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DE2019778A1 - Verfahren zur Bestimmung der Zellverteilung von Ribonukleinsaeuren - Google Patents

Verfahren zur Bestimmung der Zellverteilung von Ribonukleinsaeuren

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Publication number
DE2019778A1
DE2019778A1 DE19702019778 DE2019778A DE2019778A1 DE 2019778 A1 DE2019778 A1 DE 2019778A1 DE 19702019778 DE19702019778 DE 19702019778 DE 2019778 A DE2019778 A DE 2019778A DE 2019778 A1 DE2019778 A1 DE 2019778A1
Authority
DE
Germany
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ribonucleic acid
ribonucleic acids
solution
thionine
detmn
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Application number
DE19702019778
Other languages
English (en)
Other versions
DE2019778B2 (de
Inventor
Dumitru Dr Constantinescu
Adrana Prodanescu
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INST PENTRU CONTROLUL DE STAT
Original Assignee
INST PENTRU CONTROLUL DE STAT
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Filing date
Publication date
Application filed by INST PENTRU CONTROLUL DE STAT filed Critical INST PENTRU CONTROLUL DE STAT
Priority to DE19702019778 priority Critical patent/DE2019778B2/de
Priority to FR7018020A priority patent/FR2088100A1/fr
Publication of DE2019778A1 publication Critical patent/DE2019778A1/de
Publication of DE2019778B2 publication Critical patent/DE2019778B2/de
Granted legal-status Critical Current

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    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5094Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for blood cell populations
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/30Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
    • G01N2001/305Fixative compositions
    • G01N2001/307Fixative compositions non-toxic, no Hg, no formaldehyde

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Description

  • Verfahren zur Bestimmung der Zellverteilunz von Ribonukleinsäuren Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein metachromatisches Verfahren zur Bestimmung der intrazellulären Verteilung der Ribonukleinsäuren in Tier- und Pflanzengeweben.
  • Die Kenntnis der Ribonukleinsäureverteilung in den Zellen, und die bei dieser Verteilung vorkommenden Veränderungen, sowohl bei der Mitose als auch bei verschiedenen tathologischen Prozesses, hat eine hervorragende Bedeutsamkeit für die Zellbioiogie.
  • Zur Bestimmung der Ribonukleinsäureverteilung sind bereib zahlreiche Verfahren bekannt. Es gibt, z. B.
  • metachtomatische Methoden, welche die Eigenschaft des Toluidinblaus und des Azurs I und II benutzen, rotfarbige Verbindungen mit der Ribonukleinsäure und Fettstoffen zu bilden; diese Methoden sind aber unspezifisch und unselektiv. Man benutzt noch zum selben Zwecke weiterhin die Eigenschaften des Pyronins, die riboneukleinischen Zellstrukturen rot zu färben; diese Methode gestattet jedoch den Nachweis der chromosomischen Ribonukleinsäure nicht und gibt keine Auskunft über die Nukleolstruktur.
  • Ebenfalls kennt man noch elektromikroskopische und autoradiographische Methoden, bei welchen man das tritiumhaltige tridin (H3) als Vorgänger in der Ribonukleinsäurebiosynthese benutzt, beide Verfahren setzen jedoch eine teuere Apparatur voraus und sind schwierig-durchzufiüiren.
  • Die vorliegende Erfindung beseitigt die Nachteile der erwähnten Methoden dadurch,.dass die Schnitte von fixierten Tier-und Pflanzengeweben mit basischen Farbstoffen aus der Thioningruppe in hydroalkoholischer 0,005 bis 0,01 gew.°%iger Pufferlösung gefärbt, mit Methanol, welches~0,8 Vol.% Salzsäure enthält und nachher mit einer hydroalkoholischen 0,5 bis 1gew.0/ igen Essiguranyllösung behandelt werden.
  • Das Verfahren stützt sich auf die Eigenschaft der basischen Farbstoffe aus der Ehioningruppe und besonders des 0-Toluidinblaus, alle ribonukleinischen ZellstruXturen auf vorher mit hydrochlorischem Methanol behandelten miktoskopischen Präparaten rot zu färben, wonach eine Uranylionenbehandiung'durchgeführt wird.
  • Die Spiazifität -des Verfahrens besteht darin, dass durch Behandlung -der Tier- -oder Pflanzengewebeschnitte mit hydrochlorischem methanol die Gruppierungen -COOH durch Methylierung) und -0-SODH (durch Methan-olyse) aus den sauren Poly-~ sacchariden blockiert werden, wodurch verhindert wird, dass diese an metachromatischen Reaktionen teilnehmen.
  • Durch die Anwendung des Farbstoffs in hydroalkoholischer Lösung wi-rd weiterbin die Möglichkeit beseitigt, dass die sauren Zellfettstoffe metachromatisch -reagieren, da auch die geringsten Alkoholmengen die vondiesen Fettstoffen gebildete Metachromasie vernichten. Durch Verwendung der Uranylionenpräparate wird bei den Arbeitsbedingungen dieses Verfahrens gewährleistet, dass nur die Zellribonukleinsäure- wegen der in ihrem Molekä: enthaltenen Phosphatgruppierungen - - beständige metachromatische Komplexe, d. h. rotfarbige Komplexe, mit dem Farbstoff -bildet, während die anderen nicht ribonukleischen-Zellstrukture#sich orthochromatisch, d. d. h. hellblau, färben.
  • Zum Testen des erfindungsgemässen Verfahrens wurden Mäuse-und Rattenleber, Rattenhepatom, Larven von Chironomus tetans und Drosophilla melanogaster und Wurzelspitzen verschiedener P-flanzenarten verwendet. -Weitere Vorteile und Merkmale der Erfindung ergeben sich aus, der folgenden Beschreibung anhand eines Ausführungsbeispiels: Kleine Teilchen von Tiergeweben (Volumen 3 1 - 2 mm3), Larven oder Wurzeispitzen (2 - 3 mm lang) werden 12 bis 24 Stunden bei 5 bis 8° C mit einem der unten angegebenen Fixiermittel behandelt: I. 0,5gew.%ige Chromsäurelösung 8 ml Eisessig@ 0,4 ml 4O%iges Formol 1,6 ml II. Kobaltnitrat 0,1 g Uranylnitrat 0,1 g 5°%ige Kaliumbichromatlösung 3 ml Äthanol 6 ml Ä-thyläther 2 ml 4O%iges Formol 4 ml - Eisessig 1 ml.
  • Das - Fixiermittel wird bei der Benutzung hergestellt, unter Anwendung von analysenreinen Substanzen.
  • Nach Fixierung werden die Teile mit kaltem Wasser gewaschen, entwässert, in Paraffin eingelagert und gemäss der üblichen Technik Schnitte von 3 bis 5 Mikron hergestellt. Nach Entparaffinieren werden die Präparate in zwei Gruppen A und B geteilt.
  • Die Präparate der Gruppe A werden 20 Minuten lang bei 600 a, in 0,1 N HCl-Lösung gebracht, gewaschen und entwässert.
  • Sowohl die auf diese Weise behandelten Präparate der Gruppe A, wie auch diejenigen der Gruppe B werden der selben Behandlung unterworfen: Die Präparate werden in drei aufeinanderfolgende Bäder von absolutem Methanol gebracht und anschliessend 1 Stunde bei 37° C in absolutem Methanol, welcher 0,8 ml konz.
  • HCl (D = 1,19) in100 ml Alkohol enthält, stehengelassen. Nach dieser Zeitspanne werden die Präparate herausgenommen, wenigstens 10 Mal mit etwas gekühltem destilliertem Wasser bei 5 bis 80 C gewaschen und nachher in eine 0,5 bis 1°ige Essiguranyllösung in 30%igem Methanol eingetragen und 1 Stunde bei Zimmertemperatur stehengelassen; darauf werden die Schnitte wenigstens 10 Mal mit gekühltem Wasser bei 5 bis 80 C gewaschen und 10 Minuten bei Zimmertemperatur in einer'Pufferlösung vom pH-Wert 3,4 bis 3,6 stehengelassen1 die wie folgt hergestellt wird: 0,1 fl krist. Essignatriumlösung 12,5 ml 0,1 M Phosphorsäurelösung 8 ml 0,1 X Zitronensäurelösung 4 ml Bidestilliertes Wasser 45,5 ml Absolutes Methanol 30 ml (Der: pH-Wert wird bei der Lösung ohne Methanol eingestellt.) Schliesslich trägt man die Präparate direkt in die frisch hergestellte Farbstofflösung ein, welche durch Auflösen von 0,005 bis 0,01 gew.oigem 0-Toluidinblau (Merck) in obige Pufferlösung hergestellt wurde, und lässt 45 bis 48 Stunden bei Zimmertemperatur stehen. Dann werden die Präparate herausgeholt, in Wasser gewaschen und entwässert und nachher in ECaz74-dabalsam oder, vorzugsweise, in ein Kunstharz montiert.
  • Die mikroskopische Untersuchung der auf diese Weise erhaltenen Präparate zeigt, dass alle ribonukleischen Zellstrukturen rot gefärbt sind. So erscheint die cytoplasmatische Ribonukleinsäure in Form von zahlreichen und winzigen rotgefärbten Granulationen. Die chromosomische Ribonukleinsäure ist gekennzelchnet durch rote Granulationen, die längs der lavendelblau gefärbten Chromosome angeordnet sind. Die Ribonukleinsäure aus den Riesenchromosomen der Speicheldrüsen von Chironomus und Drosophilla haben die Form von roten Granulationen, die in schrägen Streifen angeordnet sind. Die nukleoläre Ribonukleinsäure erscheint als rote Granulationen verschiedener Grössen, die in die nukleoläre Matrix - welche auch rot gefärbt ist -eingelagert sind.
  • Das Verfahren kann vorteilhaft zum Studium des Nukleolverhaltens während der Mitose angewandt werden, was ein aktuelles Problem in der Zellbiologie darstellt; es kann wichtige Aufschlüsse über die Form-, Volumen-, Struktur- und Anzahlvariation der Nukleole in den krebserzeugenden Prozessen geben, und kann präzisere Ergebnisse bei der Funktionsweise der nakleol-organisierenden Chromosome, wie auch über die Herkubft der ikronukleole, Nukleoline und Karyosome erbringen.
  • In Betracht gezogene Druckschriften: L. Lison: Ristochimie et Cytochimie animales. Principes et methodes - Gauthier-Villars, Paris, 1960, Vol. I, pag. 280.- 300 A.G. Everson Pearse: Ristochemistry theoretical and applied J. si A. Churchill London, 1961, pag. 248 - 260 J.A. Bergeron si M. Singer: Metachromasy; S. Biophysic and Biochem. Cytol,, 1958, 4, pag. 433-45?.

Claims (3)

  1. Patentansprüche
    g Verfahren zur Bestimmung der intrazellulären Verteilung der Ribonukleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, dass die Schnitte von fixierten Tier- und Pflanzengeweben mit basischen Farbstoffen aus der Thioningruppe in hydroalkoholischer 0,005 bis 0,01gew.%iger Pufferlösung gefärbt, mit Methanol, welches 0,8 Vol.% des Salzsäure enthält und nachher mit einer hydroalkoholischen 0,5 bis \gew.0/ igen Essiguranyllösung behandelt werden.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der basische Farbstoff aus/Thioningruppe O-Toluidinblau ist.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Ribonukleinsäuren cytoplasmatische, chromosomische oder nukleolare Ribonukleinsäuren sind.
DE19702019778 1970-04-23 1970-04-23 Verfahren zur bestimmung der intrazellulaeren verteilung von ribonukleinsaeuren Granted DE2019778B2 (de)

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