DE1273226B

DE1273226B - Diagnostisches Mittel zum Nachweis von Keton-Koerpern in Koerperfluessigkeiten und Herstellungsverfahren des Mittels

Info

Publication number: DE1273226B
Application number: DEM45194A
Authority: DE
Inventors: Robert Rudolph Smeby
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1959-05-21
Filing date: 1960-05-04
Publication date: 1968-07-18
Also published as: US2990253A; GB884165A; FR1257446A

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. CL:

GOIn

Deutsche KL: 421-3/54

Nummer: 1273 226

Aktenzeichen: P 12 73 226.2-52 (M 45194)

Anmeldetag: 4. Mai 1960

Auslegetag: 18. Juli 1968

Die Erfindung betrifft ein diagnostisches Mittel zum Nachweis von Ketonkörpern in Körperflüssigkeiten, welches Natriumnitroprussid, Dinatriumphosphat, Mononatriumphosphat und Glycin enthält, und ein Verfahren zur Herstellung des diagnostischen Mittels in Streifenform.

Beim Fettmetabolismus werden Acetonkörper oder Ketonkörper als normale Zwischenprodukte angesehen, die dann zu Kohlendioxyd und Wasser oxydiert werden. Zu den Ketonkörpern gehören Aceton, Acetessigsaure (ß-Ketobuttersäure oder Diessigsäure) und /S-Hydroxybuttersäure. Unter normalen Umständen treten keine nennenswerten Mengen dieser Ketonkörper im Urin auf. Findet jedoch ein übermäßiger Fettmetabolismus entweder in Gegenwart oder in Ab-Wesenheit eines anomalen Kohlehydratmetabolismus statt, so sammeln sich die als Zwischenprodukte gebildeten Ketonkörper im Blut an und werden in verschiedenen Mengen im Urin ausgeschieden. Bei Diabetes Mellitus tritt ein solcher übermäßiger Fettmetabolismus auf, und viele der Symptome dieser Krankheit können der toxischen Wirkung der Ketonkörper zugeschrieben werden. Der praktische Arzt weiß die Nützlichkeit von Testverfahren zum Nachweis von Ketonkörpern im Urin bei Diabetes Mellitus zu schätzen. Diese Körper treten auch im Urin bei anderen bekannten Störungen des Metabolismus auf, und auch in diesen Fällen ist es wichtig, Untersuchung gen auf diese Körper durchzuführen.

Zum Nachweis von Ketonkörpern im Urin hat man bereits viele verschiedene Reagenzien und Methoden verwendet. Eine Anzahl solcher Reagenzien und Methoden bedienen sich eines wasserlöslichen Nitroprussides als reaktionsfähiges Mittel. Bei dem Nachweisverfahren gemäß der USA.-Patentschrift 2186 902 wird die Nitroprussidreaktion in Gegenwart von Ammoniak durchgeführt, um besondere Farben zu entwickeln. Eine Verbesserung dieses Verfahrens ist in der USA.-Patentschrift 2 509 140 beschrieben, welche Reagenzien zum Nachweis von Ketonkörpern im Urin beschreibt, die wasserlösliches Nitroprussid, eine aliphatische Aminosäure und einen alkalischen Stoff enthalten. Aus dieser Patentschrift ist bekannt,, daß man ein diagnostisches Mittel erhält, welches sich besonders zum Nachweis von Ketonkörpern im Urin ohne Entwicklung von Ammoniak eignet, wenn das lösliche Nitroprussid sich zusammen mit einer aliphatischen Aminosäure (z. B. Glycin) in alkalischer Lösung befindet.

Eine Verbesserung dieses Nachweisverfahrens ist in der USA.-Patentschrift 2 577 978 beschrieben, nach welcher der Zusatz von Lactose oder ähnlichen Zuk-Diagnostisches Mittel zum Nachweis von
Keton-Körpern in Körperflüssigkeiten und
Herstellungsverfahren des Mittels

Anmelder:

Miles Laboratories, Incorporated,

Elkhart, Ind. (V. St. A.)

Vertreter:

Dr. K. Th. Hegel, Patentanwalt,

2000 Hamburg 50, Große Bergstr. 223

Als Erfinder benannt:

Robert Rudolph Smeby, Cleveland, Ohio

(V. St. A.)

Beanspruchte Priorität:

V. St. v. Amerika vom 21. Mai 1959 (814 666) ■

kern zu dem diagnostischen Mittel gemäß der USA.-Patentschrift 2 509 140 die Nützlichkeit und Zuverlässigkeit des diagnostischen Mittels beträchtlich verbessert.

Die genannten Patentschriften haben einen bedeutenden technischen Fortschritt in der Diagnose der Ketonurie mit sich gebracht. Nach diesen Patentschriften hergestellte handelsübliche diagnostische Mittel haben dem Arzt: und Kliniker bei der Diagnose und Bekämpfung der Ketonurie geholfen.

Alle diese bekannten Nachweisverfahren bedienen sich eines wasserlöslichen Nitroprussides, einer aliphatischen Aminosäure und eines alkalischen Phosphatpuffers als wesentliche Bestandteile zum Nachweis der Ketonkörper. Das diagnostische Mittel selbst enthält diese Reagenzien in Form einer Tablette.

Vom technischen Gesichtspunkt ist jedoch ein diagnostisches Mittel in Form aufsaugender Streifen oder Stifte zu bevorzugen, weil es einen einfachen Nachweis durch bloßes Eintauchen und Ablesen gestattet. Ein solches diagnostisches Mittel hat den Vorteil, daß das Nachweisverfahren sich leicht und einfach gestaltet, keine umständliche Ausrüstung erfordert, die leichte Beseitigung des Mittels nach dem Test, die schnelle Durchführung des Nachweisverfahrens gestattet, usw.

Würde man aber eine wäßrige Lösung der obigen Grundbestandteile zum Tränken eines aufsaugenden Streifens verwenden, so würde man kein praktisch brauchbares diagnostisches Produkt erhalten. Natriumnitroprussid ist nämlich in wäßrigen alkalischen Me^

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dien sehr unbeständig, d. h., der größte Teil dieses Wasser versetzt. 23,8 g Mononatriumphosphat-mono-Stoffes wird zerstört, so daß man mit solchen Streifen hydrat und 1,25 g Dinatriumphosphat werden miteinkeine wahrnehmbare Reaktion mit Acetessigsäure ander vermischt und in so viel Wasser gelöst, daß (Acetoacetat) erhält. Versuche, das wäßrige alkalische das Gesamtvolumen 50 ecm beträgt. Die Phosphat-Material gesondert auf die Stifte oder Streifen aufzu- 5 pufferlösung (pH = 4) wird dann sofort zu der GIybringen, sind gescheitert, da das Reagenz bei der Ein- cin-Nitroprussid-Lösung zugesetzt. Nachdem die Löwirkung der Luft rasch verdirbt. sung klar geworden ist, gibt man 10 g Natriumchlo-

Wie oben erwähnt, ist Natriumnitroprussid in wäß- rid zu.

rigem alkalischem Medium sehr unbeständig; ein Me- Lösung B: 10 g l,3-Diamino-2-propanol und 20 g

dium dieser Art ist jedoch erforderlich, um die ge- ίο 2-Amino-2-methyl-l,3-propandiol werden miteinanwünschte Reaktion zwischen dem Keton (Natrium- der gemischt und in so viel wasserfreiem Äthanol geacetoacetat) und Natriumnitroprussid zustande zu löst, daß das Gesamtvolumen 100 ecm beträgt, bringen. Bisher war es nicht möglich, ein lösliches

alkalisches Imprägniermittel zur Herstellung von Test- Herstellung der Reagenzstreifen

streifen herzustellen, in denen das für die farberzeu- 15

gende Reaktion erforderliche Natriumnitroprussid Aufsaugende Träger, d. h. in schmale Streifen gehaltbar ist. schnittenes absorbierendes Papier, werden so in die

Es wurde nun ein Verfahren gefunden, nach wel- Tränklösung A getaucht, daß durch das Eintauchen chem das erforderliche alkalische Nitroprussid auf und die Kapillarwirkung etwa 6¹Za bis 13 mm der Teststreifen erhalten wird, ohne daß es vorzeitig der 20 Streifen an einem Ende derselben vollständig geungünstigen Einwirkung eines Mediums von wäß- tränkt werden. Die Streifen werden dann in einer rigem Alkali ausgesetzt wird. Trockenvorrichtung bei einer Temperatur im Bereich

Das neue diagnostische Mittel zum Nachweis von von 75 bis 100° C getrocknet. Nach dem Trocknen KetonkörperninKörperflüssigkeiten, welchesNatrium- werden die Streifen in ähnlicher Weise in die Lösung B nitroprussid, Dinatriumphosphat, Mononatriumphos- 25 getaucht und 10 Minuten in einem mit künstlichem phat und Glycin enthält, ist dadurch gekennzeichnet, Luftzug arbeitenden Ofen bei 45° C getrocknet. Der daß es einmal Natriumchlorid oder Natriumalginat getränkte Teil der Streifen besitzt eine weißliche und weiterhin l,3-Diamino-2-propanol, 2-Amino- Farbe.

2-methyl-l,3-propandiol, 2-(2-Amino-äthylamino)- Man kann natürlich auch andere aufsaugende

äthanol, 3,3-Diaminodipropylamin, Diäthanolamin, 30 Stoffe, z. B. kleine Holzstifte usw., sowie auch andere 1,3-Diaminopropan oder 1,4-Diaminobutan enthält. Methoden zum Aufbringen der Tränklösungen auf die Das Verfahren zur Herstellung dieses neuen Teststreifen verwenden, z. B. eine rotierende Druckdiagnostischen Mittels in Streifenform ist dadurch ge- walze.

kennzeichnet, daß man 0,5 bis 2Teile Natriumnitro- Beispiel 2

prussid und 10 bis 40 Teile Glycin gleichmäßig mit- 35

einander mischt, das Gemisch in Wasser löst, eine 0,4 g Natriumalginat werden in 50 ecm Wasser gewäßrige Lösung von 2,5 Teilen Dinatriumphosphat löst, und die Lösung wird zu einem trockenen Ge- und etwa 48 Teilen Mononatriumphosphat sowie 10 misch von 20 g Glycin und 0,5 g Natriumniiroprussid bis 20 Teilen Natriumchlorid oder 0,1 bis 1 Teil Na- zugesetzt. Die obengenannten Phosphatsalze werden triumalginat zusetzt, saugfähige Streifen in diese 40 in so viel Wasser gelöst, daß eine Pufferlösung von Tränklösung eintaucht, die Streifen bei einer Tem- 50 ecm entsteht, und diese wird zu der obigen Lösung peratur von etwa 75 bis 100° C trocknet, sie sodann zugesetzt. Die hierbei entstehende Lösung entspricht in eine äthanolische Lösung von 10 bis 30 Teilen der Tränklösung A des Beispiels 1. Die Herstellung l,3-Diamino-2-propanol, 2-Amino-2-methyH,3-pro- der Tränklösung B und der Teststifte erfolgt nach pandiol, 2-(2-Amino-äthylamino)-äthanol, 3,3-Di- 45 Beispiel 1. amindipropylamin, Diäthanolamin, 1,3-Diaminopro- Beispiel 3

pan oder 1,4-Diaminobutan eintaucht und die ge-

tränkten Streifen sodann, bei einer Temperatur von Die Tränklösung A wird nach Beispiel 2 hergestellt.

etwa 45° C trocknet. Die Tränklösung B wird folgendermaßen hergestellt:

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung 5° 30 g 2-(2-Amino-äthylamino)-äthanol werden zu so

im einzelnen: viel Chloroform zugesetzt, daß eine Lösung von

Beispiel 1 100 ecm entsteht. Aufsaugende Streifen werden zu-

nächst in die Lösung A getaucht, dann getrocknet,

Zusammensetzung der Tränklösung hierauf in die Lösung B getaucht und schließlich

. _,. . 55 16 Stunden im Vakuumofen bei 35° C getrocknet.

vr*⁰?¹ " '·'" · j ü f Außer den oben angegebenen organischen Basen

Natnummtroprussid 0,5 g können zur Herstellung der Tränklösung B erfmdungs-

mtnumcniona .. V.' "J *"' *" | gemäß unter anderem auch die folgende Amme und

Mononatnumphosphat-monohydrat 23,8 g Aminoalkohole verwendet werden: 2-(2-Amino-äthyl-

Dmatnumphosphat, wasserfrei .. 1,25 g _6o a^).^^ ₃,3'-Diaminopropylamin, Diäthanol-

^Wasser aufgefüllt auf 100 ecm _amjjl; [ ₅3__{Diaminopropail)} 1,4-Diaminobutan, Benzyl·

B. l,3-Diamino-2-propanol 10 g amin, ß-Dimethylaminoäthanol, Triäthanolamin,

2-Amino-2-methyl-l,3-propandiol.. 20 g 3-Amino-l-propanol, 2-Amino-2-äthyl-l,3-propan-

Wasserfreies Äthanol aufgefüllt auf 100 ecm diol, Diisopropanolamin. Diese Aminverbindungen

χι * 11 AT-I τ· ⁶S wurden geprüft und haben sich als durchaus zufrie-

Herstellung der Tranklosungen denstellend erwiesen. Im allgemeinen hat sich jedoch

Lösung A: 10 g Glycin und 0,5 g Natriumnitro- gezeigt, daß sekundäre und tertiäre Amine bessere

prussid werden miteinander vermischt und mit 50 ecm Ergebnisse liefern als primäre Amine.

Die oben beschriebenen Tränklösungen erläutern die optimalen Gehalte an den verschiedenen Bestandteilen. Es wurde gefunden, daß beträchtliche Abänderungen in den Mengen einiger der wesentlichen Komponenten statthaft sind. Zum Beispiel kann man 5 bis 20 g Glycin, 0,25 bis 1 g Natriumnitroprussid und 10 bis 20 g Natriumchlorid verwenden.

Testverfahren

Bei der Anwendung wird ein wie oben beschrieben getränkter Streifen in die zu untersuchende Flüssigkeitsprobe getaucht. Bei der Berührung mit Urin, welcher Ketonkörper enthält, gibt der Streifen in etwa 15 bis 30 Sekunden eine positive Reaktion, die sich durch verschiedene purpurfarbene Tönungen folgendermaßen zu erkennen gibt:

Bei Urin mit einem Gehalt von 0,1% oder mehr an Ketonkörpern entwickelt sich eine intensive Purpurfarbe, während bei Urin, der nur 0,015% oder weniger Ketonkörper enthält, die weißliche Farbe des imprägnierten Streifens in ein deutliches Hellpurpur umschlägt. Bei Urin mit einem Ketonkörpergehalt von 0,015 bis 0,1% entwickelt sich eine Purpurfarbe von mittlerer Intensität: Je höher der Ketongehalt des Urins ist, desto leuchtender ist die Farbe. Werden die Teststreifen in einen Urin getaucht, der keine Ketonkörper enthält, so findet keine Farbänderung statt. Auf Grund dieser Erscheinungen läßt sich eine einfache Farbvergleichskarte zur Verwendung bei der Untersuchung des Urins auf Ketonkörper herstellen.

Umfangreiche Stabilitätsprüfungen haben ergeben, daß die mit den in den obigen Beispielen beschriebenen Lösungen getränkten Streifen bemerkenswert beständig sind. So konnte z. B. nach 24stündiger Einwirkung einer Temperatur von 50° C bei einer relativen Feuchtigkeit von 50% kein merklicher Verlust

an Reaktionsfähigkeit bei den Streifen festgestellt werden. Bei der Berührung mit Urin, welcher 0,04% Acetoacetat enthielt, gaben die so behandelten Teststreifen immer noch in 30 Sekunden eine positive Reaktion.

Claims

Patentansprüche:

1. Diagnostisches Mittel zum Nachweis von Ketonkörpern in Körperflüssigkeiten, enthaltend Natriumnitroprussid, Dinatriumphosphat, Mononatriumphosphat und Glycin, dadurch gekennzeichnet, daß es erstens Natriumchlorid oder Natriumalginat und zweitens 1,3-Diamino-2-propanol, 2-Amino-2-methyl-l,3-propandiol, 2-(2-Amino-äthylamino)-äthanol, 3,3'-Diaminodipropylamin, Diäthanolamin, 1,3-Diaminopropan oder 1,4-Diaminobutan enthält.

2. Verfahren zur Herstellung des diagnostischen Mittels gemäß Anspruch 1 in Streifenform, dadurch gekennzeichnet, daß man 0,5 bis 2 Teile Nitriumnitroprussid und 10 bis 40 Teile Glycin gleichmäßig miteinander mischt, das Gemisch in Wasser löst, eine wäßrige Lösung von etwa 2,5 Teilen Dinatriumphosphat und etwa 48 Teilen Mononatriumphosphat sowie 10 bis 20 Teilen Natriumchlorid oder 0,1 bis 1 Teil Natriumalginat zusetzt, saugfähige Streifen in diese Tränklösung eintaucht, die Streifen bei einer Temperatur von etwa 70 bis 100° C trocknet, sie sodann in eine äthanolische Lösung von 10 bis 30 Teilen 1,3-Diamino-2-propanol, 2-Amino-2-methyl-l,3-propandiol, 2-(2-Amino-äthylamino)-äthanol, 3,3'-Diaminodipropylamin, Diäthanolamin, 1,3-Diaminopropan oder 1,4-Diaminobutan eintaucht und die getränkten Streifen sodann bei einer Temperatur von etwa 45° C trocknet.