DE19931883A1

DE19931883A1 - DNA kodierend für Beta-Tubulin und deren Verwendung

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Publication number: DE19931883A1
Application number: DE19931883A
Authority: DE
Inventors: Georg Von Samson-Himmelstjerna; Achim Harder; Thomas Schnieder; Michaela Pape
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1999-07-09
Filing date: 1999-07-09
Publication date: 2001-01-11
Also published as: WO2001004281A3; BR0012274A; HK1050026A1; EP1208199A2; AU6821500A; JP2003504051A; CA2378407A1; WO2001004281A2; CN1382216A

Abstract

Die Erfindung betrifft DNA, die für -Tubulin aus Nematoden der Familie der Strongylidae kodiert, das von dieser DNA kodierte Polypeptid, die Verwendung der DNA zur Diagnose von anthelmintischer Resistenz bei den betreffenden Nematoden und zur Identifizierung der Spezies parasitärer Nematoden, die Verwendung des -Tubulins als Bestandteil eines Impfstoffs sowie ein Verfahren zur Identifizierung von neuen anthelmintischen oder antibiotischen Verbindungen.

Description

Die Erfindung betrifft DNA, die für β-Tubulin aus Nematoden der Familie der Strongylidae kodiert, das von dieser DNA kodierte Polypeptid, die Verwendung der DNA zur Diagnose von anthelmintischer Resistenz dieser Nematoden und zur Identifizierung der Spezies dieser Nematoden, die Verwendung des β-Tubulins als Bestandteil eines Impfstoffs sowie ein Verfahren zur Identifizierung von neuen anthelmintischen oder antibiotischen Verbindungen.

Parasitische Helminthen (Würmer) stellen für Menschen und Tiere ein Gesundheits problem dar und verursachen bedeutende wirtschaftliche Schäden. Die Ausgaben für Anthelmintika betrugen im Jahr 1996 weltweit mehr als 2 Milliarden US-Dollar. Die wichtigsten Anthelmintika, die derzeit Anwendung finden, können nach ihrem Wirk mechanismus in drei Gruppen aufgeteilt werden:

1. Die zyklischen Amidine Pyrantel und Morantel wirken zusammen mit den Imidazothiazolen Tetramisol und Levamisol als cholinerge Verbindungen für das parasitäre Nervensystem.
2. Die Benzimidazole sind Inhibitoren der Polymerisation von Mikrotubuli und führen zur Degradation von Tubulin, gefolgt vom Verlust mehrerer Zellfunk tionen wie dem Transport innerhalb von Zellen und der Zellteilung.
3. Die makrozyklischen Lactone binden und öffnen glutamergische Chlorid- Kanäle und wirken so als Inhibitoren des Nervensystems von Nematoden und Arthropoden.

Mikrotubuli sind aus Tubulin-Untereinheiten aufgebaut. Tubulin ist ein dimeres Protein, das aus α- und β-Tubulin besteht und in einem dynamischen Gleichgewicht zwischen Tubulin und Mikrotubuli vorliegt. Dieses Gleichgewicht kann durch exogene Substanzen beeinflußt werden, die man als Mikrotubuli-Inhibitoren be zeichnet. Einige dieser Inhibitoren, wie z. B. die Benzimidazole, wirken durch ihre Bindung an Tubulin, wodurch sie die Selbstassoziation dieser Untereinheiten an wachsende Mikrotubuli verhindern, während am entgegengesetzten Ende die Dissoziation der Mikrotubuli fortgesetzt wird. Dadurch kommt es zu Fehlfunktionen bei lebenswichtigen Prozessen innerhalb der Zelle und schließlich zum Absterben der Zelle und des gesamten Organismus (Lacey, E. (1990) Mode of action of benz imidazoles. Parasitology Today 6, 112-115). Zu solchen Mikrotubuli-Inhibitoren gehören verschiedene Verbindungsklassen, die synthetisch hergestellt oder von ver schiedenen Organismen produziert werden.

Die Bindung von Mikrotubuli-Inhibitoren an Tubulin aus verschiedenen Organismen zeigt große Unterschiede hinsichtlich der Affinität der Bindung. So zeigen die Anthelmintika Oxfendazol und Thiabendazol eine hohe Affinität an Tubulin aus Ascaridia galli und eine nur geringe Affinität zu Tubulin aus Säugetieren wie dem Schaf (Dawson et al. (1983) Purification and characterisation of tubulin from the parasitic nematode, Ascaridia galli, Molecular and Biochemical Parasitology 7, 267-277). Die selektive Toxizität von Benzimidazolen kann anhand dieser selektiven Affinität erklärt werden (Lacey, E. (1988) The role of the cytoskeletal protein, tubulin, in the mode of action and mechanism of drug resistance to benzimidazoles, International Journal for Parasitology 18, 885-936).

Der verbreitete Gebrauch dieser Anthelmintika hat zu anthelmintischen Resistenzen gegen alle drei Klassen vor allem in Nutzvieh geführt (Bauer et al. (1994) Anthelmintic resistance in nematodes of farm animals. A seminar organised for the European Commission, Brüssel, Belgien, 8. bis 9. November 1993, S. 7-24). Die verbreiteste Klasse der Anthelmintika sind die Benzimidazole. Resistenz gegen Benzimidazole wurde weltweit bei Parasiten von Schafen, Rindern, Schweinen und Pferden beschrieben. Benzimidazole sind Breitspektrum-Anthelmintika mit Wirkung gegen Nematoden, Cestoden und Trematoden. Untersuchungen in deutschen Pferdegestüten ergab eine anthelmintische Resistenz von kleinen Strongyliden gegen Benzimidazole in mehr als 80% der Fälle (Ullrich et al. (1988) Benzimidazole resistance in small strongylids (Cyathostominae): distribution in horse stock in Northrhine-Westphalia, Berliner Münchner Tierärztliche Wochenschrift 101, 406-408).

Für eine effektive Behandlung mit Anthelmintika ist es deshalb von großer Be deutung, Informationen über mögliche Resistenzen von Würmern eines Pferdes oder innerhalb einer Pferdeherde zu erhalten. Um die mögliche Resistenz einer Wurmpopulation kleiner Strongyliden zu überprüfen, wurden bereits diagnostische Verfahren entwickelt, die auf der Wirksamkeit von Anthelmintika in den Entwicklungsstadien der Parasiten (Eier, Larven) beruhen (Coles et al. (1992) World Association for the Advancement of Veterinary Parasitology (W. A. A. V. P.) Methods for the detection of anthelmintic resistance in nematodes of veterinary importance, Veterinary Parasitology, 44, 35-44). Der "Larval development assay" (LDA) beschreibt den inhibitorischen Effekt von Anthelmintika im nicht-parasitären ersten Larvenstadium in Abhängigkeit von der eingesetzten Anthelmintika-Konzentration. In ähnlicher Weise nutzt der zweite Ansatz, der "egg hatch assay" (EHA) die inhibitorische Wirkung der Anthelmintika auf das Schlüpfen der Larven in Abhängigkeit von der eingesetzten Anthelmintika-Konzentration. Ein Nachteil beider Ansätze liegt in der geringen Reproduzierbarkeit der Ergebnisse. Zudem sind beide Ansätze zeitaufwendig und arbeitsintensiv.

Die Sensitivität beider Ansätze ist zudem gering. Eine bestehende Resistenz wird nur dann detektiert, wenn mehr als 25% der Population resistent sind (Roos et al. (1995) New genetic and practical implications of selection for anthelmintic resistance in parasitic nematodes, Parasitology Today 11, 148-150).

Es besteht deshalb ein dringender Bedarf an diagnostischen Verfahren, die empfind lich, schnell und reproduzierbar sind. Für die Parasiten des Schafes, Haemonchus contartus und Teladorsagia circumcincta wurde ein auf der PCR-Technik beruhendes Verfahren beschrieben. Dieses beruht auf mindestens einer Punktmutation in Kodon 200 des β-Tubulin-Isotyp 1-Gens (Elard et al. (1999) PCR diagnosis of benzimidazole - susceptibility or - resistance in natural populations of the small ruminant parasite, Teladorsagia circumcincta, Veterinary Parasitology 80, 231-237). Die Punktmutationen in Kodon 200 resultieren in einem Aminosäureaustausch von Phenylalanin zu Tyrosin und korreliert mit einer Benzimidazol-Resistenz des mutierten Proteins (Kwa et al. (1995) β-tubulin genes from parasitic nematode Haemonchus contortus modulate drug resistance in Caenorhabditis elegans, Journal of Molecular Biology 246, 500-510).

Aus Studien an Haemonchus contortus ist bekannt, daß die für Tubulin kodierenden Sequenzen von Nematoden spezies-spezifisch sind (WO 92/03549).

Die verschiedenen Spezies der kleinen Strongyliden des Pferdes unterscheiden sich in ihrer epidemiologischen Häufigkeit. Zu den weltweit wichtigsten und am häufigsten gefundenen Spezies gehören Cylicocyclus nassatus, Cyathostomum coronatum und Cyathostomum catinatum. Resistenzen dieser Spezies gegen Benzimidazole wurde in verschiedenen Ländern beschrieben, u. a. auch in Deutschland (Burger, H.-J. und Bauer, C. (1987) Efficacy of four anthelmintics against benzimidazole - resistant cyathostomes of horses, Veterinary Record 120, 293-296).

Die Nukleinsäure-Sequenzierung von β-Tubulin-cDNAs aus den erfindungsgemäßen Spezies kleiner Strongyliden wiesen eine Identität von über 95%. Die Identität mit den bekannten, oben genannten β-Tubulin-Sequenzen von Schaf-Parasiten beträgt dagegen nur 75,4-82,6%.

Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen sind innerhalb der erfindungsgemäßen Sequenzen sehr ähnlich. Das gilt auch für die abgeleiteten β-Tubulin-Aminosäure sequenzen der Schaf-Parasiten. Die Identität liegt dabei zwischen 95 und 99,8%. Es ergeben sich nur sehr wenige Positionen an denen ein Aminosäureaustausch auftritt. Hervorzuheben ist hier das Kodon 200, in dem ein Wechsel von Phenylalanin zu Tyrosin resultiert.

Allerdings zeigen die bisher veröffentlichten nichtkodierenden β-Tubulin-Sequenzen aus verschiedenen Helminthen-Spezies keine signifikante Identität. Es ist demnach überraschend, daß nicht nur die kodierenden Sequenzen sondern auch Teile der nicht- kodierenden Sequenzen der verschiedenen Spezies kleiner Strongyliden der hier vor liegenden Anmeldung eine hohe Identität aufweisen. Diese Regionen sind deshalb auch geeignet, um verschiedene Spezies kleiner Strongyliden und andere Nematoden-Spezies voneinander unterscheiden zu können. PCR-Primer, die aus diesen Intron-Regionen abgeleitet sind, können der spezifischen Detektion kleiner Strongyliden innerhalb einer Probe dienen, die auch genetisches Material aus anderen helmintischen Organismen enthält.

β-Tubulin aus Nematoden oder Teile davon sind dafür bekannt, ein protektives, immunologisches Potential zu besitzen (Bughio et al. (1993) Characterisation and biological activities of anti-Brugia pahangi tubulin monoclonal antibodies, International Journal for Parasitology, 7, 913-924). Das von der oben genannten DNA kodierte β-Tubulin der kleinen Strongyliden kann als Vakzin ebenso verwendet werden wie monoklonale Antikörper gegen das β-Tubulin.

Inhibitoren der Interaktion des Tubulins bzw. seiner Untereinheiten, wie Benz imidazole, Colchizine und Taxol sind wichtige Leitstrukturen einer Reihe von Thera peutika, die gegen menschliche, tierische oder pflanzliche Krankheiten gerichtet sind. Die Bedeutung des Tubulins als Ziel dieser Verbindungen ist weitreichend und unter streicht dessen Potential für die Suche nach neuen Wirkstoffen zur Bekämpfung dieser Krankheiten.

Gegenstand der Erfindung ist die für das β-Tubulin aus Nematoden der Familie der Strongylidae, besonders der Subfamilie der Cyathostominae kodierende DNA oder Fragmente dieser DNA. Die β-Tubulin-DNA kann dabei genomische DNA oder cDNA sein. Die DNA-Sequenzen, die Gegenstand dieser Erfindung sind, können als neue Mitglieder der Tubulin-Genfamilie parasitischer Nematoden der Ordnung Strongylida, besonders der Subfamilie der Cyathostominae betrachtet werden. Die Erfindung bezieht sich ganz besonders auf die DNA-Sequenzen, die für β-Tubulin aus parasitischen Nematoden der Gattungen Cyathostomum und Cylicocyclus kodieren.

Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls DNA-Sequenzen, die zu einem für eine der Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO. 2, 4, 6, 8 oder 10 kodierenden Polynukleotid eine Identität von mehr als 85% aufweisen.

Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls bevorzugt DNA-Sequenzen, die zu einem für eine der Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO. 2, 4, 6, 8 oder 10 kodierenden Polynukleotid eine Identität von mehr als 95% aufweisen.

Gegenstand der Erfindung sind im besonderen für β-Tubulin kodierende DNA- Sequenzen, die aus parasitischen Nematoden der Gattungen Cylicocyclus und Cyathostomum stammen, ganz besonders solche Sequenzen, die aus parasitischen Nematoden der Art Cylicocyclus nassatus stammen, bevorzugt DNA gemäß SEQ ID NO. 3, 5, 7, 9 oder 11 oder aus Cyathostonum coronatum, bevorzugt DNA gemäß SEQ ID NO. 1.

Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls DNA-Sequenzen wie oben beschrieben, die im Unterschied zu diesen Sequenzen in Kodon 200 mindestens eine Punktmutation bzw. einen Nukleotidaustausch aufweisen. Diese Punktmutationen resultieren in einer Änderung der von dieser DNA kodierten Aminosäuresequenz, z. B. einem Austausch der Aminosäure Phenylalanin gegen Tyrosin und korrelieren mit der Resistenz von Tubulin mit entsprechenden Mutationen gegen Benzimidazole.

Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls DNA-Sequenzen, die komplementär zur oben beschriebenen DNA oder Fragmenten dieser DNA sind, sowie Fragmente, dieser DNA-Sequenzen. Diese DNA-Sequenzen bzw. diese Fragmente umfassen Oligonukleotide, die von einer der oben genannten oder unter SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9 oder 11 beschriebenen DNA-Sequenzen abgeleitet sind oder von dazu zu 85% identischen, bevorzugt zu 95% identischen Sequenzen sowie von dazu komplementären Strängen abgeleitet sind und an diese hybridisieren können.

Gegenstand der Erfindung sind dabei bevorzugt Oligonukleotide bestehend aus oder umfassend eine der Sequenzen gemäß SEQ ID NO. 12 bis SEQ ID NO. 51, die an oben genannte DNA-Sequenzen hybridisieren, bevorzugt im Bereich nicht kodieren der Sequenzabschnitte der β-Tubulin-Gene.

Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls bevorzugt Oligonukleotide bestehend aus oder umfassend eine der Sequenzen gemäß SEQ ID NO. 12 bis SEQ ID NO. 51, die an kodierende Bereiche der oben genannten Sequenzen hybridisieren.

Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls RNA-Sequenzen, die komplementär zur oben beschriebenen DNA oder Fragmenten dieser DNA sind, sowie Fragmente dieser RNA-Sequenzen. Diese RNA-Sequenzen bzw. diese Fragmente umfassen Ribooligonukleotide, die einer Region einer der oben genannten oder unter SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9 oder 11 beschriebenen DNA-Sequenzen, dazu komplementärer Sequenzen oder dazu zu 85%, bevorzugt zu 95% identischer DNA-Sequenzen entsprechen und an diese hybridisieren können.

Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls ein Expressionskonstrukt, welches eine der oben beschriebenen DNA-Sequenzen umfaßt, sowie eine damit verknüpfte DNA- Sequenz, die die Expression der DNA ermöglicht. Dazu gehören beispielsweise min destens ein Promotor zur konstitutiven oder induzierbaren Expression oder auch Enhancer. Passende Promotoren für eine Expression in E. coli sind natürliche Hybrid- oder Bakteriophagen-Promotoren, bevorzugt Promotoren der Gruppe der λ-Phagen, hsp, omp oder synthetische Promotoren wie z. B. in WO 98/5625, DE 34 30 683 oder EP 0 173 149 genannt.

Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls Vektoren, die eine der oben beschriebenen DNA-Sequenzen umfassen und die Expression des erfindungsgemäßen β-Tubulins oder Fragmenten davon in einer Wirtszelle ermöglichen.

Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls Wirtszellen, die die oben genannte DNA enthalten, ein Expressionskonstrukt wie obengenannt, oder einen Vektor und die Expression des β-Tubulins oder Fragmente davon gestatten.

Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls Polypeptide, die von einer der oben genannten DNA-Sequenzen oder Fragmenten dieser DNA-Sequenzen kodiert werden, sowie Fragmente dieser Polypeptide.

Gegenstand der Erfindung sind dabei bevorzugt Polypeptide, die von einer DNA- Sequenz umfassend SEQ ID NO. 1, 3, S. 7, 9 oder 11 kodiert werden, von DNA- Sequenzen, die zu diesen Sequenzen eine Identität von 85%, bevorzugt von 95% aufweisen, oder von Fragmenten dieser DNA.

Gegenstand dieser Erfindung sind auch Polypeptide, die von einer oben beschrie benen DNA-Sequenz kodiert werden, die mindestens eine Punktmutation in Kodon 200 wie oben beschrieben enthalten und Resistenz gegenüber Benzimidazolen zeigen, sowie Fragmente dieser Polypeptide.

Gegenstand der Erfindung sind dabei ganz besonders bevorzugt Polypeptide um fassend eine der in SEQ ID NO. 2, 4, 6, 8 oder 10 beschriebenen Amino säuresequenzen oder Fragmente davon.

Die Erfindung bezieht sich dabei auf Polypeptide, besonders auf aufgereinigte Poly peptide oder rekombinant hergestellte Polypeptide.

Die Erfindung bezieht sich auf Polypeptide voller Länge und auch auf entsprechende Fragmente dieser Polypeptide, z. B. bestimmte Motive oder Domänen. Diese Frag mente können von unterschiedlicher Länge sein und z. B. 5, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250 oder 300 Aminosäuren umfassen.

Diese Erfindung bezieht sich ebenfalls auf Fusionsproteine, die ein Polypeptid wie oben beschrieben umfassen. Das Fusionsprotein kann dabei einen weiteren Poly peptidanteil enthalten, das nicht in Zusammenhang mit dem β-Tubulin steht (z. B. LexA, B42, Glutathione-S-Transferase, einen His-Tag, ein Polypeptid mit enzymatischer Aktivität wie die alkalische Phosphatase oder einen Epitop-Tag).

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids wie oben beschrieben in passenden prokaryontischen oder eukaryontischen Expres sionssystemen. Die Expression kann dabei permanent oder transient in einer jeweils entsprechenden Zellinie bzw. entsprechenden Wirtszellen wie oben beschrieben er folgen. Passende prokaryontische Expressionssysteme sind bekannte Wirts-Vektor- Systeme wie Bakterien (z. B. Streptomyces spp., Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, Serratia marcescens und besonders Escherichia coli).

Die Expression in einem eukaryontischen System erfolgt bevorzugt im Baculovirus- System, besonders in einem System, das das Einführen posttranslationaler Modi fikationen gestattet.

Gegenstand dieser Erfindung ist ebenfalls die Verwendung von DNA wie oben genannt zur Detektion von DNA aus Nematoden der Familie Strongylidae, bevorzugt der Subfamilie Cyathostominae, besonders bevorzugt der Gattungen Cyathostomum und Cylicocyclus, ganz besonders bevorzugt der Arten Cyathostomum coronatum und Cylicocyclus nassatus. Die Erfindung bezieht sich dabei auf Oligo nukleotide wie obengenannt, die komplementär zu für β-Tubulin kodierender DNA oder dazu komplementären Stränge sind und an diese DNA hybridisieren können.

Bevorzugt hybridisieren diese Oligonukleotide an die Intron-Regionen, d. h. die nicht kodierenden DNA-Sequenzen. Die Erfindung bezieht sich auf die Verwendung dieser Oligonukleotide oder Teilen davon als

a) Proben in Northern- oder Southern-Blot-Assays,
b) PCR-Primer in einem diagnostischen Verfahren zur Detektion der oben genannten Nematoden, wobei die DNA der betreffenden Nematoden spezifisch mit Hilfe der Primer und der PCR-Technik identifiziert und amplifiziert wird.

Gegenstand der Erfindung sind dabei bevorzugt Oligonukleotide bestehend aus oder umfassend eine der Sequenzen gemäß SEQ ID NO. 12 bis SEQ ID NO. 51.

Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls die Verwendung von DNA wie obengenannt zur Detektion von DNA aus Nematoden der Familie der Strongylidae, bevorzugt der Subfamilie der Cyathostominae, besonders bevorzugt der Gattungen Cylicocyclus und Cyathostomum, ganz besonders bevorzugt der Arten Cylicocyclus nassatus und Cyathostomum coronatum, die für β-Tubulin oder Fragmente davon kodiert, die resistent sind gegen Benzimidazole. Die Erfindung bezieht sich dabei auf Oligo nukleotide wie oben genannt, die komplementär zu DNAs sind, die für β-Tubulin mit einer Resistenz gegen Benzimidazole kodieren bzw. zu den komplementären Strängen dieser DNA und die an diese DNA spezifisch hybridisieren können.

Die Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung dieser Oligonukleotide oder Teilen davon als

a) Proben in Northern- oder Southern-Blot-Assays,
b) PCR-Primer in einem diagnostischen Verfahren zur Detektion der oben genannten Nematoden mit einer Resistenz gegenüber Benzimidazolen, wobei die DNA der betreffenden Nematoden spezifisch mit Hilfe der Primer und der PCR-Technik identifiziert und amplifiziert wird.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Detektion von Nematoden der Familie der Strongylidae, bevorzugt der Subfamilie der Cyathostominae, besonders bevorzugt der Gattungen Cylicocyclus und Cyathostomum, ganz besonders be vorzugt der Arten Cylicocyclus nassatus und Cyathostomum coronatum, wobei Oligonukleotide wie oben beschrieben an DNA-Sequenzen spezifisch hybridisieren, die aus den genannten Organismen stammen, und die mit Hilfe der PCR-Technik amplifiziert werden können. Die Hybridisierung erfolgt vorzugsweise in den nicht kodierenden Regionen des β-Tubulin-Gens (Introns).

Die Detektion von Organismen wie obengenannt kann z. B. erfolgen, indem man

a) eine Oligonukleotidprobe bzw. Primer zur Verfügung stellt, die an die oben genannte für β-Tubulin kodierende DNA oder dazu komplementäre Stränge oder an die 5'- oder 3'-flankierenden Regionen derselben hybridisieren können,
b) die Oligonukleotidprobe bzw. die Primer mit einer entsprechend aufbe reiteten, DNA enthaltenden Probe in Kontakt bringt,
c) die Hybridisierung des Oligonukleotids bzw. Primers detektiert (z. B. mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion),
d) die detektierte Sequenz des β-Tubulin-Gens sequenziert, und
e) die Sequenz mit den erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen vergleicht, die oben beschrieben wurden, bevorzugt mit DNA-Sequenzen gemäß SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9 oder 11.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Detektion von Nematoden der Familie der Strongylidae, bevorzugt der Subfamilie der Cyathostominae, besonders bevorzugt der Gattungen Cylicocyclus und Cyathostomum, ganz besonders bevorzugt der Arten Cylicocyclus nassatus und Cyathostomum coronatum, die resistent gegen Benzimidazole sind, wobei Oligonukleotide wie oben beschrieben an DNA-Sequenzen spezifisch hybridisieren, die aus den genannten Organismen stammen, und die mit Hilfe der PCR-Technik amplifiziert werden können. Die Hybridisierung erfolgt vorzugsweise in den nicht kodierenden Regionen des β- Tubulin-Gens (Introns).

Die Detektion von Organismen wie obengenannt kann z. B. erfolgen, indem man

a) eine Oligonukleotidprobe bzw. Primer zur Verfügung stellt, die an die oben genannte für β-Tubulin kodierende DNA oder dazu komplementäre Stränge oder an die 5'- oder 3'-flankierenden Regionen derselben hybridisieren können,
b) die Oligonukleotidprobe bzw. die Primer mit einer entsprechend aufbe reiteten, DNA enthaltenden Probe in Kontakt bringt,
c) die Hybridisierung des Oligonukleotids bzw. Primers detektiert (z. B. mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion),
d) die detektierte Sequenz des β-Tubulin-Gens sequenziert, und
e) die Sequenz mit den erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen vergleicht, die oben beschrieben wurden, bevorzugt mit DNA-Sequenzen gemäß SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9 oder 11, die mindestens eine Punktmutation in Kodon 200 aufweisen, die zu einer Resistenz des von diesen Sequenzen kodierten β-Tubulins gegen Benzimidazole führt.

Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls ein diagnostischer Testkit zur Detektion und Identifizierung von Nematoden der Familie der Strongylidae, bevorzugt der Sub familie der Cyathostominae, besonders bevorzugt der Gattungen Cylicocyclus und Cyathostomum, ganz besonders bevorzugt der Arten Cylicocyclus nassatus und Cyathostomum coronatum, der unter anderem Oligonukleotide wie oben beschrieben zur Verfügung stellt, die in Verfahren zur Detektion der genannten Spezies verwendet werden können. Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls Oligonukleotide zur Verfügung, die spezifisch an Sequenzen gemäß SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9 oder 11, dazu komplementäre Sequenzen, Sequenzen mit mindestens einer Punktmutation in Kodon 200, oder Fragmente dieser Sequenzen hybridisieren. Besonders bevorzugt sind dabei Oligonukleotide bestehend aus oder umfassend Sequenzen gemäß SEQ ID NO. 12 bis SEQ ID NO. 51.

Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls ein diagnostischer Testkit zur Detektion von Nematoden der Familie der Strongylidae, bevorzugt der Subfamilie der Cyathostominae, besonders bevorzugt der Gattungen Cylicocyclus und Cyathostomum, ganz besonders bevorzugt der Arten Cylicocyclus nassatus und Cyathostomum coronatum, mit einer Resistenz gegen Benzimidazole, der unter anderem Oligonukleotide wie oben beschrieben zur Verfügung stellt, die in Verfahren zur Detektion der genannten Spezies verwendet werden können. Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls Oligonukleotide zur Verfügung, die spezifisch an Sequenzen gemäß SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9 oder 11, dazu komplementäre Sequenzen, Sequenzen mit mindestens einer Punktmutation in Kodon 200, oder Fragmente dieser Sequenzen hybridisieren. Besonders bevorzugt sind dabei Oligonukleotide bestehend aus oder umfassend Sequenzen gemäß SEQ ID NO. 12 bis SEQ ID NO. 51.

Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls ein diagnostischer Testkit wie vorstehend be schrieben, wobei die in diesem Kit zur Verfügung gestellten Oligonukleotide mit einem detektierbaren Marker versehen sind. Solche detektierbaren Marker können u. a. Enzyme beinhalten, Enzym-Substrate, Coenzyme, Enzyminhibitoren, Fluoreszenzmarker, Chromophore, lumineszente Marker und Radioisotope.

Gegenstand dieser Erfindung sind ebenfalls Antikörper, die spezifisch mit einem Epitop eines β-Tubulins aus Nematoden der Familie der Strongylidae, bevorzugt der Subfamilie der Cyathostominae, besonders bevorzugt der Gattungen Cylicocyclus und Cyathostomum, ganz besonders bevorzugt der Arten Cylicocyclus nassatus und Cyathostomum coronatum reagieren.

Gegenstand dieser Erfindung sind ebenfalls besonders monoklonale Antikörper, die spezifisch mit einem Epitop eines β-Tubulins aus Nematoden der Familie der Strongylidae, bevorzugt der Subfamilie der Cyathostominae, besonders bevorzugt der Gattungen Cylicocyclus und Cyathostomum, ganz besonders bevorzugt der Arten Cylicocyclus nassatus und Cyathostomum coronatum, reagieren.

Gegenstand dieser Erfindung ist ebenfalls die Verwendung der vorstehend genannten Antikörper als Nematizide.

Gegenstand dieser Erfindung ist auch die Verwendung der vorstehend genannten β-Tubulin-Polypeptide oder Fragmente davon aus Nematoden der Familie der Strongylidae, bevorzugt der Subfamilie der Cyathostominae, besonders bevorzugt der Gattungen Cylicocyclus und Cyathostomum, ganz besonders bevorzugt der Arten Cylicocyclus nassatus und Cyathostomum coronatum, zur Herstellung von Vakzinen, die mindestens eines der genannten β-Tubulin-Polypeptide oder Fragmente davon enthalten. Das Vakzin ist dabei in der Lage eine Immunantwort hervorzurufen, die spezifisch ist für ein vorstehend beschriebenes β-Tubulin.

In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das Vakzin eine antigene Determinante, z. B. eine einzelne Determinante eines Polypeptids mit einer Amino säuresequenz gemäß SEQ ID NO. 2, 4, 6, 8 oder 10 oder eines Polypeptids, das von einer der vorstehend genannten DNA oder Fragmenten davon kodiert wird.

Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung einer immunogenen Zusammensetzung zur Immunisierung von Säugern, bestehend aus mindestens einem der vorstehend genannten erfindungsgemäßen β-Tubulin- Polypeptide oder Fragmenten davon oder aus mindestens einem der vorstehend genannten Antikörper.

Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls die Verwendung der vorstehend beschriebenen Expressionsvektoren enthaltend eine Nukleinsäure kodierend für ein erfindungsgemäßes β-Tubulin, bevorzugt eine Sequenz gemäß SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9 oder 11, Fragmente davon oder dazu homologe Sequenzen zur Herstellung einer immunogene Zusammensetzung zur Verabreichung in einen Wirt zur Aktivierung einer protektiven Immunantwort in diesem Wirt, die auf β-Tubulin aus parasitären Nematoden gerichtet ist.

Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls eine immunogene Zusammensetzung umfassend einen Vektor (umfassend eine für das erfindungsgemäße β-Tubulin kodierende Nukleinsäure, vorzugsweise eine Sequenz gemäß SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9 oder 11, Fragmente davon oder dazu homologe Sequenzen sowie eine Promotor- Sequenz, die funktionell mit besagter Nukleotidsequenz verknüpft ist und die die Expression des eine Immunantwort hervorrufenden erfindungsgemäßen β-Tubulins steuert) und eine für pharmazeutische Zwecke geeignete Trägersubstanz.

Gegenstand dieser Erfindung ist ebenfalls ein Verfahren zum Identifizieren von Substanzen, die die Interaktion von Tubulin bzw. die Interaktion von Untereinheiten des Tubulins modulieren. Das Verfahren beruht auf der Verwendung von Tubulin, bevorzugt auf Tubulin aus parasitischen Nematoden, besonders bevorzugt auf β-Tubulin aus parastischen Nematoden der Ordnung Strongylida, ganz besonders bevorzugt auf β-Tubulin aus parasitischen Nematoden der Familie der Strongylidae, am meisten bevorzugt auf β-Tubulin aus parastischen Nematoden der Subfamilie der Cyathostominae. Eine besonders bevorzugte Gruppe des in diesem Verfahren verwendeten β-Tubulins ist β-Tubulin aus parasitischen Nematoden der Gattungen Cylicocyclus und Cyathostomum.

Die Erfindung bezieht sich auf das Identifizieren von Substanzen, z. B. kleinen orga nischen Molekülen, die in der Lage sind, die Interaktion von Tubulin-Protein molekülen bzw. dessen Untereinheiten miteinander zu modulieren. Bevorzugt bezieht sich die Erfindung auf das Identifizieren von Verbindungen, die die Interaktion inhibieren.

Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls ein Verfahren wie vorstehend beschrieben, das darauf beruht, daß man

a) die zu testende Substanz mit dem Tubulin in Kontakt bringt, wobei die ge wählten Bedingungen die Interaktion der Tubulinmoleküle miteinander und die Bindung der Testsubstanz an Tubulin gestatten,
b) die erfolgte Bindung detektiert, indem man die Fähigkeit der Tubulin-Protein moleküle zur Interaktion miteinander bestimmt und
c) die Fähigkeit der Tubulin-Proteinmoleküle zur Interaktion miteinander bei Anwesenheit einer Testsubstanz zur Fähigkeit der Interaktion miteinander bei Abwesenheit einer Testsubstanz vergleicht.

Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls ein Verfahren zum Identifizieren von Sub stanzen, die die Fähigkeit von Tubulin-Molekülen zur Interaktion miteinander modulieren. Besonders bevorzugt bezieht sich die Erfindung dabei auf ein Verfahren, das eines der vorstehend beschriebenen Polypeptide verwendet, die von den vorstehend beschriebenen DNAs oder Fragmenten davon kodiert werden, besonders von DNAs bestehend aus oder umfassend Sequenzen gemäß SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9 oder 11 sowie von Sequenzen, die dazu eine Identität von 85%, vorzugsweise 95% aufweisen und für β-Tubulin kodieren, das eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ 2, 4, 6, 8 oder 10 besitzt.

Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls ein Verfahren zum Identifizieren von Sub stanzen, die die Fähigkeit von Tubulin zur Interaktion miteinander modulieren wie vorstehend beschrieben, wobei das verwendete Verfahren darauf beruht, eine Modulation der Tubulininteraktion bei Anwesenheit einer Testsubstanz mit Hilfe eines auf Zellen basierenden Testsystems zu detektieren. Eine bevorzugte Aus führungsform eines solchen Testsystems ist das sogenannte "Two Hybrid System" (US 5 283 317, Zervos et al. (1993) Cell 72, 223-232; WO 94/10300). Dieses System ist geeignet, die Interaktion zweier Proteine zu dokumentieren oder zu beschreiben, indem die Interaktion zu einem detektierbaren Signal führt. Ein solches System kann auch an Testsysteme mit hohen Durchsatzzahlen angepaßt werden.

Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls ein Verfahren zum Identifizieren von Sub stanzen, die die Fähigkeit von Tubulin zur Interaktion miteinander, wobei das verwendete Verfahren darauf beruht, eine Modulation der Tubulininteraktion bei Anwesenheit einer Testsubstanz mit Hilfe eines zellfreien Testsystems zu detektieren. Eine besonders bevorzugte Ausführungsform eines solchen Testsystems ist der sogenannte "Scintillation Proximity Assay" (SPA) (EP 015 473). Dieses Testsystem beruht auf dem Nachweis einer Interaktion eines an Mikrokügelchen ("Microspheres") oder Perlen ("Beads") gebundenen Rezeptors, z. B. eines Tubulin- Moleküls, mit einem Liganden, wobei die Microspheres oder Beads mit einem szintillierenden Molekül versehen sind. Ein Signal wird dann detektiert, wenn der Rezeptor-Ligand-Komplex zerfällt.

Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls bislang noch nicht beschriebene Sub stanzen, die mit Hilfe der vorstehend beschriebenen Verfahren identifiziert werden und geeignet sind, die Interaktion von Tubulinmolekülen zu modulieren, vorzugs weise zu inhibieren.

Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls die Verwendung von bislang noch nicht beschriebenen Substanzen, die mit einem der vorstehend beschriebenen Verfahren identifiziert wurden, zur Herstellung eines Mittels, das der prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung von Tieren oder Menschen dienen, die von Nematoden befallen werden können oder befallen wurden. Die erfindungsgemäßen Mittel enthalten mindestens eine der mit einem der vorstehend beschriebenen Verfahren identifizierten Substanzen und können nasal, dermal, parenteral oder enteral verabreicht werden.

Zum besseren Verständnis soll die Bedeutung bestimmter Wörter und Begriffe, die in der Beschreibung, den Beispielen und angefügten Ansprüchen verwendet werden, im Folgenden näher erläutert werden.

Der Begriff "Fragmente" in Bezug auf Proteine und DNA beschreibt Teile der unter den SEQ ID NO. 1 bis 11 beschriebenen Nukleinsäuren bzw. Aminosäuresequenzen, dazu komplementärer Sequenzen oder dazu zu 85%, vorzusweise zu 95% identischer Sequenzen. Die Fragmente der DNA- und Polypeptidsequenzen umfassen mindestens 5 Nukleotide oder Aminosäuren, können aber ebenso bis zu 447 Amino säuren oder bis zu 1343 Nukleotide, bzw. bis zu 2565 Nukleotide im Falle der Sequenz gemäß SEQ ID NO. 11 umfassen.

Die Begriffe "Homologie", "Identität" oder "Ähnlichkeit" beziehen sich auf Sequenz ähnlichkeiten zwischen zwei Peptiden oder zwischen zwei Nukleinsäuremolekülen. Homologie kann bestimmt werden, indem man jeweils eine Position in jeder Sequenz miteinander vergleicht. Ist eine Position in der verglichenen Sequenz von derselben Base oder Aminosäure besetzt, sind die beiden Moleküle an dieser Position homolog. Das Maß für Homologie zwischen Sequenzen ist eine Funktion der Anzahl der über einstimmenden oder homologen Positionen, die die Sequenzen miteinander teilen. Eine "nicht homologe" Sequenz weist eine Identität von weniger als 40% auf, vorzugsweise allerdings weniger als 25% Identität.

Der Begriff "Homologie" bedeutet im besonderen, daß DNA-Segmente von minde stens 15 Basenpaaren Länge oder zur DNA komplementäre Stränge in mindestens 85%, vorzugsweise 95% der Nukleotide mit der entsprechenden DNA überein stimmen. Eine Homologie kann u. a. mit Hilfe von Computerprogrammen wie dem GCG-Programm (Devereux et al. (1983), Nucleic Acids Res. 12, 387-395) festge stellt werden.

Eine "Homologie" besteht auch, wenn ein DNA-Segment an den betreffenden DNA Strang oder dessen komplementären Strang hybridisieren kann.

Der Begriff "hybridisieren" oder "Hybridisierung" beschreibt den Vorgang, bei dem ein einzelsträngiges Nukleinsäuremolekül mit einem komplementären DNA-Strang eine Basenpaarung eingeht, wobei die Fähigkeit eines einzelsträngigen Nukleinsäure moleküls von der Stringenz der Hybridisierungsbedingungen abhängt.

Der Begriff "Stringenz" bezieht sich auf die Hybridisierungsbedingungen. "Hohe Stringenz" ist dann gegeben, wenn eine Basenpaarung erschwert wird. "Niedrige Stringenz" ist dann gegeben, wenn eine Basenpaarung erleichtert wird.

Der Begriff "komplementär" bezieht sich auf die Fähigkeit von Purin- und Pyrimidinnukleotiden über Wasserstoffbrückenbindungen miteinander Basenpaare zu bilden. Komplementäre Basenpaare sind u. a. Guanin und Cytosin, Adenin und Thymin sowie Adenin und Uracil.

Der Fachmann ist sich darüber im klaren, daß aufgrund des degenerierten gene tischen Kodes (d. h. 64 Kodons kodieren für 20 Aminosäuren) zahlreiche "stille" Sub stitutionen von Nukleotidbasenpaaren in die hierfür aufgeführte Sequenz eingeführt werden können, ohne die Identität der davon kodierten Proteinprodukte zu verändern. Alle solche Substitutionen sollen im Umfang der Erfindung enthalten sein.

Der Begriff "spezifisch hybridisieren" bezieht sich auf die Fähigkeit eines Nuklein säuremoleküls der vorliegenden Erfindung, an mindestens etwa 6, 12, 20, 30, 50, 100, 150, 200, 300, 350, 400 oder 440 aufeinander folgende Nukleotide eines der vorstehend beschriebenen β-Tubulin-Gene zu hybridisieren, bevorzugt an eine der Sequenzen gemäß SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9 oder 11 oder dazu homologe oder komplementäre Sequenzen, und zwar derart, daß 10fach mehr Moleküle hybridisieren, bevorzugt 100fach mehr Moleküle hybridisieren, und besonders bevorzugt mehr als 100fach mehr Moleküle hybridisieren als an eine zelluläre Nukleinsäure (z. B. mRNA oder genomische DNA), die für ein anderes Protein als das vorstehend beschriebene β-Tubulin kodiert.

Der Begriff "Plasmid" bezieht sich auf ein extrachromosomales genetisches Element. Die für die vorliegende Erfindung verwendeten Ursprungsplasmide sind entweder kommerziell erhältlich, frei zugänglich oder können von solchen Plasmiden nach bekannten Verfahren abgeleitet werden.

Der Begriff "Vektor" beschreibt ein DNA-Element, das zum Einbringen exogener DNA in Wirtszellen verwendet wird. Ein Vektor enthält eine Nukleotidsequenz, die für ein oder mehrere Polypeptide kodiert. Vektoren, die in der Lage sind, die Expression der Gene zu steuern, die sie enthalten, werden als "Expressionsvektoren" bezeichnet.

Der Begriff "Gen" bezieht sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung auf eine Nukleinsäure enthaltend ein offenes Leseraster, das für eines der vorstehend be schriebenen β-Tubulin-Polypeptide kodiert. Dabei werden sowohl Exon- als auch evtl. Intron-Sequenzen mit eingeschlossen.

Der Begriff "interagieren" oder "Interaktion" beschreibt detektierbare Wechsel wirkungen zwischen Molekülen. Der Begriff "Bindung" wird dabei mit umfaßt.

Der Begriff "modulieren" bezieht sich sowohl auf eine Stimulation als auch auf eine Suppression oder Inhibition eines biochemischen Vorgangs. Im Rahmen der vorlie genden Erfindung bedeutet "Modulation" eine Inhibition oder Suppression der Inter aktion zwischen Tubulin-Polypeptiden oder Fragmenten oder Untereinheiten davon, oder eine Stimulation dieser Interaktion, die sich z. B. in einer irreversiblen Bindung von Tubulin-Polypeptiden aneinander zeigen kann.

Der Begriff "Nukleinsäure" bezieht sich auf Polynukleotide wie Desoxyribonuklein säuren (DNA) oder, falls angebracht, auf Ribonukleinsäuren (RNA). Der Begriff umfaßt auch in äquivalenter Weise Analoga von RNA oder DNA, die aus Nukleotidanaloga hergestellt werden, sowie im zutreffenden Fall einzelsträngige ("Sense" oder "Antisense") und doppelsträngige Polynukleotide.

Der Begriff "Promotor" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die die Expression einer bestimmten DNA regulieren, die funktionell mit dem Promotor verknüpft sind. Der Begriff umfaßt auch "gewebsspezifische" Promotoren, d. h. Promotoren, die die Expression der spezifischen DNA nur in bestimmten Zellen (z. B. Zellen eines be stimmten Gewebes) steuern. Ebenso umfaßt sind "gewebsunspezifische" Promotoren und Promotoren, die zu einer konstitutiven Expression führen oder induzierbar sind.

Die Begriffe "Protein", "Polypeptid" und "Peptid" sind in ihrer Verwendung im Rahmen der vorliegenden Anmeldung austauschbar, wenn sie sich auf ein Genprodukt beziehen.

Ein "Fusionsprotein" ist eine Fusion einer ersten Aminosäuresequenz kodierend für eines der vorstehend beschriebenen β-Tubulin-Polypeptide mit einer zweiten Aminosäuresequenz, die keine Gemeinsamkeit oder grundlegende Homologie zur Tubulin-Sequenz hat. Die zweite Aminosäuresequenz kann dabei aus demselben Organismus stammen wie die erste, oder alternativ aus einem anderen Organismus stammen (intergenisch). Im allgemeinen kann ein Fusionsprotein anhand der Formel X-Tubulin-Y wiedergegeben werden, wobei "Tubulin" für eines der vorstehend beschriebenen Polypeptide steht, und X und Y für ein Polypeptid stehen, das nicht in Zusammenhang mit einer Tubulin-Aminosäuresequenz steht. X oder Y können jeweils unabhängig voneinander abwesend sein.

Die Begriffe "Zelle" oder "Wirtszelle" können im Rahmen der hier vorliegenden Anmeldung im gleichen Sinne verwendet werden. Es versteht sich, daß diese Begriffe sich nicht nur auf eine einzelne Zelle, sondern auch auf die Nachkommen einer solchen Zelle beziehen. Aufgrund bestimmter Modifikationen im Verlauf folgender Generationen (z. B. Mutationen), sind solche Nachkommen möglicherweise nicht mit der Stammzelle identisch, sind allerdings von der vorliegenden Erfindung mit umfaßt.

Der Begriff "Intron" beschreibt solche Sequenzen der beschriebenen, vorzugsweise genomischen DNA, die transkribiert, dann aber aus dem Transkript durch soge nanntes "Splicing" entfernt werden, wobei die angrenzenden Sequenzen (Exons) verknüpft werden.

Nukleinsäuren

Wie bereits beschrieben, bezieht sich ein Aspekt der Erfindung auf Nukleinsäuren aus Nematoden der Familie der Strongylidae, besonders der Subfamilie der Cyathostominae, ganz besondere auf die Gattungen Cyathostomum und Cylicocyclus, vor allem der Arten Cylicocyclus nassatus und Cyathostomum coronatum, die für β-Tubulin-Polypeptide kodieren, oder Fragmente davon oder dazu homologe Nukleinsäuren, die den in SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9 und 11 zu 85%, vorzugsweise zu 95% homolog sind und für ein β-Tubulin gemäß einer der Sequenzen gemäß SEQ ID NO. 2, 4, 6, 8 oder 10 oder Fragmente davon kodieren. SEQ ID NO. 3 gibt die degenerierte Sequenz der für β-Tubulin kodierenden Nukleinsäure aus Cylicocyclus nassatus wieder, wobei "r" für ein Purin (Guanin oder Adenin) steht, "y" für ein Pyrimidin (Thymin bzw. Uracil oder Cytosin) und "w" für ein Adenin oder ein Thymin bzw. ein Uracil. SEQ ID NO. 3 umfaßt damit eine Reihe von Sequenzen, die in Organismen der Spezies Cylicocyclus nassatus vorliegen können. Die Sequenzen gemäß SEQ ID NO. 5, 7 und 11 zeigen drei definierte, für β- Tubulin kodierende Sequenzen, die beispielhafte und bevorzugte Ausführungsformen von DNA gemäß SEQ ID NO. 3 sind.

Teil der Erfindung sind ebenfalls Oligonukleotide, die gegebenenfalls für β-Tubulin- Polypentide kodieren, die eine Länge von mindestens 2, 5, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 oder 400 Aminosäuren umfassen. Solche Oligonukleotide können als Primer oder Antisens-Moleküle (d. h. also als nicht kodierende Nukleinsäuren) dienen und mindestens etwa 6, 12, 24, 30, 60, 100, 120, 150 oder 210 Basenpaare umfassen, während kodierende Nukleinsäuren etwa 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200 oder 1300 Basenpaare umfassen.

Die Erfindung beschreibt auch solche Oligonukleotide, die spezifisch unter stringenten Bedingungen an Nukleinsäuren hybridisieren, die von einer der Sequenzen gemäß SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9 oder 11 wiedergegeben werden. Ent sprechend stringente Bedingungen sind z. B. 6 × Natriumchlorid/Natriumcitrat (SSC) bei etwa 45°C, gefolgt von einem Waschschritt mit 2 × SSC bei 50°C, und sind dem Fachmann geläufig (siehe z. B. Current protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6). So können die Salzkonzentrationen im Waschschritt so gewählt werden, daß die Stringenz geringer ist (2 × SSC, 50°C) oder höher ist (0,2 × SSC, 50°C). Weiterhin kann die Temperatur beim Waschschritt variiert werden, von Bedingungen für eine geringe Stringenz (z. B. ca. 22°C), bis hin zu Bedingungen hoher Stringenz (z. B. ca. 65°C). Sowohl Salzkonzentration als auch Temperatur können variiert und aufeinander abgestimmt werden.

Besonders bevorzugte Oligonukleotide, die als Primer oder für eine Hybridisierung zur Identifizierung und Charakterisierung einer vorliegenden, z. B. genomischen, DNA verwendet werden können, sind in SEQ ID NO. 12-51 beschrieben. Es können jedoch auch andere Oligonukleotide aus den Sequenzen gemäß SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9 oder 11 abgeleitet werden, die dann als Primer bzw. zur Hybridisierung ver wendet werden können. Besonders bevorzugt zur Identifizierung der Spezies oder Gattung, der eine vorliegende DNA zugeordnet werden kann, sind solche Oligo nukleotide, die im Bereich des Introns einer vorliegenden (genomischen) DNA hybridisieren. Die Introns einer für β-Tubulin kodierenden genomischen DNA, die aus den vorstehend genannten Nematoden isoliert werden kann, sind am Beispiel von Cylicocyclus nassatus in SEQ ID NO. 11 beschrieben. Die Introns sind also jene Sequenzen, die zwischen den kodierenden Exons lokalisiert sind. In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten die beschriebenen Primer oder Hybridisierungssonden eine markierte Gruppierung, die die Detektion der Oligonukleotide ermöglicht, so z. B. Radioisotope, fluoreszierende Gruppierungen, Enzyme oder Enzym-Cofaktoren.

Solche Oligonukleotide können in diagnostischen Test-Kits eingesetzt werden, um die Herkunft (d. h. den Organismus) einer vorliegenden DNA zu bestimmen. Die Oligonukleotide sind durch ihre spezifische Hybridisierung mit den unter SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9 und 11 genannten DNAs deren Fragmenten, dazu homologen Sequenzen und dazu komplementären Sequenzen geeignet, definierte Sequenzen zu erkennen. Sie ermöglichen so auch die Erkennung und Identifizierung von solchen für β-Tubulin kodierenden Sequenzen, die aufgrund einer oder mehrerer Punktmutationen in Kodon 200 zur Expression von benzimidazolresistentem β-Tubulin führen. Diese von den Sequenzen SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9 und 11 abgeleiteten Oligonukleotide, bevorzugt die unter SEQ ID NO. 12 bis 51 beschrie benen Ausführungsformen sind damit geeignet zur Identifizierung der häufig auftretenden Nematoden-Spezies der Subfamilie der Cyathostominae, sowie zur Erkennung bestehender Resistenzen gegen Benzimidazole.

Die Oligonukleotide gemäß der vorliegenden Erfindung können mit Standard methoden, die dem Fachmann geläufig sind, hergestellt werden, z. B. durch de novo DNA-Synthese.

Die hier genannten Nukleinsäuren können in vollständigen Zellen, in Zell-Lysaten, in teilweise gereinigter oder biologisch reiner Form vorliegen, d. h. wenn andere Zell komponenten bzw. chemische Vorläufer und Nebenprodukte im Falle einer chemischen Synthese der DNA abgetrennt wurden.

Für β-Tubulin kodierende Nukleinsäuren, wie vorstehend beschrieben, können ausgehend von mRNA gewonnen werden, die in einer Reihe eukaryontischer Zellen vorliegt. Es ist auch möglich, die erfindungsgemäße DNA ausgehend von genomischer DNA aus den betreffenden Nematodenzellen zu erhalten (siehe auch folgende Beispiele). Ein für β-Tubulin kodierendes Gen kann z. B. aus einer cDNA- oder einer genomischen DNA-Bibliothek gewonnen werden. cDNA kann erhalten werden, indem man die gesamte mRNA einer Zelle, z. B. einer Nematodenzelle, isoliert. Ausgehend von der mRNA kann dann doppelsträngige cDNA hergestellt werden und in ein passendes Plasmid oder einen passenden Vektor insertiert werden. Die erfindungsgemäße DNA kann auch erhalten werden durch Amplifikation mit Hilfe der bekannten Polymerase-Kettenreaktion (PCR) oder auch durch de novo-DNA-Synthese (siehe auch J. Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, 2. Auflage, Kap. 14).

Vektoren und Plasmide

Die vorliegende Erfindung umfaßt auch Expressionsvektoren, die eine der erfin dungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen enthalten, die funktionell mit einer transkrip tionsregulatorischen Seqzenz verknüpft sind. "Funktionell verknüpft" bedeutet, daß die Nukleinsäuresequenz in einer Weise mit der regulatorischen Sequenz verknüpft ist, daß die Expression des von der Nukleinsäuresequenz kodierten Proteins gesteuert werden kann. "Transkriptionsregulatorische Sequenzen" umfassen z. B. Promotoren, Enhancer und andere Kontrollelemente. Die Expressionsvektoren enthalten z. B. ein Gen kodierend für ein erfindungsgemäßes β-Tubulin oder Fragmente davon. Diese Vektoren können verwendet werden, um in Zellen eingebracht zu werden, wo dann die entsprechenden Polypeptide oder auch Fusionsproteine entstehen. Passende Pro motoren zur Expression des erfindungsgemäßen Proteins in E. coli umfassen natür liche Hybrid- oder Bakteriophagenpromotoren. Bevorzugt handelt es sich um Pro motoren aus der Gruppe der Phage X-Promotoren, um omp- oder synthetische Pro motoren (siehe auch WO 98/15625, DE 34 30 683, EP 0 173 149). Geeignete Vektoren sind kommerziell erhältlich, z. B. die Expressionsvektoren der pET-Serie (z. B. pET3a, pET23a, pET28a und His-Tag oder pET32a mit His-Tag) oder pGEX mit Glutathionsynthetase-Fusion. Die Expressionsvektoren können dann z. B. in DE3-lysogene E. coli-Stämme, z. B. BL21(DE3), HM S174(DE3) oder AD494(DE3) transformiert werden.

Expression der β-Tubulin-Polypeptide

Die vorliegende Erfindung umfaßt auch Zellen, die die erfindungsgemäßen Nuklein säuresequenzen enthalten (z. B. in einem Vektor oder in das Genom insertiert). Diese Wirtszellen können prokaryontisch oder eukaryontisch sein.

Passende prokaryontische Expressionssysteme sind z. B. bakterielle Systeme wie Streptomyces spp., Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, Serratia marcescens und bevorzugt E. coli.

Ein bevorzugtes eukaryontisches Expressionssystem ist das Baculovirussystem, be sonders bevorzugt jenes, das posttranslationale Modifikationen gestattet.

Andere eukaryontische Expressionssysteme (z. B. Hefe, Insektenzellen) können eben falls benutzt werden.

Polypeptide

Die vorliegende Erfindung umfaßt ebenfalls β-Tubulin-Polypeptide, die von den er findungsgemäßen DNAs, vorzugsweise den DNA-Sequenzen gemäß SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9 und 11 kodiert werden, von Fragmenten derselben oder von homologen DNA-Sequenzen wie vorstehend beschrieben. Bevorzugte Ausführungsformen dieser β-Tubulin-Polypeptide sind in den Sequenzen gemäß SEQ ID NO. 2, 4, 6, 8 und 10 beschrieben. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den beschrie benen Polypeptiden um aufgereinigte Polypeptide, die frei sind von kontaminieren den Proteinen jener Zellen, in denen die erfindungsgemäßen Polypeptide produziert wurden.

Bei den beschriebenen Polypeptiden handelt es sich um Proteine voller Länge oder um Fragmente, Motive oder Domänen davon, die Längen von mindestens 5, 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 200, 250, 300, 350 oder 400 Aminosäuren umfassen.

Polypeptidfragmente können erhalten und ausgewählt werden durch das Testen von Polypeptiden, die von Nukleinsäurefragmenten abgeleitet aus den Sequenzen gemäß SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9 und 11 kodiert werden.

Polypeptidfragmente können auch auf bekannte Weise chemisch synthetisiert werden.

Die Erfindung umfaßt auch Polypeptide, die von der degenerierten Sequenz gemäß SEQ ID NO. 3 kodiert werden. Durch die verschiedenen möglichen Basen an definierten Positionen der DNA-Sequenz ergeben sich verschiedene Polypeptide mit vom jeweils sich ergebenden Kodon kodierten Aminosäure. Die von DNA gemäß SEQ ID NO. 3 kodierten Polypeptide sind in SEQ ID NO. 4 beschrieben, wobei die variablen Aminosäuren durch "Xaa" gekennzeichnet sind.

Bevorzugte Ausführungsformen der Polypeptide sind in SEQ ID NO. 2, 4, 6, 8 und 10 beschrieben.

Die vorliegende Erfindung umfaßt auch Verfahren zur Herstellung der erfindungsge mäßen Polypeptide.

Dem Fachmann ist bekannt, daß die Polypeptide der vorliegenden Erfindung auf ver schiedenem Wege gewonnen werden können, z. B. durch chemische Methoden wie der Festphasenmethode. Zur Gewinnung größerer Proteinmengen empfiehlt sich die Verwendung rekombinanter Methoden.

Die grundlegenden Schritte zur Herstellung des rekombinanten β-Tubulins sind:

1. Gewinnung einer natürlichen, synthetischen oder semi-synthetischen DNA, die für das erfindungsgemäße β-Tubulin kodiert.
2. Einbringen dieser DNA in einem Expressionsvektor, der geeignet ist, das er findungsgemäße β-Tubulin zu exprimieren, entweder alleine oder als Fusions protein.
3. Transformation einer passenden, vorzugsweise prokaryontischen Wirtszelle mit diesem Expressionsvektor.
4. Anzucht dieser transformierten Wirtszelle in einer Weise, die geeignet ist, das erfindungsgemäße β-Tubulin zu exprimieren.
5. Ernte der Zellen und Aufreinigung des β-Tubulins durch geeignete, bekannte Methoden.

Zum Beispiel können die Expressionsvektoren in λDE3-lysogene E. coli-Stämme, z. B. BL21(DE3), HM S174(DE3) oder AD494(DE3) transformiert werden. Nach dem Anwachsen der Zellen unter dem Fachmann geläufigen Standardbedingungen wird die Expression mit IPTG induziert. Nach Induktion der Zellen wird für 3 bis 24 Stunden bei Temperaturen von 18 bis 37°C inkubiert. Die Zellen werden aufgeschlossen, das exprimierte Protein über chromatographische Methoden gereinigt, im Fall von mit His-Tag exprimiertem Protein durch FPLC an einer Ni- NTA-Säule, sowie durch Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltrationschromatographie, Ultrafiltration, Elektrophorese oder auch Immunoaffinitäts-Aufreinigung, die für die erfindungsgemäßen Polypeptide spezifisch sind.

Homologe oder Fragmente der erfindungsgemäßen Polypeptide können durch Mutagenese generiert werden, wie z. B. durch gerichtete (Punkt-)Mutagenese, oder durch Deletionen.

Die erfindungsgemäßen Polypeptide können auch chemisch modifiziert werden, z. B. mit Glycosyl-Gruppen, Lipiden, Phosphaten, Acetylgruppen oder ähnlichen Gruppen. Kovalente Derivate können durch die Verknüpfung der modifizierenden Gruppe mit funktionellen Gruppen der Aminosäureseitenketten oder dem N-Terminus oder C-Terminus des Polypeptids erhalten werden.

Bei der Expression der Polypeptide gemäß der vorliegenden Erfindung kann es von Vorteil sein, bestimmte Kodons zu verändern, um eine optimale Expression zu er möglichen. Dies gilt dann, wenn die Verwendung bestimmter Kodons ("Codon usage") im heterologen Expressionssystem anders ist als in einem der erfindungsge mäßen Organismen. Weiterhin ist die Deletion der 5'- oder 3'-untranslatierten Region möglich, z. B. wenn mehrere destabilisierende Sequenzmotive (z. B. ATTTA) in der 3'-Region der cDNA vorliegen.

Fusionsproteine

Die erfindungsgemäßen Polypeptide können auch als Teil eines Fusionsproteins vor liegen. Solche Fusionsproteine werden von der vorliegenden Erfindung voll umfaßt. Fusionsproteine können nützlich sein unter Bedingungen, wo es wünschenswert ist, ein immunogenes Fragment des β-Tubulins zu erhalten (siehe z. B. EP 0 259 149; Schlienger et al. (1992) J. Virol. 66, 2)). Fusionsproteine erleichtern unter bestimmten Umständen die Expression eines Polypeptids. Zum Beispiel können die erfindungs gemäßen Polypeptide als Glutathione-S-Transferase (GST-) Fusions-Proteine herge stellt werden. Solche GST-Fusions-Proteine ermöglichen eine leichte Aufreinigung des Polypeptids (siehe z. B. Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al. (John Wiley & Sons, N. Y. 1991)). Fusionsproteine können z. B. eine "Leader"- Sequenz enthalten, die der Aufreinigung dient, z. B. erlaubt eine Poly-His-Sequenz am N-Terminus (aber auch am C-Terminus) des Proteins dessen Aufreinigung mittels Chromatographie an einer Ni²⁺-NTA-Säule (siehe z. B. Hachuli et al. (1987) J. Chromatography 411, 177).

Techniken zum Herstellen solcher Fusionsproteine sind dem Fachmann geläufig.

Antikörper

Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf Antikörper, die spezifisch mit dem erfindungsgemäßen β-Tubulin-Polypeptiden reagieren.

Zum Beispiel können durch die Nutzung von Immunogenen, die von erfindungs gemäßen β-Tubulin-Polypeptiden abgeleitet wurden, Anti-Protein- bzw. Anti-Peptid- Antiseren oder monoklonale Antikörper nach Standardprotokollen hergestellt werden (siehe z. B. Antibodies: A. Laboratory Manual ed. by Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, 1988)).

Säuger wie Mäuse, Hamster oder Kaninchen können mit einer immunogenen Form oder einem immunogenen Anteil des erfindungsgemäßen Polypeptids immunisiert werden, also mit einem Polypeptid, das in der Lage ist, eine Antikörper-Antwort her vorzurufen (siehe auch "Fusionsproteine" oben). Die entsprechenden Techniken sind dem Fachmann geläufig. So kann ein immunogener Anteil des β-Tubulins in der Gegenwart eines Adjuvants verabreicht werden. Der Verlauf der Immunisierung kann durch Kontrolle des Antikörper-Titers in Plasma oder Serum beobachtet werden, z. B. durch gängige ELISA- oder andere Immuno-Assays.

In einer bevorzugten Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen Antikörper immunspezifisch für eine antigene Determinante eines erfindungsgemäßen β-Tubulin-Polypeptids, z. B. eines Polypeptids gemäß SEQ ID NO. 2, 4, 6, 8 oder 10 oder solcher Polypeptide, die von DNAs gemäß SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9 oder 11 oder damit zu 85% identischer Sequenzen, bevorzugt zu 95% identischer Sequenzen kodiert werden.

Nach der Immunisierung eines Säugers können polyklonale Anti-β-Tubulin-Anti körper aus dem Serum isoliert werden. Zur Herstellung monoklonaler Antikörper können Antikörper-produzierende Zellen (Lymphocyten) von einem immunisierten Tier gewonnen werden und gemäß bekannten Methoden mit immortalen Zellen wie Myeloma-Zellen fusioniert werden, um Hybridoma-Zellen zu erhalten (siehe z. B. Kohler und Milstein (1975) nature 256, 495-497; Kozbar et al. (1983) Immunology Today 4, 72; Cole et al. (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. pp. 77-96).

Die hier genannten "Antikörper" sollen auch Fragmente von Antikörpern umfassen, die spezifisch mit erfindungsgemäßem β-Tubulin reagieren. Antikörper können mit konventionellen Techniken fragmentiert werden und die Fragmente überprüft werden.

Eine bevorzugte Ausführungsform bezieht sich auf Antikörper wie vorstehend be schrieben, die einen detektierbaren Marker tragen (z. B. Radioisotope, fluoreszierende Gruppen, Enzyme oder Enzym-Cofaktoren).

Antikörper, die spezifisch an erfindungsgemäße β-Tubulin-Polypeptide binden, können auch zur immunhistochemischen Färbung von Gewebeproben verwendet werden, um die Expression eines bestimmten β-Tubulins zu detektieren. Die Anti-β- Tubulin-Antikörper können ebenso für diagnostische Zwecke, z. B. zur Immuno präzipitation oder zum Immuno-Blotting verwendet werden.

Diagnostische Testverfahren

Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls Nukleinsäuremoleküle zur Verfügung, die zu diagnostischen Zwecken verwendet werden können.

Dazu gehören Nuleinsäuremoleküle wie vorstehend beschrieben, die Fragmente der unter SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9 oder 11 beschriebenen oder dazu komplementäre DNA-Sequenzen. Beispielhaft werden Oligonukleotide gemäß SEQ ID NO. 12 bis 51 zur Verfügung gestellt, die in der Lage sind, an Sens- oder Antisens-Sequenzen kodierend für β-Tubulin zu hybridisieren, sowie an intronische Sequenzabschnitte, die beispielhaft in SEQ ID NO. 11 beschrieben sind.

Dabei wird die Nukleinsäure einer Zelle zugänglich für die Hybridisierung gemacht, die DNA-Probe mit den Oligonukleotiden in Kontakt gebracht, und die Hybridi sierung der Probe mit dem Oligonukleotid detektiert.

Auf diese Weise wird eine Methode zur Verfügung gestellt, die es ermöglicht, durch die spezifische Hybridisierung der erfindungsgemäßen Oligonukleotide an eine DNA-Probe, vorzugsweise mit Hilfe solcher Oligonukleotide, die an die intronischen Bereiche der für β-Tubulin kodierenden DNA hybridisieren, zwischen verschiedenen Spezies kleiner Strongyliden und/oder anderen Nematoden-Spezies zu unterscheiden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform gestatten die erfindungsgemäßen Oligonukleotide die Identifizierung von Resistenzen bei kleinen (Cyathostaminae), z. B. bei Pferden, vor allem Resistenzen der Spezies Cylicocyclus nassatus, Cyathostomum coronatum und Cyathostomum catinatum. Dabei kann der Umstand genutzt werden, daß resistente Formen des β-Tubulins mindestens eine Punktmutation in der dafür kodierenden erfindungsgemäßen DNA tragen, die mittels PCR detektiert werden kann, wie z. B. in analoger Weise beschrieben bei Elard et al. (1998) PCR diagnosis of benzimidazole-susceptibility or -resistance in natural populations of the small ruminant parasite, Teladorsagia circumcincta. Veterinary Parasitology 80, 231-237.

Die beschriebene Methode ist besonders hilfreich zur Beurteilung möglicher Be handlungsstrategien bei mit Nematoden befallenen Menschen und Tieren wie z. B. Pferden, Schafen, Schweinen, Ziegen, Kamelen, Büffeln, Eseln, Hasen, Rehwild, Pelztieren, Vögeln (z. B. Hühnern, Puten, Enten), Süß- und Salzwasserfischen (z. B. Forellen, Karpfen). Sie ermöglicht die Identifizierung und Unterscheidung der parasitären Nematoden sowie die Erkennung resistenter Populationen derselben, und vermeiden eine Behandlung mit unwirksamen Nematiziden.

Die hier beschriebenen Methoden können z. B. in Form vorgefertigter Diagnose- Testkits zur Verfügung gestellt werden, die zumindest eines der oben genannten Nukleinsäuremoleküle oder einen Antikörper wie vorstehend beschrieben enthalten, der gebrauchsfertig vorbereitet ist.

Verfahren zum Auffinden von nematiziden Substanzen

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren, bei dem mit Hilfe von Tubulin oder Fragmenten davon neuartige, spezifische anthelmintische Substanzen identifiziert werden können.

In einer bevorzugten Ausführungsform werden dazu β-Tubulin-Polypeptide gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet. Das Verfahren kann jedoch auch mit Tubulin aus anderen als den hier genannten Spezies durchgeführt werden. Verfahren, die andere als die erfindungsgemäßen β-Tubulin-Polypeptide verwenden, sind von der vorliegenden Erfindung voll umfasst. Besonders bevorzugt werden für das genannte Verfahren β-Tubulin-Polypeptide gemäß SEQ ID NO. 2, 4, 6, 8 oder 10 verwendet. In der vorliegenden Erfindung werden also zusätzlich rekombinante β-Tubulin-Polypeptide aus häufig auftretenden parasitären Nematoden zur Verfügung gestellt. Diese können in verschiedenen Testsystemen zum Identifizieren neuer Inhibitoren der Tubulin-Interaktion, bzw. der Interaktion der Tubulin- Untereinheiten genutzt werden.

Zellfreie Testsysteme

Viele Testsysteme, die die Prüfung von Verbindungen und natürlichen Extrakten zum Ziel haben, sind auf hohe Durchsatzzahlen ausgerichtet, um die Zahl der unter suchten Substanzen in einem gegebenen Zeitraum zu maximieren. Testsysteme, die auf zellfreiem Arbeiten beruhen, brauchen gereinigtes oder semi-gereinigtes Protein. Sie sind geeignet für eine "erste" Prüfung, die in erster Linie darauf abzielt, einen möglichen Einfluß einer Substanz auf das Zielprotein zu detektieren.

Effekte wie Zelltoxizität werden in diesen in vitro Systemen in der Regel ignoriert. Die Testsysteme überprüfen dabei sowohl inhibierende bzw. suppressive Effekte der Substanzen, als auch stimulatorische Effekte. Die Effektivität einer Substanz kann durch konzentrationsabhängige Testreihen überprüft werden. Kontrollansätze ohne Testsubstanzen können zur Bewertung der Effekte herangezogen werden.

Eine Möglichkeit zur Identifizierung von Substanzen, die die Interaktion von Tubulin bzw. dessen Untereinheiten modulieren, ist der sogenannten "Scintillation Proximity Assay" (SPA), siehe EP 015 473. Dieses Testsystem nutzt die Interaktion eines Rezeptors (z. B. Tubulin) mit einem radiomarkierten Liganden (z. B. ein kleines orga nisches Molekül oder ein zweites, radioaktiv markiertes Proteinmolekül). Der Rezeptor ist dabei an kleine Kügelchen ("Microspheres") oder Perlen ("Beads") gebunden, die mit szintillierenden Molekülen versehen sind. Im Verlauf des Abfalls der Radioaktivität wird die szintillierende Substanz im Kügelchen durch die subatomaren Partikel des radioaktiven Markers angeregt und ein detektierbares Photon emittiert. Die Testbedingungen werden so optimiert, daß nur jene vom Liganden ausgehenden Partikel zu einem Signal führen, die von einem an den Rezeptor bzw. das Tubulin gebundenen Liganden ausgehen.

In einer möglichen Ausführungsform ist Tubulin an die Beads gebunden, entweder zusammen oder ohne interagierende bzw. bindende Testsubstanzen. Verwendet wer den könnten dabei α- oder β-Tubulin-Untereinheiten. Ein radioaktiv markierter Ligand könnte z. B. ein markiertes Benzimidazol oder ein weiteres, markiertes β- Tubulin-Molekül sein. Bei einer Bindung des Liganden an das immobilisierte Tubulin, müßte dieser Ligand eine bestehende Interaktion zwischen unmobilisiertem und freiem Tubulin inhibieren oder aufheben, um selbst im Bereich der Kontaktfläche zu binden. Eine erfolgte Bindung an das unmobilisierte Tubulin kann dann anhand eines Lichtblitzes detektiert werden. Entsprechend wird ein bestehender Komplex zwischen einem immobilisierten und einem freien, markierten Tubulin durch die Bindung einer Testsubstanz zerstört, was zu einem Abfall der detektierten Lichtblitzintensität führt. Das Testsystem entspricht dann einem komplementären Inhibitions-System.

Auf Zellen basierendes Testsystem

Das durch die vorliegende Erfindung verfügbare β-Tubulin, aber auch Tubulin aus anderen Spezies, ermöglicht die Entwicklung von Testsystemen, die auf Zellen basie ren, zur Identifizierung von Substanzen, die die Tubulin-Interaktion inhibieren.

Ein Beispiel für ein solches Testsystem ist das sogenannte "Two Hybrid System". Ein spezifisches Beispiel dafür ist die sogenannte "Interaction Trap", die Interak tions-Falle. Es handelt sich dabei um eine genetische Selektion von interagierenden Proteinen in Hefe (siehe z. B. Gyuris et al. (1993) Cdi 1, a human G1 and S phase protein phosphatase that associates with Cdk 2. Cell 75, 791-803). Das Testsystem ist darauf ausgelegt, die Interaktion zweier Proteine zu detektieren und zu beschreiben, indem eine erfolgte Interaktion zu einem detektierbaren Signal führt.

Ein solches Testsystem kann auch an die Prüfung großer Zahlen von Testsubstanzen in einem gegebenen Zeitraum angepaßt werden.

Das System beruht auf der Konstruktion zweier Vektoren, dem "Bait"- und dem "Prey"-Vektor. Ein für Tubulin, bevorzugt ein für ein erfindungsgemäßes β-Tubulin kodierendes Gen wird in den Bait-Vektor kloniert und dann als Fusionsprotein mit dem LexA-Protein, einem DNA-bindenden Protein, exprimiert. Ein zweites Gen, kodierend für Tubulin, vorzugsweise für ein erfindungsgemäßes β-Tubulin, wird in den Prey-Vektor kloniert, wo es als Fusionsprotein mit dem B42-Prey-Protein exprimiert wird. Beide Vektoren liegen in einem Saccharomyces cerevisiae-Wirt vor, der Kopien von LexA-bindender DNA auf der 5'-Seite eines lacZ- oder HIS3-Reportergens enthält. Findet eine Interaktion zwischen den beiden Tubulin-(Fusions-)Proteinen statt, kommt es zur Aktivierung der Transkription des Reportergens. Führt die Anwesenheit einer Testsubstanz zur Inhibition oder zur Störung der Tubulin-Interaktion, können die beiden Tubulin-(Fusions-)Proteine nicht mehr interagieren, das Produkt des Reportergens wird nicht mehr hergestellt.

Mit Hilfe von Tubulin, besonders des erfindungsgemäßen β-Tubulins oder Frag menten davon, und der vorstehend beschriebenen Verfahren, ist es möglich, neue und spezifische antiparasitische Verbindungen zu identifizieren.

Verbindungen, die mit Hilfe der beschriebenen Verfahren und Polypeptide gefunden werden, sind wertvoll zur Behandlung von Tieren und Menschen, die mit pathogenen Endoparasiten des Menschen oder von Nutztieren, Hobbytieren, Zootieren sowie Labor- und Versuchstieren infiziert sind.

Die Verbindungen sind wirksam gegen alle Entwicklungsstadien normaler, sensitiver Stämme und auch resistenter Stämme. Durch die Behandlung mit Mitteln, die eine oder mehrere dieser Verbindungen enthalten, können sowohl wirtschaftliche Verluste bei Nutztieren und Krankheiten bei Menschen und Tieren vermieden oder behandelt werden. Die folgenden Parasiten sind dabei von besonderem Interesse als Ziele der gefundenen Wirkstoffe:
Enoplida, z. B. Trichuris spp., Capillaria spp., Trichomosoides spp., Trichinella spp.
Rhabditia, z. B. Micronema spp., Strongyloides spp.
Strongylida, z. B. Strongylus spp., Triodontophorus spp., Oesophagodontus spp., Trichonema spp., Gyalocephalus spp., Cylindropharynx spp., Poteriosiomum spp., Cyclococercus spp., Cylicostephanus spp., Oesophagostomum spp., Chabertia spp., Stephanurus spp., Ancylostoma spp., Uncinaria spp., Bunostomum spp., Globoce phalus spp., Syngamus spp., Cyathostomum spp., Cylicocyclus spp., Neostrongylus spp., Cystocaulus spp., Pneumostrongylus spp., Spicocaulus spp., Elaphostrongylus spp., Parelaphostrongylus spp., Crenosoma spp., Paracrenosoma spp., Angiostron gylus spp., Aelurostrongylus spp., Filaroides spp., Parafilaroides spp., Tricho strongylus spp., Haemonchus spp., Ostertagia spp., Marshallagia spp., Cooperia spp., Nematodirus spp., Hyostrongylus spp., Obeliscoides spp., Amidostomum spp., Ollulanus spp.
Oxyurida, z. B. Oxyuris spp., Enterobius spp., Passalurus spp., Syphacia spp., Aspi culuris spp., Heterakis spp.
Ascaridia, z. B. Ascaris spp., Toxascaris spp., Toxocara spp., Parascaris spp., Anisa kis spp., Ascaridia spp.
Spirurida, z. B. Gnathostoma spp., Physaloptera spp., Thelazia spp., Gongylonema spp., Habronema spp., Parabronema spp., Draschia spp., Dracunculus spp.
Filariida, z. B. Stephanofilaria spp., Parafilaria spp., Setaria spp., Loa spp., Dirofilaria spp., Litomosoides spp., Brugia spp., Wuchereria spp., Onchocerca spp.
Gigantorhynchida, z. B. Filicollis spp., Moniliformir spp., Macracanthorhynchus spp., Prosthenorchis spp.
Mastigophora (Flagellata)
Trypanosomatidae, z. B. Trypanosoma b. brucei, T. b. gambiense, T. b. rhodesiense, T. congolense, T. cruzi, T. evansi, T. equinum, T. lewisi, T. percae, T. simiae, T. vivax, Leishmania brasiliensis, L. donovani, L. tropica
Trichomonadidae, z. B. Giardia lambiliu, G. canis.
Sarcomastigophora (Rhizopoda), z. B. Entamoeba histolytica
Hartmanellidae, z. B. Acanthamoeba sp., Hartmanella spp.
Apicomplexa (Sporozoa), z. B. Eimeria acervulina, E. adenoides, E. alabahmensis, E. anatis, E. anseris, E. arloingi, E. ashata, E. auburnensis, E. bovis, E. brunetti, E. canis, E. chinchillae, E. clupearum, E. columbae, E. contorta, E. crandalis, E. debliecki, E. dispersa, E. ellipsoidales, E. falciformis, E. faurei, E. labbeana, E. leucarti, E. magna, E. maxima, E. media, E. meleagridis. E. meleagrimitis, E. mitis, E. necatrix, E. ninakohlyakimovae, E. ovis, E. parva, E. pavonis, E. perforans, E. phasani, E. piriformis, E. praecox, E. residua, E. scabra, E. spec., E. stiedai, E. suis, E. tenella, E. truncata, E. truttae, E. zuernii, Globidium spec., Isospora belli, I. canis, I. felis, I. ohioensis, I. rivolta, I. spec., I. suis, Neospora caninum, Cystisospora spec. Cryptosporidium spec.
Toxoplasmadidae, z. B. Toxoplasma gondii
Sarcocystidae, z. B. Sarcocystis bovicanis, S. bovihominis, S. neuvona, S. ovicanis, S. ovifelis, S. spec., S. suihominis
Leucozoide, z. B. Leucozytozoon simondi
Plasmodiidae, z. B. Plasmodium berghei, P. falciparum, P. malariae, P. ovale, P. vivax, P. spec.
Piroplasmea, z. B. Babesia argentina, B. bovis, B. canis, B. spec., Theileria parva, T. spec.
Adeleina, z. B. Hepatozoon canis, H. spec.

Weiterhin von Bedeutung sind
Myxospora und Microspora, z. B. Glugea spec. und Nosema spec., sowie Pneumocystis carinii, Ciliophora (Ciliata), z. B. Balantidium coli, Ichthiophthirius spec., Trichondina spec. oder Epistylis spec.

Die gefundenen Verbindungen und Mittel sind ebenfalls effektiv gegenüber Proto zoen von Insekten, wie solche des Stammes Microsporidia, besonders solche der Ordnung Nosema, ganz besonder solche der Art Nosema apis, die Parasiten der Honigbiene sind.

Beispiele Beispiel 1 Gewinnung von β-Tubulin-cDNA und genomischer DNA

mRNA wurde mit Hilfe des Quick Prep® Micro mRNA Kits (Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) aus C. nassatus-Würmem und aus C. coronatum- und C. catinatum-Würmern mit dem Dynal® mRNA Direct Kit (Dynal, Hamburg, Deutschland) gewonnen. Die Würmer wurden aus dem Dickdarm von Pferden iso liert und mikroskopisch gemäß der charakteristischen Struktur von Kopf und Schwanz differenziert (siehe R. S. Lichtenfeld (1975), Helminths of domestic equids. Proceedings ofthe Helminthological Society, Washington, 42 (Special issue), 1-92).

Die Synthese der cDNA erfolgte mit Hilfe des "Reverse Transkription System" (Promega, Madison, USA) im Falle der mRNA aus C. nassatus und mit der Super script RT II Reverse Transcriptase (Gibco BRL Life Technologies) im Falle der mRNA aus C. coronatum und C. catinatum. In den genannten Fällen wurden Oligo nukleotide mit einer Länge von 15 Basenpaaren verwendet. Die Inkubation erfolgte für eine Stunde bei 42°C.

Genomische DNA wurde aus 4 bis 40 erwachsenen Würmern mit dem QIA Amp- Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) gewonnen. Dabei wurden die Würmer für 2 Stunden bei 55°C mit Proteinase K verdaut und die genomische DNA mit "Spin Columns" extrahiert.

Beispiel 2 Amplifikation von β-Tubulin-Sequenzen

Die Amplifikation von β-Tubulin-Sequenzen voller Länge oder von Fragmenten kann z. B. mit AmpliTaq Gold™ Polymerase (Perkin Eimer, Foster City, California, USA) erfolgen.

Eine Amplifikation der β-Tubulin-Sequenzen gemäß SEQ ID NO. 1, 3, 5, 7, 9 oder 11 oder Fragmenten davon kann mit Hilfe der Primer gemäß SEQ ID NO. 12-51 erfolgen.

Für die Amplifikation der cDNA von C. coronatum eignen sich z. B. die Sequenzen gemäß SEQ ID NO. 43 und 44, für die Amplifikation der cDNA von C. catinatum eignen sich besonders die Sequenzen gemäß SEQ ID NO. 40 und 42.

Die Amplifikation der C. nassatus cDNA und der genomischen DNA aller Spezies gemäß der vorliegenden Erfindung erfolgte in einem Gesamtvolumen von 50 µl, enthaltend 5 µl 10 × Puffer, 2,5 µl MgCl₂ (25 mM), 2 µl dNTP-Mix (2 mM je NTP), 1 µl jedes spezifischen Primers (SEQ ID NO. 12-47) (50 p mol/µl), 0,5 µl (2,5 U) Polymerase und 1-5 µl DNA-Template. Bei der Verwendung degenerierter Primer (SEQ ID NO. 48-51) wurden 1 µl jedes Primers einer Konz. von 500 µmol/µl eingesetzt. Das Annealing erfolgte im Falle degenerierter Primer bei 46°C, bei spezifischen Primern wurde die Temperatur entsprechend der berechneten Schmelztemperatur variiert. Die PCR-Zyklen wurden wie folgt gewählt:
95°C für 10 min. dann 35-40 Zyklen mit 1 min Denaturierung bei 94°C, 1 min Annealing, 1 min bei 72°C und ein abschließender Schritt bei 72°C für 10 min. Bei der Amplifikation von cDNA aus C. coronatum und C. catinatum wurde ein soge nanntes "Touchdown" PCR-Temperaturprogramm durchgeführt, das folgendes Profil hat:
zunächst 15 Zyklen mit 94°C für 30 sec, dann 1 min bei 60°C und 1 min bei 72°C, gefolgt von 15 Zyklen mit 30 sec bei 95°C, 55°C für 1 min und 72°C für 1 min und schließlich 10 Zyklen bei 95°C für 30 sec, dann 45°C für 1 min und 72°C für 1 min. Für die Amplifikation größerer Fragmente (<1000 Basenpaare) wurde die Elonga tionsphase bei 72°C auf 2.30 min verlängert.

Beispiel 3

PCR-Produkte aus der Amplifikation von cDNA oder genomischer DNA aus C. nassatus, C. coronatum und C. catinatum wurden mit Hilfe des "Original TA Cloning Kit"/Invitrogen, Leek, (Niederlande) kloniert, und zwar in den "Original TA Cloning®"-Vektor.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. DNA kodierend für β-Tubulin aus Cyathostominae oder Fragmente davon.

2. DNA gemäß Anspruch 1, umfassend

a) ein Polynukleotid mit mindestens 85% Identität zu einem Polynukleo tid kodierend für eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 2;
b) ein Polynukleotid mit mindestens 85% Identität zu einem Polynukleo tid kodierend für eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 4;
c) ein Polynukleotid mit mindestens 85% Identität zu einem Polynukleo tid kodierend für eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 6;
d) ein Polynukleotid mit mindestens 85% Identität zu einem Polynukleo tid kodierend für eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 8;
e) ein Polynukleotid mit mindestens 85% Identität zu einem Polynukleo tid kodierend für eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 10.

3. DNA gemäß Anspruch 1, umfassend

a) ein Polynukleotid mit mindestens 95% Identität zu einem Polynukleo tid kodierend für eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 2;
b) ein Polynukleotid mit mindestens 95% Identität zu einem Polynukleo tid kodierend für eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 4;
c) ein Polynukleotid mit mindestens 95% Identität zu einem Polynukleo tid kodierend für eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 6;
d) ein Polynukleotid mit mindestens 95% Identität zu einem Polynukleo tid kodierend für eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 8;
e) ein Polynukleotid mit mindestens 95% Identität zu einem Polynukleo tid kodierend für eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 10.

4. DNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend eine Sequenz gemäß SEQ ID NO. 1.

5. DNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend eine Sequenz gemäß SEQ ID NO. 3.

6. DNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend eine Sequenz gemäß SEQ ID NO. 5.

7. DNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend eine Sequenz gemäß SEQ ID NO. 7.

8. DNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend eine Sequenz gemäß SEQ ID NO. 9.

9. DNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend eine Sequenz gemäß SEQ ID NO. 11.

10. DNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 und 5 bis 9, dadurch gekenn zeichnet, daß sie aus Cylicocyclus stammt.

11. DNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Cyathostomum stammt.

12. DNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 und 5 bis 10, dadurch gekenn zeichnet, daß sie aus Cylicocyclus nassatus stammt.

13. DNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 und 11, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Cyathostomum coronatum stammt.

14. DNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß sie in Kodon 200 mindestens einen Basenaustausch enthält, der zur Expression eines Polypeptids mit anthelmintischer Resistenz führt.

15. DNA, dadurch gekennzeichnet, daß sie komplementär zu DNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 ist oder Fragmente davon.

16. RNA, dadurch gekennzeichnet, daß sie komplementär zu DNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15 ist.

17. Expressionskonstrukt, dadurch gekennzeichnet, daß es DNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 sowie eine funktionell damit verknüpfte Sequenz, die die Expression der DNA ermöglicht, umfaßt.

18. Vektor, dadurch gekennzeichnet, daß er DNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 umfaßt.

19. Wirtszelle, enthaltend DNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, ein Expressionskonstrukt gemäß Anspruch 17, oder einen Vektor gemäß Anspruch 18.

20. Polypeptid kodiert von einer DNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14 oder Fragmente davon.

21. Polypeptid gemäß Anspruch 20, bestehend aus oder umfassend eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 2.

22. Polypeptid gemäß Anspruch 20, bestehend aus oder umfassend eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 4.

23. Polypeptid gemäß Anspruch 20, bestehend aus oder umfassend eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 6.

24. Polypeptid gemäß Anspruch 20, bestehend aus oder umfassend eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 8.

25. Polypeptid gemäß Anspruch 20, bestehend aus oder umfassend eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 10.

26. Polypeptid kodiert von einer DNA gemäß Anspruch 14.

27. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 20 bis 26, umfassend die Expression des Polypeptids oder Fragmente davon in einem prokaryotischen oder eukaryotischen Expressionssystem.

28. Verwendung von DNA-Oligonukleotiden, die spezifisch an DNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15 hybridisieren, bevorzugt an nicht kodierende DNA-Abschnitte, zur Detektion von DNA, die aus Cyathostominae stammt.

29. Verwendung von DNA, die spezifisch an DNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15 hybridisiert, zur Detektion von DNA, die aus Cyathostominae stammt und für ein Polypeptid gemäß Anspruch 26 kodiert.

30. Verfahren zur Detektion von Cyathostominae, dadurch gekennzeichnet, daß man DNA gemäß Anspruch 28 an DNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15 hybridisiert und diese mittels PCR amplifiziert.

31. Verfahren zur Detektion von Cyathostominae mir anthelmintischer Resistenz, dadurch gekennzeichnet, daß man DNA gemäß Anspruch 29 an DNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15 hybridisiert und diese mittels PCR amplifiziert.

32. DNA-Oligonukleotide umfassend eine der Sequenzen gemäß SEQ ID NO. 12 bis SEQ ID NO. 51 oder eine aus einer der DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 1 bis 15 abgeleitete Sequenz.

33. Diagnostischer Testkit umfassend mindestens eines der Oligonukleotide gemäß Anspruch 32 und/oder Antikörper gemäß Anspruch 35 oder 36.

34. Diagnostischer Testkit gemäß Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Oligonukleotide mit einem detektierbaren Marker versehen sind.

35. Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß er spezifisch mit einem Epitop eines Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 20 bis 26 reagiert.

36. Antikörper gemäß Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß er monoklonal ist.

37. Verwendung von Antikörpern gemäß Anspruch 35 oder 36 als Nematizide.

38. Verwendung von Polypeptiden gemäß einem der Ansprüche 20 bis 26 zur Herstellung von Vakzinen.

39. Verfahren zum Identifizieren von Substanzen, die die Interaktion von Tubulin modulieren.

40. Verfahren gemäß Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) die Testsubstanz unter solchen Bedingungen mit Tubulin in Kontakt bringt, die eine Interaktion der Tubulinmoleküle miteinander und eine Bindung der Testsubstanz an Tubulin gestatten,
b) die erfolgte Bindung der Testsubstanz detektiert, indem man die Fähigkeit der Tubulin-Proteinmoleküle zur Interaktion miteinander bestimmt, und
c) die Fähigkeit der Tubulin-Proteinmoleküle zur Interaktion miteinander bei Anwesenheit der Testsubstanz mit ihrer Fähigkeit zur Interaktion miteinander bei Abwesenheit einer Testsubstanz vergleicht.

41. Verfahren gemäß Anspruch 39 oder 40, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Tubulin ein Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 20 bis 26 ist.

42. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 39 bis 41, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Detektion einer Modulation der Tubulininteraktion bei Anwe senheit einer Testsubstanz ein auf Zellen basierendes Testsystem verwendet.

43. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 39 bis 41, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Detektion einer Modulation der Tubulininteraktion bei Anwe senheit einer Testsubstanz ein zellfreies Testsystem verwendet.

44. Substanzen, die in einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 39 bis 43 identifiziert werden.

45. Verwendung einer Substanz gemäß Anspruch 44 zur Herstellung eines Mittels zur prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung von Nemato denbefall.