JP2003504051A - β−チューブリンをコードするＤＮＡおよびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ストロンギルス科（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｉｄａｅ）の線虫類由来のβ−チューブリンをコードするＤＮＡ、このＤＮＡによってコードされているポリペプチド、当該線虫類における駆虫剤耐性の診断および寄生線虫種の同定のためのＤＮＡの使用、ワクチンの成分としてのβ−チューブリンの使用、および新規な駆虫剤または抗生物質化合物の同定方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （技術分野） 本発明は、ストロンギルス科（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｉｄａｅ）の線虫類由来のβ
−チューブリンをコードするＤＮＡ、このＤＮＡによってコードされているポリ
ペプチド、これらの線虫類の駆虫剤耐性の診断およびこれらの線虫類の種の同定
のためのＤＮＡの使用、ワクチンの成分としてのβ−チューブリンの使用、およ
び新規な駆虫剤または抗生物質化合物の同定方法に関する。

【０００２】 寄生蠕虫類（蠕形動物（ｗｏｒｍ））は、ヒトおよび動物にとっての健康問題
であり、そしてかなりの経済的損失を引き起こす。１９９６年には、世界中の駆
虫剤に対する支出は２０億ＵＳドル以上であった。現在使用されるもっとも重要
な駆虫剤は、それらの作用機構によって３グループに分けることができる： １．環式アミジン類ピランテルおよびモランテルは、寄生虫の神経系に対する
コリン作用化合物として、イミダゾチアゾール類テトラミソールおよびレバミソ
ールとともに作用する。

【０００３】 ２．ベンズイミダゾール類は、微小管の重合のインヒビターであり、そしてチ
ューブリンの分解と、それに続く細胞内輸送および細胞分裂のような多くの細胞
機能の損失をもたらす。

【０００４】 ３．大環状ラクトン類は、グルタミン作用塩素チャンネルに結合して開口し、
したがって、線虫類および節足動物の神経系のインヒビターとして作用する。

【０００５】 微小管は、チューブリンサブユニットから構成される。チューブリンは、α−
およびβ−チューブリンからなり、そしてチューブリンと微小管の間の動的平衡
において存在する二量体タンパク質である。この平衡は、微小管インヒビターと
して計画された外因性物質によって影響を受けることができる。これらのインヒ
ビターのあるもの、例えばベンズイミダゾールは、チューブリンへのそれらの結
合によって作用し、その結果、それらは、成長する微小管へのこれらのサブユニ
ットの自己会合を防ぎ、一方、反対側の末端では微小管の分解が継続される。こ
のために、生存にとって重要である細胞内のプロセスにおいて機能障害が起こり
、そして最後には、細胞および完全な生物体の死が起きる（Ｌａｃｅｙ，Ｅ．（
１９９０）Ｍｏｄｅ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅ
ｓ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ６，１１２−１１５）。そのよう
な微小管インヒビターは合成的に生成されるか、または種々の生物によって生産
される種々の類の化合物を含む。

【０００６】 種々の生物由来のチューブリンに対する微小管インヒビターの結合は、結合の
親和力に関して大きな差を示す。それ故、駆虫剤オクスフェンダールおよびチア
ベンダールは、アスカリジア・ガリ（Ａｓｃａｒｉｄｉａ ｇａｌｌｉ）由来の
チューブリンには高い親和力を示すが、ヒツジのような哺乳動物由来のチューブ
リンには弱い親和力しか示さない（Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ（１９８３）Ｐｕ
ｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｔ
ｕｂｕｌｉｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｐａｒａｓｉｔｉｃ ｎｅｍａｔｏｄｅ，Ａ
ｓｃａｒｉｄｉｄａ ｇａｌｌｉ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｃａｌ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ ７，２６７−２７７）。ベンズイミダ
ゾールの選択毒性は、この選択的親和力によって説明することができる（Ｌａｃ
ｅｙ，Ｅ．（１９８８）Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｙｔｏｓｋｅｌｅ
ｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ，ｔｕｂｕｌｉｎ，ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｄｅ ｏｆ ａ
ｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎ
ｃｅ ｔｏ ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏ
ｕｒｎａｌ ｆｏｒ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ １８，８８５−９３６）。

【０００７】 これらの駆虫剤の広範な使用は、特に家畜における全３種類（ｃｌａｓｓ）に
対する無視できない耐性問題をもたらした（Ｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９
４）Ａｎｔｈｅｌｍｉｎｔｉｃ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｎｅｍａｔｏｄ
ｅｓ ｏｆ ｆａｒｍ ａｎｉｍａｌｓ．Ａ ｓｅｍｉｎａｒ ｏｒｇａｎｉｓ
ｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ，Ｂｒｕｓｓ
ｅｌｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ，８ ｔｏ ９ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９９３，ｐｐ．
１７−２４）。もっとも汎用される駆虫剤の種類はベンズイミダゾールである。
ベンズイミダゾールに対する耐性は、ヒツジ、ウシ、ブタおよびウマの寄生虫の
場合において世界的に報告されている。ベンズイミダゾールは、線虫類、条虫類
および吸虫類に対する作用をもつ広スペクトルの駆虫剤である。ドイツの種馬飼
育場における研究は、症例の８０％以上においてベンズイミダゾールに対する小
ストロンギルド（ｓｍａｌｌ ｓｔｒｏｎｇｙｌｉｄｓ）の耐性を示した（Ｕｌ
ｌｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｒｅｓｉ
ｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｓｍａｌｌ ｓｔｒｏｎｇｙｌｉｄｓ（Ｃｙａｔｈｏｓｔ
ｏｍｉｎａｅ）：ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｉｎ ｈｏｒｓｅ ｓｔｏｃｋ
ｉｎ Ｎｏｒｔｈｒｈｉｎｅ−Ｗｅｓｔｐｈａｌｉａ，Ｂｅｒｌｉｎｅｒ Ｍｕ
ｅｎｃｈｎｅｒ Ｔｉｅｒａｅｚｔｌｉｃｈｅ Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒｉｆｔ １０１ ，４０６−４０８）。

【０００８】 したがって、駆虫剤による効果的な治療では、１頭のウマまたはウマの群れ内
で可能性のある寄生蠕虫類の耐性についての情報を得ることが非常に重要である
。小ストロンギルドの寄生蠕虫集団の可能性のある耐性を検査するために、寄生
虫の発生段階（卵、幼生）における駆虫剤の活性に基づく診断操作が、既に開発
されている（Ｃｏｌｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｗｏｒｌｄ Ａｓｓｏｃｉ
ａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｄｖａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎ
ａｒｙ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ（Ｗ．Ａ．Ａ．Ｖ．Ｐ．）Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｈｅｌｍｉｎｔｉｃ ｒｅ
ｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｎｅｍａｔｏｄｅｓ ｏｆ ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ
ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ、４ ４ ，３５−４４）。「幼生発生アッセイ」（ＬＤＡ）は、使用される駆虫剤濃度
の関数として、非寄生性の第１幼生段階における駆虫剤の阻害効果を記述する。
同様にして、第２のアプローチ、「卵孵化アッセイ」（ＥＨＡ）が、使用される
駆虫剤濃度の関数として、幼生の孵化に及ぼす駆虫剤の阻害作用を使用する。両
アプローチの欠点は、結果の低い再現性にある。さらに、両アプローチは時間浪
費と労力集中を要する。

【０００９】 さらに両アプローチの感度は低い。耐性の存在は、集団の２５％以上が耐性で
ある場合にのみ検出される（Ｒｏｏｓ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｎｅｗ ｇｅ
ｎｅｔｉｃ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｉｍｐｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓ
ｅｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ａｎｔｈｅｌｍｉｎｔｉｃ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ
ｉｎ ｐａｒａｓｉｔｉｃ ｎｅｍａｔｏｄｅｓ，Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ
Ｔｏｄａｙ １１，１４８−１５０）。

【００１０】 したがって、敏感で、急速な、そして再現性のある診断操作に対する緊急の要
求が存在する。ヒツジの寄生虫、ヘモンカス・コントルタス（Ｈａｅｍｏｎｃｈ ｕｓ ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ ）およびテラドルサギア・サーカムシンクタ（Ｔｅｌ ａｄｏｒｓａｇｉａ ｃｉｒｃｕｍｃｉｎｃｔａ ）では、ＰＣＲ技術に基づく操
作が記述されている。これは、β−チューブリンイソタイプ１遺伝子のコドン２
００における少なくとも１つの点突然変異に基づく（Ｅｌａｒｄ ｅｔ ａｌ．
（１９９９）ＰＣＲ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅ
−ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｏｒ −ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｎａ
ｔｕｒａｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｍａｌｌ ｒｕｍｉｎ
ａｎｔ ｐａｒａｓｉｔｅ、Ｔｅｌａｄｏｒｓａｇｉａ ｃｉｒｃｕｍｃｉｎｃ ｔａ ，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ ８０，２３１−２３
７）。コドン２００における点突然変異は、フェニルアラニンのチロシンによる
アミノ酸置換をもたらし、そして変異タンパク質のベンズイミダゾール耐性と相
関する（Ｋｗａ ｅｔ ａｌ．（１９９５）β−ｔｕｂｕｌｉｎ ｇｅｎｅｓ
ｆｒｏｍ ｐａｒａｓｉｔｉｃ ｎｅｍａｔｏｄｅ Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ ｃ ｏｎｔｏｒｔｕｓ ｍｏｄｕｌａｔｅ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ
Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４６，５００−５１０）。

【００１１】 ヘモンカス・コントルタスにおける研究から、チューブリンをコードする線虫
類の配列が種特異的であることが知られている（ＷＯ９２／０３５４９）。

【００１２】 ウマの小ストロンギルドの種々の種は、それらの疫学的頻度において異なる。
もっとも重要であり、そして世界的にもっとも高頻度に見いだされる種は、シリ
コシクルス・ナッサタス（Ｃｙｌｉｃｏｃｙｃｌｕｓ ｎａｓｓａｔｕｓ）、シ
アトストマム・コロナタム（Ｃｙａｔｈｏｓｔｏｍｕｍ ｃｏｒｏｎａｔｕｍ）
およびシアトストマム・カチナタム（Ｃｙａｔｈｏｓｔｏｍｕｍ ｃａｔｉｎａ ｔｕｍ ）を含む。ベンズイミダゾールに対するこれらの種の耐性は、種々の国に
おいて、なかでもドイツにおいてもまた記述された（Ｂｕｒｇｅｒ，Ｈ．−Ｊ．
ａｎｄ Ｂａｕｅｒ，Ｃ．（１９８７）Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｆｏｕｒ ａ
ｎｔｈｅｌｍｉｎｔｉｃｓ ａｇａｉｎｓｔ ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅ−ｒ
ｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｃｙａｔｈｏｓｏｍｅｓ ｏｆ ｈｏｒｓｅ，Ｖｅｔｅｒ
ｉｎａｒｙ Ｒｅｃｏｒｄ １２０，２９３−２９６）。

【００１３】 本発明による小ストロンギルドの種由来のβ−チューブリンｃＤＮＡの核酸配
列は９５％を超える同一性を有した。しかしながら、ヒツジ寄生虫の既知の上記
β−チューブリン配列との同一性は、わずかに７５．４−８２．６％である。

【００１４】 推定アミノ酸配列は、本発明による配列内で非常に類似している。また、これ
は、ヒツジ寄生虫の推定β−チューブリンアミノ酸配列についても事実である。
ここでの同一性は９５〜９９．８％である。非常にまれな位置においてのみアミ
ノ酸置換が起きる。ここで強調されるのはコドン２００であり、この位置でフェ
ニルアラニンからチロシンへの変化が起きる。

【００１５】 しかしながら、従来公表された種々の蠕虫種からの非コーディングβ−チュー
ブリン配列は有意な同一性を示さない。したがって、ここに提示される本出願の
小ストロンギルドの種々の種の、コーディング配列のみならず非コーディング配
列の一部もまた高い同一性を有することは驚くべきことである。

【００１６】 したがってまた、これらの領域は、互いに小ストロンギルドの種々の種と他の
線虫種を区別するのに適している。これらのイントロン領域由来のＰＣＲプライ
マーは、また他の蠕虫生物体からの遺伝材料を含有するサンプルにおいて、小ス
トロンギルドの特異的検出のために使用することができる。

【００１７】 線虫類由来のβ−チューブリンもしくはその一部は、予防的な、免疫学的可能
性をもつことが知られている（Ｂｕｇｈｉｏ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｃｈａ
ｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔ
ｉｅｓ ｏｆ ａｎｔｉ−Ｂｒｕｇｉａ ｐａｈａｎｇｉ ｔｕｂｕｌｉｎ ｍ
ｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊ
ｏｕｒｎａｌ ｆｏｒ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ，７，９１３−９２４）。上
記ＤＮＡによってコードされている小ストロンギルドのβ−チューブリンは、モ
ノクローナル抗体が、まさにβ−チューブリンに対して使用できるように、ワク
チンとして使用することができる。

【００１８】 チューブリンもしくはそのサブユニットの相互作用のインヒビター、例えばベ
ンズイミダゾール類、コルチジンおよびタキソールは、ヒト、動物もしくは植物
病に対向される一連の治療剤の重要な先導構造物である。これらの化合物の標的
としてのチューブリンの重要性は、これらの病気の防除のための新しい活性化合
物探求のそれの可能性にまで及び、そしてそれの可能性を明白に示している。

【００１９】 本発明は、ストロンギルス科、特に亜科シアトストミナエ（Ｃｙａｔｈｏｓｔ
ｏｍｉｎａｅ）の線虫類由来のβ−チューブリンをコードするＤＮＡまたはこの
ＤＮＡのフラグメントに関する。β−チューブリンＤＮＡは、この場合には、ゲ
ノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡであってもよい。本発明が関係するＤＮＡ配列は、
目円虫類（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｉｄａ）、特に亜科シアトストミナエの寄生線虫類
のチューブリン遺伝子ファミリーの新メンバーと見なすことができる。非常に特
別には、本発明は、属シアトストマムおよびシリコシクルスの寄生線虫類由来の
β−チューブリンをコードするＤＮＡ配列に関する。

【００２０】 同様に本発明は、配列番号：２，４，６，８もしくは１０において示されるよ
うなアミノ酸配列の１つをコードするポリヌクレオチドに対して８５％以上の同
一性をもつＤＮＡ配列に関する。

【００２１】 同様に本発明は、配列番号：２，４，６，８もしくは１０において示されるよ
うなアミノ酸配列の１つをコードするポリヌクレオチドに対して９５％以上の同
一性をもつ好適なＤＮＡ配列に関する。

【００２２】 本発明は、特に、属シリコシクルスおよびシアトストマムの寄生線虫類に由来
するβ−チューブリンをコードするＤＮＡ配列、非常に特別には、種シリコシク
ルス・ナッサタスの寄生線虫類に由来するそれらの配列、好ましくは配列番号：
３，５，７，９もしくは１１に示されるようなＤＮＡか、またはシアトストマム
・コロナタムに由来するそれらの配列、好ましくは配列番号：１によるＤＮＡに
関する。

【００２３】 同様に本発明は、これらの配列に対して、コドン２００において少なくとも１
つの点突然変異または１つのヌクレオチド置換をもつ、上記ＤＮＡ配列に関する
。これらの点突然変異は、このＤＮＡによってコードされているアミノ酸配列に
おける変化、例えばチロシンによるアミノ酸フェニルアラニンの置換をもたらし
、そしてベンズイミダゾールに対する適当な変異をもつチューブリンの耐性に相
関する。

【００２４】 同様に本発明は、上記ＤＮＡまたはこのＤＮＡのフラグメントに相補的である
ＤＮＡ配列、およびこれらのＤＮＡ配列のフラグメントに関する。これらのＤＮ
Ａ配列もしくはこれらのフラグメントは、上記のまたは配列番号：１，３，５，
７，９もしくは１１の下に記されるＤＮＡ配列またはそれらに８５％同一である
配列、好ましくは９５％同一である配列から誘導されるオリゴヌクレオチド、お
よびそれらに相補的な鎖から誘導され、これらにハイブリダイズできるオリゴヌ
クレオチドを含む。

【００２５】 本発明は、この場合、好ましくは、上記ＤＮＡ配列に、好ましくはβ−チュー
ブリン遺伝子の非コーディング配列部分の領域においてハイブリダイズする、配
列番号：１２〜配列番号：５１において示されるような配列からなるか、または
配列の１つを含むオリゴヌクレオチドに関する。

【００２６】 同様に本発明は、好ましくは、上記配列のコーディング領域にハイブリダイズ
する、配列番号：１２〜配列番号：５１において示されるような配列からなるか
、または配列の１つを含むオリゴヌクレオチドに関する。

【００２７】 同様に本発明は、上記ＤＮＡまたはこのＤＮＡのフラグメントに相補的である
ＲＮＡ配列、およびこれらのＲＮＡ配列のフラグメントに関する。これらのＲＮ
Ａ配列もしくはこれらのフラグメントは、上記のまたは配列番号：１，３，５，
７，９もしくは１１の下に記されるＤＮＡ配列、それらに相補的な配列またはそ
れらに８５％同一、好ましくは９５％同一なＤＮＡ配列の１つの領域に対応し、
そしてこれらにハイブリダイズできるリボオリゴヌクレオチドを含む。

【００２８】 同様に本発明は、上記ＤＮＡ配列の１つを含有する発現構築物、およびＤＮＡ
の発現を可能にするそれに結合されたＤＮＡ配列に関する。これらは、例えば、
構成的もしくは誘導的発現のための少なくとも１つのプロモーターあるいはまた
エンハンサーを含む。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現に適当なプロモー
ターは、天然のハイブリッドもしくはバクテリオファージプロモーター、好まし
くはλ−ファージ、ｈｓｐ、ｏｍｐまたは例えば、ＷＯ９８／５６２５、ドイツ
特許第３４３０６８３号もしくは欧州特許第０１７３１４９号に挙げられるよう
な合成プロモーターの群のプロモーターである。

【００２９】 同様に本発明は、上記ＤＮＡ配列の１つを含有し、そして宿主細胞において本
発明によるβ−チューブリンもしくはそのフラグメントの発現を可能にするベク
ターに関する。

【００３０】 同様に本発明は、上記ＤＮＡ、上記のような発現構築物、またはベクターを含
有し、そしてβ−チューブリンもしくはそのフラグメントの発現を可能にする宿
主細胞に関する。

【００３１】 同様に本発明は、上記ＤＮＡ配列またはこれらのＤＮＡ配列のフラグメントの
１つによってコードされているポリペプチド、およびこれらのポリペプチドのフ
ラグメントに関する。

【００３２】 本発明は、この場合好ましくは、配列番号：１，３，５，７，９もしくは１１
を含むＤＮＡによって、これらの配列に８５％、好ましくは９５％の同一性をも
つＤＮＡ配列、またはこのＤＮＡのフラグメントのＤＮＡ配列によってコードさ
れているポリペプチドに関する。

【００３３】 また本発明は、上記ＤＮＡ配列によってコードされ、上記のようにコドン２０
０において少なくとも１つの点突然変異を含有し、そしてベンズイミダゾールに
耐性を示すポリペプチド、およびこれらのポリペプチドのフラグメントに関する
。

【００３４】 本発明は、この場合、非常に特に好ましくは、配列番号：２，４，６，８もし
くは１０において記述されたアミノ酸配列またはそのフラグメントの１つを含有
するポリペプチドに関する。

【００３５】 本発明は、この場合、ポリペプチド、特に精製されたポリペプチドまたは組み
換え技術によって作成されたポリペプチドに関する。

【００３６】 本発明は、完全長のポリペプチドおよびまたこれらのポリペプチドの対応する
フラグメント、例えばある種のモチーフもしくはドメインに関する。これらのフ
ラグメントは、種々の長さをもち、そして例えば５，１０，２５，５０，１００
，１５０，２００，２５０もしくは３００アミノ酸を含有してもよい。

【００３７】 同様に本発明は、上記のようなポリペプチドを含有する融合タンパク質に関す
る。融合タンパク質は、この場合、β−チューブリンに関係しないさらなるポリ
ペプチド成分（例えば、ＬｅｘＡ，Ｂ４２，グルタチオンＳ−トランスフェラー
ゼ、Ｈｉｓタグ、アルカリホスファターゼのような酵素活性をもつポリペプチド
またはエピトープタグ）を含有してもよい。

【００３８】 また本発明は、適当な原核または真核生物発現系における上記ポリペプチドの
製造方法に関する。発現は、この場合、各場合に対応する細胞系または対応する
宿主細胞において上記のように永続的または一時的に実施することができる。適
当な原核生物発現系は、既知の宿主−ベクター系、例えば細菌（例えば、ストレ
プトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌ ｌｕｓ ｓｕｔｉｌｉｓ ）、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌ ａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ）、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ ）および特にＥ．コリ）である。

【００３９】 真核生物系における発現は、好ましくは、バキュロウイルス系、特に翻訳後修
飾の導入を可能にする系において実施される。

【００４０】 同様に本発明は、ストロンギルス科、好ましくは亜科シアトストミナエ、特に
好ましくは属シアトストマムおよびシリコシクルス、非常に特に好ましくは種シ
アトストマム・コロナタムおよびシリコシクルス・ナッサタスの線虫類由来のＤ
ＮＡの検出のための上記ＤＮＡの使用に関する。本発明は、この場合、β−チュ
ーブリンをコードするＤＮＡまたはそれの相補鎖に相補的であり、そしてこのＤ
ＮＡにハイブリダイズできる上記オリゴヌクレオチドに関する。好ましくは、こ
れらのオリゴヌクレオチドは、イントロン領域、すなわち非コーディングＤＮＡ
配列にハイブリダイズする。

【００４１】 本発明は、 ａ）ノザンもしくはサザンブロットアッセイにおけるサンプル、 ｂ）当該線虫類のＤＮＡがプライマーおよびＰＣＲ技術を用いて特異的に同定お
よび増幅される、上記線虫類の検出のための診断操作におけるＰＣＲプライマー
、としてのこれらのオリゴヌクレオチドまたはそれらの一部の使用に関する。

【００４２】 本発明は、この場合好ましくは、配列番号：１２〜配列番号：５１において示
される配列からなるか、または配列の１つを含有するオリゴヌクレオチドに関す
る。

【００４３】 同様に本発明は、ベンズイミダゾールに耐性であるβ−チューブリンまたはそ
のフラグメントをコードする、ストロンギルス科、好ましくは亜科シアトストミ
ナエ、特に好ましくは属シリコシクルスおよびシアトストマム、非常に特に好ま
しくは種シリコシクルス・ナッサタスおよびシアトストマム・コロナタムの線虫
類由来のＤＮＡの検出のための上記ＤＮＡの使用に関する。本発明は、この場合
、ベンズイミダゾールに対する耐性をもつβ−チューブリンをコードするＤＮＡ
またはこのＤＮＡの相補鎖に相補的であり、そしてこのＤＮＡに特異的にハイブ
リダイズできる上記オリゴヌクレオチドに関する。

【００４４】 また本発明は、 ａ）ノザンもしくはサザンブロットアッセイにおけるサンプル、 ｂ）当該線虫類のＤＮＡがプライマーおよびＰＣＲ技術を用いて特異的に同定お
よび増幅される、ベンズイミダゾールに対する耐性をもつ上記線虫類の検出のた
めの診断操作におけるＰＣＲプライマー、 としてのこれらのオリゴヌクレオチドまたはそれらの一部の使用に関する。

【００４５】 本発明は、この場合好ましくは、配列番号：１２〜配列番号：５１において示
された配列からなるか、または配列の１つを含有するオリゴヌクレオチドに関す
る。

【００４６】 また本発明は、ストロンギルス科、好ましくは亜科シアトストミナエ、特に好
ましくは属シリコシクルスおよびシアトストマム、非常に特に好ましくは種シリ
コシクルス・ナッサタスおよびシアトストマム・コロナタムの線虫類の検出方法
であって、上記オリゴヌクレオチドが、前記生物に由来し、そしてＰＣＲ技術を
用いて増幅できるＤＮＡ配列に特異的にハイブリダイズする方法に関する。ハイ
ブリダイゼーションは、好ましくは、β−チューブリン遺伝子の非コーディング
領域（イントロン）において実施される。

【００４７】 上記のような生物の検出は、例えば、 ａ）β−チューブリンをコードする上記ＤＮＡまたはそれの相補鎖、またはそれ
の５’−もしくは３’−隣接領域にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドプ
ローブもしくはプライマーを取得し、 ｂ）オリゴヌクレオチドプローブもしくはプライマーを、適当に作成されたプロ
ーブ含有ＤＮＡと接触させ、 ｃ）オリゴヌクレオチドもしくはプライマーのハイブリダイゼーションを検出し
（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて）、 ｄ）β−チューブリン遺伝子の検出された配列を配列決定し、そして ｅ）先に記述された本発明によるＤＮＡ配列、好ましくは配列番号：１，３，５
，７，９もしくは１１に示されたＤＮＡ配列と、この配列を比較すること、 によって実施することができる。

【００４８】 また本発明は、ベンズイミダゾールに対して耐性である、ストロンギルス科、
好ましくは亜科シアトストミナエ、特に好ましくは属シリコシクルスおよびシア
トストマム、非常に特に好ましくは種シリコシクルス・ナッサタスおよびシアト
ストマム・コロナタムの線虫類の検出方法であって、上記オリゴヌクレオチドが
、前記生物に由来し、そしてＰＣＲ技術を用いて増幅できるＤＮＡ配列に特異的
にハイブリダイズする方法に関する。ハイブリダイゼーションは、好ましくは、
β−チューブリン遺伝子の非コーディング領域（イントロン）において実施され
る。

【００４９】 上記のような生物の検出は、例えば、 ａ）β−チューブリンをコードする上記ＤＮＡまたはそれの相補鎖、またはそれ
の５’−もしくは３’−隣接領域にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドプ
ローブもしくはプライマーを取得し、 ｂ）オリゴヌクレオチドプローブもしくはプライマーを、適当に作成されたプロ
ーブ含有ＤＮＡと接触させ、 ｃ）オリゴヌクレオチドもしくはプライマーのハイブリダイゼーションを検出し
（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて）、 ｄ）β−チューブリン遺伝子の検出された配列を配列決定し、そして ｅ）ベンズイミダゾールに対してこれらの配列によってコードされているβ−チ
ューブリンの耐性をもたらす、コドン２００において少なくとも１つの点突然変
異をもつ、先に記述された本発明によるＤＮＡ配列、好ましくは配列番号：１，
３，５，７，９もしくは１１に示されたＤＮＡ配列とこの配列を比較すること、
によって実施することができる。

【００５０】 同様に本発明は、ストロンギルス科、好ましくは亜科シアトストミナエ、特に
好ましくは属シリコシクルスおよびシアトストマム、非常に特に好ましくは種シ
リコシクルス・ナッサタスおよびシアトストマム・コロナタムの線虫類の検出お
よび同定のための診断試験キットであって、なかでも、上記オリゴヌクレオチド
を利用可能にし、前記種の検出方法において使用することができるキットに関す
る。同様に本発明は、配列番号：１，３，５，７，９もしくは１１に示された配
列、それに相補的な配列、コドン２００において少なくとも１つの点突然変異を
もつ配列、またはこれらの配列のフラグメントに特異的にハイブリダイズするオ
リゴヌクレオチドを利用可能にさせる。この場合、配列番号：１２〜配列番号：
５１において示された配列からなるか、またはこの配列を含有するオリゴヌクレ
オチドが特に好適である。

【００５１】 同様に本発明は、ベンズイミダゾールに対する耐性をもつ、ストロンギルス科
、好ましくは亜科シアトストミナエ、特に好ましくは属シリコシクルスおよびシ
アトストマム、非常に特に好ましくは種シリコシクルス・ナッサタスおよびシア
トストマム・コロナタムの線虫類の検出のための診断試験キットであって、なか
でも、上記オリゴヌクレオチドを利用可能にし、挙げられた種の検出方法におい
て使用することができるキットに関する。同様に本発明は、配列番号：１，３，
５，７，９もしくは１１に示された配列、それに相補的な配列、コドン２００に
おいて少なくとも１つの点突然変異をもつ配列、またはこれらの配列のフラグメ
ントに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを利用可能にさせる。こ
の場合、配列番号：１２〜配列番号：５１において示された配列からなるか、ま
たはこの配列を含有するオリゴヌクレオチドが特に好適である。

【００５２】 同様に本発明は、このキットにおいて利用可能にされたオリゴヌクレオチドが
検出可能なマーカーとともに提供される、上記のような診断試験キットに関する
。そのような検出可能なマーカーは、なかでも、酵素、酵素基質、補講素、酵素
阻害剤、蛍光マーカー、発色団、発光マーカーおよびラジオアイソトープを含ん
でもよい。

【００５３】 同様に本発明は、ストロンギルス科、好ましくは亜科シアトストミナエ、特に
好ましくは属シリコシクルスおよびシアトストマム、非常に特に好ましくは種シ
リコシクルス・ナッサタスおよびシアトストマム・コロナタムの線虫類由来のβ
−チューブリンのエピトープと特異的に反応する抗体に関する。

【００５４】 同様に本発明は、特に、ストロンギルス科、好ましくは亜科シアトストミナエ
、特に好ましくは属シリコシクルスおよびシアトストマム、非常に特に好ましく
は種シリコシクルス・ナッサタスおよびシアトストマム・コロナタムの線虫類由
来のβ−チューブリンのエピトープと特異的に反応するモノクローナル抗体に関
する。

【００５５】 同様に本発明は、殺線虫剤としての上記抗体の使用に関する。

【００５６】 また本発明は、少なくとも１つの上記β−チューブリンポリペプチドまたはそ
れらのフラグメントを含有するワクチンの製造のための、ストロンギルス科、好
ましくは亜科シアトストミナエ、特に好ましくは属シリコシクルスおよびシアト
ストマム、非常に特に好ましくは種シリコシクルス・ナッサタスおよびシアトス
トマム・コロナタムの線虫類由来の上記β−チューブリンポリペプチドまたはそ
れらのフラグメントの使用に関する。ワクチンは、この場合、上記β−チューブ
リンに特異的である免疫応答を生成することができる。

【００５７】 好適な実施態様では、ワクチンは、抗原決定基、例えば、配列番号：２，４，
６，８もしくは１０に示されるアミノ酸配列をもつポリペプチドまたは上記ＤＮ
Ａまたはそのフラグメントの１つによってコードされているポリペプチドの個々
の決定基を含有する。

【００５８】 同様に本発明は、少なくとも１つの本発明による上記β−チューブリンポリペ
プチドまたはそれらのフラグメント、または少なくとも１つの上記抗体からなる
、哺乳動物の免疫化のための免疫原性組成物の製造方法に関する。

【００５９】 同様に本発明は、寄生線虫類由来のβ−チューブリンに対向される宿主におけ
る予防的免疫応答の活性化のためにこの宿主に投与される免疫原性組成物の製造
のための、本発明によるβ−チューブリン、好ましくは配列番号：１，３，５，
７，９もしくは１１に示された配列をコードする核酸、それらのフラグメントま
たはそれに相同的な配列を含有する上記発現ベクターの使用に関する。

【００６０】 同様に本発明は、ベクター（本発明によるβ−チューブリンをコードする核酸
、好ましくは配列番号：１，３，５，７，９もしくは１１に示される配列、それ
らのフラグメントまたはそれに相同的な配列および該核酸配列に機能的に結合さ
れ、そして免疫応答を生成する本発明によるβ−チューブリンの発現を制御する
プロモーター配列を含有する）および製薬学的目的に適当な媒質（ｖｅｈｉｃｌ
ｅ）を含んでなる免疫原性組成物に関する。

【００６１】 同様に本発明は、チューブリンの相互作用またはチューブリンのサブユニット
の相互作用をモジュレートする物質の同定方法に関する。方法は、チューブリン
の使用、好ましくは寄生線虫類由来のチューブリン、特に好ましくは目、円虫類
の寄生線虫類由来のβ−チューブリン、非常に特に好ましくはストロンギルス科
の寄生線虫類由来のβ−チューブリン、もっとも好ましくは亜科シアトストミナ
エの寄生線虫類由来のβ−チューブリンに基づく。この方法において使用される
β−チューブリンの特に好適な群は、属シリコシクルスおよびシアトストマムの
寄生線虫類由来のβ−チューブリンである。

【００６２】 本発明は、チューブリンタンパク質分子またはそのサブユニットどうしの相互
作用をモジュレートする物質、例えば小有機分子の同定に関する。好ましくは、
本発明は、相互作用を阻害する化合物の同定に関する。

【００６３】 同様に本発明は、 ａ）チューブリン分子どうしの相互作用およびチューブリンへの試験物質の結合
を可能にする条件で、試験されるべき物質をチューブリンと接触させ、 ｂ）互いに相互作用するチューブリンタンパク質分子の能力を決定することによ
って、生じた結合を検出し、そして ｃ）試験物質の存在下で互いに相互作用するチューブリンタンパク質分子の能力
を、試験物質の不在下で互いに相互作用する能力と比較すること、 に基づく上記の方法に関する。

【００６４】 同様に本発明は、互いに相互作用するチューブリン分子の能力をモジュレート
する物質の同定方法に関する。特に好ましくは、本発明は、この場合、上記ＤＮ
Ａまたはそれらのフラグメントによって、特に、配列番号：１，３，５，７，９
もしくは１１において示される配列からなるか、または配列を含むＤＮＡによっ
て、およびそれらに８５％、好ましくは９５％の同一性をもち、そして配列番号
：２，４，６，８もしくは１０において示されるアミノ酸配列をもつβ−チュー
ブリンをコードする配列によって、コードされている上記ポリペプチドの１つを
使用する方法に関する。

【００６５】 同様に本発明は、上記のように、互いに相互作用するチューブリンの能力をモ
ジュレートする物質の同定方法であって、使用される方法が、細胞に基づく試験
システムを用いて試験物質の存在下でチューブリン相互作用のモジュレーション
を検出することに基づく方法に関する。そのような試験システムの好適な実施態
様は、「ツーハイブリッドシステム」である（米国特許第５２８３３１７号、Ｚ
ｅｒｖｏｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｃｅｌｌ ７２，２２３−２３２；ＷＯ
９４／１０３００）。このシステムは、検出できるシグナルをもたらす相互作用
によって２種のタンパク質の相互作用を記録または記述するために適当である。
また、そのようなシステムは、高処理数をもつ試験システムに適合させることが
できる。

【００６６】 同様に本発明は、互いに相互作用するチューブリンの能力をモジュレートする
物質の同定方法であって、使用される方法が、セル・フリー試験システムを用い
て試験物質の存在下でチューブリン相互作用のモジュレーションを検出すること
に基づく方法に関する。そのような試験システムの特に好適な実施態様は、「シ
ンチレーション近似アッセイ（ＳＰＡ）」である（欧州特許第０１５ ４７３号
）。この試験システムは、ミクロスフェアもしくはビーズに結合されたレセプタ
ー、例えばチューブリン分子とリガンドとの相互作用の検出に基づき、ミクロス
フェアもしくはビーズはシンチレート分子を備えている。シグナルは、レセプタ
ー・リガンド複合体が分解する場合に検出される。

【００６７】 同様に本発明は、上記方法を用いて同定され、そしてチューブリン分子の相互
作用をモジュレート、好ましくは阻害するのに適当である、これまでなお記述さ
れなかった物質に関する。

【００６８】 同様に本発明は、線虫類によって攻撃される可能性があるか、または既に攻撃
された動物もしくはヒトの予防もしくは治療処置のために使用される薬剤の製造
のための、上記方法の１つを使用して同定された、これまでなお記述されなかっ
た物質の使用に関する。本発明による薬剤は、上記方法の１つによって同定され
た少なくとも１種の物質を含有し、そして経鼻、経皮、非経口もしくは経腸的に
投与することができる。

【００６９】 さらに良く理解するために、記述において使用されるある種の言語および用語
の意味、実施例および添付された請求項が、以下に、より詳細に説明される。

【００７０】 タンパク質およびＤＮＡに関する用語「フラグメント」は、配列番号：１〜１
１の下で記述される核酸もしくはアミノ酸配列、それらに相補的な配列またはそ
れらに８５％まで、好ましくは９５％まで同一な配列の一部を記述する。ＤＮＡ
およびポリペプチド配列のフラグメントは、少なくとも５個のヌクレオチドもし
くはアミノ酸を含有するが、同様に、４４７個までのアミノ酸もしくは１３４３
個までのヌクレオチド、または配列番号：１１に示される配列の場合には２５６
５個までのヌクレオチドを含有してもよい。

【００７１】 用語「相同性」、「同一性」もしくは「類似性」は、２種のペプチド間または
２種の核酸間における配列類似性に関する。相同性は、各場合、各配列における
位置を互いに比較することによって決定できる。比較された配列における位置が
同じ塩基もしくはアミノ酸によって占められる場合、この位置において２種の分
子は相同である。配列間の相同性の尺度は、配列が互いに共有している対応する
または相同な位置の数の関数である。「非相同性」配列は、４０％未満の同一性
、しかし好ましくは２５％未満の同一性をもつ。

【００７２】 用語「相同性」は、特に、少なくとも１５塩基対の長さのＤＮＡセグメントま
たはＤＮＡに対して相補的な鎖が、対応するＤＮＡと少なくとも８５％、好まし
くは９５％合致することを意味する。相同性は、なかでも、ＧＣＧプログラムの
ようなコンピュータープログラムを用いて決定できる（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ
ａｌ．（１９８３），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２，３８７−
３９５）。

【００７３】 また、ＤＮＡセグメントが当該ＤＮＡ鎖またはその相補鎖にハイブリダイズで
きる場合にも「相同性」は存在する。

【００７４】 用語「ハイブリダイズする」もしくは「ハイブリダイゼーション」は、一本鎖
核酸分子が相補ＤＮＡ鎖と塩基対合を受ける過程を記し、一本鎖核酸分子の能力
はハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに依存する。

【００７５】 用語「ストリンジェンシー」はハイブリダイゼーション条件に関する。「高い
ストリンジェンシー」は、塩基対合が困難にされる場合に与えられる。「低いス
トリンジェンシー」は、塩基対合が容易にされる場合に与えられる。

【００７６】 用語「相補的」は、水素架橋を介して塩基対を互いに形成するプリンおよびピ
リミジンヌクレオチドの能力に関する。相補的塩基対は、なかでも、グアニンと
シトシン、アデニンとチミンおよびアデニンとウラシルである。

【００７７】 当業者は、縮重遺伝子コード（すなわち、２０アミノ酸についての６４コドン
コード）によって、ヌクレオチド塩基対の多くの「サイレント」置換が、それに
よってコードされるタンパク質生産物の同一性を変えることなく、それをコード
する配列中に導入できることを理解している。すべてのそのような置換は本発明
の範囲内に含まれるべきである。

【００７８】 用語「特異的にハイブリダイズする」は、上記１つのβ−チューブリン遺伝子
の少なくとも約６，１２，２０，３０，５０，１００，１５０，２００，３００
，３５０，４００もしくは４４０個の連続するヌクレオチドに、好ましくは配列
番号：１，３，５，７，９もしくは１１に示される配列またはそれに相同か相補
的な配列の１つにハイブリダイズする本発明の核酸分子の能力、すなわち、上記
β−チューブリン以外のタンパク質をコードする細胞の核酸（例えばｍＲＮＡも
しくはゲノムＤＮＡ）に対するよりも、１０倍多い分子がハイブリダイズする、
好ましくは１００倍多い分子がハイブリダイズする、特に好ましくは１００倍以
上多い分子がハイブリダイズするような能力に関する。

【００７９】 用語「プラスミド」は、染色体外の遺伝要素に関する。本発明のために使用さ
れる元になるプラスミドは市販のものから得られても、自由に取得しても、また
既知の方法にしたがってそのようなプラスミドから誘導されてもよい。

【００８０】 用語「ベクター」は、宿主細胞への外因性ＤＮＡの導入のために使用されるＤ
ＮＡ要素を述べる。ベクターは、１種以上のポリペプチドをコードするヌクレオ
チド配列を含有する。それらが含有する遺伝子の発現を制御できるベクターは「
発現ベクター」と呼ばれる。

【００８１】 用語「遺伝子」は、本発明の範囲では、上記β−チューブリンポリペプチドの
１つをコードする読み枠を含んでなる核酸に関する。エクソンおよび可能性のあ
るイントロン配列がさらにここに含まれる。

【００８２】 用語「相互作用する」もしくは「相互作用」は、分子間に検出しうる相互作用
を述べる。用語「結合」はさらにここに含まれる。

【００８３】 用語「モジュレートする」は、生物化学的プロセスの刺激および抑制もしくは
阻害の両方に関する。本発明の文脈上、「モジュレーション」は、チューブリン
ポリペプチドまたはそのサブユニットもしくはフラグメント間の相互作用の阻害
もしくは抑制、または例えばチューブリンポリペプチドの互いの不可逆的結合に
おいて示すことができる相互作用の刺激を意味する。

【００８４】 用語「核酸」は、ポリヌクレオチド、例えばデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）また
は適当ならばリボ核酸（ＲＮＡ）に関する。同様に、また用語は、ヌクレオチド
類似体から作成されるＲＮＡもしくはＤＮＡの類似体、およびその場合には一本
鎖（「センス」もしくは「アンチセンス」）および二本鎖のポリヌクレオチドを
含む。

【００８５】 用語「プロモーター」は、プロモーターに機能的に結合されている、特定のＤ
ＮＡの発現を調節するＤＮＡ配列に関する。また、用語は、「組織特異的」プロ
モーター、すなわちある種の細胞（例えばある種の組織の細胞）においてのみ特
定のＤＮＡの発現を制御するプロモーターを含む。同様に、「組織に非特異的な
』プロモーターおよび構成的発現をもたらすか、または誘導しうるプロモーター
が含まれる。

【００８６】 用語「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、それらが遺伝
子産物に関する場合には、本明細書の文脈におけるそれらの使用では交換可能で
ある。

【００８７】 「融合タンパク質」は、チューブリン配列に対して共通性（ｃｏｍｍｏｎａｌ
ｉｔｙ）または基本的な相同性をもたない第２のアミノ酸配列をもつ上記β−チ
ューブリンポリペプチドの１つをコードする第１のアミノ酸配列の融合物である
。第２のアミノ酸配列は、この場合、第１のものと同じ生物に由来してもよく、
さもなくばその他の生物（遺伝子間）に由来してもよい。一般に、融合タンパク
質は、式Ｘ−チューブリン−Ｙによって表すことができ、この場合「チューブリ
ン」は、上記ポリペプチドの１つを表し、そしてＸおよびＹは、チューブリンア
ミノ酸配列には関係しないポリペプチドを表す。ＸもしくはＹは、各場合互いに
独立に不在であってもよい。

【００８８】 用語「細胞」もしくは「宿主細胞」は、ここに提示される明細書の文脈では同
じ意味において使用できる。これらの用語は個々の細胞のみならず、またそのよ
うな細胞の子孫にも関することが理解される。後続する世代におけるある種の改
変（例えば変異）のために、そのような子孫は、幹細胞とは同一ではない可能性
もあるが、本発明によってさらに包含される。

【００８９】 用語「イントロン」は、転写されるが、結合している隣接配列（エクソン）を
「スプライシング」によって転写物から除去される既述の、好ましくはゲノムの
、ＤＮＡのそれらの配列を述べる。

【００９０】 核酸 既に記述されたように、本発明の１つの態様は、ストロンギルス科、特に亜科
シアトストミナエ、非常に特に属シアトストマムおよびシリコシクルス、特別に
は種シリコシクルス・ナッサタスおよびシアトストマム・コロナタムの線虫類由
来の核酸であって、β−チューブリンポリペプチドまたはそのフラグメントをコ
ードする核酸、または配列番号：１，３，５，７，９および１１における［空白
］に８５％、好ましくは９５％相同であり、そして配列番号：２，４，６，８も
しくは１０において示されるような配列の１つにしたがうβ−チューブリンまた
はそのフラグメントをコードする、それに相同な核酸に関する。配列番号：３は
、β−チューブリンをコードするシリコシクルス・ナッサタス由来の核酸の退化
された配列を表し、この場合「ｒ」はプリン（グアニンもしくはアデニン）を表
し、「ｙ」はピリミジン（チミン、またはウラシルもしくはシトシン）を表し、
そして「ｗ」はアデニンもしくはチミン、またはウラシルを表す。したがって、
配列番号：３は、種シリコシクルス・ナッサタスの生物体において存在すること
ができる多くの配列を含む。配列番号：５，７および１１に示される配列はβ−
チューブリンをコードする３種の一定の配列を示し、これらは配列番号：３に示
されるＤＮＡの代表的および好適な態様である。

【００９１】 同様に、本発明の一部は、場合によっては、長さ少なくとも２，５，１０，２
５，５０，１００，１５０，２００，２５０，３００，３５０もしくは４００ア
ミノ酸を含有するβ−チューブリンポリペプチドをコードするオリゴヌクレオチ
ドである。そのようなオリゴヌクレオチドは、プライマーまたはアンチセンス分
子（すなわち非コーディング核酸として）として使用することができ、そして少
なくとも約６，１２，２４，３０，６０，１００，１２０，１５０もしくは２１
０塩基対を含有し、一方コーディング核酸は、約２００，３００，４００，５０
０，６００，７００，８００，９００，１０００，１１００，１２００もしくは
１３００塩基対を含有する。

【００９２】 また、本発明は、配列番号：１，３，５，７，９もしくは１１に示される配列
の１つによって表される核酸に対してストリンジェント条件下で特異的にハイブ
リダイズするそれらのオリゴヌクレオチドを述べる。対応して、ストリンジェン
ト条件は、例えば、約４５℃において６ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム
（ＳＳＣ）、続いて５０℃において２ｘＳＳＣによる洗浄段階であり、そして当
業者には周知である（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，
Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６、参照）。したがって、洗浄段
階における塩濃度は、ストリンジェンシーが、より低い（２ｘＳＳＣ，５０℃）
か、またはより高い（０．２ｘＳＳＣ，５０℃）ように選ばれてもよい。さらに
また、洗浄段階における温度は、低いストリンジェンシー（例えば約２２℃）に
ついての条件から、より高いストリンジェンシー（例えば約６５℃）の条件まで
変えることができる。両塩濃度および温度は変えられるし、互いに合わせること
もできる。

【００９３】 存在する、例えばゲノムの、ＤＮＡの同定および特性決定のために、プライマ
ーとして、またはハイブリダイゼーションのために使用できる特に好適なオリゴ
ヌクレオチドは、配列番号：１２−５１において記述される。しかしながら、ま
た、他のオリゴヌクレオチドが、配列番号：１，３，５，７，９もしくは１１に
示される配列から誘導されてもよく、次いで、これらがプライマーとして、また
はハイブリダイゼーションのために使用できる。存在するＤＮＡが指定できる種
もしくは属の同定のために特に好適なものは、存在する（ゲノムの）ＤＮＡのイ
ントロンの領域においてハイブリダイズするそれらのオリゴヌクレオチドである
。上記線虫類から単離できるβ−チューブリンをコードするゲノムＤＮＡのイン
トロンは、配列番号：１１においてシリコシクルス・ナッサタスの例によって記
述される。かくして、イントロンは、コーディングエクソン間に位置しているそ
れらの配列である。好適な実施態様では、既述プライマーもしくはハイブリダイ
ゼーションプローブは、オリゴヌクレオチドの検出を可能にする標識基、すなわ
ち例えばラジオアイソトープ、蛍光基、酵素もしくは酵素コファクターを含有す
る。

【００９４】 そのようなオリゴヌクレオチドは、存在するＤＮＡの起源（すなわち生物）を
決定するために、診断試験キットにおいて用いることができる。オリゴヌクレオ
チドは、特定の配列を認識するために、配列番号：１，３，５，７，９および１
１に示されるＤＮＡ［空白］それらのフラグメント、それらに相同な配列および
それらに相補的な配列とのそれらの特異的なハイブリダイゼーションに適当であ
る。したがって、また、それらは、コドン２００における１つ以上の点突然変異
により、ベンズイミダゾール耐性β−チューブリンの発現をもたらすβ−チュー
ブリンをコードするそれらの配列の認識および同定を可能にする。その結果、配
列番号：１，３，５，７，９および１１の配列、好ましくは配列番号：１２〜５
１において記述された態様から誘導されるこれらのオリゴヌクレオチドは、頻繁
に存在する亜科シアトストミナエの線虫種の同定のために、そしてベンズイミダ
ゾールに対して存在する耐性の認識のために適当である。

【００９５】 本発明によるオリゴヌクレオチドは、当業者には周知である標準的方法、例え
ばド・ノボＤＮＡ合成によって作成することができる。

【００９６】 ここに述べれれる核酸は、完全な細胞中または細胞溶解物中に部分精製形態ま
たは生物学的に純粋な形態において、すなわち、他の細胞成分もしくは化学的前
駆物質および副生物がＤＮＡの化学的合成の場合に除去されれば、存在すること
もできる。

【００９７】 上記のβ−チューブリンをコードする核酸は、多くの真核細胞において存在し
ているｍＲＮＡから出発して得ることができる。また、当該線虫細胞由来のゲノ
ムＤＮＡから出発して本発明によるＤＮＡを得ることも可能である（また、次の
実施例参照）。β−チューブリンをコードする遺伝子は、例えば、ｃＤＮＡライ
ブラリーもしくはゲノムＤＮＡライブラリーから得ることができる。ｃＤＮＡは
、細胞、例えば線虫細胞の全ｍＲＮＡを単離することによって得られてもよい。
ｍＲＮＡから出発して、次いで、二本鎖ｃＤＮＡが作成され、そして適当なプラ
スミドもしくは適当なベクター中に挿入できる。本発明によるＤＮＡは、既知の
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いる増幅によるか、あるいはまたド・ノボ
ＤＮＡ合成によって作成することができる（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ
．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ
，Ｃｈａｐ．１４、参照）。

【００９８】 ベクターおよびプラスミド また本発明は、転写調節配列に機能的に結合される本発明による核酸配列の１
つを含有する発現ベクターを含む。「機能的に結合される」は、核酸配列によっ
てコードされているタンパク質の発現が制御できるように、核酸配列が調節配列
に連結されていることを意味する。「転写調節配列」は、例えば、プロモーター
、エンハンサーおよび他の調節要素を含む。発現ベクターは、例えば、本発明に
よるβ−チューブリンをコードする遺伝子またはそのフラグメントを含有する。
これらのベクターは、対応するポリペプチドあるいはまた融合タンパク質が、後
に生成される細胞中への組み込みのために使用することができる。Ｅ．コリにお
ける本発明によるタンパク質の発現のために適当なプロモーターは、天然のハイ
ブリッドまたはバクテリオファージプロモーターを含む。好ましくは、それらは
、ファージλプロモーター、ｏｍｐプロモーターまたは合成プロモーター（また
ＷＯ９８／１５６２５、ドイツ特許第３４３０６８３号、欧州特許第０１７３１
４９号、参照）の群からのプロモーターである。適当なベクターは、市販品、例
えば、ｐＥＴシリーズ（ｐＥＴ３ａ，ｐＥＴ２３ａ，ｐＥＴ２８ａおよびＨｉｓ
タグまたはＨｉｓタグをもつｐＥＴ３ａ）またはグルタチオンシンテターゼ融合
物をもつｐＧＥＸの発現ベクターを得ることができる。次に、発現ベクターは、
例えば、ＤＥ３溶原性Ｅ．コリ菌株、例えばＢＬ２１（ＤＥ３），ＨＭＳ１７４
（ＤＥ３）またはＡＤ４９４（ＤＥ３）を形質転換することができる。

【００９９】 β−チューブリンポリペプチドの発現 また、本発明は、本発明による核酸配列を含有する（例えば、ベクター中また
はゲノム中に挿入された）細胞を含む。これらの宿主細胞は原核または真核細胞
であってもよい。適当な原核生物発現系は、例えばストレプトミセス種、バチル
ス・ズブチリス、サルモネラ・チフィムリウム、セラチア・マルセッセンスおよ
び好ましくはＥ．コリのような細菌の系である。

【０１００】 好適な真核生物発現系は、バキュロウイルス系、特に好ましくは翻訳後修飾を
可能にするものである。

【０１０１】 他の真核生物発現系（例えば酵母、昆虫細胞）も同様に使用できる。

【０１０２】 ポリペプチド 同様に本発明は、本発明によるＤＮＡ、好ましくは配列番号：１，３，５，７
，９および１１に示されるＤＮＡ配列、それらのフラグメントまたは上記のよう
な相同性ＤＮＡ配列によってコードされているβ−チューブリンポリペプチドを
含む。これらのβ−チューブリンの好適な実施態様は、配列番号：２，４，６，
８および１０に示される配列において記述される。好適な実施態様では、前記ポ
リペプチドは、本発明によるポリペプチドが生産された細胞の混入タンパク質を
含有しない精製されたポリペプチドである。

【０１０３】 上記ポリペプチドは、完全長のタンパク質、または長さ少なくとも５，１０，
２５，５０，７５，１００，１２５，１５０，２００，２５０，３００，３５０
もしくは４００アミノ酸を含有するそれらのフラグメント、モチーフもしくはド
メインである。ポリペプチドフラグメントは、配列番号：１，３，５，７，９お
よび１１に示される配列から得られた核酸フラグメントによってコードされてい
るポリペプチドの試験によって得られ、そして選択することができる。

【０１０４】 ポリペプチドフラグメントは、また、既知の方法で化学的に合成されてもよい
。

【０１０５】 また本発明は、配列番号：３に示される退化配列によってコードされているポ
リペプチドを含む。ＤＮＡ配列の特定の位置における種々の可能な塩基のために
、各場合に得られるコドンによってコードされているアミノ酸をもつ種々のポリ
ペプチドがもたらされる。配列番号：３に示される退化配列によってコードされ
ているポリペプチドは配列番号：４において記述され、変更可能なアミノ酸が「
Ｘａａ」によって印される。

【０１０６】 ポリペプチドの好適な実施態様は、配列番号：２，４，６，８および１０にお
いて記述される。

【０１０７】 本発明は、本発明によるポリペプチドのすべての製造方法を含む。

【０１０８】 本発明のポリペプチドは、種々の方法、例えば、固相法のような化学的方法に
よって得ることができることは当業者には周知である。大量のタンパク質の取得
のためには、組み換え方法の使用が推奨される。

【０１０９】 組み換えβ−チューブリンの調製のための強調すべき段階は次のとおりである
： １．本発明によるβ−チューブリンをコードする天然、合成または半合成ＤＮＡ
の取得。 ２．それ自体でも、また融合タンパク質としても、いずれでも本発明によるβ−
チューブリンを発現するために適当である発現ベクター中へのこのＤＮＡの組み
込み。 ３．この発現ベクターを用いて適当な、好ましくは原核生物の宿主細胞の形質転
換。 ４．本発明によるβ−チューブリンを発現するために適当である方式で形質転換
された宿主細胞の増殖。 ５．細胞の収穫および適当な既知の方法によるβ−チューブリンの精製。

【０１１０】 例えば、発現ベクターは、λＤＥ３溶原性Ｅ．コリ菌株、例えばＢＬ２１（Ｄ
Ｅ３），ＨＭ Ｓ１７４（ＤＥ３）またはＡＤ４９４（ＤＥ３）において形質転
換することができる。当業者には周知の標準条件下での細胞の増殖後、発現はＩ
ＰＴＧを用いて誘導される。細胞の誘導後、培養が温度１８〜３７℃で３〜２４
時間実施される。細胞が破壊され、発現されたタンパク質がクロマトグラフィー
法によって、Ｈｉｓタグをもって発現されたタンパク質の場合にはＮｉ−ＮＴＡ
カラムにおけるＦＰＬＣ法によって、そしてまたイオン交換クロマトグラフィー
、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動あるいはまた本発明による
ポリペプチドに特異的であるイムノアフィニティー精製によって精製される。

【０１１１】 本発明によるポリペプチドの同族体もしくはフラグメントは、突然変異誘発、
例えば部位特異的（点）突然変異誘発、または欠失によって生成できる。

【０１１２】 また、本発明によるポリペプチドは、例えば、グリコシル基、脂質、燐酸エス
テル、アセチル基または類似の基を用いて化学的に改変されてもよい。共有結合
誘導体は、改変する基と、ポリペプチドのアミノ酸側鎖またはＮ末端もしくはＣ
末端の官能基との結合によって得ることができる。

【０１１３】 本発明によるポリペプチドの発現では、最適発現を可能にするために、ある種
のコドンを変化させることが有利であるかもしれない。このことは、異種の発現
系におけるある種のコドンの使用（「コドン使用（ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ）」
）が本発明による生物体の１種とは異なる場合には真実である。さらにまた、い
くつかの不安定化配列モチーフ（例えばＡＴＴＴＡ）がｃＤＮＡの３’領域に存
在する場合には、５’−もしくは３’−非翻訳領域の欠失が可能である。

【０１１４】 融合タンパク質 本発明によるポリペプチドは、また、融合タンパク質の一部として存在するこ
とができる。そのような融合タンパク質は本発明によって完全に包括される。融
合タンパク質は、β−チューブリンの免疫原性フラグメントを得ることが望まれ
る状況下で有用である（例えば、欧州特許第０２５９１４９号；Ｓｃｈｌｉｅｎ
ｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６，２、参照）。ある環
境下では、融合タンパク質はポリペプチドの発現を助長する。例えば、本発明に
よるポリペプチドは、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タン
パク質として作成されてもよい。そのようなＧＳＴ融合タンパク質はポリペプチ
ドの精製を容易にする（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．
（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．１９９１）、参照）。融合
タンパク質は、例えば、精製のために使用される「リーダー」配列であって、例
えばＮｉ²⁺ＮＴＡカラムにおけるクロマトグラフィー手段によってその精製が［
空白］されるタンパク質のＮ末端（しかしまたＣ末端においても）におけるポリ
−Ｈｉｓ配列を与える、配列を含有してもよい（例えば、Ｈａｃｈｕｌｉ ｅｔ
ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ４１１，１７７、参
照）。

【０１１５】 そのような融合タンパク質を製造する技術は当業者には周知である。

【０１１６】 抗体 本発明のその他の態様は、本発明によるβ−チューブリンポリペプチドと特異
的に反応する抗体に関する。

【０１１７】 例えば、抗タンパク質もしくは抗ペプチド血清またはモノクローナル抗体は、
本発明によるβ−チューブリンポリペプチドから得られた免疫源の使用によって
標準的プロトコールにしたがって作成することができる（例えば、Ａｎｔｉｂｏ
ｄｉｅｓ：Ａ．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ｅｄ．ｂｙ Ｈａｒｌｏ
ｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，
１９８８））。

【０１１８】 哺乳動物、例えばマウス、ハムスターもしくはウサギが、本発明によるポリペ
プチドの免疫原性形態または免疫原性画分を用いて、例えば抗体応答を生じるこ
とができるポリペプチドを用いて免疫化される。適当な技術は当業者には周知で
ある。かくして、β−チューブリンの免疫原性画分が、アジュバントの存在下で
投与される。免疫化の過程は、血漿もしくは血清中の抗体タイターを、例えばＥ
ＬＩＳＡアッセイもしくは他のイムノアッセイによって検査することによって観
察できる。

【０１１９】 好適な実施態様では、本発明による抗体は、本発明によるβ−チューブリンポ
リペプチド、例えば配列番号：２，４，６，８もしくは１０に示されるポリペプ
チドあるいは配列番号：１，３，５，７，９もしくは１１に示されるＤＮＡまた
はそれと８５％まで同一な配列、好ましくは９５％まで同一な配列によってコー
ドされているそれらのポリペプチドの抗原決定基に対して免疫特異的である。

【０１２０】 哺乳動物の免疫化後、ポリクローナル抗β−チューブリン抗体が血清から単離
することができる。モノクローナル抗体の製造では、抗体産生細胞（リンパ球）
が、免疫化された動物から得られ、そしてハイブリドーマ細胞を得るためには、
既知の方法にしたがって骨髄腫細胞のような不死細胞と融合される（例えば、Ｋ
ｏｅｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６，
４９５−４９７；Ｋｏｚｂａｒ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｙ Ｔｏｄａｙ ４，７２；Ｃｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｍｏｎｏｃｌｏ
ｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌ
ａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．ｐｐ．７７−９６、参照）。

【０１２１】 ここに述べられる「抗体」は、また、本発明によるβ−チューブリンと特異的
に反応する抗体のフラグメントも含む。抗体は、慣用の技術を用いてフラグメン
ト化され、そしてフラグメントが試験される。

【０１２２】 好適な実施態様は、検出可能な標識（例えば、ラジオアイソトープ、蛍光基、
酵素もしくは酵素コファクター）を担持している上記のような抗体に関する。

【０１２３】 また、本発明によるβ−チューブリンポリペプチドに特異的に結合する抗体は
、組織サンプルの免疫組織化学的染色に使用して特異的β−チューブリンの発現
を検出することができる。抗β−チューブリン抗体は、同じく、診断目的のため
に、例えば免疫沈降もしくはイムノブロッティングのために使用できる。

【０１２４】 診断試験操作 同様に本発明は、診断目的のために使用できる核酸分子を利用可能にさせる。

【０１２５】 これらは、上記のような核酸分子、配列番号：１，３，５，７，９もしくは１
１において記述されるＤＮＡ配列またはそれに相補的なＤＮＡ配列を含む。例え
ば、配列番号：１２〜５１に示されるオリゴヌクレオチドが利用可能にされ、こ
れらは、β−チューブリンをコードするセンスもしくはアンチセンス配列、およ
び配列番号：１１において例として記述されるイントロン配列部分にハイブリダ
イズすることができる。

【０１２６】 この操作では、細胞の核酸はハイブリダイゼーション可能なようにされ、ＤＮ
Ａプローブがオリゴヌクレオチドと接触させられ、そしてサンプルのハイブリダ
イゼーションがオリゴヌクレオチドを用いて検出される。

【０１２７】 この方式では、ＤＮＡプローブへの本発明によるオリゴヌクレオチドの特異的
ハイブリダイゼーションによって、好ましくはβ−チューブリンをコードするＤ
ＮＡのイントロン領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを用いて、種々
の種の小ストロンギルドおよび／または他の線虫種間を区別することをできる方
法が利用可能にされる。特に好適な実施態様では、本発明によるオリゴヌクレオ
チドは、例えばウマにおける小ストロンギルドルド（シアトストミナエ）におけ
る耐性、特に種シリコシクルス・ナッサタス、シアトストマム・コロナタムおよ
びシアトストマム・カチナタムの耐性の同定を可能にさせる。この操作では、β
−チューブリンの耐性型が、それをコードする本発明によるＤＮＡにおいて、例
えば、Ｅｌａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９９８）ＰＣＲ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏ
ｆ ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅ−ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｏｒ −ｒ
ｅｓｉｓｔａｎｅｃｅ ｉｎ ｎａｔｕｒａｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ
ｔｈｅ ｓｍａｌｌ ｒｕｍｉｎａｎｔ ｐａｒａｓｉｔｅ，Ｔｅｌａｄｏｒ ｓａｇｉａ ｃｉｒｃｕｍｃｉｎｃｔａ ，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｐａｒａｓｉ
ｔｏｌｏｇｙ ８０，２３１−２３７において記述されているようなＰＣＲによ
って検出できる、少なくとも１つの点突然変異を担持するという事実が使用でき
る。

【０１２８】 前記方法は、線虫類に罹ったヒトおよび動物、例えばウマ、ヒツジ、ブタ、ヤ
ギ、ラクダ、バッファロー、ロバ、野ウサギ、ノロ、毛皮動物、トリ（例えばニ
ワトリ、シチメンチョウ、アヒル）、淡水および塩水魚（例えばニジマス、コイ
）における可能な治療戦略の調査のために特に有用である。それは、寄生線虫類
の同定および区別ならびにその耐性集団の認識を可能にさせ、活性のない殺線虫
剤による治療を回避する。

【０１２９】 ここに記述される方法は、例えば、即時使用剤形において製造される上記核酸
分子または前記抗体の少なくとも１つを含有するプレハブ診断試験キットの形態
において利用可能にさせる。

【０１３０】 殺線虫物質の発見方法 本発明は、チューブリンもしくはそのフラグメントを用いて、新規な特異的駆
虫物質が同定できる方法に関する。

【０１３１】 好適な実施態様では、本発明によるβ−チューブリンポリペプチドがこのため
に使用される。しかしながら、方法は、また、ここに記述されるもの以外の種由
来のチューブリンを用いても実施できる。本発明によるもの以外のβ−チューブ
リンポリペプチドを使用する方法は、本発明によって完全に包含される。特に好
ましくは、配列番号：２，４，６，８もしくは１０に示されるβ−チューブリン
ポリペプチドが、前記方法のために使用される。したがって、本発明では、しば
しば存在している寄生線虫類由来のβ−チューブリンポリペプチドが、さらに利
用可能にされる。これらは、チューブリン相互作用、またはチューブリンサブユ
ニットの相互作用の新規インヒビターの同定のための種々の試験システムにおい
て使用できる。

【０１３２】 セル・フリー試験システム それらの目的としての化合物および天然抽出物の試験をする多くの試験システ
ムは、与えられた期間内に検討される物質の数を最大にするために高い処理数を
ねらっている。セル・フリーの研究に基づく試験システムは精製または半精製タ
ンパク質を使用する。それらは、標的タンパク質への物質の可能性のある影響を
検出することを主なねらいとする「最初の」試験に適している。

【０１３３】 細胞毒性のような効果は、これらのイン・ビトロ系において一般に無視される
。この場合の試験システムは、物質の阻害および抑制効果、および刺激効果の両
方をチェックする。物質の有効性は濃度依存試験シリーズによってチェックでき
る。試験物質を含まない対照バッチが使用されて効果が検査される。

【０１３４】 チューブリンもしくはそのサブユニットの相互作用をモジュレートする物質の
同定のための１つの可能性は、「シンチレーション近似アッセイ」（ＳＰＡ）で
ある、欧州特許第０１５４７３号、参照。この試験システムは、放射能標識され
たリガンド（例えば、小有機分子もしくは第２の放射能標識タンパク質分子）と
レセプター（例えばチューブリン）との相互作用を使用する。レセプターは、こ
の場合、シンチレート分子を備えている小球（「ミクロスフェア」）もしくはビ
ーズに結合される。放射能の崩壊過程において、ミクロスフェア中のシンチレー
ト物質は、放射能標識の亜原子粒子によって励起され、そして検出しうる光子が
放出される。リガンドから発するそれらの粒子のみが、レセプターもしくはチュ
ーブリンに結合されたリガンドから発するシグナルをもたらすように、試験条件
が最適化される。

【０１３５】 １つの可能な実施態様では、チューブリンは、相互作用または結合する試験物
質の有無によらずビーズに結合される。α−もしくはβ−チューブリンサブユニ
ットがここでは使用できる。放射能標識リガンドは、例えば、標識されたベンズ
イミダゾールまたはさらなる標識されたβ−チューブリン分子であってもよい。
固定されたチューブリンへのリガンドの結合の場合には、このリガンドは、接触
表面の領域にそれ自体を結合するために、固定化チューブリンと遊離チューブリ
ン間に存在する相互作用を阻害または阻止するにちがいない。生じた固定化チュ
ーブリンへの結合が、次に光のフラッシュによって検出できる。対応して、固定
化および遊離の、標識チューブリン間に存在する複合体は、試験物質の結合によ
って壊され、この物質は光のフラッシュの検出される強度を減少させる。そこで
、試験システムは補足的阻害システムに対応する。

【０１３６】 細胞に基づく試験システム 本発明によって利用しうるβ−チューブリン、しかしまた他の種由来のチュー
ブリンは、チューブリン相互作用を阻害する物質の同定のために、細胞に基づく
試験システムの開発を可能にする。

【０１３７】 そのような試験システムの例は「ツーハイブリッド系」である。この特定の例
は「相互作用トラップ」である。これは、酵母において相互作用するタンパク質
の遺伝的選択である（例えば、Ｇｙｕｒｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｃｄｉ
１，ａ ｈｕｍａｎ Ｇ１ ａｎｄ Ｓ ｐｈａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈ
ｏｓｐｈａｔａｓｅ ｔｈａｔ ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ｗｉｔｈ Ｃｄｋ ²
．Ｃｅｌｌ ７５，７９１−８０３、参照）。試験システムは、生じた相互作
用が検出可能なシグナルをもたらすことにおいて、２種のタンパク質の相互作用
を検出し、記録するように設計される。

【０１３８】 そのような試験システムは、また、与えられた期間内の多数の試験物質の試験
処理に適合できる。

【０１３９】 システムは、２種のベクター、「バイト（えさ、ｂａｉｔ）」ベクターおよび
「プレイ（捕食、ｐｒｅｙ）」ベクターの構築に基づく。チューブリンをコード
する遺伝子、好ましくは本発明によるβ−チューブリンをコードする遺伝子が、
バイトベクターにおいてクローン化され、次いでＬｅｘＡタンパク質、ＤＮＡ結
合タンパク質との融合タンパク質として発現される。チューブリン、好ましくは
本発明によるβ−チューブリンをコードする第２の遺伝子は、プレイベクター中
にクローン化され、この場合、それは、Ｂ４２プレイタンパク質との融合タンパ
ク質として発現される。両ベクターは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃ ｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ）宿主において存在し、これは、ｌ
ａｃＺまたはＨＩＳ３レポーター遺伝子の５’側においてＬｅｘＡ結合ＤＮＡの
コピーを含有している。相互作用が２つのチューブリン（融合）タンパク質間に
起きる場合、レポーター遺伝子の転写の活性化が生じる。試験物質の存在がチュ
ーブリン相互作用の阻害または妨害をもたらす場合、２つのチューブリン（融合
）タンパク質は、もはや相互作用できず、そしてレポーター遺伝子の生産物は、
もはや生産されない。

【０１４０】 チューブリン、特に本発明によるβ−チューブリンまたはそのフラグメント、
および上記方法により、新規な、そして特異的な抗寄生虫化合物を同定すること
が可能である。

【０１４１】 上記方法およびポリペプチドにより見いだされる化合物は、ヒト、または農業
動物、ペット、動物園動物ならびに研究室動物および試験動物の病原性内部寄生
虫に感染しているヒトおよび動物の治療のために有用である。

【０１４２】 化合物は、正常な、感受性株およびまた耐性株の発生の全段階に対して活性が
ある。これらの化合物の１種以上を含有する薬剤による治療によって、農業動物
の場合の経済的損失ならびにヒトおよび動物における疾病の両方が、回避または
治療することができる。次の寄生虫が、発見された活性化合物の標的としてこの
場合特に興味がある： 有針類（Ｅｎｏｐｌｉｄａ）目、例えば：トリキュリス種（Ｔｒｉｃｈｕｒｉ ｓ ｓｐｐ．），カピラリア種（Ｃａｐｉｌｌａｒｉａ ｓｐｐ．），トリコモ
ソイデス種（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｓｏｉｄｅｓ ｓｐｐ．），トリキネラ種（Ｔｒ ｉｃｈｉｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）。

【０１４３】 桿線虫類（Ｒｈａｂｄｉｔｉａ）目、例えば：ミクロネマ種（Ｍｉｃｒｏｎｅ ｍａ ｓｐｐ．），ストロンジロイデス種（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ ｓｐ
ｐ．）。

【０１４４】 円虫類（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｉｄａ）目、例えば：ストロンギルス種（Ｓｔｒｏ ｎｇｙｌｕｓ ｓｐｐ．），トリオドントホラス種（Ｔｒｉｏｄｏｎｔｏｐｈｏ ｒｕｓ ｓｐｐ．），エソファゴドンタス種（Ｏｅｓｏｐｈａｇｏｄｏｎｔｕｓ ｓｐｐ．），トリコネマ種（Ｔｒｉｃｈｏｎｅｍａ ｓｐｐ．），ジアロセフ
ァルス種（Ｇｙａｌｏｃｅｐｈａｌｕｓ ｓｐｐ．），シリンドロファリンクス
種（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｐｈａｒｙｎｘ ｓｐｐ．），ポテリオストマム種（Ｐｏ ｔｅｒｉｏｓｔｏｍｕｍ ｓｐｐ．），シクロコセルカス種（Ｃｙｃｌｏｃｏｃ ｅｒｃｕｓ ｓｐｐ．），シリコステファナス種（Ｃｙｌｉｃｏｓｔｅｐｈａｎ ｕｓ ｓｐｐ．），エソファゴストマム種（Ｏｅｓｏｐｈａｇｏｓｔｏｍｕｍ
ｓｐｐ．），チャベルチア種（Ｃｈａｂｅｒｔｉａ ｓｐｐ．），ステファヌラ
ス種（Ｓｔｅｐｈａｎｕｒｕｓ ｓｐｐ．），アンシロストマ種（Ａｎｃｙｌｏ ｓｔｏｍａ ｓｐｐ．），アンシナリア種（Ｕｎｃｉｎａｒｉａ ｓｐｐ．），
ブノストマム種（Ｂｕｎｏｓｔｏｍｕｍ ｓｐｐ．），グロボセファルス種（Ｇ ｌｏｂｏｃｅｐｈａｌｕｓ ｓｐｐ．），シンガムス種（Ｓｙｎｇａｍｕｓ ｓ
ｐｐ．），シアトストマム種（Ｃｙａｔｈｏｓｔｏｍｕｍ ｓｐｐ．），シリコ
シクルス種（Ｃｙｌｉｃｏｃｙｃｌｕｓ ｓｐｐ．）、ネオストロンジルス種（ Ｎｅｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ｓｐｐ．），シストカウルス種（Ｃｙｓｔｏｃａ ｕｌｕｓ ｓｐｐ．），ニウモストロンジルス種（Ｐｎｅｕｍｏｓｔｒｏｎｇｙ ｌｕｓ ｓｐｐ．），スピコカウルス種（Ｓｐｉｃｏｃａｕｌｕｓ ｓｐｐ．）
，エラホストロンジルス種（Ｅｌａｐｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ｓｐｐ．），
パレラホストロンジルス種（Ｐａｒｅｌａｐｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ｓｐｐ
．），クレノソマ種（Ｃｒｅｎｏｓｏｍａ ｓｐｐ．），パラクレノソマ種（Ｐ ａｒａｃｒｅｎｏｓｏｍａ ｓｐｐ．），アンジオストロンジルス種（Ａｎｇｉ ｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ｓｐｐ．），エルロストロンジルス種（Ａｅｌｕｒｏ ｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ｓｐｐ．），フィラロイデス種（Ｆｉｌａｒｏｉｄｅｓ ｓｐｐ．），パラフィラロイデス種（Ｐａｒａｆｉｌａｒｏｉｄｅｓ ｓｐｐ
．），トリコストロンジルス種（Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ｓｐｐ．
），ハエモンカス種（Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ ｓｐｐ．），オステルタジア種（ Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ ｓｐｐ．），マルシャラジア種（Ｍａｒｓｈａｌｌａｇ ｉａ ｓｐｐ．），クーペリア種（Ｃｏｏｐｅｒｉａ ｓｐｐ．），ネマトジラ
ス種（Ｎｅｍａｔｏｄｉｒｕｓ ｓｐｐ．），ヒオストロンジルス種（Ｈｙｏｓ ｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ｓｐｐ．），オベリスコイデス種（Ｏｂｅｌｉｓｃｏｉｄ ｅｓ ｓｐｐ．），アミドストマム種（Ａｍｉｄｏｓｔｏｍｕｍ ｓｐｐ．），
オルラヌス種（Ｏｌｌｕｌａｎｕｓ ｓｐｐ．）。

【０１４５】 蟯虫類（Ｏｘｙｕｒｉｄａ）目、例えば：オキシウリス種（Ｏｘｙｕｒｉｓ
ｓｐｐ．），エンテロビウス種（Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓ ｓｐｐ．），パサルラ
ス種（Ｐａｓｓａｌｕｒｕｓ ｓｐｐ．），シファシア種（Ｓｙｐｈａｃｉａ
ｓｐｐ．），アスピクルリス種（Ａｓｐｉｃｕｌｕｒｉｓ ｓｐｐ．），ヘテラ
キス種（Ｈｅｔｅｒａｋｉｓ ｓｐｐ．）。

【０１４６】 回虫類（Ａｓｃａｒｉｄｉｄａ）目、例えば：アスカリス種（Ａｓｃａｒｉｓ ｓｐｐ．）、トキサスカリス種（Ｔｏｘａｓｃａｒｉｓ ｓｐｐ．）、トキソ
カラ種（Ｔｏｘｏｃａｒａ ｓｐｐ．）、パラスカリス種（Ｐａｒａｓｃａｒｉ ｓ ｓｐｐ．）、アニサキス種（Ａｎｉｓａｋｉｓ ｓｐｐ．）、アスカリジア
種（Ａｓｃａｒｉｄｉａ ｓｐｐ．）。

【０１４７】 旋尾線虫類（Ｓｐｉｒｕｒｉｄａ）目、例えば：グナトストマ種（Ｇｎａｔｈ ｏｓｔｏｍａ ｓｐｐ．），フィサロプテラ種（Ｐｈｙｓａｌｏｐｔｅｒａ ｓ
ｐｐ．），テラジア種（Ｔｈｅｌａｚｉａ ｓｐｐ．），ゴンジロネマ種（Ｇｏ ｎｇｙｌｏｎｅｍａ ｓｐｐ．），ハブロネマ種（Ｈａｂｒｏｎｅｍａ ｓｐｐ
．），パラブロネマ種（Ｐａｒａｂｒｏｎｅｍａ ｓｐｐ．），ドラスキア種（ Ｄｒａｓｃｈｉａ ｓｐｐ．），ドラカンクルス種（Ｄｒａｃｕｎｃｕｌｕｓ
ｓｐｐ．）。

【０１４８】 糸状虫類（Ｆｉｌａｒｉｉｄａ）目、例えば：ステファノフィラリア種（Ｓｔ ｅｐｈａｎｏｆｉｌａｒｉａ ｓｐｐ．），パラフィラリア種（Ｐａｒａｆｉｌ ａｒｉａ ｓｐｐ．），セタリア種（Ｓｅｔａｒｉａ ｓｐｐ．），ロア種（Ｌ ｏａ ｓｐｐ．），ジロフィラリア種（Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ ｓｐｐ．），
リトモソイデス種（Ｌｉｔｏｍｏｓｏｉｄｅｓ ｓｐｐ．），ブルジア種（Ｂｒ ｕｇｉａ ｓｐｐ．），ブケレリア種（Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ ｓｐｐ．），オ
ンコセルカ種（Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ ｓｐｐ．）。

【０１４９】 鉤頭虫類（Ｇｉｇａｎｔｏｒｈｙｎｃｈｉｄａ）目、例えば：フィリコリス種
（Ｆｉｌｉｃｏｌｌｉｓ ｓｐｐ．），モニリホルミス種（Ｍｏｎｉｌｉｆｏｒ ｍｉｓ ｓｐｐ．），マクラカントリンカス種（Ｍａｃｒａｃａｎｔｈｏｒｈｙ ｎｃｈｕｓ ｓｐｐ．），プロテノルキス種（Ｐｒｏｔｈｅｎｏｒｃｈｉｓ ｓ
ｐｐ．）。

【０１５０】 鞭毛藻類（Ｍａｓｔｉｇｏｐｈｏｒａ（Ｆｌａｇｅｌｌａｔａ）） トリパノソマ科（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｔｉｄａｅ）、例えば、トリパノソ
マ ｂ．ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂ．ｂｒｕｃｅｉ）、Ｔ．ｂ．ガ
ムビエンセ（Ｔ．ｂ．ｇａｍｂｉｅｎｓｅ）、Ｔ．コンゴレンセ（Ｔ．ｃｏｎｇ
ｏｌｅｎｓｅ）、Ｔ．クルジ（Ｔ．Ｃｒｕｚｉ），Ｔ．エバンシ（Ｔ．ｅｖａｎ ｓｉ ），Ｔ．エクイナム（Ｔ．ｅｑｕｉｎｕｍ），Ｔ．レビシ（Ｔ．ｌｅｗｉｓ ｉ ），Ｔ．ペルカエ（Ｔ．ｐｅｒｃａｅ），Ｔ．シミエ（Ｔ．ｓｉｍｉａｅ），
Ｔ．ビバックス（Ｔ．ｖｉｖａｘ），ライシュマニア・ブラシリエンシス（Ｌｅ ｉｓｈｍａｎｉａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ ），Ｌ．ドノバニ（Ｌ．ｄｏｎｏ ｖａｎｉ ），Ｌ．トロピカ（Ｌ．ｔｒｏｐｉｃａ）、 トリコモナド科（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｄｉｄａｅ）、例えば、ギアルジア・
ラムビリア（Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｉｌｉａ），Ｇ．カニス（Ｇ．ｃａｎｉ ｓ ）． 有毛根足虫類（根足虫類）（Ｓａｒｃｏｍａｓｔｉｇｏｐｈｏｒａ（Ｒｈｉｚ ｏｐｏｄａ） ）、例えば、エンタモエバ・ヒストリチカ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ ） ハルトマネラ科（Ｈａｒｔｍａｎｅｌｌｉｄａｅ），例えば、アカンタモエバ
種（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ ｓｐ．），ハルトマネラ種（Ｈａｒｔｍａｎｅ ｌｌａ ｓｐｐ．） 胞子虫類（Ａｐｉｃｏｍｐｌｅｘａ（Ｓｐｏｒｏｚｏａ））、例えば、エイメ
リア・アセルブリナ（Ｅｉｍｅｒｉａ ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ），Ｅ．アデノイ
デス（Ｅ．ａｄｅｎｏｉｄｅｓ），Ｅ．アラバメンシス（Ｅ．ａｌａｂａｈｍｅ ｎｓｉｓ ），Ｅ．アナチス（Ｅ．ａｎａｔｉｓ），Ｅ．アンセリス（Ｅ．ａｎｓ ｅｒｉｓ ），Ｅ．アルロインギ（Ｅ．ａｒｌｏｉｎｇｉ），Ｅ．アシャタ（Ｅ． ａｓｈａｔａ ），Ｅ．アウブルネンシス（Ｅ．ａｕｂｕｒｎｅｎｓｉｓ），Ｅ．
ボビス（Ｅ．ｂｏｖｉｓ），Ｅ．ブルネッチ（Ｅ．ｂｒｕｎｅｔｔｉ），Ｅ．カ
ニス（Ｅ．ｃａｎｉｓ），Ｅ．チンチラエ（Ｅ．ｃｈｉｎｃｈｉｌｌａｅ），Ｅ
．クルペアルム（Ｅ．ｃｌｕｐｅａｒｕｍ），Ｅ．コルムバエ（Ｅ．ｃｏｌｕｍ ｂａｅ ），Ｅ．コントルタ（Ｅ．ｃｏｎｔｏｒｔａ），Ｅ．クランダリス（Ｅ． ｃｒａｎｄａｌｉｓ ），Ｅ．デルブリエッキ（Ｅ．ｄｅｂｌｉｅｃｋｉ），エ．
ジスペルサ（Ｅ．ｄｉｓｐｅｒｓａ），Ｅ．エリプソイダレス（Ｅ．ｅｌｌｉｐ ｓｏｉｄａｌｅｓ ），Ｅ．ファルシフォルミス（Ｅ．ｆａｌｃｉｆｏｒｍｉｓ）
，Ｅ．ファウレイ（Ｅ．ｆａｕｒｅｉ），Ｅ．ラベアナ（Ｅ．ｌａｂｂｅａｎａ ），Ｅ．ロイカルチ（Ｅ．ｌｅｕｃａｒｔｉ），Ｅ．マグナ（Ｅ．ｍａｇｎａ）
，Ｅ．マキシマ（Ｅ．ｍａｘｉｍａ），Ｅ．メジア（Ｅ．ｍｅｄｉａ），Ｅ．メ
レアグリジス（Ｅ．ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ），Ｅ．メレアグリミチス（Ｅ．ｍ ｅｌｅａｇｒｉｍｉｔｉｓ ），Ｅ．ミチス（Ｅ．ｍｉｔｉｓ），Ｅ．ネカトリッ
クス（Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉｘ），Ｅ．ニナコーリアキモバエ（Ｅ．ｎｉｎａｋｏ ｈｌｙａｋｉｍｏｖａｅ ），Ｅ．オービス（Ｅ．ｏｖｉｓ），Ｅ．パルバ（Ｅ． ｐａｒｖａ ），Ｅ．パボニス（Ｅ．ｐａｖｏｎｉｓ），Ｅ．ペルホランス（Ｅ． ｐｅｒｆｏｒａｎｓ ），Ｅ．ファサニ（Ｅ．ｐｈａｓａｎｉ），Ｅ．ピリホルミ
ス（Ｅ．ｐｉｒｉｆｏｒｍｉｓ），Ｅ．プラエコックス（Ｅ．ｐｒａｅｃｏｘ）
，Ｅ．レシヅア（Ｅ．ｒｅｓｉｄｕａ），Ｅ．スカブラ（Ｅ．ｓｃａｂｒａ）， Ｅ．ｓｐｅｃ． ，Ｅ．スチエダイ（Ｅ．ｓｔｉｅｄａｉ），Ｅ．スイス（Ｅ．ｓ ｕｉｓ ），Ｅ．テネラ（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ），Ｅ．トルンカタ（Ｅ．ｔｒｕｎ ｃａｔａ ），Ｅ．トルッタエ（Ｅ．ｔｒｕｔｔａｅ），Ｅ．ズエルニイ（Ｅ．ｚ ｕｅｒｎｉｉ ），グロビジウム種（Ｇｌｏｂｉｄｉｕｍ ｓｐｅｃ．），イソス
ポラ・ベリイ（Ｉｓｏｓｐｏｒａ ｂｅｌｌｉ），Ｉ．カニス（Ｉ．ｃａｎｉｓ ），Ｉ．フェリス（Ｉ．ｆｅｌｉｓ），Ｉ．オヒオエンシス（Ｉ．ｏｈｉｏｅｎ ｓｉｓ ），Ｉ．リボルタ（Ｉ．ｒｉｖｏｌｔａ），Ｉ．ｓｐｅｃ．，Ｉ．スイス
（Ｉ．ｓｕｉｓ），エオスポラ・カニナム（Ｎｅｏｓｐｏｒａ ｃａｎｉｎｕｍ ），シスチソスポラ種（Ｃｙｓｔｉｓｏｓｐｏｒａ ｓｐｅｃ．），クリプトス
ポリジウム種（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｓｐｅｃ．）、 トキソプラスマ科（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａｄｉｄａｅ）、例えば、トキソプラ
スマ・ゴンジイ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ） サルコシスト科（Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｄａｅ）、例えば、サルコシスチス・
ボビカニス（Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ ｂｏｖｉｃａｎｉｓ），Ｓ．ボビホミニ
ス（Ｓ．ｂｏｖｉｈｏｍｉｎｉｓ），Ｓ．ノイボナ（Ｓ．ｎｅｕｖｏｎａ），Ｓ
．オビカニス（Ｓ．ｏｖｉｃａｎｉｓ），Ｓ．オビフェリス（Ｓ．ｏｖｉｆｅｌ ｉｓ ），Ｓ．ｓｐｅｃ．，Ｓ．スイホミニス（Ｓ．ｓｕｉｈｏｍｉｎｉｓ） ロイコゾイド（Ｌｅｕｃｏｚｏｉｄｅ）、例えば、ロイコジドズーン・シモン
ジ（Ｌｅｕｃｏｚｙｔｏｚｏｏｎ ｓｉｍｏｎｄｉ） プラスモジウム科（Ｐｌａｓｍｏｄｉｉｄａｅ）、例えば、プラスモジウム・
ベルゲイ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｂｅｒｇｈｅｉ），Ｐ．ファルシパルム（Ｐ ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ），Ｐ．マラリアエ（Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ），Ｐ．オ
バレ（Ｐ．ｏｖａｌｅ），Ｐ．ビバックス（Ｐ．ｖｉｖａｘ），Ｐ．ｓｐｅｃ． ピロプラスマ類（Ｐｉｒｏｐｌａｓｍｅａ）、例えば、バベシア・アルジェン
チナ（Ｂａｂｅｓｉａ ａｒｇｅｎｔｉｎａ），Ｂ．ボビス（Ｂ．ｂｏｖｉｓ）
，Ｂ．カニス（Ｂ．ｃａｎｉｓ），Ｂ．ｓｐｅｃ．，テイレリア・パルバ（Ｔｈ ｅｉｌｅｒｉａ ｐａｒｖａ ），Ｔ．ｓｐｅｃ． アデレイナ（Ａｄｅｌｅｉｎａ），例えば、ヘパトズーン・カニス（Ｈｅｐａ ｔｏｚｏｏｎ ｃａｎｉｓ ），Ｈ．ｓｐｅｃ． 次のものはさらに重要である： 粘液胞子虫類（Ｍｙｘｏｓｐｏｒａ）および微胞子虫類（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒ ａ ）、例えば、グルゲア種（Ｇｌｕｇｅａ ｓｐｅｃ．）およびノセマ種（Ｎｏ ｓｅｍａ ｓｐｅｃ． ）およびニューモシスチス・カリニイ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙ ｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ ）、有毛類（繊毛虫類）（Ｃｉｌｉｏｐｈｏｒａ（Ｃ ｉｌｉａｔａ） ）、例えば、バランチジウム・コリ（Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ ｃｏｌｉ ），イクチオフチリウス種（Ｉｃｈｔｈｉｏｐｈｔｈｉｒｉｕｓ ｓｐ ｅｃ． ），トリコンジナ種（Ｔｒｉｃｈｏｎｄｉｎａ ｓｐｅｃ．）またはエピ
スチリス種（Ｅｐｉｓｔｙｌｉｓ ｓｐｅｃ．）。

【０１５１】 さらに、発見された化合物および薬剤は、昆虫類の原生動物、例えば株、微胞
子虫類（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ）、特に目ノセマ（Ｎｏｓｅｍａ）、非常
に特には、ミツバチの寄生虫である種ノセマ・アピス（Ｎｏｓｅｍａ ａｐｉｓ ）に対して効果的である。

【０１５２】 実施例 例１ β−チューブリンｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡの取得 ｍＲＮＡは、Ｃ．ナッサタス蠕虫からＱｕｉｃｋ Ｐｒｅｐ^RＭｉｃｒｏ ｍ
ＲＮＡキット（Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて
、そしてＣ．コロナタムおよびＣ．カチナタム蠕虫からＤｙｎａｌ^RｍＲＮＡ
Ｄｉｒｅｃｔキット（Ｄｙｎａｌ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて
得られた。蠕虫類は、ウマの大腸から分離され、そして頭部および尾部の特徴的
構造にしたがって顕微鏡的に区別された（Ｒ．Ｓ．Ｌｉｃｈｔｅｎｆｅｌｄ（１
９７５），Ｈｅｌｍｉｎｔｈｓ ｏｆ ｄｏｍｅｓｔｉｃ ｅｑｕｉｄｓ，Ｐｒ
ｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｏ
ｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，４２（Ｓｐｅｃｉａｌ ｉｓｓｕｅ），１
−９２、参照）。

【０１５３】 ｃＤＮＡの合成は、Ｃ．ナッサタス由来のｍＲＮＡの場合には「逆転写系」（
Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＵＳＡ）を用いて、そしてＣ．コロナタムお
よびＣ．カチナタム由来のｍＲＮＡの場合にはｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＲＴＩ
Ｉ逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を
用いて実施された。上記場合には、長さ１５塩基対をもつオリゴヌクレオチドが
使用された。インキュベーションは、４２℃で１時間実施された。

【０１５４】 ゲノムＤＮＡは、ＱＩＡ Ａｍｐ−ｔｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉ
ｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて４〜４０匹の成蠕虫から得られた。この操
作では、蠕虫類はプロテアーゼＫにより５５℃で２時間消化され、そしてゲノム
ＤＮＡは「スピンカラム」を用いて抽出された。

【０１５５】 例２ β−チューブリン配列の増幅 全長のβ−チューブリン配列またはフラグメントの増幅は、例えば、Ａｍｐｌ
ｉＴａｑ Ｇｏｌｄ^TMポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ
Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を用いて実施できる。

【０１５６】 配列番号：１，３，５，７，９もしくは１１に示されるβ−チューブリン配列
またはそのフラグメントの増幅は、配列番号：１２−５１に示されるプライマー
を用いて実施できる。

【０１５７】 Ｃ．コロナタム由来のｃＤＮＡの増幅では、例えば、配列番号：４３および４
４に示される配列が適当であり、Ｃ．カチナタム由来のｃＤＮＡの増幅では、配
列番号：４０および４２に示される配列が特に適当である。

【０１５８】 Ｃ．ナッサタスｃＤＮＡおよび本発明によるあらゆる種のゲノムＤＮＡの増幅
は、１０ｘバッファー５μｌ、ＭｇＣｌ₂（２５ｍＭ）２．５μｌ、ｄＮＴＰ混
合液（各ＮＴＰについて２ｍＭ）２μｌ、各特異的プライマー（配列番号：１２
−４７）（５０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、ポリメラーゼ０．５μｌ（２．５Ｕ）
およびＤＮＡ鋳型１−５μｌを含有する総容量５０μｌにおいて実施された。退
化プライマー（配列番号：４８−５１）を用いる場合は、濃度５００ｐｍｏｌ／
μｌの各プライマー１μｌが用いられた。アニーリングは、退化プライマーの場
合には４６℃において実施され、特異的プライマーの場合は、温度は計算される
融解温度にしたがって変えられた。ＰＣＲサイクルは次のように選ばれた： １０分間９６℃、次いで９４℃で１分変性により３５−４０サイクル、１分アニ
ーリング、７２℃で１分および１０分間７２℃の最終段階。Ｃ．コロナタムおよ
びＣ．カチナタム由来のｃＤＮＡの増幅では、次のプロフィルをもつ「タッチダ
ウン」ＰＣＲ温度プログラムが実施された： 最初に、３０秒間９４℃で１５サイクル、次いで６０℃で１分および７２℃で１
分、続いて９５℃で３０秒により１５サイクル、１分間５５℃および１分間７２
℃、そして最後に、３０秒間９５℃で１０サイクル、次いで１分間４５℃および
１分間７２℃。比較的大きいフラグメント（＞１０００塩基対）の増幅では、７
２℃における伸長相が２．３０分に延長された。

【０１５９】 例３ Ｃ．ナッサタス、Ｃ．コロナタムおよびＣ．カチナタム由来のｃＤＮＡもしく
はゲノムＤＮＡの増幅からのＰＣＲ生成物が、「Ｏｒｉｇｉｎａｌ ＴＡ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ」／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌｅｅｋ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎ
ｄｓ）を用いて、すなわち「Ｏｒｉｇｉｎａｌ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ^R」ベク
ターにおいてクローン化された。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/435 Ｃ１２Ｎ 1/15 ４Ｃ０８４ 16/18 1/19 ４Ｃ０８５ Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 ４Ｈ０４５ 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/10 1/68 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ 1/68 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/566 33/50 33/569 Ａ 33/53 33/577 Ｂ 33/566 33/58 Ａ 33/569 Ｃ１２Ｐ 21/08 33/577 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/58 5/00 Ａ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 シユニーダー，トマス ドイツ・デー−30539ハノーバー・インデ アベビエ38 (72)発明者 パペ，ミヒヤエラ ドイツ・デー−30173ハノーバー・エルカ ルトアレー21 Ｆターム(参考） 2G045 AA28 AA40 CB21 DA12 DA13 DA14 DA36 FB02 FB03 FB07 4B024 AA01 AA11 BA31 BA43 CA04 DA02 DA06 EA04 GA01 GA03 GA11 HA14 HA15 4B063 QA01 QA18 QQ08 QQ42 QR32 QR38 QR55 QR77 QR80 QS24 QS25 QS28 QS34 QX02 4B064 AG01 AG27 AG31 CA19 CC24 DA01 DA13 DA20 4B065 AA26X AA90Y AA91X AA92X AB01 AB05 AC14 BA02 CA24 CA25 CA44 CA45 CA46 4C084 AA02 AA03 AA06 AA07 AA13 BA03 CA53 NA14 ZB392 4C085 AA13 AA14 DD62 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA50 DA76 DA86 EA29 EA31 EA50 FA74

Claims (45)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 シアトストミナエ（Ｃｙａｔｈｏｓｔｏｍｉｎａｅ）由来の
   β−チューブリンをコードするＤＮＡまたはそのフラグメント。
2. 【請求項２】 ａ）配列番号：２において示されるようなアミノ酸配列をコ
   ードするポリヌクレオチドに対して少なくとも８５％同一性をもつポリヌクレオ
   チド； ｂ）配列番号：４において示されるようなアミノ酸配列をコードするポリヌクレ
   オチドに対して少なくとも８５％同一性をもつポリヌクレオチド； ｃ）配列番号：６において示されるようなアミノ酸配列をコードするポリヌクレ
   オチドに対して少なくとも８５％同一性をもつポリヌクレオチド； ｄ）配列番号：８において示されるようなアミノ酸配列をコードするポリヌクレ
   オチドに対して少なくとも８５％同一性をもつポリヌクレオチド； ｅ）配列番号：１０において示されるようなアミノ酸配列をコードするポリヌク
   レオチドに対して少なくとも８５％同一性をもつポリヌクレオチド； を含んでなる、請求項１記載のＤＮＡ。
3. 【請求項３】 ａ）配列番号：２において示されるようなアミノ酸配列をコ
   ードするポリヌクレオチドに対して少なくとも９５％同一性をもつポリヌクレオ
   チド； ｂ）配列番号：４において示されるようなアミノ酸配列をコードするポリヌクレ
   オチドに対して少なくとも９５％同一性をもつポリヌクレオチド； ｃ）配列番号：６において示されるようなアミノ酸配列をコードするポリヌクレ
   オチドに対して少なくとも９５％同一性をもつポリヌクレオチド； ｄ）配列番号：８において示されるようなアミノ酸配列をコードするポリヌクレ
   オチドに対して少なくとも９５％同一性をもつポリヌクレオチド； ｅ）配列番号：１０において示されるようなアミノ酸配列をコードするポリヌク
   レオチドに対して少なくとも９５％同一性をもつポリヌクレオチド； を含んでなる、請求項１記載のＤＮＡ。
4. 【請求項４】 配列番号：１において示されるような配列を含んでなる、請
   求項１〜３の１つに記載のＤＮＡ。
5. 【請求項５】 配列番号：３において示されるような配列を含んでなる、請
   求項１〜３の１つに記載のＤＮＡ。
6. 【請求項６】 配列番号：５において示されるような配列を含んでなる、請
   求項１〜３の１つに記載のＤＮＡ。
7. 【請求項７】 配列番号：７において示されるような配列を含んでなる、請
   求項１〜３の１つに記載のＤＮＡ。
8. 【請求項８】 配列番号：９において示されるような配列を含んでなる、請
   求項１〜３の１つに記載のＤＮＡ。
9. 【請求項９】 配列番号：１１において示されるような配列を含んでなる、
   請求項１〜３の１つに記載のＤＮＡ。
10. 【請求項１０】 ＤＮＡがシリコシクルス（Ｃｙｌｉｃｏｃｙｃｌｕｓ）に
    由来することを特徴とする、請求項１〜３および５〜９の１つに記載のＤＮＡ。
11. 【請求項１１】 ＤＮＡがシアトストマム（Ｃｙａｔｈｏｓｔｏｍｕｍ）に
    由来することを特徴とする、請求項１〜４の１つに記載のＤＮＡ。
12. 【請求項１２】 ＤＮＡがシリコシクルス・ナッサタス（Ｃｙｌｉｃｏｃｙ ｃｌｕｓ ｎａｓｓａｔｕｓ ）に由来することを特徴とする、請求項１〜３およ
    び５〜１０の１つに記載のＤＮＡ。
13. 【請求項１３】 ＤＮＡがシアトストマム・コロナタム（Ｃｙａｔｈｏｓｔ ｏｍｕｍ ｃｏｒｏｎａｔｕｍ ）に由来することを特徴とする、請求項１〜４お
    よび１１の１つに記載のＤＮＡ。
14. 【請求項１４】 ＤＮＡが、駆虫剤耐性をもつポリペプチドの発現をもたら
    すコドン２００における少なくとも１つの塩基置換を含有することを特徴とする
    、請求項１〜１３の１つに記載のＤＮＡ。
15. 【請求項１５】 ＤＮＡが、請求項１〜１４の１つに記載のＤＮＡまたはそ
    のフラグメントに相補的であることを特徴とする、ＤＮＡ。
16. 【請求項１６】 ＲＮＡが、請求項１〜１５の１つに記載のＤＮＡに相補的
    であることを特徴とする、ＲＮＡ。
17. 【請求項１７】 発現構築物が、ＤＮＡの発現を可能にさせる請求項１〜１
    ４の１つに記載のＤＮＡおよびそれに機能的に結合された配列を含有することを
    特徴とする、構築物。
18. 【請求項１８】 ベクターが、請求項１〜１４の１つに記載のＤＮＡを含有
    することを特徴とする、ベクター。
19. 【請求項１９】 請求項１〜１４の１つに記載のＤＮＡ、請求項１７に記載
    の発現構築物、または請求項１８に記載のベクターを含んでなる、宿主細胞。
20. 【請求項２０】 請求項１〜１４の１つに記載のＤＮＡまたはそのフラグメ
    ントによってコードされているポリペプチド。
21. 【請求項２１】 配列番号：２において示されるようなアミノ酸配列からな
    るか、または含んでなる、請求項２０に記載のポリペプチド。
22. 【請求項２２】 配列番号：４において示されるようなアミノ酸配列からな
    るか、または含んでなる、請求項２０に記載のポリペプチド。
23. 【請求項２３】 配列番号：６において示されるようなアミノ酸配列からな
    るか、または含んでなる、請求項２０に記載のポリペプチド。
24. 【請求項２４】 配列番号：８において示されるようなアミノ酸配列からな
    るか、または含んでなる、請求項２０に記載のポリペプチド。
25. 【請求項２５】 配列番号：１０において示されるようなアミノ酸配列から
    なるか、または含んでなる、請求項２０に記載のポリペプチド。
26. 【請求項２６】 請求項１４に記載のＤＮＡによってコードされているポリ
    ペプチド。
27. 【請求項２７】 原核生物もしくは真核生物発現系におけるポリペプチドま
    たはそのフラグメントの発現を含む、請求項２０〜２６の１つに記載のポリペプ
    チドの製造方法。
28. 【請求項２８】 シアトストミナエに由来するＤＮＡの検出のための、請求
    項１〜１５の１つに記載のＤＮＡ、好ましくは非コーディングＤＮＡ部分に特異
    的にハイブリダイズするＤＮＡオリゴヌクレオチドの使用。
29. 【請求項２９】 シアトストミナエに由来し、そして請求項２６に記載のポ
    リペプチドをコードするＤＮＡの検出のための、請求項１〜１５の１つに記載の
    ＤＮＡに特異的にハイブリダイズするＤＮＡの使用。
30. 【請求項３０】 請求項２８に記載のＤＮＡが、請求項１〜１５の１つに記
    載のＤＮＡにハイブリダイズされ、そしてこれがＰＣＲの手段によって増幅され
    ることを特徴とする、シアトストミナエの検出法。
31. 【請求項３１】 請求項２９に記載のＤＮＡが、請求項１〜１５の１つに記
    載のＤＮＡにハイブリダイズされ、そしてこれがＰＣＲの手段によって増幅され
    ることを特徴とする、駆虫剤耐性をもつシアトストミナエの検出法。
32. 【請求項３２】 配列番号：１２〜配列番号：５１において示されるような
    配列の１つか、または請求項１〜１５に記載のＤＮＡ配列の１つから誘導された
    配列を含んでなるＤＮＡオリゴヌクレオチド。
33. 【請求項３３】 請求項３２に記載のオリゴヌクレオチドおよび／または請
    求項３５もしくは３６に記載の抗体の少なくとも１つを含んでなる診断試験キッ
    ト。
34. 【請求項３４】 ＤＮＡオリゴヌクレオチドが検出可能な標識を備えている
    ことを特徴とする、請求項３３に記載の診断試験キット。
35. 【請求項３５】 抗体が請求項２０〜２６の１つに記載のポリペプチドのエ
    ピトープと特異的に反応することを特徴とする、抗体。
36. 【請求項３６】 抗体がモノクローナルであることを特徴とする、請求項３
    ５に記載の抗体。
37. 【請求項３７】 殺線虫剤としての請求項３５もしくは３６に記載の抗体の
    使用。
38. 【請求項３８】 ワクチンの生産のための、請求項２０〜２６の１つに記載
    のポリペプチドの使用。
39. 【請求項３９】 チューブリンの相互作用をモジュレートする物質の同定法
    。
40. 【請求項４０】 ａ）試験物質が、チューブリン分子どうしの相互作用およ
    びチューブリンへの試験物質の結合を可能にする条件で、チューブリンと接触さ
    せられ、 ｂ）生じた試験物質の結合が、互いに相互作用するチューブリンタンパク質分子
    の能力を決定することによって検出され、そして ｃ）試験物質の存在下で互いに相互作用するチューブリンタンパク質分子の能力
    が、試験物質の不在下で互いに相互作用するそれらの能力と比較される、 ことを特徴とする、請求項３９に記載の方法。
41. 【請求項４１】 使用されるチューブリンが、請求項２０〜２６の１つに記
    載のポリペプチドであることを特徴とする、請求項３９もしくは４０に記載の方
    法。
42. 【請求項４２】 試験物質の存在下のチューブリン相互作用のモジュレーシ
    ョンの検出のために、細胞に基づく試験システムが使用されることを特徴とする
    、請求項３９〜４１の１つに記載の方法。
43. 【請求項４３】 試験物質の存在下のチューブリン相互作用のモジュレーシ
    ョンの検出のために、セル・フリー試験システムが使用されることを特徴とする
    、請求項３９〜４１の１つに記載の方法。
44. 【請求項４４】 請求項３９〜４３の１つに記載の方法において同定される
    物質。
45. 【請求項４５】 線虫攻撃の予防的もしくは治療的処置用の薬剤の製造のた
    めの、請求項４４に記載の物質の使用。