＳＫ５１（図１１ｂ）
５ １．０ｍＬの培地中の１μＭのＰＣ０１ＳＫ５６（図１２ｂ）
６ １．０ｍＬの培地中の１μＭのＰＣ０１ＳＫ４５（図１３ｂ）
７ １．０ｍＬの培地中の１μＭのＰＣ０１ＳＫ４９（図１４ｂ）

サンプルは３７℃で４５分間、５％−ＣＯ_２雰囲気中でインキュベートした。細胞は、１．０ｍＬのＲＰＭＩ培地により２回およびトリス緩衝液により１回洗い流した。１ｍＬのトリス緩衝液を各チューブに追加し、個々のＦＡＣＳバイアルへ移した。データーはフローサイトメーターを使用して、各サンプルについて得た。

（実施例２０）
＜共焦点顕微鏡を使用する蛍光標識解析＞
ＬＮＣａＰ細胞を６ウェルのファルコン（Falcon）社プレート中に播種し、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気中で、グルタミン含有ＲＰＭＩ（２ｍＭ）（ギブコ社ＲＰＭＩ培地１６４０、カタログ番号２２４００）プラス１０％のＦＢＳ（ウシ胎仔血清）、１％ピルビン酸ナトリウム（１００ｍＭ）および１％ＰＳ（ペニシリン・ストレプトマイシン）中で接着単層に４８時間増殖させた。３つのウェル中の細胞を、ＰＣ０１ＳＫ５８（１μＭ；図１５（ａ）、（ｉ））またはＰＣ０１ＳＫ４９（１μＭ；図１５（ｂ）、（ｉ））またはＰＣ０１ＳＫ５１（１μＭ；図１５（ｃ）、（ｉ））と共に、３７℃で１時間、５％ＣＯ_２雰囲気中でインキュベートした。他の３つのウェル中の細胞を３７℃で３０分間、５％のＣＯ_２雰囲気中でＰＭＰＡ（競合）と共にインキュベートし、次に５％ＣＯ_２雰囲気中でＰＣ０１ＳＫ５８（１μＭ；図１５（ａ）、（ｉｉｉ））またはＰＣ０１ＳＫ４９（１μＭ；図１５（ｂ）、（ｉｉｉ））またはＰＣ０１ＳＫ５１（１μＭ；図１５（ｃ）、（ｉｉｉ））と共に３７℃で１時間インキュベートした。細胞を１．０ｍＬのＲＰＭＩにより３回洗い流し、次に２ｍＬのＲＰＭＩ培地を各ウェルに追加した。共焦点顕微鏡写真を各ウェルについて撮り、蛍光標識および競合（ＰＳＭＡに対するリガンドの結合特異性）を示した。

（実施例２１）
＜ＦＡＣＳを使用する血液スパイキング解析＞
ＬＮＣａＰ細胞をＴ７５フラスコ中に播種し、３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気中で、グルタミン含有ＲＰＭＩ（２ｍＭ）（ギブコ社ＲＰＭＩ培地１６４０、カタログ番号２２４００）プラス１０％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）、１％ピルビン酸ナトリウム（１００ｍＭ）および１％ＰＳ（ペニシリン・ストレプトマイシン）で、４８時間接着単層に増殖させた。細胞をトリプシン処理し、２×１０^６細胞を遠心分離チューブへ移した。ＬＮＣａＰ細胞を３７℃、５％−ＣＯ_２雰囲気中でＤＩＤ（１μＭ）と共に２０分間インキュベートした。ＤＩＤ標識ＬＮＣａＰ細胞を遠心分離チューブ中の健康なドナー血液サンプル（４．０ｍＬ）へ移した。ロゼットセップ手順は、血液（４．０ｍＬ）中のＤＩＤ標識ＬＮＣａＰ細胞、およびさらに別個の遠心分離チューブ中のＬＮＣａＰ細胞を含まない血液サンプル（１．０ｍＬ）に従った。

簡潔には、血液サンプル、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ、フィコールパックおよび遠心分離機を、室温で保った。ロゼットセップヒト循環上皮性腫瘍細胞濃縮カクテルを、５０μＬ／ｍＬ全血の割合で添加（例えば、１００μＬのカクテルを２ｍＬの全血に添加）し、十分に混合した。サンプルを２０分間室温でインキュベートした。サンプルを等容量のＰＢＳ＋２％ＦＢＳにより希釈し、穏やかに混合した。希釈サンプルを、フィコール−パック（３ｍＬ）の上に重層した。サンプルは、ブレーキをオフにして室温で１２００×ｇで２０分間遠心分離した。濃縮細胞をフィコール−パック（血漿境界面）から取り出し、ＬＮＣａＰ細胞を含まない血液サンプルから血漿境界面を取り出した。ある場合において、特に非常にまれな細胞が濃縮されるときには、境界面での細胞の可視化は困難かもしれないことが理解される。それらの場合において、いくらかのフィコール−パックは、細胞の完全な回収を保証するために、濃縮細胞と共に取り出してもよい。

濃縮細胞をＰＢＳ＋２％ＦＢＳにより２回および塩化アンモニウムにより１回洗浄し、赤血球を除去した。等量の濃縮細胞（ＤＩＤ標識ＬＮＣａＰ細胞）を、１．０ｍＬのＲＰＭＩ培地を含む４本の遠心分離チューブ（〜５０，０００細胞／チューブ）（チューブ番号２〜５）に移し、ＬＮＣａＰ細胞を含まない血液サンプルから等容量の血漿境界面を、１．０ｍＬのＲＰＭＩ培地のもう１本の遠心分離チューブ（チューブ番号１）に移した。
サンプル番号（チューブ番号） 追加した基質
１（血漿境界面） １μＭのＰＣ０１ＳＫ６４＝＞図１６（ａ）（ｉ）
２（血漿境界面におけるＤＩＤ標識ＬＮＣａＰ細胞）
１μＭのＰＣ０１ＳＫ５９＝＞図１６（ａ）（ｉｉ）
３（血漿境界面におけるＤＩＤ標識ＬＮＣａＰ細胞）
１μＭのＰＣ０１ＳＫ６３＝＞図１６（ｂ）（ｉｉ）
４（血漿境界面におけるＤＩＤ標識ＬＮＣａＰ細胞）
１μＭのＰＣ０１ＳＫ６４＝＞図１６（ｃ）（ｉｉ）
５（血漿境界面におけるＤＩＤ標識ＬＮＣａＰ細胞）
１μＭのＰＣ０１ＳＫ５８＝＞図１６（ｄ）（ｉｉ）

１００μＬの基質（１０μＭストック溶液から）を上で示されるような各遠心分離チューブに追加し、サンプルを３７℃で４５分間、５％ＣＯ_２雰囲気でインキュベートした。サンプルをＲＰＭＩ培地により２回、トリス緩衝液により１回洗浄し、フローサイトメトリー分析を行なった。

ＤＩＤで標識された％・対・ＦＩＴＣで標識された％のドットプロットを、ＰＳＭＡに対する各化合物の結合親和性を決定するために使用した。％蛍光・対・スペーサー長のプロットから（図１７）、ＰＣ０１ＳＫ６４は４つの化合物のＰＳＭＡについて最良の結合親和性を有していた。

（実施例２２）
＜ＦＡＣＳ分析を使用する前立腺癌患者血液サンプル中の循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の検出＞
サンプル：
１）５人の健康なドナーの血液サンプル（６．０〜８．０ｍＬ／ドナー）。データーを３人のドナーについて示す（図１８（ａ））。
２）メイヨークリニック（Mayo clinic）（ロチェスター、ミネソタ）から受け入れた５人の前立腺癌患者の血液サンプル（６．０〜８．０ｍＬ／ドナー）。３人の患者（図１８（ｂ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ））について、データーを示す。

各血液サンプルを３本の遠心分離チューブ（２．０ｍＬ／チューブ）へと分割し、ロゼットセップ手順を各サンプルについて個別に行なった。簡潔には、血液サンプル、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ、フィコールパックおよび遠心分離機を室温で保った。ロゼットセップヒト循環上皮性腫瘍細胞濃縮カクテルを、５０μＬ／ｍＬ全血の割合で添加（例えば、１００μＬのカクテルを２ｍＬの全血に添加）し、十分に混合した。サンプルを室温で２０分間インキュベートした。等容量のＰＢＳ＋２％ＦＢＳによりサンプルを希釈し、穏やかに混合した。希釈サンプルを、フィコール−パック（３ｍＬ）の上に重層した。サンプルは、ブレーキをオフにして室温で１２００×ｇで２０分間遠心分離した。血漿境界面を各サンプルのフィコール−パックから取り出した。

血漿境界面を、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳにより２回および塩化アンモニウムにより１回洗浄し、赤血球を除去した。１ｍＬの培地を各遠心分離チューブに追加し、２００μＬのＣＤ４５−アレクサフルオル６４７（１μＭ、抗体）を各サンプルに追加した。１００μＬのＰＣ０１ＳＫ６４（１０μＭストック溶液から）を各サンプルに追加し、３７℃で４５分間、５％−ＣＯ_２雰囲気で、インキュベートした。ＦＡＣＳ分析を実行する前に、細胞をＲＰＭＩ培地により２回およびトリス緩衝液により１回洗浄した。

ＣＤ４５−アレクサフルオル６４７標識細胞・対・ＦＩＴＣ標識された細胞のドットプロットを、血液サンプル中のＣＴＣの数を計算するために使用した（図１８（ａ）、（Ｉ）；領域２またはゲート２）。癌コール（call）の大きさおよび粒度に起因して、それらはＲ２領域（ゲート）に出現する。ＣＴＣ被験者識別番号のグラフを、前立腺癌患者の血液中の循環腫瘍細胞の数を決定するために使用した。

（実施例２３）
＜フォレート−システインの合成＞
標準的なＦｍｏｃペプチド化学を、葉酸のγ−ＣＯＯＨに結合されたシステインによりフォレート−システインを合成するために使用した。塩基としてのジイソプロピエチルアミン、およびＦｍｏｃ基の脱保護のためのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の２０％のピペリジンと共に、活性化剤としてのＨＢＴＵおよびＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールによるＦｍｏｃ化学によって、配列Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−プテロイン酸（フォレート−Ｃｙｓ）を構築した。α−ｔ−Ｂｏｃ保護Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−Ｌ−グルタミン酸を、２−クロロトリチル樹脂に結合されたトリチル保護Ｃｙｓに結合した。次に、Ｎ１０−トリフルオロアセチルプテロイル酸をＧｌｕのγ−ＣＯＯＨに結合した。フォレート−Ｃｙｓを、９２．５％トリフルオロ酢酸−２．５％水−２．５％トリイソプロピルシラン−２．５％エタンジチオ溶液を使用して、樹脂から切断した。ジエチルエーテルを使用して生成物を沈殿させ、沈殿物を遠心分離によって回収した。生成物をジエチルエーテルにより２回洗浄し、真空下で一晩乾燥した。Ｎ１０−トリフルオルアセチル保護基を除去するために、生成物を１０％水酸化アンモニウム溶液で溶解し、室温で３０分間撹拌した。システインのジスルフィド形成を阻害するために、溶液を窒素気流下で全ての時間保った。３０分後に、化合物が沈殿するまで、塩酸を溶液に追加した。生成物を遠心分離によって回収し、凍結乾燥した。生成物を質量分光分析によって解析および確認した（分子量５４４、Ｍ＋５４５）。

（実施例２４）
＜フォレート−Ｃｙｓ−アレクサフルオル４８８の合成＞
アレクサフルオル４８８ Ｃ５マレイミド（モレキュラー・プローブ社、ユージーン、オレゴン）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解した（５０μｌのＤＭＳＯ中に０．５ｍｇ）。１．５モル当量（０．５７ｍｇ）のフォレート−Ｃｙｓを溶液に追加し、室温で４時間混合した。フォレート−Ｃｙｓ−アレクサフルオル４８８（フォレート−アレクサフルオル）を、１ｍｌ／分の流速でＣ１８カラムの逆相ＨＰＬＣによって精製した。１０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ７．０）（溶出液Ａ）およびアセトニトリル（溶出液Ｂ）からなる移動相を、最初の１分間はＡ：Ｂが９９：１の比率で維持し、次に次の２９分にわたり直線的勾配でＡ：Ｂを１：９９まで変化させた。フォレート−Ｃｙｓ−アレクサフルオル４８８は２０分で溶出された。生成物を質量分析法によって確認し、生物学的活性を、培養におけるフォレート受容体陽性のＭ１０９細胞上の細胞表面のフォレート受容体に対するその結合の蛍光測定によって確認した。

（実施例２５）
＜フォレート結合体の固相合成＞
フォレートの前駆体（Ｎ^１０−ＴＦＡ−プテロイン酸）を標準手順に従って合成した。反応前にＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−ワング樹脂を窒素バブリングと共に２０分間ＤＭＦ中で浸漬した。２０％ピペリジンを追加し、Ｆｍｏｃ保護基を切断した。４当量のＤＩＰＥＡに加えて、ＤＭＦ中で溶解した２．５当量のＦｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ、ＨＯＢＴおよびＨＢＴＵも、反応漏斗へ追加した。室温での２時間の窒素バブリング後に、Ｆｍｏｃ切断工程を２０％ピペリジンにより繰り返した。次に、４当量のＤＩＰＥＡに加えて、１：１のＤＭＦ／ＤＭＳＯ（ジメチルホルムアミド／ジメチルスルホキシド）中に溶解した１．５当量のＮ^１０−ＴＦＡ−プテロイン酸ならびに２．５当量のＨＯＢＴおよびＨＢＴＵも、窒素によるバブリングと共に反応へ４時間かけて追加した。次に生成物を、ＤＭＦ、ＤＣＭ（ジクロロメタン）、メタノールおよびイソプロピルアルコールにより完全に洗浄し、窒素下で乾燥した。１％ＴＦＡ／ＤＣＭ（トリフルオロ酢酸／ジクロロメタン）を使用してＭｔｔ（Ｍｔｔ＝４−メチル−トリチル）基を切断した。２．５当量のＲｄ−ＩＴＣ（ＤＭＦ中に溶解）および４当量のＤＩＰＥＡを樹脂へ追加し、反応は減光条件下で室温で一晩行なった。結合体の切断をＴＦＡ：ＴＩＰＳ：Ｈ_２Ｏ（９５：２．５：２．５）によって行なった。粗製生成物を冷エーテルによる沈殿によって回収した。粗製生成物を一晩凍結乾燥した。２日目に、窒素バブリングと共に１０％水酸化アンモニウム（ｐＨ＝１０）を４５分間使用して、粗製生成物を加水分解した。生成物を凍結乾燥によって回収した。分取ＨＰＬＣ（リゲル）を使用して、精製を実行した。

（実施例２６）
＜フォレートオレゴングリーン４８８の合成＞

Ｎ^１０ＴＦＡ−プテロイン酸を以下のように合成した。ユニバーサルフォレート樹脂は、ユニバーサルノバタッグ（NovaTag）（商標）樹脂（ノバビオケム社；カタログ番号０４−１２−３９１０）を使用して合成した。ＤＣＭ（ジクロロメタン）中で１時間、および次にＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）により３０分間樹脂を膨潤した後に、Ｆｍｏｃ（フルオレンルメチルオキシカルボニル（Fluorenlmethyloxycarbonyl））保護基の脱保護を、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンの溶液を使用することによって行なった。次に、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ（３倍モル過剰）を、ＤＭＦ中のＨＡＴＵ［２−（１Ｈ−７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート］（３倍モル過剰）およびＤＩＰＥＡ（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン）（１０倍モル過剰）を使用して、脱保護二級アミンへカップリングした。この樹脂の完全な洗浄後に、上述されるようにＧｌｕ上のＦｍｏｃを除去し、Ｎ^１０−ＴＦＡプテロイン酸を、標準的なＦｍｏｃ固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）手順を使用してカップリングした。次に、ペンダントＭｍｔ（４−メトキシトリチル）を、ＤＣＭ／ＴＦＥ（トリフルオロエタノール）中の１Ｍ ＨＯＢＴ（１−ヒロキシベンゾトリアゾール（Hyroxybenzotriazole））により除去した。この時点で樹脂をＤＭＦにより洗浄し、さらなる合成のために直ちに使用するか、またはＤＣＭ、ＤＭＦおよびＭｅＯＨ（メタノール）により連続して洗浄し、後の使用のために乾燥できる。脱保護アミン反応性ユニバーサルフォレート樹脂へ、１．５倍モル過剰のオレゴングリーン４８８カルボン酸スクシンイミジルエステル６異性体（０−６１４９）および３倍モル過剰のＤＩＰＥＡを室温で１２時間反応させた。次にＤＭＦ、ＤＣＭおよびメタノールにより樹脂を完全に洗い流し、２時間乾燥した。次にフォレート−オレゴングリーン４８８を、９５％トリフルオロ酢酸−２．５％水−２．５％トリイソプロピルシラン溶液により樹脂から切断した。ジエチルエーテルを使用して生成物を沈殿させ、沈殿物を遠心分離によって回収した。生成物をジエチルエーテルにより２回洗浄し、真空下で一晩乾燥した。Ｎ^１０−トリフルオルアセチル保護基を除去するために、生成物を１０％水酸化アンモニウム溶液中に溶解し、室温で３０分間撹拌した。生成物をイソプロパノールおよびエーテルの組み合わせにより沈殿し、沈殿物を遠心分離によって回収した。１ｍｌ／分の流速でＣ１８カラムの逆相ＨＰＬＣによって、生成物を精製した。１０ｍＭのＮＨ_４ＨＣＯ_３緩衝液（ｐＨ７．０）（溶出液Ａ）およびアセトニトリル（溶出液Ｂ）からなる移動相を、最初の１分間はＡ：Ｂが９９：１の比率で維持し、次に次の２９分にわたり直線的勾配でＡ：Ｂを１：９９まで変化させた。生成物をＭＳおよびＮＭＲによって確認した。

（実施例２７）
＜フォレートダイライト６８０の合成＞

ダイライト６８０マレイミド（ピアース（Pierce）社）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解した（１００μＬのＤＭＳＯ中で１ｍｇ）。３倍モル過剰のフォレート−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ（Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters、１６巻、２０号、２００６年１０月１５日、５３５０〜５３５５ページに以前に記述されるように合成した）を、溶液へ追加し、室温で４時間混合した。フォレート−ダイライト６８０を１ｍｌ／分の流速でＣ１８カラムの逆相ＨＰＬＣによって精製した。１０ｍＭのＮＨ_４ＨＣＯ_３緩衝液（ｐＨ７．０）（溶出液Ａ）およびアセトニトリル（溶出液Ｂ）からなる移動相を、最初の１分間はＡ：Ｂが９９：１の比率で維持し、次に次の２９分にわたり直線的勾配でＡ：Ｂが１：９９まで変化させた。生成物をＭＳおよびＮＭＲによって確認した（（Ｃ_８３Ｈ_１０３Ｎ_１９Ｏ_３０Ｓ_４）^２−、正確な質量：１９７３．６０；分子量：１９７５．０８；Ｃ、５０．４７；Ｈ、５．２６；Ｎ、１３．４７；Ｏ、２４．３０；Ｓ、６．４９）。

（実施例２８）
＜ローダミンＰＥＧ結合体の合成＞

ａ）ピペリジン、ＤＭＦ；ｂ）Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ（１）、ＨＯＢｔ、ＨＢＴＵ、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦ；ｃ）プテロイン酸（２）、ＨＯＢｔ、ＨＢＴＵ、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦ；ｄ）１％ＴＦＡ、ＣＨ_２Ｃｌ_２；ｅ）Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−ＯＨ（３）、ＨＯＢＴ、ＨＢＴＵ、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦ；ｆ）Ｓ−トリチル−３−メルカプトプロピオン酸（４）、ＨＯＢＴ、ＨＢＴＵ、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦ；ｇ）ローダミン−ＩＴＣ（５）、ＤＩＰＥＡ；ｈ）９４．５％ＴＦＡ、２．５％Ｈ_２Ｏ、２．５％ＥＤＴ；１％ＴＩＳ；ｉ）ＮＨ_４ＯＨ。

前述のスキームにおいて、Ｒは下記を表わす。

＜ＰＥＧアンカーとしてのフォレート−ローダミン−ＳＨの合成＞
標準的なＦｍｏｃペプチド化学を使用して、葉酸のγ−ＣＯＯＨ末端に結合された２つのリジンからなるスペーサー経由でローダミンＢ−イソチオシアネートへ結合したフォレートを合成した。配列Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−（γ）Ｇｌｕ−プテロイン酸を、塩基としてのジイソプロピエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）と共に、活性化剤としてＨＢＴＵおよびＨＯＢＴ（ノバビオケム社、サンディエゴ、カリフォルニア）によるＦｍｏｃ化学によって構築した。Ｆｍｏｃ基をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の２０％ピペリジンにより脱保護した。ε−アミン上に４−メチルトリチル保護基を含むα−Ｆｍｏｃ保護リジンをロードしたワング樹脂を、フォレートについてのアンカーとして使用した。Ｎ^１０−トリフルオロアセチルプテロイル酸（シグマ社、セントルイス、ミズーリ）をグルタミン酸アミンへ結合した後に、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕをリジンのα−アミンへ結合し、フォレートのγ結合結合体を形成した。リジンのε−アミン上にメトキシトリチル（Ｍｔｔ）保護基をジクロロメタン中の１％トリフルオロ酢酸により除去し、第２のＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−ＯＨを結合させた。第２のリジンのＭｔｔ保護基の除去後に、Ｓ−トリチル保護３−メカプトプロピオン酸（mecaptopropionic acid）を、カップリング試薬（ＨＯＢＴおよびＨＢＴＵ）を使用して、上述されるように、第２のリジンのα−アミンへカップリングした。最後に、第２のリジンのＭｔｔ保護基を除去し、ＤＩＰＥＡの存在下においてペプチドと共にＤＭＦ中に溶解したローダミンＢイソチオシアネート（シグマ社、セントルイス、ミズーリ）を一晩反応させ、次にペプチド樹脂ビーズから完全に洗浄した。樹脂をジクロロメタンおよびメタノールにより数回洗浄し、数時間Ｎ_２下で放置して乾燥させた。次にフォレート−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−メルカプトプロピオン酸−ローダミンペプチドを、９５％ＴＦＡ／２．５Ｈ_２Ｏ／２．５％ＴＩＳ／２．５％ＥＤＴ溶液により３〜４時間かけて樹脂から切断した。氷冷ジエチルエーテルを使用して生成物を沈殿させ、沈殿物を遠心分離によって回収した。次に生成物をジエチルエーテルにより３回洗浄し、真空下で乾燥した。フォレート部分からＮ^１０−トリフルオルアセチル保護基を除去するために、生成物を１０％水酸化アンモニウム溶液中で溶解し、アルゴン下で室温で３０分間撹拌してジスルフィド結合の形成を阻害した。次に乾燥するまで生成物を凍結乾燥し、アルゴン下で保存した。生成物を質量分光分析によって確認した（［Ｍ−］計算されたもの、１２８６．５；見出されたもの、１２８５．０８）。

＜フォレート−ＰＥＧ（５ｋ）−ローダミン、フォレート−ＰＥＧ（２０ｋ）−ローダミンおよびフォレート−ＰＥＧ（６０ｋ）−ローダミンの合成＞
上述されるように合成されたフォレート−ローダミン−ＳＨアンカーを使用して、マレイミド活性化ＰＥＧ（５ｋ）、ＰＥＧ（２０ｋ）またはＰＥＧ（６０ｋ）（ネクター・セラピューティックス（Nektar Therapeutics）社、サンカルロス、カリフォルニア）と共に反応させた。ＰＥＧ−ＭＡＬ分子をＰＢＳ中で溶解し、５倍モル過剰のフォレート−ローダミン−ＳＨを溶液へ追加し、窒素下で室温で一晩撹拌した。次に、未反応フォレート−ローダミンを、水中で平衡化した粗粒セファデックスＧ−５０カラム（球状タンパク質についての分画範囲：１，５００〜３０，０００、シグマ社、セントルイス、ミズーリ）を使用、およびサンプルを流すために重力を使用して、ゲル濾過クロマトグラフィーによってフォレート−ＰＥＧ−ローダミン結合体から分離した。フォレート−ＰＥＧ−ローダミンのピークを回収し、凍結乾燥し、動物研究のためにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で再懸濁した。

＜フォレート−ＰＥＧ−ローダミン結合体の分子量の特性評価＞
フォレート−ＰＥＧ−ローダミン結合体の見かけの分子量を明らかにするために、それらのＶ_ｅ／Ｖ_ｏ比率を、既知の分子量のタンパク質スタンダードのＶ_ｅ／Ｖ_ｏと比較した（Ｖ_ｅは溶出量であり、Ｖ_ｏはボイド容量である）。カラムは、５ｍｌ／分の流速で室温のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（ｐＨ７．４））中で流した。カラムのボイド容量（Ｖ_ｏ）を、サンプル適用の時点から流出ピークの中央までに回収される流出物の容量の測定によって、６１０ｎｍでのブルーデキストラン（分子量、およそ２，０００，０００、シグマ社、セントルイス、ミズーリ）についての溶出量で、分光測光的に決定した。個々のタンパク質スタンダードをＰＢＳ中に溶解し、２８０ｎｍでの吸光度読み取りはそれらの溶出時間に従った。タンパク質スタンダードの溶出量（Ｖ_ｅ）を、サンプル適用の時点から流出ピークの中央までに回収される流出物の容量の測定によって決定した。フォレート−ＰＥＧ−ローダミン結合体のＶ_ｅを決定するために、サンプルをカラム上に適用し、ブルーデキストランおよびタンパク質スタンダードについて使用されるのと同一の流速で流した。フォレート−ＰＥＧ−ローダミン結合体のＶ_ｅを、スタンダードへ適用されものと同一の方法を使用して決定された。タンパク質スタンダードの既知の分子量の対数・対・それぞれのＶ_ｅ／Ｖ_ｏ値のプロットにより、直線検量線を生成する。すべてのフォレート−ＰＥＧ結合体の分離の目的のために、２つの異なるセファクリルＨＲカラムを使用した。２４ｃｍ×１．０ｃｍセファクリル１００−ＨＲ（分子量範囲１０００〜１０，０００Ｄａ）は、フォレート−ＰＥＧ（５ｋ）−ローダミン結合体を分離できたが、フォレート−ＰＥＧ（２０ｋ）−ローダミン結合体およびフォレート−ＰＥＧ（６０ｋ）−ローダミン結合体は分離できなかった。後者の２つの結合体は、２２ｃｍ×１．０ｃｍのセファクリル２００−ＨＲ（分子量範囲５〜２５０ｋＤａ）上で分離された。セファクリル１００−ＨＲ上で使用するタンパク質スタンダードは、ブラジキニンフラグメント２−９（ＭＷ〜９０４）、ウシ肺からのアプロチニン（ＭＷ６，５１１．４４）、ウマ心臓からのミオグロビン（ＭＷ〜１７，０００）、ウシ赤血球からのカルボニックアンヒドラーゼ（ＭＷ〜２９，０００）、アルブミン（ＭＷ〜６６，０００）、アルドラーゼ（ＭＷ〜１６１，０００）であった。セファクリル２００−ＨＲ上で使用するタンパク質スタンダードは、ウマ心臓からのミオグロビン（ＭＷ〜１７，０００）、ウシ赤血球からのカルボニックアンヒドラーゼ（ＭＷ〜２９，０００）、アルブミン（ＭＷ〜６６，０００）、酵母からのアルコール脱水素酵素（ＭＷ〜１５０，０００）、サツマイモからのβ−アミラーゼ（ＭＷ〜２００，０００）、ウマ脾臓からのアポフェリチン（ＭＷ〜４４３，０００）、ウシチログロブリン（ＭＷ〜６６９，０００）であった。

＜フォレート−ＰＥＧ−ローダミン結合体についてのフォレート／ローダミン比率の特性評価＞
すべてのフォレート−ＰＥＧ−ローダミン結合体のローダミンに対するフォレートの比率を決定するために、最初に水中の葉酸およびローダミン−イソチオシアネートの吸光係数を、２つの異なる波長（２８０ｎｍおよび５６０ｎｍ）のこれらの両方の波長で構築するスタンダード曲線によって決定した。これらのスタンダード曲線の勾配は、水中の葉酸およびローダミン−イソチオシアネートの吸光係数に相当する。次にフォレート−ＰＥＧ−ローダミン結合体のサンプルを水中に溶解し、それらの２８０ｎｍおよび５６０ｎｍの吸光度を測定した。これらの波長でのフォレート−ＰＥＧ−ローダミン結合体の吸光度は、葉酸（ＦＡ）の吸光度およびローダミン（Ｒｈｏｄ）の両方についてであり、したがって：
Ａ_２８０＝Ａ_２８０（ＦＡ）＋Ａ_２８０（Ｒｈｏｄ）およびＡ_５６０＝Ａ_５６０（ＦＡ）＋Ａ_５６０（Ｒｈｏｄ）

葉酸（ＦＡ）およびローダミン（Ｒｈｏｄ）の吸光係数（スタンダード曲線によって決定される）の使用によって、各フォレート−ＰＥＧ−ローダミン結合体サンプルにおける、フォレートおよびローダミンの濃度、ならびにしたがってそれらの比率は、以下の等式中のそれぞれの濃度について同時に解くことによって決定できる：
Ａ_２８０＝ε_２８０（ＦＡ・１・ｃ（ＦＡ）＋ε_２８０（Ｒｈｏｄ）・１・ｃ（Ｒｈｏｄ）
Ａ_５６０＝Ｂ_５６０（ＦＡ）・１・ｃ（ＦＡ）＋ε_５６０（Ｒｈｏｄ）・１・ｃ（Ｒｈｏｄ）

（実施例２９）
＜フォレートＣＷ８００の合成＞
他の部分で報告されるように、Ｎ^１０−ＴＦＡプテロイン酸を合成した。最初に、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−ワング樹脂を２０分間ＤＭＦ中で膨潤させた。樹脂のＦｍｏｃ基の脱保護をＤＭＦ中の２０％ピペリジンによって行なった。２．５当量のＦｍｏｃ−（γ）Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ、ＨＯＢＴ、ＨＢＴＵおよび４当量のＤＩＰＥＡを、反応に追加した。２時間後に、グルタミン酸のＦｍｏｃ基を２０％ピペリジンにより脱保護した。次に、２．５当量のＮ^１０−ＴＦＡプテロイン酸、ＨＯＢＴおよびＨＢＴＵを３：１のＤＭＦ／ＤＭＳＯ中に溶解し、４当量のＤＩＰＥＡを反応に追加し、４時間反応させた。生成物をＤＭＦ、ＤＣＭおよびメタノールにより洗浄した。１％ＴＦＡ／ＤＣＭを使用してＭｔｔ保護基を切断した。結合体の切断をＴＦＡ：ＴＩＰＳ：Ｈ_２Ｏ（９５：２．５：２．５）によって行なった。次に粗製生成物を冷エーテルにより沈殿させた。次に粗製生成物を２０分間水酸化アンモニウム（ｐＨ＝１０）により加水分解した。フォレート−リジンをＨＰＬＣによって精製し、ＭＳおよびＮＭＲによって特性を評価した。フォレート−リジンおよびＣＷ８００スクシンイミジルエステル（１：１）を１８時間暗中で０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）中で撹拌した。フォレート−ＣＷ８００結合体をＨＰＬＣによって精製し、ＭＳおよびＮＭＲによって特性を評価した。

ａ）２０％ピペリジン／ＤＭＦ、ｂ）Ｆｍｏｃ−ＧｌｕＯｔＢｕ（Ｉ）／ＨＯＢｔ／ＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡ／ＤＭＦｃ）Ｎ^１０−ｔｆａ−プテロイルＨＯＢｔ／ＨＢＴＵ／ＤｌＰＥＡ／ＤＭＦｄ）１％ＴＦＡ／ＤＣＭｅ）９５％ＴＦＡ／２．５％Ｈ_２Ｏ／２．５％ＴＩＰＳｆ）１０％ＮＨ ＣＷ８００／ＤＩＰＥＡ／ＤＭＳＯ

（実施例３０）
＜フォレートアレクサフルオル６４７の合成＞

最初に、Ｈ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−２−Ｃｌ Ｔｒｔ樹脂を２０分間ＤＭＦ中で膨潤した。樹脂のＦｍｏｃ基の脱保護をＤＭＦ中の２０％ピペリジンにより行なった。２．５当量のＦｍｏｃ−（γ）Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ、ＨＯＢＴ、ＨＢＴＵおよび４当量のＤＩＰＥＡを反応に追加した。２時間後にグルタミン酸のＦｍｏｃ基を２０％ピペリジンにより脱保護した。次に、２．５当量のＮ^１０−ＴＦＡプテロイン酸、ＨＯＢＴおよびＨＢＴＵを３：１のＤＭＦ／ＤＭＳＯ中に溶解し、４当量のＤＩＰＥＡを反応に追加し、４時間反応させた。生成物をＤＭＦ、ＤＣＭおよびメタノールにより洗浄した。結合体の切断をＴＦＡ：ＴＩＰＳ：Ｈ_２Ｏ（９５：２．５：２．５）により行なった。次に粗製生成物を冷エーテルにより沈殿させた。粗製生成物を水酸化アンモニウム（ｐＨ＝１０）により２０分間加水分解した。フォレート−システインをＨＰＬＣによって精製し、ＭＳおよびＮＭＲによって特性を評価した。フォレート−システインおよびアレクサフルオル６４７マレイミド（１：１）を１８時間暗中でＤＭＳＯ中でカップリングした。フォレート−アレクサフルオル６４７の結合体をＨＰＬＣによって精製し、ＭＳおよびＮＭＲによって特性を評価した。

（実施例３１）
＜フォレート−ＥＤＡ−ローダミンの合成＞

（実施例３２）
＜フォレート−ＥＤＡ−テトラメチルローダミン＞

フォレート−ＥＤＡ−テトラメチルローダミンフォレート−ＥＤＡ−テトラメチルローダミンを，実施例３４について上述されたプロセスに従って調製した。

（実施例３３）
＜フォレート−ＬＹＳ−ローダミンの合成＞

ａ）ピペリジン、ＤＭＦ；ｂ）Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ、ＨＯＢｔ、ＨＢＴＵ、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦ；ｃ）プテロイン酸、ＨＯＢｔ、ＨＢＴＵ、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦ；ｄ）１％ＴＦＡ、ＤＣＭ。

（実施例３４）
＜フォレート−アレクサフルオル４８８の合成＞

前述の実施例は本明細書において記述された化合物の単なる例証となることが理解されるべきであり、追加の化合物を、色素または蛍光剤を含む出発材料の適切な選択によって、本明細書において記述されるように調製してもよい。

Claims (33)

1. 病原性細胞によって仲介される病状を診断する方法であって、一般式
   Ａ_ｂ−Ｘ
   （上式において、基Ａ_ｂは病原性細胞に結合するリガンドを含み、基Ｘは造影剤を含む）の結合体または複合体を含む組成物を、エクスビボ患者サンプルと混合する工程、および、フローサイトメトリーを使用して、リガンドに対する受容体を発現する病原性細胞を検出する工程を含む方法。
2. 前記病原性細胞が多光子フローサイトメトリーによって検出される、請求項１に記載の方法。
3. Ａ_ｂがフォレート受容体結合リガンド、またはその類縁体もしくは誘導体を含む、請求項１に記載の方法。
4. 前記エクスビボ患者サンプルが患者の体液である、請求項１に記載の方法。
5. 前記体液が、髄液、リンパ液、尿、粘液および血液からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
6. 前記病原性細胞が癌細胞である、請求項１に記載の方法。
7. 前記癌細胞が転移性癌細胞である、請求項６に記載の方法。
8. Ａ_ｂが前立腺特異的膜抗原に結合するリガンドを含む、請求項６に記載の方法。
9. Ａ_ｂ−Ｘが、フォレート−フルオレセイン、フォレート−オレゴングリーン、フォレート−ローダミン、フォレート−フィコエリトリン、フォレート−システイン−テキサスレッド、フォレート−アレクサフルオル（AlexaFluor）およびフォレート−ダイライト（DyLight）からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
10. 前記造影剤が発色団を含む、請求項１に記載の方法。
11. 前記発色団が蛍光性発色団である、請求項１０に記載の方法。
12. 前記発色団が、フルオレセイン、オレゴングリーン、ローダミン、フィコエリトリン、テキサスレッド、ダイライト６８０およびアレクサフルオル４８８からなる群から選択される化合物を含む、請求項１１に記載の方法。
13. 前記エクスビボ患者サンプル中の前記病原性細胞を定量する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
14. エクスビボ患者サンプル中の癌細胞の検出によって、癌の予後を決定する方法であって、
    フローサイトメトリーによってエクスビボ患者サンプル中の癌細胞を検出する工程、および
    癌についての予後を決定する工程
    を含む方法。
15. 前記癌細胞が多光子フローサイトメトリーによって検出される、請求項１４に記載の方法。
16. 前記エクスビボ患者サンプルが体液である、請求項１４に記載の方法。
17. 前記体液が、髄液、リンパ液、粘液、尿および血液からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
18. 前記癌細胞が転移性癌細胞である、請求項１４に記載の方法。
19. 前記癌細胞がフォレート受容体を発現する、請求項１４に記載の方法。
20. エクスビボ患者サンプル中の癌細胞を定量する工程をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
21. 病原性細胞を定量する方法であって、一般式
    Ａ_ｂ−Ｘ
    （上式において、基Ａ_ｂは病原性細胞に結合するリガンドを含み、基Ｘは造影剤を含む）の結合体または複合体を含む組成物を、エクスビボ患者サンプルと混合する工程、および、フローサイトメトリーを使用して、エクスビボ患者サンプル中の前記病原性細胞を定量する工程を含む方法。
22. 前記病原性細胞が多光子フローサイトメトリーを使用して定量される、請求項２１に記載の方法。
23. Ａ_ｂがフォレート受容体結合リガンド、またはその類縁体もしくは誘導体を含む、請求項２１に記載の方法。
24. 前記エクスビボ患者サンプルが体液である、請求項２１に記載の方法。
25. 前記体液が、髄液、リンパ液、尿、粘液および血液からなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
26. 前記病原性細胞が癌細胞である、請求項２１に記載の方法。
27. 前記癌細胞が転移性癌細胞である、請求項２６に記載の方法。
28. Ａ_ｂが前立腺特異的膜抗原に結合するリガンドを含む、請求項２６に記載の方法。
29. Ａ_ｂ−Ｘが、フォレート−フルオレセイン、フォレート−オレゴングリーン、フォレート−ローダミン、フォレート−フィコエリトリン、フォレート−システイン−テキサスレッド、フォレート−ダイライトおよびフォレート−アレクサフルオルからなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
30. 前記造影剤が発色団を含む、請求項２１に記載の方法。
31. 前記発色団が蛍光性発色団である、請求項３０に記載の方法。
32. 前記発色団がフルオレセイン、オレゴングリーン、ローダミン、フィコエリトリン、テキサスレッド、ダイライト６８０およびアレクサフルオル４８８からなる群から選択される化合物を含む、請求項３１に記載の方法。
33. Ａ_ｂ−Ｘが、少なくとも７原子のリンカーを有することを特徴とする、請求項８に記載の方法。

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