DE1966534A1

DE1966534A1 - Verfahren zur herstellung von l-serin

Info

Publication number: DE1966534A1
Application number: DE19691966534
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Kase; Kiyoshi Nakayama
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1969-03-31
Filing date: 1969-03-31
Publication date: 1973-05-03
Also published as: DE1966534B2; DE1966534C3

Description

Verfahren zur Herstellung von 1,-Serin I,Serin wird durch ein Fermentationsverfahren hergestellt, wobei ein Mikroorganismus, der zum Genus Arthrobacter, Brevibacterium oder Corynebacterium gehört, in einem wäßrigen Nährmedium1 das keine DL-Glycerinsäure als Substrat enthält, kultiviert wird. Billige Kohlehydrate oder Kohlenwasserstoffe können als Kohlenstoffquelle in dem Medium verwendet werden. Zu den beispielsweise verwendbaren Stämmen gehören Arthrobacter paraffineus, Brevibacterium ketoglutamicum und Corynebacterium hydrocarboclastus.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Serin, insbesondere zur Herstellung von L-Serin durch Bermentation. Im speziellen betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von L-Serin durch Fermentation mit Mikroorganismen in geeigneten Nährmedien.
1-Serin ist eine bekannte Aminosäure, die als Arzneimittel und Xosmetikum verwendet wird. 1-Serin ist auch eine wertvolle Substanz, die zur Herstellung anderer wertvoller Verbindungen, beispielsweise iN-Methylserin, verwendet werden kann.
Bisher wurde Serin dadurch hergestellt, daß man DL-Serin durch eine synthetische Methode herstellte und dann das Produkt in die entsprechenden optischen Isomeren trennte. In jüngster Zelt würde ein Verfahren zur Herstellung von L-Se rin unter Anwendung von LI-Glycerinsäure als ein Substrat bekannt (japanische veröffentlichte Patentschrift 17728/67).
Jedoch ist bisher kein Verfahren zur Herstellung beträchtlicher Mengen 1-Serin aus unter geringem Kostenaufwand zugänglichen Kohlehydraten, Kohlenwasserstoffen, anderen Kohlenstoffquellen und Stickstoffquellen ohne die Notwendigkeit der Anwendung kostspieliger Substanzen, wie beispielsweise Glycerinsäure als Ausgangsmaterial bekannt.
Eine Aufgabe der Erfindung besteht in einem verbesserten Verfahren zur Herstellung von Serin, das die Nachteile und Unzulänglichkeiten der bisherigen Verfahren beseitigt.
Eine andere Aufgabe der Erfindung besteht in einem Verfahren zur Erzeugung von Serin durch Fermentation, das in wirksamer und relativ einfacher Weise durchführbar ist.
Ferner liefert die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Serin durch Fermentation, das in vorteilhafter Weise in industriellem Maßstab bei geringen Kosten unter Erzielung hoher Produktausbeuten durchführbar ist.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Herstellung von 1-Serin.
Als Ergebnis vielfältiger Untersuchungen hinsichtlich der Herstellung von 1-Serin in industriellen Mengen bei geringen Kosten wurde festgestellt, daß beträchtliche Mengen L-Serin erzeugt und in einer Kulturflüssigkeit angesammelt werden können, wenn ein zum Genus Arthrobacter, Brevibacterium oder Corynebacterium gehörendes Bakterium in einem NährmediM, das Kohlehydrate, Kohlenwasserstoffe oder andere Kohlenstoffquellen und dgl. enthält, und insbesondere ohne die Zugabe von DL-Glycerinsäure zu dem Medium kultiviert wird. Die Verwendung eines Mediums, das keine DL-Glycerinsäure enthält, ist eines der neuen Merkmale der Erfindung.
Zu den in der vorriegenden Erfindung verwendbaren Mikroorganismen gehören Bakterien, die zum Genus Arthrobacter, dem Genus Brevibacterium oder dem Genus Corynebacterium gehören.
Isoleucin-erfordernde Mutantenstämme erwiesen sich als besonders ausgezeichnet zur Lösung der erfindungsgemäßen Aufgaben.
Sowohl ein synthetisches Kulturmedium als auch ein natürli-Nährmedium ist zur Kultivierung der erfindungsgemäß verwendeten Stämme geeignet, sofern es die wesentlichen Nährstoffe zum AJ3chstum des verwendeten Stamms aufweist. Derartige Nihrstoffe sind bekannt und dazu gehören Substanzen, wie beispielsweise eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Verbindungen und dgl., die von dem angewendeten Mikroorganismus in geeigneten Mengen gebraucht werden. Als Kohlenstoffquelle seien beispielsweise Kohlehydrate, wie z.B. Glucose, Fructose, Maltose, Saccharose, Stärke, Stärkehydrolysate, Melasse, Mannose, Glycerin, Sorbit, Mannit und dgl., oder irgendeine andere geeignete Kohlenstoffquelle, wie t.B. Zuckeralkohole, organische Säuren, z.B. Essigsäure, Milchsäure, Pyruvsäure, Fumarsäure oder Aminosäuren, wie beispielsweise Asparaginsäure, Glutaminsäure und dgl. erwähnt. Im Fall der Verwendung kohlenwasserstoffassimilierender Mikroorganismen können Kohlenwasserstoffe, beispielsweise n-Paraffine, Kerosin oder Erdölfraktionen, zu denen Leichtöle, Schweröle, Paraffinöle und dgl. gehören, in dem Nährnediun als Kohlenstoffquelle oder in Kombination mit einer oder mehreren der oben genannten Kohlenstoffquellen verwendet werden. Entweder eine einzelne Kohlenstoffquelle oder ein Gemisch von zwei oder mehr können angewendet werden.
Gemäß der Erfindung enthält das Nährmedium jedoch keine DL-Glycerinsäure. Folglich ist diese Substanz von den im Raen der Erfindung verwendeten Kohlenstoffquellen ausgeschlossen.
Lis Stickstoffquelle können verschiedene Arten anorganischer oder organischer Salze oder Verbindungen, z.B. Harnstoff, flüssiges Ammoniak oder Ammoniumsalze, wie z.B. Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumacetat, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und dgl., oder natürliche stickstoffhaltige Substanzen, wie z.B. Maisquellflüssigkeit, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl, oder verschiedene Abbausubstanzen davon,Bouillon, Caseinhydrolysate, lösliche Fischsubstanz, Reiskleieextrakt, entfettete Sojabohenrücketände oder Abbausubstanzen davon, Chrysalishydrolysate und dgl., verwendet werden. Diese Substanzen können wiederum entweder einzeln oder in Kombinationen von zwei.
oder mehr verwendet werden.
Zu-den anorganischen Verbindungen, die zu dem Kulturmedium zugesetzt werden können, gehören Magnesiumsulfat, Natriumphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Kaliummonohydrogenphosphat, Eisensulfat, Manganchlorid, Calciumchlorid, Natriumchlorid-, Zinksulfat, Mangansulfat, Calciumcarbonat und dgl.
Falls der verwendete Mikroorganismus andere Nährstoffe zu seinem Wachstum benötigt, sollten natürlich entsprechende engen der zur Befriedigung der speziellen Bedürfnisse eriorderlichen ährstoffe zu dem Kulturmedium zugesetzt werden.
Diese Nährstoffe sind bisweilen in den dem Medium als Stickstofftuelle zugesetzten natürlichen Substanzen enthalten und müssen nicht eigens zugesetzt werden. Gegebenenfalls Kölmen diese Substanzen jedoch zu dem Medium als solche zugesetzt werden und enthalten Wachstumsfaktoren, wie z.B.
Aminosäuren, Vitamine, wie beispielweise Thiamin, Cobalamin ar dgl., oder Biotin.
Die Kultivierung wird unter aeroben Bedingungen, wie z.B.
aerobe Schütteln der Kultur oder unter Belüften und Rühren einer Sibmerskultur bei einer Temperatur von beispielsweise etwa 20 bis 40 °C und einem pH-Wert von beispielsweise etwa 5 bis 9,5 durchgeführt. Selbstverständlich können die Temperatur und der pH-Wert auch außerhalb der beschriebenen Grenzen variieren entsprechend den Wachstums erfordernissen des speziellen verwendeten Mikroorganismus. Um hohe Ausbeuten an 1-Serin zu erhalten, ist es erwünscht, den pE-Wert des Kulturmediums etwa beim Neutralpunkt (7,0) während der Kultivierung zu halten. Nach etwa 1 bis 5 Tagen Eultivierungszeit unter diesen Bedingungen haben sich beträchtliche Mengen 1-Serin gebildet und in der erhaltenen Kulturflüssigkeit angesammelt.
Nach beendeter Kultivierung werden die Mikroorganismenzellen und unerwünschte Ausfällungen von der Kulturflüssigkeit abgetrennt, und das 1-Serin wird aus der Flüssigkeit durch übliche Mittel, wie beispielsweise eine Ionenaustauschharzbehandlung, Extraktion mit Lösungsmitteln, Ausfällung, Adsorption, Chromatographie, Konzentrierung oder dgl., gewonnen. Eine besonders geeignete Methode zur Gewinnung ist die Ionenaustauschharzbehandlung, die. im folgenden Beispiel 1 beschrieben wird.
Die folgenden Beispiele dienen nur zur Erläuterung der Erfindung, ohne sie zu begrenzen. Falls nicht anders angegeben, beziehen sich die Prozentgehalte in den Beispielen und der gesamten Beschreibung auf das Gewicht pro 1 Wasser. Beispiele für im erfindungsgemäßen Verfahren vorteilhaft eingesetzte Mikroorganismenstämme sind darin beschrieben.
Beispiel 1 Als Impfmikroorganismus wird der L-Serin-bildende Stamm Brevibacterium ketoglutamicum ATCO 21222 verwendet. Dieser Stamm leitet sich von dem Stamm Brevibacterium ketoglutamicin ATCC 15588 ab und benötigt für sein Wachstum Isoleucin.
Dieser Stamm wird in einen konischen 250 ml-Kolben, der 20 ml eines sterilisierten Impfkulturmediums mit 2 % Sorbit, 1 % Fleischextrakt, 1 % Pepton, 0,5 % Hefeextrakt, 0,3 O/o NaCl und 50 mg/l m-Diaminopimelinsäure enthält, eingeimpft. Die Xultivierung wird unter aerobem Schütteln bei 30°C 24 Stunden lang durchgeführt, wobei eine Impfkultur erhalten wirds 2 ml der erhaltenen Impfkultur werden in einen Konischen 250 ml-Kolben eingeimpft, der 20 ml eines sterilisiert Fermentationsmediums (pH 7,4) der folgenden Zusammensetzung enthält.
5 % n-Alkangemischt (C12-C14) 2 % (NH4)2SO4 0,1 % K2HPO4 0,1 % KH2PO4 0,1 % MgSO4.7H2O 2 % CaCO3 1 mg/1 Thiazin 0,5 % NZ-Amin (aus der Reihe der Caseinhydrolysate) 1 ml/l der Lösung A Zusammensetzung der Lösung A: 88 mg/l Na2B4O7.1OH2O 37 mg/l (NH4)6Mo7O24.4H2O 970 mg/l FeCl3.6H2O 8,8 mg/1 ZnS04.7H20 20 mg/l CuSO4.5H2O 7,2 mg/l MnCL2.4H2O Die Kult lvi erung wird dann unter aerobem Schütteln der Kultur in dem Fermentationsmedium bei 300C über einen Zeitraum von 96 Stunden durchgeführt. In der Kulturflüssigkeit wird dabei das L-Serin in einer Menge von 1,7 mg/ml gebildet.
2 1 des nach der Entfernung der Mikroorganismenzellen und der anderen unlöslichen Stoffe aus der Kulturflüssigkeit erhaltenen Filtrats werden auf eine Kolonne mit einem stark sauren kationischen Polystyrolaustauscherharz (Diaion SKI, einer Handelsbezeichnung eines von der Firma Mitsubishi Kasei Co., Ltd.
hergestellten Ionenaustauscherhaezes) aufgegeben, um das L-Serin zu adsorbieren. Die Kolonne wird mit Wasser gewaschen und mit Ammoniakwasser eluiert. Die gesammelten L-Serinfraktionen werden eingeengt. Auf diese Weise erhält man 2,3 g L-Serinkristalle.
BeisPiel 2 Die Kultivierung wird in der gleichen Weise und unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 durchgeführt, wobei diesmal jedoch ein Kulturmedium verwendet wird, das 5 % Sorbit anstelle des in Beispiel 1 angegebenen n-Alkangemisches als eine Kohlenstoffquelle in dem Fermentationsmedium enthält. Die Menge des gebildeten L-Serins beträgt 1,2 mg/ml.
Beispiel 3 Als Impfmikroorganismus wird der L-Serin-bildende Stamm Corynebacterium hydrocarboclastus ATCC 21221 verwendet. Dieser Stamm leitet sich von dem Stamm Corynebacterium hydrocarboclastus ATCO 15592 ab und benötigt für sein Wachstum Isoleucin.
Die Kultivierung wird auf die gleiche Weise und unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 durchgeführt. Die Menge des dabei gebildeten L-Serins in der Kulturflüssigkeit beträgt 1,9 mgZml.
Beispiel 4 Die Kultivierung wird in der gleichen Weise und unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 durchgeführt, wobei diesmal jedoch ein Kulturmedium verwendet wird, das 5 % Sorbit anstelle der in Beispiel 1 als Kohlenstoffquelle in dem Fermentationsmedium verwendeten n-Alkanmischung verwendet vrird. Die Menge des in der erhaltenen Kulturflüssigkeit gebildeten L-Serins beträgt 1,3 mgzzl.

Claims

P a t e n t a n s p r u c h

Verfahren zur fermentativen Gewinnung von L-Serin durch aerobes Züchten von Mikroorganismen in einem hierfür üblichen Nährmedium und anschließende Abtrennung des in der Kulturbrühe angereicherten L-Serins, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Brevibacterium ketoglutamicum ATCC 21222 oder Corynebacterium hydrocarboclastus ATCC 21221 verwendet.