DE10053785A1

DE10053785A1 - Testsysteme und deren Verwendung zur Identifizierung und Charakterisierung von Verbindungen

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Publication number: DE10053785A1
Application number: DE10053785A
Authority: DE
Inventors: Georg Von Samson-Himmelstjerna; Achim Harder; Frank Wunderlich; Hans-Peter Schmitt-Wrede; Beate Saeger
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 2000-09-07
Filing date: 2000-10-30
Publication date: 2002-03-28

Abstract

Die Erfindung betrifft auf Transmembranrezeptoren aus Helminthen und Arthropoden basierende Testsysteme und deren Verwendung zur Identifizierung und Charakterisierung von Stoffen mit Wirkungen gegen Helminthen, Arthropoden oder mit Wirkung auf den Calciumhaushalt von Organismen und/oder Zellen. Die Erfindung betrifft die Verwendung eines spezifischen Liganden in diesem Testsystem und dessen Verwendung als anthelmintischer oder arthropodizider Wirkstoff.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft auf Transmembranrezeptoren aus Helminthen und Arthropoden basierende Testsysteme und deren Verwendung zur Identifizierung und Charakterisierung von Stoffen mit Wirkungen gegen Helminthen, Arthropoden oder mit Wirkung auf den Calciumhaushalt von Organismen und/oder Zellen. Die Er findung betrifft weiterhin die Verwendung eines spezifischen Liganden in diesem Testsystem und dessen Verwendung als anthelmintischer oder arthropodizider Wirk stoff.

Parasitische Helminthen und Arthropoden stellen für Menschen und Tiere ein erheb liches Gesundheitsproblem dar. Allein im Bereich der Landwirtschaft betragen die jährlich zur Bekämpfung oder Vermeidung von derartigen Parasiten hervorgerufenen Schädigungen weltweit mehr als 7 Mrd. DM (Stand 1997). Zur Behandlung von durch die vorwiegend von Helminthen verursachten Endoparasitosen, sowie die in erster Linie durch Arthropoden hervorgerufenen Ektoparasitosen stehen eine große Zahl von Wirksubstanzen aus einer Reihe von Wirkstoffklassen zur Verfügung. Während der letzten zwei Jahrzehnte haben insbesondere derartige Wirkstoffe, die gleichzeitig eine sehr gute Wirkung gegen mehrere Parasitenspezies innerhalb eines Stammes (z. B. Helminthen), oder sogar über verschiedene zoologische Stämme hin weg (z. B. Helminthen und Insekten) aufweisen, an Bedeutung gewonnen. Zu ersteren zählen unter anderem die Breitspektrumanthelmintika wie z. B. die Benzimidazole oder die Imidazothiazole, während die makrozyklischen Laktone zu den letzteren zählen.

Mit den makrozyklischen Laktonen wurde zuletzt vor ca. zwei Jahrzehnten eine neue, breit wirksame Wirkstoffgruppe in den Markt eingeführt. Inzwischen haben je doch eine Vielzahl von Endo-, als auch Ektoparasitenspezies Resistenzen gegen Ver treter einzelner, teilweise auch mehrerer Wirkstoffklassen gleichzeitig entwickelt.

Daher besteht ein ständiger und zunehmend dringender Bedarf, neue antiparasitisch wirksame Substanzen zu entwickeln.

Zu den wenigen neuen aussichtsreichen Wirkstoffgruppen, an denen gegenwärtig ge arbeitet wird, gehören die cyclischen Depsipeptide, welche Gegenstand umfang reicher Patent- (WO 93/19053, EP-OS 626 376, WO 94/19334, WO 95/07272, EP-OS 626 375, EP-OS 657 171, EP-OS 657 172, EP-OS 657 173) und Forschungsakti vitäten sind (Conder et al. 1995; Martin et al. 1996; Sasaki et al. 1992; Terada M. 1992; Samson-Himmelstjerna et al. 2000).

Zur Aufklärung des Wirkmechanismus eines Vertreters dieser Wirkstoffgruppe, dem PF1022A (cyclo(-D-Lac-L-MeLeu-D-PhLac-L-MeLeu-)₂) sind bereits mehrere Stu dien beschrieben worden (vgl. dazu Angaben in DE-A-197 04 024). Dazu gehörte auch die Identifizierung und Charakterisierung eines spezifischen Bindungsproteins für zyklische Depsipeptide und der für das Protein kodierenden DNA-Sequenz aus dem Schafparasiten Haemonchus contortus (DE-A-197 04 024). Im Rahmen der hier vorliegenden Erfindung wird die funktionale Interaktion des o. a. Proteins, genannt HC110-R, unter anderem mit dem Liganden BAY44-4400 (cyclo(-D-Lac-L-MeLeu- D-p-Morpholinyl-PhLac-L-MeLeu-), als einem weiteren Vertreter der zyklischen Depsipeptide beschrieben. Dazu wurden rekombinante eukaryotische Zelllinien kon struiert, in denen das HC110-R, basierend auf der in der früheren Anmeldung DE-A-197 04 024 beschriebenen Sequenz ID No. 2, exprimiert wird.

Der vorliegenden Erfindung liegt demnach insbesondere die Aufgabe zugrunde, auf Basis von Transmembranrezeptoren von Helminthen und Arthropoden, bevorzugt aus Nematoden und Akarina, besonders bevorzugt aus Trichostrongylidae, ganz be sonders bevorzugt aus Haemonchus spp. und insbesondere auf Basis des Rezeptors HC110-R aus H. contortus, Testsysteme mit einem hohen Durchsatz an Testver bindungen (High Throughput Screening Assays; HTS-Assays) bereitzustellen.

Als homologe Proteine werden solche Proteine betrachtet, die eine zumindest 70%ige Identität, vorzugsweise 80%ige Identität, besonders bevorzugt 90%ige Identität, ganz besonders bevorzugt 95%ige Identität, mit einer Sequenz gemäß SEQ ID NO. 2 des Dokuments DE-A-197 04 024, dessen Inhalt ausdrücklich Teil der vorliegenden Anmeldung sein soll, über eine Länge von wenigstens 20, vorzugs weise wenigstens 25, besonders bevorzugt wenigstens 30 fortlaufenden Aminosäuren und ganz besonders bevorzugt über deren Gesamtlängen aufweisen.

Der Grad der Identität der Aminosäuresequenzen wird vorzugsweise bestimmt mit Hilfe des Programms GAP aus dem Programmpaket GCG, Version 9.1 unter Standard einstellungen (Devereux et al. 1984).

Die Aufgabe wird gelöst durch die Bereitstellung von Polypeptiden, welche zumindest eine biologische Aktivität eines GPCR-Rezeptors ausüben sowie durch die Bereit stellung eines Verfahrens zur Gewinnung dieser Polypeptide und durch die Bereit stellung von Verfahren zum Identifizieren von nematizid und arthropodizid wirk samen Verbindungen.

Auf rekombinanten Mikroorganismen basierende Testsysteme wurden bereits viel fältig zur Identifizierung von pharmazeutisch wirksamen Substanzen verwendet, un ter anderem auch unter Verwendung von Mikroorganismen, die rekombinant para sitische Gene exprimieren (Klein und Geary 1997). Bisher sind jedoch keine Systeme bekannt, in denen parasitische Transmembranrezeptoren als rekombinante, funktio nale Proteine in eukaryotischen Zellen als Targets verwendet werden. Durch die in dieser Erfindung beschriebenen Prüfsysteme lassen sich im High-Throughput- Screening (HTS), bzw. im Ultra-HTS neue Agonisten und Antagonisten dieser neuen Rezeptorklasse identifizieren.

Die rekombinante Expression von Rezeptoren aus Nematoden hat sich regelmäßig als schwierig erwiesen. So ist es bisher im allgemeinen nicht gelungen, G-Protein gekop pelte Rezeptoren (GPCR) aus Nematoden so zu exprimieren, dass ihre funktionalen Eigenschaften (z. B. Empfindlichkeit gegenüber Inhibitoren) denen natürlicher Rezeptoren entspricht.

Es ist von großer praktischer Bedeutung, beispielsweise für die Suche nach neuen Anthelmintika oder Arthropodiziden, Rezeptoren aus Helminthen, insbesondere Nematoden sowie aus Arthropoden in eukaryotischen Systemen funktionell auszu prägen.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit auch die Aufgabe zu Grunde, eine Möglichkeit zur Expression von Transmembranrezeptoren, vor allem von GPC-Rezeptoren aus Nematoden und Arthropoden bereit zu stellen und darauf basierend ein Testsystem zu entwickeln, das die Identifizierung von neuen nematizid und arthropodizid wirksamen Substanzen ermöglicht.

Die vorliegende Erfindung betrifft somit insbesondere die Expression und Ver wendung eines orphanen G-Protein-gekoppelten Rezeptors aus Helminthen und Arthropoden, bevorzugt aus Nematoden und Akarina, besonders bevorzugt aus Trichostrongylidae, ganz besonders bevorzugt aus Haemonchus und am meisten bevorzugt aus dem parasitären Nematoden H. contortus als Zielprotein für die effektive Suche nach nematiziden Wirkstoffen.

Dieser Rezeptor wurde in einer cDNA-Bibliothek identifiziert, die aus dem gastro intestinalen Nematoden H. contortus gewonnen wurde. Die cDNA kodiert für ein heptahelikales Transmembranprotein einer Größe von 110 kDa, das als HC110-R be zeichnet wurde. Das Protein gehört zur Sekretin-Familie von G-Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCR) und zeigt eine hohe Ähnlichkeit zu Latrophilin.

Der HC110-R Rezeptor als Target

Der GPCR Latrophilin wurde ursprünglich aus dem Gehirn von Säugern isoliert. Latrophilin hat eine molekulare Masse von 210 kDa und wird posttranslational an Rest 18 stromaufwärts des ersten Transmembransegments gespalten, besteht also aus zwei nichtkovalent verknüpften Untereinheiten. Die Untereinheit p120 enthält den N- terminalen, hydrophilen extrazellulären Anteil, die p85-Untereinheit enthält die sieben Transmembran-Domänen und die intrazelluläre C-terminale Region des Latrophilins, die für GPCRs ungewöhnlich groß ist. Vor kurzem wurden zwei enge Homologe identifiziert, Latrophilin-2 und Latrophilin-3. Letzteres wird bevorzugt, wie auch das Latrophilin-1, im Gehirn exprimiert, während Latrophilin-2 ubiquitär mit einer Präferenz für Plazenta, Niere, Milz, Ovarien, Herz und Lunge von Säugern exprimiert wird (Ichtchenko et al. 1999; Sugita et al. 1998).

Obwohl HC110-R nur etwa halb so groß ist wie das 210 kDa große Latrophilin, er streckt sich die Ähnlichkeit der Sequenz auch auf eine funktionelle Ähnlichkeit. Für beide Rezeptoren ist der endogene Ligand noch unbekannt, aber sowohl Latrophilin als auch HC110-R werden durch den künstlichen Liganden α-LTX (alpha-Latro toxin) beeinflusst.

Werden z. B. HEK-293-Zellen transient mit Latrophilin transfiziert, verursacht die Zugabe von α-LTX den Einstrom von externem Ca²⁺, wie anhand eines Versuchs ansatzes mit radioaktivem ⁴⁵Ca²⁺ gezeigt werden kann. α-LTX verursacht einen solchen Ca²⁺-Einstrom auch bei HEK-293-Zellen, die transient mit HC110-R trans fiziert wurden, was zum Beispiel durch Ca²⁺-Imaging beobachtet werden kann.

Dieser Ca²⁺-Einstrom ist allerdings sehr komplex. Liegt das HC110-R als Konstrukt mit C-terminalem Green-Fluorescent-Protein (GFP) Anhang vor, ist er biphasisch, d. h. es zeigt sich eine Änderung nach ca. 3 und eine weitere nach ca. 22 Minuten. Wird dem HC110-R jedoch nur ein Myc-His-Tag N-terminal vorangestellt, so wird Haupteinstrom bereits ca. 2-3 Minuten nach Zugabe von α-LTX beobachtet. Der Grund hierfür ist bislang unbekannt, die Reaktion auf die α-LTX Zugabe ist jedoch, wie die späteren Ausführungen zeigen, spezifisch:

1. Der Ca²⁺-Einstrom kann nicht beobachtet werden in nicht transfizierten Zellen sowie in Zellen, die transient mit einem β₂-adrenergen Rezeptor aus der Maus transfiziert wurden.
2. Die Änderungen der [Ca²⁺]_i sind α-LTX dosisabhängig.
3. Die biphasische Änderung benötigt den Einstrom von Ca²⁺, der durch Ca²⁺- Kanäle erfolgt, die von Cd²⁺ blockiert werden können, vor allem solche des L-Typs, wie anhand deren Empfindlichkeit gegenüber Nifedipin zu erkennen ist.

Der genaue Mechanismus der Interaktion von α-LTX mit HC110-R und die Weiter leitung von Signalen muss noch geklärt werden. Am Beispiel des Latrophilin-1 konnte gezeigt werden, dass nur eine einzige Transmembran-Domäne für den durch α-LTX bedingten Ca²⁺-Einstrom in HEK-293-Zellen nötig ist (Kraspernov et al. 1999).

Die Tatsache, daß Nifedipin die Wirkung des α-LTX in dem hier beschriebenen System blockiert, zeigt, dass sich das Systems auch für die Identifizierung neuer spezifischer Calcium-Kanal-Blocker eignet. Nifedipin gehört zu einer Klasse von Calcium-Kanal Agonisten und Antagonisten, die entsprechend ihrer Bindung an einen spezifischen Ort eines Calcium-Kanals eingeteilt werden, z. B. anhand ihrer Bindung an Kanäle des L-Typs. Bei den wichtigsten drei Klassen von Calcium- Kanal-Blockern (L-Typ) handelt es sich um Benzoacetonitrile (z. B. Verapamil, WO 91/02497), Benzothiazepinone (z. B. Diltiazem) und 1,4-Dihydropyridin-Derivate wie Nifedipin, Nivaldipin, Nimodipin, Nicardipin, Isradipin, Amlodipin, Nitren dipine, Felodipin oder Nisoldipin (Bacon et al. 1989; WO 90/09792). Eine weitere Klasse von Blockern von Calcium-Kanälen des L-Typs sind 1,3-Diphosphonate, z. B. Belfosodil.

Gegenstand dieser Erfindung ist daher auch die Verwendung von α-LTX bindenden Transmembranrezeptoren zur Identifizierung von neuen Calcium-Kanal-Blockern. Besonders bevorzugt werden dabei heptahelikale Transmembranrezeptoren ver wendet, besonders bevorzugt handelt es sich um G-Protein bindende Rezeptoren. Ganz besonders bevorzugt ist die Verwendung von Transmembranrezeptoren der Sekretin-Familie. Am meisten bevorzugt ist die Verwendung des HC110-R Rezeptors gemäß SEQ ID. NO. 2 sowie dazu zu 70%, bevorzugt zu 80%, besonders bevorzugt zu 90% und besonders bevorzugt zu 95% homologer Rezeptorproteine.

Die vorliegenden Daten zeigen insbesondere, dass HC110-R ein Target für das neue anthelmintische Depsipeptid BAY44-4400 ist. BAY44-4400 stört die Signalübertra gung durch α-LTX in HEK-293-Zellen, die mit HC110-R transfiziert wurden. Diese Störung kann auf der ionophoren Aktivität des BAY44-4400 beruhen, wie es für andere Depsipeptide typisch ist, z. B. dem Beauvericin, Enniatin etc. (Geßner et al. 1996). BAY44-4400 verursacht jedoch keine Änderungen in nicht transfizierten Zellen. Ausserdem stört BAY44-4400 nicht die durch Isoproterenol induzierte Sig nalübertragung durch mit dem β₂-adrenergen Rezeptor der Maus transfizierten HEK- 293-Zellen. Darüber hinaus wirkt BAY44-4400 als Antagonist von α-LTX, während BAY44-4400 alleine die Ca²⁺-Konzentration in HC110-R transfizierten HEK-293- Zellen nicht beeinflusst.

Das HC110-R-Protein

Das in DE 197 04 024 A1 beschriebene Membranprotein wurde als ein mögliches Zielprotein für den anthelmintischen Wirkstoff PF1022A identifiziert. Zur Identifi zierung möglicher Zielproteine wurde eine λZAPII cDNA-Expressions-Bibliothek des parasitären Nematoden Haemonchus contortus hergestellt und die cDNA- Bibliothek mit Hilfe eines Konjugats aus PF1022A und KLH (keyhole limpet hemocyanin), PF1022A-KLH, und polyklonalen Antikörpern gegen dieses Konjugat durchsucht. Die Überprüfung von etwa 1,5 × 10⁶ nicht amplifizierten, rekombinanten Klonen ergab einen 3036 bp langen cDNA-Klon, der an eine 3,6 kb große mRNA aus H. contortus hybridisierte. Um die 3'- und 5'-Enden zu vervollständigen, wurde die RACE-PCR-Technik verwendet. Schließlich wurde eine 3539 bp lange cDNA er halten, die als HC110-R bezeichnet wurde. Diese cDNA kodiert für 986 Amino säuren (110 kDa), wobei der offene Leserahmen mit dem ATG¹⁰⁰ beginnt. Das Start kodon ist zur optimalen Initiation der Translation von einer Kozak-Sequenz um geben. Das abgeleitete Molekulargewicht des Proteins wurde durch die in vitro Translation der in vitro transkribierten HC110-R RNA bestätigt.

Die Aminosäuresequenz des HC110-R Proteins weist einige besondere Merkmale auf. Der extrazelluläre N-terminale Teil des Proteins besteht aus insgesamt 535 Resten. Der N-Terminus enthält ein Signalpeptid mit einer Länge von 21 Amino säuren und einer Spaltstelle an Position 18. Darauf folgt eine Lektin-ähnliche Sequenz (AS 22-125) und ein sogenannter "Thr-Stretch" (AS 128-147), der nur durch ein Serin in Position 144 unterbrochen wird. Stromabwärts des "Thr-Stretch" folgt ein cysteinreiches Motiv der Struktur CX₉WX₁₂CX₉WXCX₅WX₉CX₃W (AS 166-221). Darüberhinaus enthält das Protein HC110-R sieben hydrophobe, α-helikale Transmembran-Domänen zwischen den Resten 536 und 772. Direkt stromaufwärts der Transmembran-Region existiert eine weitere 4-Cys-Region der Struktur CXWWX₆WX₄CX₄CX₁₁CXC (AS 478-524). In der Transmembranregion gibt es drei extrazelluläre Loops enthaltend die Reste 587-597, 654-673 und 743-749 und drei intrazelluläre Loops (Position 559-569, 627-636, 696-724). Der C-Terminus ist 214 Reste lang (24 kDa) und enthält einen prolinreichen Teil (AS 845-861) und eine PEST-Region (AS 915-933). Schließlich existieren noch drei putative N-Glyko sylierungsstellen an den Resten 26, 499 und 862 sowie 14 putative Phos phorylierungsstellen in der abgeleiteten intrazellulären Domänen.

Die Analyse von Datenbanken ergab eine 48%ige Identität und 76%ige Ähnlichkeit des HC110-R-Proteins mit einem unbekannten Transmembranprotein (1014 AS), welches aus dem genomischen Klon B0457 (GenBank™ Accession Number Z54306) des Nematoden Caenorhabditis elegans abgeleitet wurde.

Der Vergleich beider Sequenzen zeigt gemeinsame Merkmale beider Proteine, so zum Beispiel die Lektin-ähnliche Sequenz, den "Thr-Stretch", die Cys-Motive und die PEST-Sequenz. Die höchste Identität ist im Bereich der Transmembranregion zu finden (62%), wogegen eine geringer ausgeprägte Identität in der N-terminalen (44%) und C-terminalen (50%) Region zu finden ist.

Darüberhinaus weist das Protein HC110-R eine 20-30%ige Identität mit heptahelikalen G-Protein-gekoppelten Transmembranrezeptoren (GPCR) auf, be sonders mit der Sekretin-Subfamilie. Vergleiche von sieben Transmembran- Domänen zeigen hohe Identität und Ähnlichkeit hinsichtlich Struktur und Sequenz zwischen verschiedenen GPCR der Sekretin-Subfamilie und HC110-R.

Latrophilin, ein Mitglied der Sekretin-Subfamilie, aus Säugern wie dem Menschen (Gen Bank™ Accession Nr.: E1360690), dem Rind (z. B. G416021, G416053 und G4185804), und der Ratte (U78105 oder U72487) zeigt eine etwas höhere Identität (31%) zu HC110-R als andere Sekretin-Rezeptoren. Vor allem die Transmembran regionen zeigen eine Identität von 45-48%. HC110-R und der 1466 Aminosäuren große Latrophilin-1 GPCR (U78105) aus der Ratte weisen gemeinsame Merkmale auf, z. B. die Lektin-Domäne, die cysteinreiche Region und ein konserviertes 4-Cys- Motiv vor der Transmembranregion. Letzteres wurde vor kurzem als Proteolysestelle von Latrophilin und anderen großen Sekretin GPCR vorgeschlagen. Dagegen enthält der N-Terminus des HC110-R nicht die Olfactomedin-Region und die Pro/Thr- Region des Latrophilins, während Latrophilin wiederum nicht den "Thr-Stretch" des HC110-R aufweist.

Zelluläre Lokalisation

Transiente Transfektionsexperimente mit einem HC110-R-GFP-Fusionsprotein wurden in verschiedenen Säugerzelllinien durchgeführt, so zum Beispiel COS-7- Zellen oder HEK-293-Zellen. Die heterologe Expression wurde gewählt, da bislang noch keine Zelllinien aus H. contortus etabliert wurden.

Zur Proteinlokalisation in lebenden Zellen läßt sich das grün-fluoreszierende Protein (Green Fluorescent Protein, GFP) aus der pazifischen Qualle Aequorea victoria ver wenden. Auf zellulärer Ebene dient GFP als ein in vivo Reporter, um die Frequenz einer transienten oder stabilen Transfektion aufzuzeigen und auf subzellulärer Ebene zur Lokalisation von Proteinen. Wildtyp-GFP ist ein 27 kD-Monomer aus 238 Aminosäuren, das nach Anregung mit UV-Licht (360-400 nm; Max. bei 395 nm) oder blauem Licht (440-480 nm; Max. bei 475 nm) grünes Licht mit einem Maximum von 509 nm emittiert, ohne dazu exogene Substrate oder Kofaktoren zu benötigen (Chalfie et al. 1994). GFP läßt sich somit direkt durch Fluoreszenz mikroskopie in vivo nachweisen und sein Fluoreszenzverhalten bleibt auch als Teil eines Fusionsproteins im wesentlichen unverändert. EGFP ("enhanced" GFP) stellt eine genetische Variante des Wildtyp-GFP dar und wird zur Transfektion von Säugerzellen eingesetzt (Yang et al. 1996). Das Anregungsmaximum von EGFP wurde durch Substitution von Ser⁶⁵ durch Thr auf nur einen Peak bei 490 nm ver schoben. Die Vektoren pEGFP-C1 (GenBank Accession Nr.: U55763) und pEGFP- N3 (GenBank Accession Nr.: U55762) [Clontech, Palo Alto, CA, U.S.A.] exprimieren EGFP unter der Kontrolle des starken konstitutiven CMV-Promotors und können zur Fusion von anderen Proteinen an den N- bzw. C-Terminus von EGFP verwendet werden.

Stabile Zelllinien bieten gegenüber einer transienten Expression den Vorteil, daß jede Zelle das gewünschte Protein dauerhaft exprimiert und eine Isolation des Proteins nach der Lokalisation möglich wird. Um das Protein Fluoreszenz-mikroskopisch oder mit Hilfe eines Western Blots nachzuweisen, wird ein Antikörper gegen das gewünschte Protein benötigt, oder es bietet sich an, einen Expressionsvektor zu wählen, der beispielsweise ein Myc- oder His-Tag C-terminal mit dem eigentlichen Protein im richtigen Leseraster fusioniert, gegen die es dann käufliche, meist sogar monoklonale Antikörper gibt.

Wirkung von alpha-Latrotoxin auf das HC110-R Protein

Zur weiteren Substantiierung der Ähnlichkeit zwischen HC110-R und Latrophilin sowie zur Überprüfung der Funktionalität des rekombinant exprimierten HC110-R wurden HEK-293-Zellen transient und stabil mit HC110-R-GFP-Fusionsprotein transfiziert und mit alpha-Latrotoxin (α-LTR) stimuliert.

Alpha-Latrotoxin ist ein präsynaptisches Neurotoxin, das aus dem Gift der Schwarzen Witwe (Latrodectus mactans) gewonnen werden kann. Es ist bekannt für seine Toxizität für das zentrale Nervensystem von Vertebraten, wo es durch die Er höhung der [Ca²⁺]_i und die Stimulation der unkontrollierten Exozytose von Neuro transmittern die Depolarisation von Neuronen auslöst. So ist auch bekannt geworden, dass die Wirkung des α-Latrotoxins zumindest teilweise durch Latrophilin vermittelt wird. Dabei wird angenommen, dass die Toxizität des α-Latrotoxins auf dessen Fähigkeit beruht, mit Rezeptoren, die mit GTP-bindenden Protein gekoppelt sind (GPCR), zu interagieren. Diese Rezeptoren vermitteln normalerweise die Wirkung endogener Hormone oder Neuropeptide (Holz und Habener 1998).

In der vorliegenden Erfindung wurde die sogenannte "Ca²⁺-Imaging"-Technik ver wendet, um die Reaktion transfizierter HEK-293-Zellen auf α-LTX zu testen, indem die Änderung des intrazellulär vorliegenden Ca²⁺ [Ca²⁺]_i bestimmt wird.

α-LTX verursacht einen biphasischen Anstieg von [Ca²⁺]_i. Bei einer Konzentration von 75 nM induziert α-LTX zunächst einen sehr kleinen Anstieg von nur 5 ± 0,2 nM 2 Minuten nach α-LTX-Zugabe und einen stärkeren, verzögerten Anstieg von etwa 220 ± 14,9 nM Ca²⁺ nach 22 Minuten. Mit zunehmender Konzentration von α-LTX (7,5 nM-120 nM) wird der erste Anstieg größer, während sich der zweite Anstieg verringert. Bei einer Konzentration von 120 nM α-LTX erreicht der erste An stieg Werte von etwa 135 ± 13,6 nM Ca²⁺, während der zweite Anstieg sich auf einen Wert von 50 ± 7,1 nM Ca²⁺ absenkt. Der gleiche Verlauf bei Einsatz von 90 nM und 120 nM α-LTX deutet auf eine Sättigung hin.

Transfiziert man HEK-293-Zellen mit einem N-terminalen GFP-getaggtem HC110- R-Konstrukt und stimuliert sie mit 75 nM α-LTX kommt es zu einem geringfügig re duzierten 2. Peak. Schließlich wurde auch dann eine nur geringfügig verminderte Reaktion auf α-LTX hin festgestellt, wenn das HC110-R Protein mit einem N-ter minalen GFP-Tag versehen wurde. Daher kann davon ausgegangen werden, daß das Anhängen eines GFP-Tags N- oder C-terminal keinen wesentlichen Einfluß auf die α-LTX-Bindung und die nachstehende Signaltransduktion durch HC110-R hat.

Zellen, die nicht oder nur mit GFP transient transfiziert worden waren, zeigen keine Reaktion auf α-LTX. Werden HEK-293-Zellen transient mit anderen C-terminal GFP-getaggten G-Protein gekoppelten Rezeptoren transfiziert, z. B. dem β₂- adrenergen Rezeptor der Maus, oder dem humanen muscarinergen H1 Acetylcholin- Rezeptor, verursacht α-LTX in einer Konzentration von 75 nM nur einen geringen (von etwa 40 ± 10,4 nM nach etwa 20 Minuten) bis keinen Anstieg der [Ca²⁺]_i.

Der durch α-LTX bedingte Anstieg der [Ca²⁺]_i kann sowohl den Einstrom von extrazellulärem Ca²⁺ als auch den Ausstrom von intrazellulärem Ca²⁺ nach sich ziehen. Wird extrazelluläres Ca²⁺ vor oder nach der Zugabe von α-LTX mit 2 mM EGTA entfernt, zeigt sich nur ein kleiner Anstieg der [Ca²⁺]_i von HEK-293-Zellen, die das HC110-R-GFP-Fusionsprotein exprimieren. Daraus wird ersichtlich, dass α- LTX in erster Linie den Einstrom von extrazellulärem Ca²⁺ verursacht. Dieser Ca²⁺- Einstrom basiert nicht auf einfacher Diffusion, sondern geht mit Hilfe von Ca²⁺- Kanälen in der Plasmamembran vonstatten.

Bei einem Großteil der Ca²⁺-Kanäle, die am Ca²⁺-Einstrom beteiligt sind, handelt es sich um solche des L-Typs, da 15 µM Nifedipin bereits ausreichen, den durch α-LTX induzierten Anstieg von [Ca²⁺]_i signifikant zu unterdrücken. Dabei wird der erste An stieg vollständig inhibiert, der zweite Anstieg sinkt von 267 ± 12,7 nM auf 30 ± 5,4 nM ab.

Auch die den C-terminal Myc/His-getaggten HC110-R Rezeptor exprimierende stabile bzw. transiente HEK-293-Zelllinie reagiert dosisabhängig auf α-LTX. 7,5 nM α-LTX sind auch hier noch zu gering, um einen α-LTX-induzierten Ca²⁺-Einstrom zu erzeugen. Aber bereits 25 nM α-LTX sind ausreichend, um eine Erhöhung der [Ca²⁺]_i von 130 ± 38,0 nM bereits nach 2 min zu erzeugen. Bei Zugabe von 75 nM α- LTX kommt es zu einem Ca²⁺-Einstrom von 296 ± 91,5 nM, der ebenfalls 2 min nach α-LTX-Gabe stark zunimmt und erst nach 27 min wieder seinen ursprünglichen Ca²⁺-Gehalt erreicht. Dieses Ca²⁺-Signal gleicht dem zweiten verzögerten Ca²⁺-Peak HC110-R-GFP transfizierter HEK-293-Zellen bei gleicher α-LTX Konzentration (75 nM) in der Höhe des Signals und in seinem Verlauf, die Antwort erfolgt nur - wie auch bei höheren Konzentrationen (90 nM und 120 nM) HC110-R-GFP transfizierter Zellen - unmittelbar nach α-LTX-Zugabe.

Gegenstand der Erfindung ist deshalb ebenfalls die Verwendung von α-LTX als Agonist von Transmembranrezeptoren der Sekretin-Familie aus Nematoden. Bevor zugt wird α-LTX als Agonist des HC110-R Rezeptors gemäß SEQ ID NO. 2 ver wendet sowie von dazu zu 70%, bevorzugt zu 80%, besonders bevorzugt zu 90% und ganz besonders bevorzugt zu 95% homologer Rezeptorproteine.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ebenfalls die Verwendung von α-LTX als Nematizid.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ebenfalls die Verwendung von α-LTX in einem Verfahren zum Identifizieren von nematizid oder arthropodizid wirksamen Verbindungen, wobei die Verbindungen als Agonisten oder Antagonisten der Trans membranrezeptoren wirksam sein können.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ebenfalls die Verwendung von α-LTX in einem Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen, die Calcium-Kanäle blockieren.

Einfluss von BAY44-4400 auf die Wirkung von α-LTX

PF1022A übt seine Wirkung auf Nematoden in Abhängigkeit von der jeweiligen Spezies bei Konzentrationen im Bereich von 100-800 ng/ml aus (Terada, 1992). Um jeweils eine mögliche Wechselwirkung zwischen PF1022A mit HC110-R und der durch HC110-R vermittelten Signalübertragung zu untersuchen, wurde in den folgenden Ca²⁺-Imaging Experimenten in mit FURA-2 beladenen und mit HC110-R- GFP transfizierten HEK-293-Zellen das BAY44-4400 verwendet, das ein leichter lösliches Derivat von PF1022A ist.

Bei einer Konzentration von 400 ng/ml rufen weder das sehr effektive Nematizid BAY44-4400 noch die nahezu ineffektive Antipode PF1022-001 eine Ca²⁺-Antwort in HC110-R-GFP transfizierten HEK-293-Zellen hervor, selbst wenn die Zellen für 90 Minuten mit dem Wirkstoff vorinkubiert worden waren. Im Gegensatz dazu beeinflussen beide Substanzen die durch α-LTX bedingte Signalübertragung, wenn auch in verschiedenem Ausmaß. Bei Anwesenheit von 4 ng/ml BAY44-4400 ruft α- LTX einen nur geringen Ca²⁺-Anstieg mit einem Maximum von 44 ± 6,0 nM Ca²⁺ nach 14 Minuten hervor. Bei Anwesenheit von PF1022-001 verursacht α-LTX jedoch einen größeren Anstieg von 103 ± 11,5 nM Ca²⁺ nach 6 Minuten (Abb. 10B). In einem anderen Ansatz wurden die Zellen entweder mit 4 ng/ml oder 400 ng/ml BAY44-4400 und PF1022A für 90 Minuten vorinkubiert, die Wirkstoffe dann entfernt bevor die Zellen mit α-LTX stimuliert wurden. HEK-293-Zellen, die mit PF1022A vorinkubiert worden waren, zeigten keine signifikante Änderung in ihrer Reaktion auf α-LTX. Nur BAY44-4400 beeinflusste die Empfindlichkeit der Zellen gegenüber α-LTX. Bei einer Konzentration von BAY44-4400 von 4 ng/ml induzierte α-LTX einen Ca²⁺-Anstieg (95 ± 20,5 nM Ca²⁺), 19 Minuten bevor ein stabiles Ca²⁺- Niveau erreicht wurde. Bei 400 ng/ml BAY44-4400 verursachte α-LTX nur einen Anstieg der Ca²⁺-Konzentration auf etwa 65 ± 7,5 nM Ca²⁺. Zusätzlich war dieser kleinere Anstieg um 12 Minuten verschoben.

Um die Spezifizität dieser Ergebnisse zu untermauern, wurde weiterhin der Effekt von 1 mM Carbachol auf das endogene, natürliche M1-R in nicht transfizierten HEK- 293-Zellen gemessen. Die Anwesenheit von 400 ng/ml BAY44-4400 veränderte die Antwort der Zellen nicht. Auch die durch Isoproterenol und Arecolin induzierte Stimulation des endogenen, natürlichen β₂-R oder des nikotinischen cholinergen Rezeptors in HEK-293-Zellen wurde durch BAY44-4400 in keiner Weise beein flusst.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde schließlich durch Ca²⁺-Imaging der Einfluss von BAY44-4400, einer besser löslichen Variante von PF1022A, auf das HC110-R-Protein in HEK-293-Zellen untersucht, die transient oder stabil ein C-ter minal mit GFP versehenes HC110-R-Protein exprimieren. Bei einer Inkubation von HEK-293-Zellen mit nur 400 ng/ml BAY44-4400 reagieren die Zellen für 50 Minuten in keiner vergleichbaren Weise mit einer Änderung der intrazellulären Ca²⁺- Konzentration. Allerdings kann ein Einfluss des BAY44-4400 bei Anwesenheit des α-LTX festgestellt werden. Inkubiert man Zellen 6 Minuten vor der Zugabe von 75 nM α-LTX mit BAY44-4400, vernngert sich der Einfluss des α-LTX auf die Ca²⁺- Konzentration. Der erste kleine Anstieg der [Ca²⁺]_i verschwindet und der zweite wird 15 Minuten nach der Zugabe von α-LTX um 85% reduziert. Die Reaktion auf α- LTX verstärkt sich noch mehr, wenn die Zellen für 60 Minuten mit BAY44-4400 vorinkubiert werden, bevor die Zellen für 30 Minuten mit FURA versetzt werden. Es ergibt sich ein völliges Verschwinden des ersten Ca²⁺-Anstiegs sowie ein nur sehr geringer zweiter Anstieg von 70 nM [Ca²⁺]_i 30 Minuten nach Zugabe von 75 nM α- LTX.

Um den spezifischen Einfluss von BAY44-4400 auf die Wirkung von α-LTX zu zei gen, wurden zwei Kontrollexperimente durchgeführt. Zunächst wurden HEK-293- Zellen transient oder stabil mit einem C-terminal mit einem GFP-Tag versehenen β₂- adrenergen Rezeptor aus der Maus transfiziert und Isoproterenol als Ligand verwendet.

Tatsächlich verursacht Isoproterenol auch eine signifikante Ca²⁺-Antwort: direkt nach der Zugabe von Isoproterenol ergibt sich nur ein Ca²⁺-Anstieg. Dieser Anstieg wird jedoch nicht durch BAY44-4400 beeinflusst.

Weiterhin wird die Spezifität der Wechselwirkung zwischen BAY44-4400 mit HC110-R mit Hilfe des optischen Antipoden gezeigt, die die Stelle des BAY44-4400 als Ligand einnehmen. Nach Vorinkubation der Zellen mit 400 ng/ml eines anthelmintisch 100fach schwächer wirksamen Derivates von PF1022A des PF1022- 001: cyclo(-L-Lac-D-MeLeu-L-PhLac-D-Me-Leu-)₂ (auch als optischer Antipode be zeichnet) für 90 Minuten ergibt sich nur ein Ca²⁺-Anstieg von 110 nM 6 Minuten nach Zugabe von 75 nM α-LTX, also eine Verringerung um 59%. Wenn 4 ng/ml des optischen Antipode 6 Minuten vor der Zugabe von 75 nM α-LTX zugegeben werden, ergibt sich ein Anstieg von 67 nM [Ca²⁺]_i direkt nach der Zugabe des α- LTX. Mit zunehmender Konzentration des optischen Antipode verringert sich der Anstieg auf 20 nM Ca²⁺.

Der Ausdruck "Polypeptide", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich sowohl auf kurze Aminosäureketten, die gewöhnlich als Peptide, Oligopeptide oder Oligomere bezeichnet werden, als auch auf längere Aminosäureketten, die gewöhnlich als Prote ine bezeichnet werden. Er umfasst Aminosäureketten, die entweder durch natürliche Prozesse, wie posttranslationale Prozessierung, oder durch chemische Verfahren, die Stand der Technik sind, modifiziert sein können. Solche Modifikationen können an verschiedenen Stellen und mehrfach in einem Polypeptid vorkommen, wie beispiels weise an dem Peptid-Rückgrat, an der Aminosäure-Seitenkette, am Amino- und/oder am Carboxy-Terminus. Sie umfassen beispielsweise Acetylierungen, Acylierungen, ADP-Ribosylierungen, Amidierungen, kovalente Verknüpfungen mit Flavinen, Häm- Anteilen, Nukleotiden oder Nukleotid-Derivaten, Lipiden oder Lipid-Derivaten oder Phophatidylinositol, Cyclisierungen, Disulfidbrückenbildungen, Demethylierungen, Cystin-Bildungen, Formylierungen, gamma-Carboxylierungen, Glycosylierungen, Hydroxylierungen, Iodierungen, Methylierungen, Myristoylierungen, Oxidationen, proteolytische Prozessierungen, Phosphorylierungen, Selenoylierungen und tRNA- vermittelte Additionen von Aminosäuren.

Die Polypeptide können erfindungsgemäß in der Form "reifer" Proteine oder als Teile größerer Proteine, z. B. als Fusionsproteine verwendet werden. Weiterhin kön nen sie Sezernierungs- oder "Leader"-Sequenzen, Pro-Sequenzen, Sequenzen, die eine einfache Reinigung ermöglichen, wie mehrfache Histidin-Reste, oder zusätz liche stabilisierende Aminosäuren aufweisen.

Als homologe Proteine oder Polypeptide werden solche Proteine oder Polypeptide betrachtet, die eine zumindest 70%ige Identität, vorzugsweise 80%ige Identität, be sonders bevorzugt 90%ige Identität, ganz besonders bevorzugt 95%ige Identität, mit einer Sequenz gemäß SEQ ID NO. 2 des Dokuments DE-A-197 04 024, dessen In halt ausdrücklich Teil der vorliegenden Anmeldung sein soll, über eine Länge von wenigstens 20, vorzugsweise wenigstens 25, besonders bevorzugt wenigstens 30 fort laufenden Aminosäuren und ganz besonders bevorzugt über deren Gesamtlängen auf weisen.

Die Polypeptide müssen für ihre erfindungsgemäße Verwendung nicht vollständige Rezeptoren darstellen, sondern können auch nur Fragmente davon sein, solange sie zumindest noch eine biologische Aktivität der vollständigen Rezeptoren aufweisen. Dabei müssen die Polypeptide nicht von Transmembranrezeptoren aus H. contortus ableitbar sein. Als erfindungsgemäß werden auch Polypeptide betrachtet, die Trans membranrezeptoren von anderen Helminthen- oder auch Arthropodenspezies ent sprechen oder Fragmenten davon, die noch die biologische Aktivität dieser Rezeptoren ausüben können.

Die Polypeptide können für ihre erfindungsgemäße Verwendung im Vergleich zu der entsprechenden Region natürlich vorkommender GPCR-Rezeptoren Deletionen oder Aminosäuresubstitutionen aufweisen, solange sie zumindest noch eine biologische Aktivität der vollständigen Rezeptoren ausüben. Konservative Substitutionen sind bevorzugt. Solche konservativen Substitutionen umfassen Variationen, wobei eine Aminosäure durch eine andere Aminosäure aus der folgenden Gruppe ersetzt wird:

1. Kleine aliphatische, nicht-polare oder wenig polare Reste: Ala, Ser, Thr, Pro und Gly;
2. Polare, negativ geladene Reste und deren Amide: Asp, Asn, Glu und Gln;
3. Polare, positiv geladene Reste: His, Arg und Lys;
4. Große aliphatische, nicht-polare Reste: Met, Leu, Ile, Val und Cys; und
5. Aromatische Reste: Phe, Tyr und Trp.

Die folgende Liste zeigt bevorzugte konservative Substitutionen:

Die vorstehend und in DE-A-197 04 024 unter SEQ ID NO. 1 und SEQ ID NO. 3 be schriebenen Sequenzen können außerdem zum Auffinden von Genen verwendet werden, die für Polypeptide kodieren, welche am Aufbau von funktionell ähnlichen Transmembranrezeptoren in Helminthen oder Arthropoden beteiligt sind. Unter funktionell ähnlichen Rezeptoren werden gemäß der vorliegenden Erfindung Rezep toren verstanden, die Polypeptide umfassen, welche sich zwar hinsichtlich der Aminosäuresequenz von den hierin beschriebenen Polypeptiden unterscheiden, aber im wesentlichen dieselbe biologische Funktion haben.

Der Ausdruck "im wesentlichen dieselbe biologische Funktion", wie er hierin ver wendet wird, bedeutet eine Beteiligung am Aufbau von funktionsfähigen G-Protein gekoppelten heptahelikalen Transmembranrezeptorenrezeptoren, besonders solcher Rezeptoren der Sekretin-Subfamilie, bzw. eine dem HC110-R Rezeptor aus H. contortus entsprechende Funktion. Eine solche Funktion beinhaltet auch die vor stehend beschriebenen Eigenschaften des Rezeptors, wie der Sensitivität gegenüber α-LTX als Agonisten oder Nifedipin als Antagonisten des α-LTX.

Der Ausdruck "hybridisieren", wie er hierin verwendet wird, beschreibt den Vor gang, bei welchem ein einzelsträngiges Nukleinsäuremolekül mit einem komplemen tären Strang eine Basenpaarung eingeht. Auf diese Weise können ausgehend von der hierin offenbarten Sequenzinformation beispielsweise DNA-Fragmente aus anderen Nematoden als H. contortus sowie aus Arthropoden isoliert werden, welche für Polypeptide mit der biologischen Aktivität von GPCR-Rezeptoren codieren.

In Hinblick auf eine geeignete Sonde werden die aminoterminalen und carboxyter minalen cDNA-Abschnitte bevorzugt. Die Hybridisierungsbedingungen werden so gewählt, dass auch weniger ähnliche Sequenzen aus anderen Organismen detektier bar sind. Die Hybridisierungsbedingungen unter erniedrigter Stringenz können bei spielsweise wie folgt aussehen: In 6×SSC/0% Formamid als Hybridisierungslösung wird zwischen 40-55°C hybridisiert. Die Bedingungen des spezifischen 2. Wasch schritts müssen ausgetestet werden, z. B. initial 2×SSC bei 50°C, dann Abschätzung der Signalintensitäten. Daraufhin folgt die Modifikation der Waschbedingungen.

Bevorzugte Hybridisierungsbedingungen sind nachstehend angegeben:
Hybridisierungslösung: 6×SSC/0% Formamid, bevorzugte Hybridisierungslösung: 6×SSC/25% Formamid
Hybridisierungstemperatur: 34°C, bevorzugte Hybridisierungstemperatur: 42°C

1. Waschschritt: 2×SSC bei 40°C,
2. Waschschritt: 2×SSC bei 45°C; bevorzugter 2. Waschschritt: 0,6×SSC bei 55°C; besonders bevorzugter 2. Waschschritt: 0,3×SSC bei 65°C.

Hybridisierungsbedingungen werden nach folgender Formel näherungsweise be rechnet:
Die Schmelztemperatur Tm = 81.5°C + 16.6 log{c(Na⁺)] + 0.41 (%G + C)) - 500/n (Lottspeich und Zorbas 1998).

Dabei ist c die Konzentration und n die Länge des hybridisierenden Sequenzab schnitts in Basenpaaren. Für eine Sequenz < 100 bp entfällt der Ausdruck 500/n. Mit höchster Stringenz wird bei einer Temperatur 5-15°C unterhalb Tm und einer Ionen stärke von 15 mM Na⁺ (entspricht 0.1×SSC) gewaschen. Wird eine RNA-Probe zur Hybridisierung verwendet, so ist der Schmelzpunkt um 10-15°C höher.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren zum Identifizieren von nematizid und arthro podizid wirksamen Verbindungen verwendeten Polypeptide werden von der in DE-A-197 04 024 unter SEQ ID NO. 1 und SEQ ID NO. 3 beschriebenen Nukleinsäuren kodiert.

Weiterhin werden zur erfindungsgemäßen Verwendung solche Nukleinsäuren erfasst, die eine zumindest 70%ige Identität, vorzugsweise 80%ige Identität, besonders be vorzugt 90%ige Identität, ganz besonders bevorzugt 95%ige Identität mit einer Sequenz gemäß SEQ ID NO. 1 oder SEQ ID NO. 3 über eine Länge von wenigstens 20, vorzugsweise wenigstens 100, besonders bevorzugt wenigstens 500 fortlaufenden Nukleotiden und ganz besonders bevorzugt über deren Gesamtlänge aufweisen.

Die erfindungsgemäße Nukleinsäure kann ebenfalls zur Herstellung transgener In vertebraten verwendet werden. Diese können in Testsysteme eingesetzt werden, die auf einer vom Wildtyp abweichenden Expression der erfindungsgemäßen Rezeptoren oder Varianten hiervon basieren. Ferner fallen hierunter sämtliche transgenen Invertebraten, bei denen durch die Modifikation anderer Gene oder Genkontrollsequenzen (Promo toren) eine Veränderung der Expression der erfindungsgemäßen Rezeptoren oder deren Varianten eintritt.

Die Herstellung der transgenen Invertebraten erfolgt beispielsweise in Drosophila melanogaster durch P-Element-vermittelten Gentransfer oder in Caenorhabditis elegans durch Transposon-vermittelten Gentransfer (z. B. durch Tc1, Plasterk 1996).

Gegenstand der Erfindung sind somit auch transgene Invertebraten, die zumindest eine der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren enthalten, vorzugsweise transgene Invertebraten der Arten Drosophila melanogaster oder Caenorhabditis elegans, sowie deren trans gene Nachkommen. Vorzugsweise enthalten die transgenen Invertebraten die er findungsgemäßen Rezeptoren in einer vom Wildtyp abweichenden Form.

Die erfindungsgemäße Nukleinsäure kann auf die übliche Weise hergestellt werden. Beispielsweise kann das Nukleinsäuremolekül vollständig chemisch synthetisiert werden. Man kann auch nur kurze Stücke der erfindungsgemäßen Sequenz chemisch synthetisieren und solche Oligonukleotide radioaktiv oder mit einem Fluoreszenz farbstoff markieren. Die markierten Oligonukleotide können verwendet werden, um ausgehend von Nematoden-mRNA oder Insekten-mRNA hergestellte cDNA-Banken zu durchsuchen. Klone, an die die markierten Oligonukleotide hybridisieren, werden zur Isolierung der betreffenden DNA ausgewählt. Nach der Charakterisierung der isolierten DNA erhält man auf einfache Weise die erfindungsgemäße Nukleinsäure.

Die erfindungsgemäße Nukleinsäure kann auch mittels PCR-Verfahren unter Ver wendung chemisch synthetisierter Oligonukleotide hergestellt werden.

Der Ausdruck "Oligonukleotid(e)", wie er hierin verwendet wird, bedeutet DNA- Moleküle, die aus 10 bis 50 Nukleotiden, vorzugsweise 15 bis 30 Nukleotiden, be stehen. Sie werden chemisch synthetisiert und können als Sonden verwendet werden.

Die erfindungsgemäße Nukleinsäure kann zur Isolierung und Charakterisierung der regulatorischen Regionen, die natürlicherweise benachbart zu der kodierenden Region vorkommen, verwendet werden. Solche regulatorischen Regionen sind somit ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

In den erfindungsgemäßen Verfahren kommen ebenfalls Vektoren zum Einsatz, die eine erfindungsgemäß zu verwendende Nukleinsäure oder ein erfindungsgemäß zu verwendendes DNA-Konstrukt enthalten. Als Vektoren können alle in molekularbio logischen Laboratorien verwendete Phagen, Plasmide, Phagmide, Phasmide, Cosmide, YACs, BACs, künstliche Chromosomen oder Partikel, die für einen Partikelbeschuss geeignet sind, verwendet werden.

Bevorzugte Vektoren sind pBIN und seine Derivate für pflanzliche Zellen, pFL61 für Hefezellen, pBLUESCRIPT-Vektoren für bakterielle Zellen, lamdaZAP (Fa. Stratagene) für Phagen.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurden verschiedene Vektoren verwendet und mehrere Konstrukte erstellt. Die Vektoren, die zur transienten bzw. stabilen Transformation von Zelllinien und zur stabilen Expression des HC110-R Rezeptors verwendet wurden, sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Zur transienten Expression in eukaryotischen Zellen wurden EGFP-Konstrukte her gestellt, die zur Expression von Fusionsproteinen mit einem N-terminalen EGFP-Tag (EGFP-HC110-R) oder einem C-terminalen EGFP-Tag (HC110-R-EGFP) führen. Die von diesen Vektoren und den herkömmlichen GFP-Vektoren sowie Rotshift- und Blaushift-Varianten kodierten Polypeptide sind ebenfalls Gegenstand der vor liegenden Erfindung.

Für die stabile Expression wurde ein weiteres Konstrukt, der Vektor pMyc6xHis, verwendet, der ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist. Der Vektor pMyc6xHis leitet sich von dem Vektor pSecTagA [Invitrogen, Leek, NL] durch Dop pelverdau mit den Restriktionsenzymen NhiI und SfiI, gefolgt von "blunting" der Enden und Religation des Vektors ab.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Wirtszellen, die eine erfindungs gemäß zu verwendende Nukleinsäure oder einen erfindungsgemäß zu verwendenden Vektor enthalten. Insbesondere ist die stabil transformierte Zelllinie HEK-293 mit HC110-R-Myc/His Gegenstand dieser Erfindung, die unter der Nummer DSM ACC2464 bei der internationalen Hinterlegungsstelle DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b in 38124 Braunschweig hinterlegt wurde.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ebenfalls Wirtszellen, die eine er findungsgemäß zu verwendende Nukleinsäure oder einen erfindungsgemäß zu ver wendenden Vektor enthalten, sowie einen Vektor, der die Zellen zur Expression von Aequorin befähigt, einem Lumineszenz-Protein, das in Gegenwart von Ca²⁺-Licht emittiert. Durch entsprechende Wirtszellen wird es möglich gemacht, die Ver änderung der Ca²⁺-Konzentration und damit die Wirkung von Substanzen z. B. auf HC110-R mit Hilfe des Indikators Aequorin zu verfolgen. Insbesondere ist die zur Expression von Aequorin befähigte, stabil transformierte Zelllinie HEK-293 mit HC110-R-Myc/His Gegenstand der Erfindung, die unter der Nummer DSM ACC2465 bei der internationalen Hinterlegungsstelle DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b in 38124 Braunschweig hinterlegt wurde.

Der Ausdruck "Wirtszelle", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf Zellen, die natürlicherweise die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren nicht enthalten.

Als Wirtszellen eignen sich vorzugsweise eukaryotische Zellen, wie Hefen, Säuger-, Amphibien-, Insekten- oder Pflanzenzellen. Bevorzugte eukaryotische Wirtszellen sind HEK-293-, Schneider S2-, Spodoptera Sf9-, Kc-, CHO-, HepG-2-, Kl-, COS-1-, COS-7-, HeLa-, C127-, 3T3- oder BHK-Zellen und insbesondere Xenopus-Oocyten, ganz besonders eigenen sich HEK-293- oder COS-7-Zellen.

Gegenstand dieser Erfindung ist ebenfalls die Verwendung von DNA entsprechend der in Anmeldung DE-A-197 04 024 beschriebenen Sequenz ID No. 2 zur Detektion von DNA aus Helminthen, bevorzugt aus dem Stamm Nematoda, besonders bevor zugt aus der Familie Trichostrongylidae, ganz besonders bevorzugt der Gattung Haemonchus und am meisten bevorzugt der Art Haemonchus contortus.

Die Erfindung bezieht sich dabei auf Oligonukleotide die einer Region der oben be schriebenen DNA-Sequenz oder deren komplementärem Strang entsprechen und an diese hybridisieren können. Die Erfindung bezieht sich auf die Verwendung dieser Oligonukleotide oder Teilen davon als

a) Proben in Northern- oder Southern-Blot-Assays,
b) PCR-Primer in einem diagnostischen Verfahren zur Detektion der oben ge nannten Nematoden, wobei die DNA der betreffenden Helminthen spezifisch mit Hilfe der Primer und der PCR-Technik amplifiziert und dann identifiziert wird.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Detektion von Helminthen, be vorzugt aus dem Stamm Nematoda, besonders bevorzugt aus der Familie Tri chostrongylidae, ganz besonders bevorzugt der Gattung Haemonchus und am meisten bevorzugt der Art Haemonchus contortus, wobei Oligonukleotide wie oben beschrieben zu DNA-Sequenzen spezifisch hybridisieren, die aus den genannten Organismen stammen, und die dann mit Hilfe der PCR-Technik amplifiziert werden.

Die Detektion von Organismen wie obengenannt kann z. B. erfolgen, indem man

a) eine Oligonukleotidprobe bzw. Primer zur Verfügung stellt, die an die oben genannte für HC110-R kodierende DNA oder dazu komplementäre Stränge hydridisieren oder an die 5'- oder 3'-flankierenden Regionen derselben,
b) die Oligonukleotidprobe bzw. die Primer mit einer entsprechend aufbe reiteten, DNA enthaltenden Probe in Kontakt bringt,
c) die Hybridisierung des Oligonukleotids bzw. Primers detektiert (z. B. mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion),
d) die detektierte Sequenz des HC110-R-Gens sequenziert, und
e) die Sequenz mit den erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen vergleicht, die oben beschrieben wurden, bevorzugt mit der in Anmeldung DE-A-197 04 024 beschriebenen Sequenz ID No. 2.

Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls ein diagnostischer Testkit zur Detektion von von Helminthen, bevorzugt aus dem Stamm Nematoda, besonders bevorzugt aus der Familie Trichostrongylidae, ganz besonders bevorzugt der Gattung Haemonchus und am meisten bevorzugt der Art Haemonchus contortus, die unter anderem Oligo nukleotide wie oben beschrieben zur Verfügung stellt, die in Verfahren zur Detektion von Spezies aus den genannten systematischen Gruppen verwendet werden können.

Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls ein diagnostischer Testkit wie vorstehend be schrieben, wobei die in diesem Kit zur Verfügung gestellten Oligonukleotide mit einem detektierbaren Marker versehen sind. Solche detektierbaren Marker können u. a. Enzyme beinhalten, Enzym-Substrate, Coenzyme, Enzyminhibitoren, Fluores zenzmarker, Chromophore, lumineszente Marker und Radioisotope.

Gegenstand dieser Erfindung ist auch die Verwendung der vorstehend genannten HC110-R-Polypeptide oder Fragmente davon sowie von dazu zu 70%, bevorzugt zu 80%, besonders bevorzugt zu 90% und besonders bevorzugt zu 95% homologer Rezeptorproteine aus Helminthen, bevorzugt aus dem Stamm Nematoda, besonders bevorzugt aus der Familie Trichostrongylidae, ganz besonders bevorzugt der Gattung Haemonchus und am meisten bevorzugt der Art Haemonchus contortus zur Her stellung von Vakzinen, die mindestens ein HC110-R-Polypeptid oder Fragment oder ein dazu zu 70%, bevorzugt zu 80%, besonders bevorzugt zu 90% und besonders bevorzugt zu 95% homologes Rezeptorprotein davon enthalten. Das Vakzin ist dabei in der Lage eine Immunantwort hervorzurufen, die spezifisch ist für ein vorstehend beschriebenes HC110-R Protein.

In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das Vakzin eine antigene Deter minante, z. B. eine einzelne Determinante eines Polypeptids mit einer Aminosäure sequenz gemäß der in Anmeldung DE-A-197 04 024 beschriebenen Sequenz ID No. 2 oder eines Polypeptids, das von der vorstehend genannten DNA oder Fragmenten davon kodiert wird.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind weiterhin Verfahren zum Herstellen der erfindungsgemäß zu verwendenden Polypeptide. Zur Herstellung der Polypeptide, die von den bekannten Nukleinsäuren codiert werden, können Wirtszellen, die diese Nukleinsäuren enthalten, unter geeigneten Bedingungen kultiviert werden. Die ge wünschten Polypeptide können danach auf übliche Weise aus den Zellen oder dem Kulturmedium isoliert werden. Die Polypeptide können auch in in vitro-Systemen hergestellt werden.

Ein schnelles Verfahren zum Isolieren der erfindungsgemäßen Polypeptide, die von Wirtszellen unter Verwendung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure synthetisiert werden, beginnt zum Beispiel, wie in den Beispielen beschrieben, mit der Expression eines Fusionsproteins, wobei der Fusionspartner auf einfache Weise affinitätsgereinigt werden kann. Der Fusionspartner kann beispielsweise Glutathion S-Transferase sein. Das Fusionsprotein kann dann an einer Glutathion-Affinitätssäule gereinigt werden. Der Fusionspartner kann durch partielle proteolytische Spaltung beispielsweise an Linkem zwischen dem Fusionspartner und dem zu reinigenden erfindungsgemäßen Polypeptid abgetrennt werden. Der Linker kann so gestaltet werden, dass er Ziel- Aminosäuren, wie Arginin- und Lysin-Reste einschließt, die Stellen für eine Spaltung durch Trypsin definieren. Um solche Linker zu erzeugen, können Standard- Klonierungsverfahren unter Verwendung von Oligonukleotiden angewendet werden. Ein weiteres mögliches Verfahren basiert auf der Verwendung von Histidin-Fusions proteinen und deren Aufreinigung über Ni²⁺-Talonsäulen.

Weitere mögliche Reinigungsverfahren basieren auf präparativer Elektrophorese, FPLC, HPLC (z. B. unter Anwendung von Gelfiltrations-, Reversphasen- oder leicht hydrophoben Säulen), Gelfiltration, differentieller Präzipitation, Ionenaustausch- Chromatographie und Affinitätschromatographie.

Da rezeptorähnliche Proteinkinasen Membranproteine darstellen, werden in den Reinigungsverfahren vorzugsweise Detergenzextraktionen durchgeführt, beispielsweise unter Verwendung von Detergenzien, die die Sekundär- und Tertiärstrukturen der Polypeptide nicht oder nur wenig beeinflussen, wie nicht-ionische Detergenzien.

Die Reinigung der erfindungsgemäß zu verwendenden Polypeptide kann die Isolierung von Membranen ausgehend von Wirtszellen, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren exprimieren, umfassen. Vorzugsweise exprimieren solche Zellen die Polypeptide in einer ausreichenden Kopienanzahl, so dass die Menge der Polypeptide in einer Membranfraktion mindestens 10fach höher ist als diejenige, die in vergleichbaren Membranen von Zellen gefunden wird, die das HC110-R-Gen natürlicherweise expri mieren; besonders bevorzugt ist die Menge mindestens 100fach, ganz besonders be vorzugt mindestens 1000fach höher.

Die Ausdrücke "Isolierung oder Reinigung", wie sie hierin verwendet werden, be deuten, dass die Polypeptide von anderen Proteinen oder anderen Makromolekülen der Zelle oder des Gewebes abgetrennt werden. Vorzugsweise ist eine erfindungsge mäße, die Polypeptide enthaltende Zusammensetzung hinsichtlich des Proteingehalts gegenüber einer Präparation aus den Wirtszellen mindestens 10fach und besonders be vorzugt mindestens 100fach angereichert.

Die erfindungsgemäßen Polypeptide können auch ohne Fusionspartner mit Hilfe von Antikörpern, die an die Polypeptide binden, affinitätsgereinigt werden.

Weiterhin sind Antikörper Gegenstand der Erfindung, die spezifisch an die vorstehend genannten Polypeptide bzw. Rezeptoren binden. Die Herstellung solcher Antikörper er folgt auf die übliche Weise. Beispielsweise können solche Antikörper produziert werden durch die Injektion eines substantiell immunkompetenten Wirts mit einer für die Antikörperproduktion effektiven Menge eines erfindungsgemäßen Transmem branrezeptors wie des HC110-R Rezeptors aus H. contortus oder eines Fragments davon und durch nachfolgende Gewinnung dieses Antikörpers. Weiterhin läßt sich in an sich bekannter Weise eine immortalisierte Zellinie erhalten, die monoklonale Antikörper produziert. Die Antikörper können gegebenenfalls mit einem Nachweis reagenz markiert sein. Bevorzugte Beispiele für ein solches Nachweis-Reagenz sind Enzyme, radioaktiv markierte Elemente, fluoreszierende Chemikalien oder Biotin. Anstelle des vollständigen Antikörpers können auch Fragmente eingesetzt werden, die die gewünschten spezifischen Bindungseigenschaften besitzen.

Der Ausdruck "Agonist", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein Molekül, das Transmembranrezeptoren aktiviert.

Der Ausdruck "Antagonist", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein Mole kül, das einen Agonisten von seiner Bindungsstelle verdrängt oder die Funktion des Agonisten inhibiert.

Der Ausdruck "Modulator", wie er hierin verwendet wird, stellt den Oberbegriff zu Agonist bzw. Antagonist dar. Modulatoren können kleine organisch-chemische Moleküle, Peptide oder Antikörper sein, die an die erfindungsgemäßen Polypeptide binden. Weiterhin können Modulatoren kleine organisch-chemische Moleküle, Peptide oder Antikörper sein, die an ein Molekül binden, welches wiederum an die erfindungsgemäßen Polypeptide bindet, und dadurch deren biologische Aktivität be einflusst. Modulatoren können Mimetika von natürlichen Substraten und Liganden darstellen.

Vorzugsweise handelt es sich bei den Modulatoren um kleine organisch-chemische Verbindungen.

Die Bindung der Modulatoren an die Polypeptide kann die zellulären Vorgänge auf eine Weise verändern, die zum Absterben der damit behandelten Helminthen oder Arthropoden führt.

Daher erstreckt sich die vorliegende Erfindung auch auf die Verwendung von Modulatoren der Polypeptide als Anthelmintika und Arthropodizide.

Insbesondere ist die Verwendung des α-LTX als Anthelmintikum ebenfalls Gegen stand dieser Erfindung.

Die erfindungsgemäße Verwendung der Nukleinsäuren bzw. Polypeptide in einem er findungsgemäßen Verfahren ermöglicht auch das Auffinden von Verbindungen, die an die erfindungsgemäßen Rezeptoren binden. Diese können ebenfalls als Anthelmintika, z. B. als Nematizide bei Pflanzen oder als anthelmintische Wirkstoffe bei Tieren ange wandt werden. Beispielsweise werden Wirtszellen, die die Nukleinsäuren enthalten und die entsprechenden Rezeptoren bzw. Polypeptide exprimieren oder die Genprodukte selbst mit einer Verbindung oder einem Gemisch von Verbindungen unter Be dingungen in Kontakt gebracht, die die Wechselwirkung zumindest einer Verbindung mit den Wirtszellen, den Rezeptoren oder den einzelnen Polypeptiden erlauben.

Insbesondere ist ein Verfahren Gegenstand der vorliegenden Erfindung, dass zur Identifizierung von nematiziden Wirkstoffen geeignet ist, die an Transmembranrezep toren aus Helminthen oder Arthropoden binden, bevorzugt an GPCR der Sekretin-Sub familie, besonders bevorzugt an den Rezeptor HC110-R aus H. contortus sowie an dazu zu 70%, bevorzugt zu 80%, besonders bevorzugt zu 90% und ganz besonders bevorzugt an dazu zu 95% sequenzidentische Rezeptoren binden. Die Verfahren können jedoch auch mit einem HC110-R homologen Rezeptor aus einer anderen als der hier genannten Spezies durchgeführt werden. Verfahren, die andere als den erfin dungsgemäßen HC110-R Rezeptor verwenden, sind von der vorliegenden Erfindung voll umfasst.

Die erfindungsgemäßen Verfahren schließen Hochdurchsatz-Screening (z. B. high throughput screening; HTS) ein. Dafür können sowohl Wirtszellen als auch zellfreie Präparationen verwendet werden, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren und/oder die erfindungsgemäßen Polypeptide enthalten.

Zellfreie Testsysteme

Viele Testsysteme, die die Prüfung von Verbindungen und natürlichen Extrakten zum Ziel haben, sind auf hohe Durchsatzzahlen ausgerichtet, um die Zahl der unter suchten Substanzen in einem gegebenen Zeitraum zu maximieren. Testsysteme, die auf zelifreiem Arbeiten beruhen, brauchen gereinigtes oder semi-gereinigtes Protein. Sie sind geeignet für eine "erste" Prüfung, die in erster Linie darauf abzielt, einen möglichen Einfluß einer Substanz auf das Zielprotein zu detektieren.

Effekte wie Zelltoxizität werden in diesen in vitro Systemen in der Regel ignoriert. Die Testsysteme überprüfen dabei sowohl inhibierende bzw. suppressive Effekte der Substanzen, als auch stimulatorische Effekte. Die Effektivität einer Substanz kann durch konzentrationsabhängige Testreihen überprüft werden. Kontrollansätze ohne Testsubstanzen können zur Bewertung der Effekte herangezogen werden.

Auf Zellen basierende Testsysteme

Durch die anhand der vorliegenden Erfindung verfügbaren, stabil mit HC110-R transformierten Zelllinien, aber auch durch die anhand der vorliegenden Erfindung indentifizierbaren entsprechenden, homologen Rezeptoren aus anderen Spezies, wird die Entwicklung von Testsystemen, die auf Zellen basieren, zur Identifizierung von Substanzen ermöglicht, die die Aktivität von HC110-R und homologer Rezeptoren modulieren.

Ebenso wird durch die vorliegende Erfindung die Identifizierung von weiteren Ver bindungen ermöglicht, die als Calcium-Kanal-Blocker wirksam sind.

Um Modulatoren aufzufinden, kann ein synthetischer Reaktionsmix (z. B. Produkte der in vitro-Translation) oder ein zellulärer Bestandteil, wie eine Membran oder irgendeine andere Präparation, die das Polypeptid enthält, zusammen mit einem markierten Substrat oder Liganden der Polypeptide in Gegenwart und Abwesenheit eines Kandidatenmoleküls, das ein Agonist oder Antagonist sein kann, inkubiert werden. Die Fähigkeit des Kandidatenmoleküls, die Aktivität der erfindungsgemäßen Polypeptide zu erhöhen oder zu hemmen, wird erkennbar an einer erhöhten oder ver ringerten Bindung des markierten Liganden oder an einer erhöhten oder verringerten Umsetzung des markierten Substrates. Moleküle, die gut binden und zu einer er höhten Aktivität der erfindungsgemäßen Polypeptide führen, sind Agonisten. Mole küle, die gut binden, aber nicht die biologische Aktivität der erfindungsgemäßen Polypeptide auslösen, sind wahrscheinlich gute Antagonisten.

Scintillation Proximity Assay (SPA)

Eine Möglichkeit zur Identifizierung von Substanzen, die die Aktivtät von HC110-R bzw. dazu homologer Rezeptorproteine modulieren, ist der sogenannte "Scintillation Proximity Assay" (SPA), siehe EP 015 473. Dieses Testsystem nutzt die Interaktion eines Rezeptors (z. B. HC110-R) mit einem radiomarkierten Liganden (z. B. ein kleines organisches Molekül oder ein zweites, radioaktiv markiertes Proteinmolekül). Der Rezeptor ist dabei an kleine Kügelchen ("Microspheres") oder Perlen ("Beads") gebunden, die mit szintillierenden Molekülen versehen sind. Im Verlauf des Abfalls der Radioaktivität wird die szintillierende Substanz im Kügel chen durch die subatomaren Partikel des radioaktiven Markers angeregt und ein detektierbares Photon emittiert. Die Testbedingungen werden so optimiert, daß nur jene vom Liganden ausgehenden Partikel zu einem Signal führen, die von einem an den Rezeptor bzw. HC110-R gebundenen Liganden ausgehen.

In einer möglichen Ausführungsform ist HC110-R an die Beads gebunden, entweder zusammen oder ohne interagierende bzw. bindende Testsubstanzen. Verwendet wer den könnten dabei auch Fragmente des HC110-R Rezeptors. Ein radioaktiv mar kierter Ligand könnte z. B. markiertes α-LTX, Nifedipin oder ein markiertes Depsipeptid sein. Bei einer Bindung eines bindenden Liganden an den immobilisierte HC110-R Rezeptor, müßte dieser Ligand eine bestehende Interaktion zwischen dem immobilisiertem HC110-R und dem markierten Liganden inhibieren oder aufheben, um selbst im Bereich der Kontaktfläche zu binden. Eine erfolgte Bindung an den immobilisierten HC110-R-Rezeptor kann dann anhand eines Lichtblitzes detektiert werden. Entsprechend wird ein bestehender Komplex zwischen einem immobili sierten und einem freien, markierten Liganden durch die Bindung einer Testsubstanz zerstört, was zu einem Abfall der detektierten Lichtblitzintensität führt. Das Test system entspricht dann einem komplementären Inhibitions-System.

Two Hybrid System

Ein Beispiel für ein solches Testsystem ist das sogenannte "Two Hybrid System". Ein spezifisches Beispiel dafür ist die sogenannte "Interaction Trap", die Inter aktions-Falle. Es handelt sich dabei um eine genetische Selektion von inter agierenden Proteinen in Hefe (siehe z. B. Gyuris et al. 1993). Das Testsystem ist darauf ausgelegt, die Interaktion zweier Proteine zu detektieren und zu beschreiben, indem eine erfolgte Interaktion zu einem detektierbaren Signal führt.

Ein solches Testsystem kann auch an die Prüfung großer Zahlen von Testsubstanzen in einem gegebenen Zeitraum angepaßt werden.

Das System beruht auf der Konstruktion zweier Vektoren, dem "Bait"- und dem "Prey"-Vektor. Ein für ein erfindungsgemäßes HC110-R oder Fragmente davon kodierendes Gen wird in den Bait-Vektor kloniert und dann als Fusionsprotein mit dem LexA-Protein, einem DNA-bindenden Protein, exprimiert. Ein zweites Gen, ko dierend für ein Interaktionspartner von HC110-R, beispielsweise für ein α-LTX, wird in den Prey-Vektor kloniert, wo es als Fusionsprotein mit dem B42-Prey-Protein exprimiert wird. Beide Vektoren liegen in einem Saccharomyces cerevisiae-Wirt vor, der Kopien von LexA-bindender DNA auf der 5'-Seite eines lacZ- oder HIS3-Reportergens enthält. Findet eine Interaktion zwischen den beiden Fusions-Proteinen statt, kommt es zur Aktivierung der Transkription des Reporter gens. Führt die Anwesenheit einer Testsubstanz zur Inhibition oder zur Störung der Interaktion, können die beiden Fusions-Proteine nicht mehr interagieren und das Produkt des Reportergens wird nicht mehr hergestellt.

Verdrängungstest

Ein weiteres Beispiel für ein Verfahren, mit welchem Modulatoren der erfindungsge mäßen Polypeptide aufgefunden werden können, ist ein Verdrängungstest, bei dem man unter dafür geeigneten Bedingungen die erfindungsgemäßen Polypeptide und einen potenziellen Modulator mit einem Molekül, das bekanntermaßen an die erfin dungsgemäßen Polypeptide bindet, wie einem natürlichen Substrat oder Liganden oder einem Substrat- oder Liganden-Mimetikum zusammenbringt. Bevorzugt wird dazu in erfindungsgemäßer Weise das α-LTX verwendet.

Im Rahmen von molekularen Interaktionsstudien unter Verwendung des voll ständigen HC110-R Proteins bzw der N- und/oder C-terminalen Deletionsmutanten von HC110-R, oder auch mit durch in vitro Mutagenese bzw sonstige bekannte Methoden veränderten HC110-R-Molekülvarianten, kann ein bekanntes Analyse system eingesetzt werden, z. B. von Biacore AB, Uppsala, Schweden. Dabei kann einerseits (i) das HC110-R Protein oder Fragmente davon über bekannte chemische Methoden (Kopplung über Amine, Thiole, Aldehyde) oder Affinitätsbindung (z. B. Streptavidin-Biotin, IMAC) an einen Biochip gekoppelt oder andererseits (ii) α-LTX oder ein anderer Modulator z. B. BAY44-4400 oder andere mögliche Liganden wie unter (i) beschrieben an den Chip gekoppelt werden. Die Bindung eines in Lösung befindlichen Liganden (HC110-R Protein, bzw. ein beliebiger Modulator z. B. BAY44-4400 etc.) an die immobilisierten Moleküle ist physikalisch messbar. Bei dem Biacore Instrument wird der Ligand auf einem Sesorchip immobilisiert der eine dünne Goldschicht aufweist. Die Analytlösung wird durch eine Mikroflusszelle auf dem Chip perfundiert. Bindung des Analyten an den immobilisierten Liganden er höht die lokale Konzentration auf der Oberfläche, wobei der Brechungsindex des Mediums nahe der Goldschicht graduell erhöht wird. Dies hat einen Einfluß auf die Interaktion zwischen freien Elektronen (Plasmonen) in dem Metall und Photonen, die vom Instrument emittiert werden. Diese physikalischen Änderungen sind propor tional zur Masse und Molekülzahl auf dem Chip, die Ligand-Analyt-Bindung wird in Echtzeit registriert, wodurch Bestimmung der apparenten Assoziations-/Dissoziation rate möglich ist (Fivash et al. 1998). Durch Kompetitionsversuche wird die Spezifität der Bindung validiert.

Entsprechende Messungen dienen auch zur Bestimmung der für die Bindung von Liganden wichtigen HC110-R Proteindomänen sowie die Identifikation neuer noch nicht bekannter Liganden des HC110-R.

Calcium Imaging

Als weiteres Verfahren zur Detektion von mit dem HC110-R interagierenden Substanzen ist das Calcium Imaging oder Signaling anzusehen. Dabei kommen Calcium-Indikatoren zum Einsatz mit deren Hilfe Änderungen im intrazellulären Calciumspiegel detektierbar gemacht werden. Im Rahmen dieser Verfahren kommen HC110-R exprimierende Zellen zum Einsatz, die mit Calcium-Indikatoren beladen werden. Unter UV-Anregung kommt es dann bei einem durch einen HC110-R Agonisten hervorgerufenen Calcium-Einstrom, bzw. bei Freisetzung intrazellulären Calciums zu einer Änderung der Absorption in Abhängigkeit der Calciumbeladung des Indikators. Ein Antagonist läßt sich in einem derartigen System durch die vollständige oder teilweise Unterdrückung des von dem Agonisten (z. B. α-LTX) induzierten Cal ciumsignals erkennen. Als mögliche Calcium-Indikatoren kommen dazu das Fura-2 (Sigma) oder Indo-1 (Molecular Probes) in Betracht.

Weitere Calcium Indikatoren lassen sich durch sichtbares Licht anregen und ändern in Abhängigkeit von ihrer Calciumbeladung detektierbar ihr Fluoreszenzverhalten. Die Indikatoren Fluo-3 und Fluo-4 weisen eine hohe Calciumaffinität auf. Fluo-4 eignet sich mit seinem stärkeren Fluoreszenzsignal dabei insbesondere für Messungen bei Testsystemen, bei denen die Zellen nur in geringer Dichte eingesetzt werden, wie im Falle der HEK293-Zellen. Weitere Indikatoren sind Rhod-2, x-Rhod-1, Fluo-5N, Fluo- 5F, Mag-Fluo-4, Rhod-5F, Rhod-5N, Y-Rhod-5N, Mag-Rhod-2, Mag-X-Rhod-1, Calcium Green-1 und 2, Calcium Green-5N, Oregon Green 488 BAPTA-1, Orgeon Green 488 BAPTA-2 und -5N, Fura Red, Calcein und ähnliche.

Eine Alternative zur Beladung von Zellen mit Calcium-Indikatoren stellt die re kombinante Expression von Photoproteinen in den Zielzellen dar. Diese Photoproteine reagieren dann in Form einer Lichtemission nachdem sie mit Calciumionen einen Komplex eingegangen sind. Ein in zahlreichen Untersuchungen und Testsystemen bereits vielfach verwendetes Photoprotein ist das Aequorin. Die das Zielprotein und gleichzeitig das Aequorin exprimierenden Zellen werden in diesem Testverfahren zu nächst mit dem Luminophor Coelenterazin beladen. Das von den Zellen gebildete Apoaequorin bildet mit dem Coelenterazin und Kohlendioxid einen Komplex. Tritt an schließend Calcium in die Zelle hinzu und bindet an den Komplex, kommt es zur Frei setzung von Kohlendioxid und blauem Licht (Emissions-Maximum ∼466 nm). Die Lichtemission korreliert dabei mit der intrazellulär herrschenden Calciumkonzen tration. Gegenstand dieser Erfindung ist die Verwendung von HC110-R, Fragmenten davon oder ähnlicher Proteine aus anderen Organismen in einem Testverfahren, in dem die Funktion des Rezeptors oder die Bindung an den Rezeptor mittels eines durch Aequorin oder ähnlichen Photoproteinen vermittelten Lichtsignals detektiert wird.

Unter Verwendung von Wirtszellen oder transgenen Invertebraten, die die er findungsgemäße Nukleinsäure enthalten, ist es auch möglich, Substanzen aufzu finden, welche die Expression der Rezeptoren verändern.

Die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens gefundenen Wirkstoffe eignen sich entsprechend zur Bekämpfung von tierischen Schädlingen, insbesondere Insekten, Spinnentieren und Nematoden, die in der Landwirtschaft, in Forsten, im Vorrats- und Materialschutz sowie auf dem Hygienesektor vorkommen. Besonders eignen sich die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gefundenen Wirkstoffe zur Bekämpfung von Nematoden und Spinnentieren. Zu den oben erwähnten Schädlingen gehören:
Aus der Ordnung der Isopoda z. B. Oniscus asellus, Armadillidium vulgare, Porcellio scaber.
Aus der Ordnung der Diplopoda z. B. Blaniulus guttulatus.
Aus der Ordnung der Chilopoda z. B. Geophilus carpophagus, Scutigera spp.
Aus der Ordnung der Symphyla z. B. Scutigerella immaculata.
Aus der Ordnung der Thysanura z. B. Lepisma saccharina.
Aus der Ordnung der Collembola z. B. Onychiurus armatus.
Aus der Ordnung der Orthoptera z. B. Acheta domesticus, Gryllotalpa spp., Locusta migratoria migratorioides, Medanoplus spp., Schistocerca gregaria.
Aus der Ordnung der Blattaria z. B. Blatta orientalis, Periplaneta americana, Leucophaea maderae, Blattella germanica.
Aus der Ordnung der Dermaptera z. B. Forficula auricularia.
Aus der Ordnung der Isoptera z. B. Reticulitermes spp.
Aus der Ordnung der Phthiraptera z. B. Pediculus humanus corporis, Haematopinus spp., Linognathus spp., Trichodectes spp., Damalinia spp.
Aus der Ordnung der Thysanoptera z. B. Hercinothrips femoralis, Thrips tabaci, Thrips palmi, Frankliniella accidentalis.
Aus der Ordnung der Heteroptera z. B. Eurygaster spp., Dysdercus intermedius, Piesma quadrata, Cimex lectularius, Rhodnius prolixus, Triatoma spp.
Aus der Ordnung der Homoptera z. B. Aleurodes brassicae, Bemisia tabaci, Trialeurodes vaporariorum, Aphis gossypii, Brevicoryne brassicae, Cryptomyzus ribis, Aphis fabae, Aphis pomi, Eriosoma lanigerum, Hyalopterus arundinis, Phylloxera vastatrix, Pemphigus spp., Macrosiphum avenae, Myzus spp., Phorodon humuli, Rhopalosiphum padi, Empoasca spp., Euscelis bilobatus, Nephotettix cincticeps, Lecanium corni, Saissetia oleae, Laodelphax striatellus, Nilaparvata lugens, Aonidiella aurantii, Aspidiotus hederae, Pseudococcus spp., Psylla spp.
Aus der Ordnung der Lepidoptera z. B. Pectinophora gossypiella, Bupalus piniarius, Cheimatobia brumata, Lithocolletis blancardella, Hyponomeuta padella, Plutella xylostella, Malacosoma neustria, Euproctis chrysorrhoea, Lymantria spp., Bucculatrix thurberiella, Phyllocnistis citrella, Agrotis spp., Euxoa spp., Feltia spp., Earias insulana, Heliothis spp., Mamestra brassicae, Panolis.flammea, Spodoptera spp., Trichoplusia ni, Carpocapsa pomonella, Pieris spp., Chilo spp., Pyrausta nubilalis, Ephestia kuehniella, Galleria mellonella, Tineola bisselliella, Tinea pellionella, Hofmannophila pseudospretella, Cacoecia podana, Capua reticulana, Choristoneura fumiferana, Clysia ambiguella, Homona magnanima, Tortrix viridana, Cnapha/ocerus spp., Oulema oryzae.
Aus der Ordnung der Coleoptera z. B. Anoblum punctatum, Rhizopertha dominica, Bruchidius obtectus, Acanthoscelides obtectus, Hylotrupes bajulus, Agelastica alni, Leptinotarsa decemlineata, Phaedon cochleariae, Diabrotica spp., Psylliodes chrysocephala, Epilachna varivestis, Atomaria spp., Oryzaephilus surinamensis, Anthonomus spp., Sitophilus spp., Otiorrhynchus sulcatus, Cosmopolites sordidus, Ceuthorrhynchus assimilis, Hypera postica, Dermestes spp., Trogoderma spp., Anthrenus spp., Attagenus spp., Lyctus spp., Meligethes aeneus, Ptinus spp., Niptus hololeucus, Gibbium psylloides, Tribolium spp., Tenebrio molitor, Agriotes spp., Conoderus spp., Melolontha melolontha, Amphimallon solstitialis, Costelytra zealandica, Lissorhoptrus oryzophilus.
Aus der Ordnung der Hymenoptera z. B. Diprion spp., Hoplocampa spp., Lasius spp., Monomorium pharaonis, Vespa spp.
Aus der Ordnung der Diptera z. B. Aedes spp., Anopheles spp., Culex spp., Drosophila melanogaster, Musca spp., Fannia spp., Calliphora erythrocephala, Lucilia spp., Chrysomyia spp., Cuterebra spp., Gastrophilus spp., Hyppobosca spp., Stomoxys spp., Oestrus spp., Hypoderma spp., Tabanus spp., Tannia spp., Bibio hortulanus, Oscinella frit, Phorbia spp., Pegomyia hyoscyami, Ceratitis capitata, Dacus oleae, Tipula paludosa, Hylemyia spp., Liriomyza spp.
Aus der Ordnung der Siphonaptera z. B. Xenopsylla cheopis, Ceratophyllus spp.
Aus der Klasse der Arachnida z. B. Scorpio maurus, Latrodectus mactans, Acarus siro, Argas spp., Ornithodoros spp., Dermanyssus gallinae, Eriophyes ribis, Phyllocoptruta oleivora, Boophilus spp., Rhipicephalus spp., Amblyomma spp., Hyalomma spp., Ixodes spp., Psoroptes spp., Chorioptes spp., Sarcoptes spp., Tarsonemus spp., Bryobia praetiosa, Panonychus spp., Tetranychus spp., Hemitarsonemus spp., Brevipalpus spp.

Zu den pflanzenparasitären Nematoden gehören z. B. Pratylenchus spp., Radopholus similis, Ditylenchus dipsaci, Tylenchulus semipenetrans, Heterodera spp., Globodera spp., Meloidogyne spp., Aphelenchoides spp., Longidorus spp., Xiphinema spp., Trichodorus spp., Bursaphelenchus spp.

Die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gefundenen Wirkstoffe wirken nicht nur gegen Pflanzen-, Hygiene- und Vorratsschädlinge, sondern auch auf dem veterinärmedizinischen Sektor gegen tierische Parasiten (Ektoparasiten) wie Schildzecken, Lederzecken, Räudemilben, Laufmilben, Fliegen (stechend und leckend), parasitierende Fliegenlarven, Läuse, Haarlinge, Federlinge und Flöhe. Zu diesen Parasiten gehören:
Aus der Ordnung der Anoplurida z. B. Haematopinus spp., Linognathus spp., Pediculus spp., Phtirus spp., Solenopotes spp.
Aus der Ordnung der Mallophagida und den Unterordnungen Amblycerina sowie Ischnocerina z. B. Trimenopon spp., Menopon spp., Trinoton spp., Bovicola spp., Werneckiella spp., Lepikentron spp., Damalina spp., Trichodectes spp., Felicola spp.
Aus der Ordnung Diptera und den Unterordnungen Nematocerina sowie Brachycerina z. B. Aedes spp., Anopheles spp., Culex spp., Simulium spp., Eusimulium spp., Phlebotomus spp., Lutzomyia spp., Culicoides spp., Chrysops spp., Hybomitra spp., Atylotus spp., Tabanus spp., Haematopota spp., Philipomyia spp., Braula spp., Musca spp., Hydrotaea spp., Stomoxys spp., Haematobia spp., Morellia spp., Fannia spp., Glossina spp., Calliphora spp., Lucilia spp., Chrysomyia spp., Wohlfahrtia spp., Sarcophaga spp., Oestrus spp., Hypoderma spp., Gasterophilus spp., Hippobosca spp., Lipoptena spp., Melophagus spp.
Aus der Ordnung der Siphonapterida z. B. Pulex spp., Ctenocephalides spp., Xenopsylla spp., Ceratophyllus spp.
Aus der Ordnung der Heteropterida z. B. Cimex spp., Triatoma spp., Rhodnius spp., Panstrongylus spp.
Aus der Ordnung der Blattarida z. B. Blatta orientalis, Periplaneta americana, Blattela germanica, Supella spp.
Aus der Unterklasse der Acaria (Acarida) und den Ordnungen der Meta- sowie Mesostigmata z. B. Argas spp., Ornithodorus spp., Otobius spp., Ixodes spp., Amblyomma spp., Boophilus spp., Dermacentor spp., Haemophysalis spp., Hyalomma spp., Rhipicephalus spp., Dermanyssus spp., Raillietia spp., Pneumonyssus spp., Sternostoma spp., Varroa spp.
Aus der Ordnung der Actinedida (Prostigmata) und Acaridida (Astigmata) z. B. Acarapis spp., Cheyletiella spp., Ornithocheyletia spp., Hyobia spp., Psorergates spp., Demodex spp., Trombicula spp., Listrophorus spp., Acarus spp., Tyrophagus spp., Caloglyphus sph., Hypodectes spp., Pterolichus spp., Psoroptes spp., Chorioptes spp., Otodectes spp., Sarcoptes spp., Notoedres spp., Knemidocoptes spp., Cytodectes spp., Laminosioptes spp.

Beispielsweise zeigen sie eine hervorragende Wirksamkeit gegen Sarcoptes scabei, S. suis, S. bovis, S. ovis und S. equi.

Die erfindungsgemäßen Wirkstoffe der Formel (I) sind auch hervorragend wirksam gegen Milben, insbesondere Hausstaubmilben z. B. Dermatophagoides pteronyssinus und D. farinae.

Die erfindungsgemäßen Wirkstoffe der Formel (I) eignen sich auch zur Bekämpfung von Arthropoden, die landwirtschaftliche Nutztiere, wie z. B. Rinder, Schafe, Ziegen, Pferde, Schweine, Esel, Kamele, Büffel, Kaninchen, Hühner, Puten, Enten, Gänse, Bienen, sonstige Haustiere wie z. B. Hunde, Katzen, Stubenvögel, Aquarienfische sowie sogenannte Versuchstiere, wie z. B. Hamster, Meerschweinchen, Ratten und Mäuse befallen. Durch die Bekämpfung dieser Arthropoden sollen Todesfälle und Leistungsminderungen (bei Fleisch, Milch, Wolle, Häuten, Eiern, Honig usw.) vermindert werden, so daß durch den Einsatz der erfindungsgemäßen Wirkstoffe eine wirtschaftlichere und einfachere Tierhaltung möglich ist.

Verbindungen, die mit Hilfe der beschriebenen Verfahren und Polypeptide gefunden werden, sind ebenfalls wertvoll zur Behandlung von Tieren und Menschen, die mit pathogenen Endoparasiten des Menschen oder von Nutztieren, Hobbytieren, Zoo tieren sowie Labor und Versuchstieren infiziert sind.

Die Verbindungen sind wirksam gegen alle Entwicklungsstadien normaler, sensitiver Stämme und auch resistenter Stämme. Durch die Behandlung mit Mitteln, die eine oder mehrere dieser Verbindungen enthalten, können sowohl wirtschaftliche Verluste bei Nutztieren und Krankheiten bei Menschen und Tieren vermieden oder behandelt werden. Die folgenden Parasiten sind dabei von besonderem Interesse als Ziele der gefundenen Wirkstoffe:
Enoplida, z. B. Trichuris spp., Capillaria spp., Trichomosoldes spp., Trichinella spp.
Rhabditia, z. B. Micronema spp., Strongyloides spp.
Strongylida, z. B. Strongylus spp., Triodontophorus spp., Oesophagodontus spp., Trichonema spp., Gyalocephalus spp., Cylindropharynx spp., Poteriostomum spp., Cyclococercus spp., Cylicostephanus spp., Oesophagostomum spp., Chabertia spp., Stephanurus spp., Ancylostoma spp., Uncinaria spp., Bunostomum spp., Globocephalus spp., Syngamus spp., Cyathostomum spp., Cylicocyclus spp., Neostrongylus spp., Cystocaulus spp., Pneumostrongylus spp., Spicocaulus spp., Elaphostrongylus spp., Parelaphostrongylus spp., Crenosoma spp., Paracrenosoma spp., Angiostrongylus spp., Aelurostrongylus spp., Filaroides spp., Parafilaroides spp., Trichostrongylus spp., Haemonchus spp., Ostertagia spp., Marshallagia spp., Cooperia spp., Nematodirus spp., Hyostrongylus spp., Obeliscoides spp., Amidostomum spp., Ollulanus spp. Dictyocaulus spp., Muellerius spp., Protostrongylus spp.
Oxyurida, z. B. Oxyuris spp., Enteroblus spp., Passalurus spp., Syphacia spp., Aspi culuris spp., Heterakis spp.
Ascaridia, z. B. Ascaris spp., Toxascaris spp., Toxocara spp., Parascaris spp., Anisa kis spp., Ascaridia spp.
Spirurida, z. B. Gnathostoma spp., Physaloptera spp., Thelazia spp., Gongylonema spp., Habronema spp., Parabronema spp., Draschia spp., Dracunculus spp.
Filariida, z. B. Stephanofilaria spp., Parafilaria spp., Setaria spp., Loa spp., Dirofilaria spp., Litomosoides spp., Brugia spp., Wuchereria spp., Onchocerca spp.
Gigantorhynchida, z. B. Filicollis spp., Moniliformis spp., Macracanthorhynchus spp., Prosthenorchis spp.
Mastigophora (Flagellata).
Trypanosomatidae, z. B. Trypanosoma b. brucei, T. b. gambiense, T. b. rhodesiense, T. congolense, T. cruzi, T. evansi, T. equinum, T. lewisi, T. percae, T. simiae, T. vivax, Leishmania brasiliensis, L. donovani, L. tropica.
Trichomonadidae, z. B. Giardia lambilia, G. canis.
Sarcomastigophora (Rhizopoda), z. B. Entamoeba histolytica.
Hartmanellidae, z. B. Acanthamoeba sp., Hartmanella spp.
Apicomplexa (Sporozoa), z. B. Eimeria acervulina, E. adenoides, E. alabahmensis, E. anatis, E. anseris, E. arloingi, E. ashata, E. auburnensis, E. bovis, E. brunetti, E. canis, E. chinchillae, E. elupearum, E. columbae, E. contorta, E. crandalis, E. debliecki, E. dispersa, E. ellipsoidales, E. falciformis, E. faurei, E. labbeana, E. leucarti, E. magna, E. maxima, E. media, E meleagridis. E meleagrimitis, E. mitis, E necatrix, E. ninakohlyakimovae, E ovis, E. parva, E. pavonis, E. perforans, E. phasani, E. piriformis, E. praecox, E. residua, E. scabra, E. spec., E. stiedai, E. suis, E. tenella, E. truncata, E. truttae, E. zuernii, Globidium spec., Isospora belli, I. canis, I. felis, I. ohioensis, I. rivolta, L spec., I. suis, Neospora caninum, Cystisospora spec., Cryptosporidium spec.
Toxoplasmadidae, z. B. Toxoplasma gondii.
Sarcocystidae, z. B. Sarcocystis bovicanis, S. bovihominis, S. neuvona, S. ovicanis, S. ovifelis, S. spec., S. suihominis.
Leucozoide, z. B. Leucozytozoon simondi.
Plasmodiidae, z. B. Plasmodium berghei, P. falciparum, P. malariae, P. ovale, P. vivax, P. spec.
Piroplasmea, z. B. Babesia argentina, B. bovis, B. canis, B. spec., Theileria parva, T. spec.
Adeleina, z. B. Hepatozoon canis, H. spec.

Weiterhin von Bedeutung sind
Myxospora und Microspora, z. B. Glugea spec. und Nosema spec., sowie Pneumocystis carinii, Ciliophora (Ciliata), z. B. Balantidium coli, Ichthiophthirius spec., Trichondina spec. oder Epistylis spec.

Die gefundenen Verbindungen und Mittel sind ebenfalls effektiv gegenüber Proto zoen von Insekten, wie solche des Stammes Microsporidia, besonders solche der Ordnung Nosema, ganz besonder solche der Art Nosema apis, die Parasiten der Honigbiene sind.

Beispiele 1. Konstruktion und Durchsuchen der cDNA-Bibliothek

Die Konstruktion der cDNA-Bibliothek, die Herstellung von KLH-PF1022A- Konjugat und Antiserum gegen PF1022A sowie das Immunscreening der cDNA- Bibliothek und die DNA-Analyse erfolgte wie in WO 98/15625 beschrieben.

2. Isolierung von RNA

Die totale RNA wurde entsprechend der GTC/CsClKissen-Methode aus adulten Haemonchus contortus Nematoden extrahiert und isoliert (Sambrook et al. 1989) oder durch einen einzigen Schritt durch GTC/Phenol/Chloroform-Extraktion gewon nen (Chomczynski und Sacchi 1987). Poly (A)⁺ RNA wurde durch Chromatographie an oligo(dT)Cellulose isoliert (Aviv und Leder, 1972).

3. Northern Blotting

Glyoxylierte totale RNA aus Haemonchus contortus (20 µg pro Bahn) wurden im Agarosegel aufgetrennt (Sambrook et al. 1989; McMaster und Carmicheal 1977) und auf eine Hybond N Membran (Amersham) mittels basischer Kapillar-Transfer methode übertragen (Chomczynski, 1992). Radiomarkierte Proben wurden durch randomisierte Markierung linearisierter Plasmid-DNA (HC110-R) hergestellt, wobei ein Megaprime-Kit (Amersham, Braunschweig, Deutschland) und 50 µCi [α- ³²P]dCTP (3000 Ci/mmol, ICN, Meckenheim, Deutschland) verwendet wurden. Die Hybridisierung wurde über Nacht durchgeführt bei 65°C in 6×SSC (1×SSC: 0,15 M NaCl, 0,015 M Na-Citrat), 5× Denhardt's Reagenz (0,1% Polyinylpyrrolidon, 0,1% BSA, 0,1% Ficoll 400), 0,1% SDS und 100 µg/ml Heringssperma-DNA. Die Filter wurden unter hoher Stringenz in 0,1×SSC und 0,1% SDS bei 65°C gewaschen und exponiert (Kodak BioMax MS Filme bei -80°C).

4. 5'- und 3'-RACE-PCR

Zur Isolierung der im identifizierten cDNA Klon fehlenden 5'- und 3'-Enden wurde das Verfahren des 5'/3'-RACE angewendet.

Das 5'-RACE beruht auf der spezifischen Amplifizierung des 5'-Endes eines Gens aus mRNA. Mit Hilfe eines sequenzspezifischen Primers und der AMV Reversen Transkriptase wird der cDNA-Erststrang synthetisiert. An das Produkt wird ein poly (A)-Schwanz angehängt, so dass in der nachfolgenden PCR ein oligo dT-Anker primer und ein nested sequenzspezifischer Primer eingesetzt werden kann. In einer zweiten PCR kann ein weiterer "nested" Primer verwendet werden, um die Spezifität zu gewährleisten.

Im 3'-RACE erfolgt die cDNA-Erststrangsynthese mit einem oligo dT-Primer und die nachfolgenden PCR-Reaktionen mit sequenzspezifischen Primern.

cDNA wurde aus 1 µg totaler H. contortus RNA mit dem Primer 5'-GGT CAC CGT CGT CCC AGA AA-3' synthetisiert unter Verwendung des 5'-RACE Kits von GIBCO BRL (Eggenstein, Deutschland). Dazu wurde die Superscript Reverse Transkriptase verwendet. Das C-Tailing des C-Terminus der cDNA wurde mit Hilfe der Terminalen Desoxynukleotidyltransferase durchgeführt. Die erste Amplifikation erfolgte mit 400 nM eines oligo-desoxy-inosyl-Anker-Primers (5'-CUA CUA CUA CUA GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACG GGI IGG GII GGG IIG-3') und 400 nM des ersten "nested" Primers 5'-CCA TTC GAT TCC TCT TCT CG-3' (Birsner und Grob, Denzlingen, Deutschland) in 50 µl enthaltend 200 µM jedes dNTP, 1,5 mM MgCl₂, ein Fünftel der "tailed" cDNA und 2,5 U der nativen Taq- Polymerase. Die erste Denaturierung erfolgte bei 94°C für 5 Minuten, gefolgt von 35 Zyklen zu je 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 53°C und 2 Minuten bei 72°C, wiederum gefolgt von einem letzten Syntheseschritt von 10 Minuten bei 72°C. Die Reaktionsbedingungen für die "nested" PCR waren dieselben wie oben beschrieben, mit der Ausnahme, dass 1 µl des ersten Amplifikationsproduktes als Template verwendet wurde, sowie der genspezifische zweite "nested" Primer 5'-GTC GAT GGT GCA GAT TTC GC-3', eine verkürzte Form des Anker-Primers (5'-CUA CUA CUA CUA GGC CAC GCG TCG ACT AGT AC-3') und nur 25 Zyklen bei einer Annealing-Temperatur von 53°C durchgeführt wurden.

Die 3'-RACE-PCR (GIBCO BRL, Eggenstein, Deutschland) wurde mit 1 µg der totalen RNA adulter H. contortus und 500 nM des oligo dT Adapter-Primers 5'-GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACT TTT TTT TTT TTT TTT T-3' durchgeführt, beginnend mit einer Präinkubation für 10 Minuten bei 70°C und 2 Minuten bei 4°C. Nach Zugabe von 2,5 mM MgCl₂, 500 µM jedes dNTP, 10 µM DTT und 200 U Super-Script II Reverse Transkriptase in 20 µl wurde die cDNA für 50 Minuten bei 42°C und in einem abschließenden Schritt für 15 Minuten bei 70°C und 10 Minuten bei 4°C inkubiert. Die RNA wurde durch 2 U E. coli RNase H und einer Inkubation bei 37°C für 10 Minuten entfernt. Die erste Amplifikation erfolgte mit 400 nM eines universellen Adapter-Primers (5'-CUA CUA CUA CUA GGC CAC GCG TCG ACT AGT AC-3') und 400 nM des sequenzspezifischen Primers 5'-TTTGTTCTT CCT TGG TAT CC-3' in 50 µl enthaltend 200 mM jedes dNTP, 1,5 mM MgCl₂, ein Zehntel der "tailed" cDNA und 2,5 U native Taq-DNA-Polymerase. Der erste Denaturierungsschritt erfolgte bei 94°C für 3 Minuten, gefolgt von 35 Zyklen zu je 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 51°C und 2 Minuten bei 72°C sowie einem ab schließenden Syntheseschritt von 15 Minuten bei 72°C. Für die "nested" PCR wurden 2 µl der ersten Amplifikation bei ansonsten gleichen Bedingungen verwen det, wobei nun der kürzere Adapter-Primer 5'-GGC CAC GCG TCG ACT AGT AC- 3' und der "nested" Primer 5'-ACA CTC TAA TCT CCA ACT G-3' bei nunmehr 30 Zyklen verwendet wurden. Die PCR-Produkte wurden auf 2%igen Agarose-Gelen analysiert, eluiert und in den TA-Vektor pMosBlue (Amersham, Braunschweig, Deutschland) kloniert.

5. Transfer der RNA

Der Transfer der aufgetrennten RNA aus dem Glyoxalgel bzw. genom. DNA aus einem TBE-Agarosegel auf eine neutrale Hybond-N Nylonmembran [Amersham, Braunschweig] erfolgt nach dem "Downward Alkaline Capillary Transfer" in alka lischer Transferlösung nach der Methode von Chomczynski 1992 für 2 h. Danach wird die Membran für 20 min in 0,2 M Natriumphosphat-Puffer (pH 6,8) neutrali siert, getrocknet und für 20-60 min bei 80°C gebacken. Für die Hybridisierung gegen radioaktiv markierte Sonden wird die Membran mit 5 ml/cm² Prähybridisierungslösung in Kunststofftüten eingeschweißt und für 3 h bei 65°C inkubiert. Zur Hybridisierung wird der Puffer durch Hybridisierungslösung ersetzt. Bei Verwendung von Rapid Hyb.-Lösung [Amersham, Braunschweig] erfolgt die Prähybridisierung in 30 min bei 65°C ohne zusätzliche Prähybridisierungslösung. Nach Zugabe der durch "Random Priming" radioaktiv markierten Sonde erfolgt die Hybridisierung bei 65°C über Nacht. Danach wird die Membran einmal mit 65°C warmem 2×SSC/0,1% SDS für 20 min und dreimal mit 0,1×SSC/0,1% SDS für je 1 h gewaschen. Die Exposition der Membran erfolgt auf Kodak X-OMAT oder Kodak BIOMAX-MS Röntgenfilmen mit entsprechender Verstärkerfolie bei -80°C.

6. In vitro Transkription und Translation

Das TNT T7/T3 gekoppelte Retikulocytenlysat-System (Promega) wurde verwendet, um die volle Länge der kodierenden Sequenz von HC110-R in der Gegenwart von ³⁵S-markiertem Methionin und Cystein (ICN, Eschwege, Deutschland) entsprechend den Vorschriften des Herstellers zu transkribieren und translatieren. Die RNA wurde mit einem Kaninchen Retikulocytenlysat-System (Promega, Serva, Heidelberg) translatiert, wobei eine 40 µCi ³⁵S-markierte Mischung (< 1000 Ci/mmol, ICN, Meckenheim, Deutschland), 1 µg zirkularisierte HC110-R Plasmid-DNA und 10 U T3-RNA-Polymerase verwendet wurden. Die Reaktion wurde bei 30°C für 90 Minuten durchgeführt. Eine positive Kontrolle enthielt 1 µg Luciferase-Kontroll- DNA.

Die Reaktionsprodukte wurden durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (Lämmli 1970) aufgetrennt und mit Hilfe der "Amplify Fluorography Solution" (Amersham Pharmacia Biotech) oder 1 M Natriumsalicylat (pH 7) fluorographiert (Chamberlain 1979), die Gele dann getrocknet und expon 86413 00070 552 001000280000000200012000285918630200040 0002010053785 00004 86294iert (Kodak BioMax MR Film mit Ver stärker bei -80°C).

Alternativ wurde zur in vitro Synthese eines RNA-Transkriptes aus in pBluescript SK klonierter HC110-R cDNA das "MAXIscript In Vitro Transcription Kit" von Ambion [Heidelberg] herangezogen. 4 µg HC110-R Plasmid-DNA wurden mit dem Restriktionsenzym Hind III bzw. Sal I hinter dem Stop-Codon linearisiert, mit Phenol-Chloroform extrahiert, in 3 Vol. Ethanol gefällt und in DEPC-H₂O gelöst. In einem 50 µl Reaktionsansatz wurden 2 µg HC110-R cDNA mit 2,5 µl 200 mM DTT, je 2,5 µl 10 mM ATP, CTP, GTP und UTP, 5 µl 10× Transkriptionspuffer, 1,6 µl RNasin-Inhibitor (40 U/µl) [Promega, Heidelberg] und 2 µl T3-Phagen-Polymerase (10 U/µl) versetzt und für 2 h bei 37°C inkubiert. Nach 1 h wurden noch einmal 2 µl T3-Phagen-Polymerase (10 U/µl) hinzugegeben. Der Ansatz wurde mit 1,5 µl RNasefreier DNase I (2 U/µl) und 1 µl RNasin-Inhibitor (40 U/µl) versetzt, für 15 min bei 37°C inkubiert, mit Phenol-Chloroform extrahiert, in 3 Vol. Ethanol gefällt und in 25 µl DEPC-H₂O resuspendiert. 1/5 Vol. der Probe wurde in einem Glyoxalgel analysiert.

7. DNA-Analyse

Die Klone wurden durch die Didesoxynukleotid-Kettenterminationsmethode unter Zuhilfenahme der automatisierten Laser-Fluoreszenz-Sequenzierung (LICOR 4000; MWG, Ebersberg, Deutschland) sequenziert sowie des "Thermo Sequenase fluorescent-labeled cycle sequencing kit" (Amersham, Braunschweig, Deutschland). Die Sequenzen beider Stränge wurden bestimmt und die Sequenzdaten mit der GCG- Software (Genetics Computer Group Inc., Madison, WI, U.S.A.) sowie der PC/GENE- Software (Intelligenetics, Mountain View, CA, U.S.A.). Die Programme FASTA (Pearson und Lipman 1988), BLITZ (Smith und Waterman 1981) und BLAST (Altschul und Lipmann 1990) wurden verwendet, um die EMBL- und Swiss-Prot Protein-Datenbanken nach Sequenzähnlichkeiten der abgeleiteten Proteinsequenz zu durchsuchen. Die Proteinsequenzen wurden mit SAPS analysiert (Brendel et al. 1992), sowie mit PROSITE und Prot-Param (Appel et al. 1994).

8. Herstellung von Proteinextrakten aus Haemonchus contortus

50-100 mg in flüssigem Stickstoff eingefrorene H. contortus-Würmer wurden in 1 ml TRIZOL [Gibco, Karlsruhe] aufgenommen. Die Nematoden wurden zusammen mit dem TRIZOL 3× für 15 sec in einem Glas-Potter homogenisiert und für 5 min bei RT inkubiert. Nach Zugabe von 200 µl Chloroform pro ml TRIZOL und Schütteln der Probe für 15 sec wurde der Ansatz für weitere 2-3 min bei RT inkubiert, bevor er für 10 min bei 7000-12000 rpm und 4°C zentrifugiert wurde. Die obere wäßrige Phase enthält die RNA, die Interphase die genomische DNA, die rote organische Phase die Proteine (Coombs et al. 1990; Chomczynski 1993). Die wäßrige Phase wurde entfernt und separat aufbereitet. Die Interphase und organische Phase wurden mit 300 µl 100% Ethanol pro ml TRIZOL versetzt, gut durchmischt und für 2-3 min bei RT inkubiert. Nach einer Zentrifugation für 2000 rpm für 5 min und 4°C wurde der Protein-Überstand vorsichtig in ein neues Eppendorfgefäß überführt und mit 1 ml Isopropanol für 10 min bei RT gefällt. Es wurde erneut für 10 min bei 12000 rpm und 4°C zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Proteinpellet 3× mit je 2 ml 0,3 M Guanidin-Hydrochlorid-Lösung in 95% Ethanol versetzt, "gevortext", für 20 min bei RT inkubiert und für 5 min bei 7500 rpm und 4°C zentrifugiert. Danach wurde das Pellet in 2 ml 100% Ethanol gelöst, für 20 min bei RT gefällt und für 5 min bei 7500 rpm und 4°C pelletiert. Das Pellet wurde kurz vakuumgetrocknet und in Harnstoff-Lysispuffer (8 M) resuspendiert. Unlösliches Material wurde durch eine Zentrifugation für 10 min bei 10000 rpm und 4°C entfernt, der Überstand in ein neues Eppendorfgefäß überführt und nach Bestimmung der Proteinkonzentration bis zur Weiterverarbeitung bei -20°C gelagert.

9. Herstellung von Proteinextrakten aus Hefezellen

Zur Herstellung von Proteinextrakten aus einer Hefekultur wurden 5 ml YPAD- Medium mit einer Hefe-Einzelkolonie angeimpft und bis zur Sättigung bei 30°C ge schüttelt (2 Tage). Jeweils 2 ml einer solchen Hefekultur wurden für 2 min bei 3000 rpm und 4°C (Heraeus Biofuge 15 R) abzentrifugiert, einmal mit H₂O ge waschen, in 250 µl Hefe-Lysispuffer resuspendiert, in ein kleines Reagenzglas über führt, mit Glasperlen (∅ 0,5 mm) bis knapp unter den Flüssigkeitsspiegel aufgefüllt und für 5 min auf höchster Stufe "gevortext". Anschließend wurde 4× RotiLoad- Puffer [Roth, Karlsruhe] zugegeben und der Ansatz für 5 min bei 95°C inkubiert. Die aufgeschlossenen Zellen wurden in ein Eppendorfgefäß überführt und die Zelltrüm mer für 5 min bei 14000 rpm (Eppendorf Centrifuge 5415 C) abzentrifugiert. Jeweils 20 µl der so aufbereiteten Proben wurden auf ein SDS-Polyacrylamidgel aufgetragen.

10. Herstellung von Proteinextrakten aus E. coli-Zellen

Zur Herstellung von Proteinextrakten wurden 1 × 10⁷ E. coli-Zellen aus einer 5 ml Über-Nacht-Kultur für 5 min bei 5000 rpm und 4°C in einer Heraeus-Untertisch zentrifuge pelletiert, mit 5 ml PBS gewaschen und erneut abzentrifugiert. Das Pellet wurde danach in 1 ml TRIZOL [Gibco, Karlsruhe] resuspendiert und weiter aufgear beitet.

Alternativ hierzu wurde das mit PBS gewaschene Zellpellet wieder in PBS resuspen diert und die Zellen mit Hilfe von mehreren kurzen Ultraschallimpulsen [Sonifier B- 12, Branson Sonic Power Company, Danbury, U.S.A.], flüssigem Stickstoff und durch Zugabe von Lysozym zerstört.

In Anschluß an die Proteinbestimmung wurde 4× RotiLoad-Puffer [Roth, Karlsruhe] zugegeben und die Fraktion durch Auftragung auf ein SDS-Polyacrylamidgel analysiert. Dabei wurde pro Spur eine Proteinmenge von insgesamt 10-20 µg auf getragen.

11. Herstellung von Proteinextrakten aus der Zellkultur

Eine konfluente 35 mm Zellkulturschale adhärenter Zellen bzw. 5-10 × 10⁶ nicht adhärente Säuger-Zellen in FCS-haltigem Medium wurden zuvor mit einer Trypsin- EDTA-Lösung abtrypsiniert oder mechanisch nach Kälteeinwirkung mit einem Zell schaber abgelöst, in ein Eppendorfgefäß überführt, für 10 sec bei 13000 rpm und RT pelletiert, zweimal mit PBS gewaschen und erneut abzentrifugiert. Nach Aufnahme der Zellen in 1 ml TRIZOL wurden diese durch kräftiges "Vortexen" oder durch mehrfaches Ziehen der Zellen durch die Kanüle einer Einwegspritze lysiert und für 5 min bei RT inkubiert. Alternativ hierzu kann das Zellpellet auch in 1 ml PBS oder Harnstoff-Lysispuffer (8 M) resuspendiert und einer kurzen Ultraschallbehandlung [Sonifier B-12, Branson Sonic Power Company, Danbury, U.S.A.] unterzogen werden. Danach wird der Proteingehalt nach Bradford (1976) oder Lowry et al. (1951) bestimmt.

12. Induzierbare Protein-Expression in E. coli

Zur Herstellung von polyklonalen Antikörpern gegen das HC110-R Protein wurden drei HC110-R Fragmente - die komplette HC110-R cDNA, das N-terminale Ende ohne TM-Domänen und das C-terminale Ende nach der 7. TM-Domäne - in den Ex pressionsvektor pRSET B (Invitrogen, Leek, NL) kloniert und so N-terminal mit einem 6xHis-Tag unter Beachtung des Leserasters fusioniert.

Der komplette kodierende Bereich von HC110-R wurde mit dem P84_ATG BamHI 5'-Primer 5'-CTG CCG GAT CCT CGG TTT AAT ACC AAC ATG AGG-3' und dem P3121_TGA HindIII 3'-Primer 5'-GCA CTA AGC TTG ACT GAA GCG CAC AAC CTC G-3', der N-Terminus bis zur 1. Transmembrandomäne wurde mit den Primern P84_ATG BamHI 5'-Primer (s. o.) und dem P1434_TGA HindIII 3'-Primer 5'-GGC TCA AGC TTA TCA GAG AAC AAG CGA CAC GGC-3', und der C-Ter minus beginnend nach der 7. Transmembrandomäne wurde mit dem P2486_ATG BamHI 5'-Primer 5'-CTA TCG GAT CCC AAC ATG GCT GGC TCC CGT GAT ACC TCT AGG-3' und dem P3121_TGA HindIII 3'-Primer (s. o.) amplifiziert. Die Annealingtemperatur betrug bei allen drei Plasmid-PCR zunächst über 5 Zyklen 56°C und dann über 30 Zyklen 62°C. Die PCR-Produkte wurden mit den Enzymen BamHI und HindIII verdaut und gerichtet in den ebenfalls BamHI/HindIII linearisierten pRSET B-Expressionsvektor ligiert.

In dem pRSET B-Vektor wird die Expression über einen viralen Promoter des Bakteriophagen T7 kontrolliert. Die Klonierung erfolgte deshalb in dem XL1-Blue E. coli Stamm, der kein Gen der T7 RNA Polymerase enthält. Das rekombinante Plas mid wurde danach in T7 Polymerase exprimierenden BL21(De3)pLysS E. coli-Zel len transformiert, die zusätzlich das Plasmid pACYC 184 enthalten, das über eine Chloramphenicolresistenz stabilisiert wird, und in geringen Mengen das T7- Lysozym, einen natürlichen Inhibitor der T7 RNA-Polymerase, exprimieren. Da diese Zellen unter der Kontrolle des lacUVS Promoters stehen, erfolgt bei IPTG- Induktion die Expression der T7 RNA Polymerase und damit auch die des Fusions proteins.

Eine Einzelkolonie mit dem gewünschten HC110-R Plasmid wurde von einer frischen LB-Platte mit 50 µg/ml Ampicillin und 35 µg/ml Chloramphenicol in 50 ml LB-Medium unter gleichem Selektionsdruck überimpft und ÜN bei 37°C und 280 rpm bis zur stationären Phase geschüttelt. Diese ÜN-Kultur wurde anschließend auf OD₆₀₀ = 0,3 verdünnt und 100 ml der Kultur bei 37°C und 280 rpm bis zu einer OD₆₀₀ = 0,6-0,5 weitergeschüttelt.

1 OD₆₀₀-Einheit wurde abgenommen, die nicht-induzierten Zellen kurz abzentri fugiert und in 150 µl 8 M-Harnstoff-Lysispuffer, pH 8,0, und 50 µl 4×RotiLoad- Puffer [Roth, Karlsruhe] aufgenommen. Die nicht-induzierte Probe wurde für 2 min denaturiert, die genomische DNA durch kurze Ultraschallimpulse von wenigen Sekunden im Sonifier B-12 [Branson Sonic Power Company, Danbury, U.S.A.] geschert und unlösliche Partikel durch eine 3minütige Zentrifugation bei 14000 rpm pelletiert.

Die Expression des Fusionsproteins wurde durch Zugabe von 1 mM IPTG induziert und die 100 ml Kultur für weitere 3-4 h bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die induzierten Zellen für 15 min bei 5000 rpm und 4°C [Heraeus- Untertischzentrifuge] abzentrifugiert, das Pellet in PBS gewaschen und anschließend in 8 ml 8 M-Harnstoff-Lysispuffer resuspendiert. Der Aufschluß der Zellen erfolgte durch 3maliges Eintauchen der Zellen in flüssigen Stickstoff und anschließendes Auftauen bei 37°C. Nach der ersten Stickstoffbehandlung wurden 0,75 mg/ml Lysozym zugesetzt. Nach der letzten Inkubation in flüssigem Stickstoff erfolgte eine Inkubation für 20 min bei 16°C, gefolgt von kurzen Ultraschallimpulsen zu je 10 sec und einer Abkühlung im Eiswasserbad, bis die Lösung eine wasserähnliche Viskosi tät aufwies. Nach einer 10minütigen Zentrifugation bei 13000 rpm und 4°C [Beckmann J2-21; JS 13.1-Rotor] wurde eine induzierte 150 µl Probe entnommen, mit 50 µl 4× RotiLoad-Puffer [Roth] versetzt und die Induktion des jeweiligen HC110-R Proteinfragmentes zusammen mit der nicht-induzierten Probe durch SDS-PAGE mit anschließender Coomassiefärbung bzw. Western Blot-Analyse mit einem Maus-anti- His-Antikörper überprüft.

Der restliche Überstand wurde für die weitere Aufreinigung mittels Affinitäts chromatographie in ein frisches Gefäß überführt und bei -20°C gelagert.

13. Proteinaufreinigung durch Metall-Affinitätschromatographie

Die Anreicherung erfolgte unter denaturierenden Bedingungen über das N-terminale 6× His-Tag mit Hilfe des IMAC-Systems ("Immobilized Metal Affinity Chromato graphy") über TALONspin-Säulen von Clontech [Palo Alto, U.S.A.]. Das Harz der Säule wurde zunächst separat mit 5 Vol. 8 M-Harnstoff-Lysispuffer, pH 8,0, äquili briert, für 4 min bei 3000 rpm und 4°C sedimentiert und zusammen mit dem HC110-R Protein-Überstand für 20 min bei RT unter leichtem Schütteln inkubiert.

Nach einer erneuten Zentrifugation wurde das Harz 3mal mit dem 10fachen Volumen 8 M-Harnstoff-Lysispuffer, pH 8,0, für 10 min bei RT unter leichtem Schütteln ge waschen und wieder abzentrifugiert. Nach dem letzten Waschschritt wurde das Pellet in 1 ml 8 M-Harnstoff-Lysispuffer aufgenommen und damit die Säule beladen; diese wurde im folgenden noch 2mal mit dem 3fachen Volumen 8 M-Harnstoff-Lysis puffer gewaschen, bevor die Elution mit Imidazol-haltigem 8 M-Harnstoff- Lysispuffer in mehreren Fraktionen zu je 150 µl erfolgte. Der Gehalt von Fusions protein in den Fraktionen wird durch Gelanalyse und Proteinbestimmung nach Bradford ermittelt.

14. Proteinaufreinigung durch Affinitätschromatographie

An dieser Stelle soll beispielhaft die Proteinaufreinigung durch Metall-Affinitäts chromatographie beschrieben werden. Die Anreicherung erfolgte unter denatu rierenden Bedingungen über das N-terminale 6× His-Tag mit Hilfe des IMAC- Systems ("Immobilized Metal Affinity Chromatography") über TALONspin-Säulen von Clontech [Palo Alto, U.S.A.]. Das Harz der Säule wurde zunächst separat mit 5 Vol. 8 M-Harnstoff-Lysispuffer, pH 8,0, äquilibriert, für 4 min bei 3000 rpm und 4°C sedimentiert und zusammen mit dem HC-1 Protein-Überstand für 20 min bei RT unter leichtem Schütteln inkubiert. Nach einer erneuten Zentrifugation wurde das Harz 3mal mit dem 10fachen Volumen 8 M-Harnstoff-Lysispuffer, pH 8,0, für 10 min bei RT unter leichtem Schütteln gewaschen und wieder abzentrifugiert. Nach dem letzten Waschschritt wurde das Pellet in 1 ml 8 M-Harnstoff-Lysispuffer aufge nommen und damit die Säule beladen; diese wurde im folgenden noch 2mal mit dem 3fachen Volumen 8 M-Harnstoff-Lysispuffer gewaschen, bevor die Elution mit Imid azol-haltigem 8 M-Harnstoff-Lysispuffer in mehreren Fraktionen zu je 150 µl er folgte. Der Gehalt von Fusionsprotein in den Fraktionen wird durch Gelanalyse und Proteinbestimmung nach Bradford ermittelt.

15. Aminosäuresequenzanalyse

Zur Überprüfung der deduzierten Aminosäure-Sequenz ausgehend von dem cDNA- full length Klon HC110-R wurde das 3'-Ende bestehend aus 688 bp (Pos. 2486-3182) mit einem vorangestellten Start-Codon und Kozak-Sequenz in den pRSET B- Expressionsvektor kloniert und in kompetenten BL21(DE3)pLysS E. coli-Zellen die Expression des 21 kD Proteins (189 AS) durch Zugabe von 1 mM IPTG induziert. Das mit einem N-terminalen HisTag versehene Fusionsprotein wurde über eine Talon-Matrix angereichert und mittels Centriconröhrchen aufkonzentriert und ent salzt. Wegen des N-terminalen HisTags wurde eine C-terminale Protein-An sequenzierung von 1 nM des 21 kD HC110-R Proteins nach dem schrittweisen Schlack-Kumpf-Abbau (Schlack et al. 1926) in einer Modifikation von Boyd (Boyd et al. 1992) von der Firma TopLab (Martinsried) durchgeführt. Die Sequenzierung der abgespaltenen Aminosäuren erfolgte in einem Aminosäuresequenzierer PROCISE 492 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt) und wurde mit dem PROCISE C Reversed phase HPLC System, bestehend aus einem ABI 140C Mikrogradienten System und einem ABI 785A UV/VIS Detektor, analysiert und mit der PROCISE C Kontrollsoftware sowie der ABI Data Analysis Software identifiziert.

25 µmol des 21 kD HC110-R Proteins wurden durch 2% Trypsin (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim) bei 37°C über Nacht intern gespalten. Insgesamt wurden vier Peptidfragmente durch einen Vergleich des HC110-R Standardchromato grammes nach dem Trypsin-Verdau mit dem Chromatogramm des Trypsin-Blank verdaus ausgewählt, um die Sequenzierung von tryptischen Autolyseprodukten aus zuschließen. Diese vier Peptidfragmente wurden einer N-terminalen Protein-An sequenzierung nach dem Verfahren des schrittweisen Edman-Abbaues in einer Modifikation nach Hunkapiller et al. (1983) durch die Firma TopLab (Martinsried) unterzogen. Die gespaltenen Peptidfragmente wurden mittels HPLC aufgetrennt und fraktioniert. Die auf Immobilon geblottete Peptidfraktion wurde in die Reaktionskammer des Aminosäuresequenzierers PROCISE 492 (Applied Bio systems, Weiterstadt) eingebracht und die Aminosäuren in einem 140 C-PTH- Analyser und UV-Detektor 785 A (Applied Biosystems, Weiterstadt) abgetrennt. Die Aminosäuren wurden quantitativ durch "Reversed Phase" HPLC erfaßt und über Retentionszeitvergleich mit einem vor der Sequenzanalyse erstellten Standard chromatogramm identifiziert.

16. Zellkulturlinien

Die folgenden Zellkulturlinien wurden über die Deutsche Sammlung von Mikro organismen und Zellkulturen GmbH [Braunschweig] bezogen [Drexler et al. 1995]:

COS-7-Zellen (DSM: ACC 60) - Affe, Niere

HEK-293-Zellen (ATCC: CRL 1573) - Human, embryonal, Niere.

17. Kultivierung der verschiedenen Zellkulturlinien

Die Kultivierung der adhärenten Zellinien COS-7 und HEK-293 erfolgte in 110 mm Gewebekulturschalen [Greiner, Solingen] in einem Volumen von 10 ml Medium bei 37°C, 5% CO₂ und 95% Luftfeuchtigkeit. Zur Aufrechterhaltung der Zellkultur wurden COS-7- und HEK-293-Zellen in DMEM-Medium kultiviert. Die Medien enthielten 3,024 g/l NaHCO₃, 10% FCS, 50 U/ml Penicillin, sowie 50 µg/ml Streptomycin und wurden vor Gebrauch auf 37°C erwärmt. Zur Subkultivierung der COS-7-Zellen wurden diese für 2 h bei 4°C gelagert und anschließend mechanisch mit einem Zellschaber von der Kulturschale abgelöst. Die HEK-293-Zellen ließen sich direkt mit einer Glaspipette vom Boden der Kulturschale ablösen.

18. Transiente und stabile Transfektion von eukaryotischen Zellen

Um Fremd-DNA transient in Säuger-Zellen einzubringen, wurde das nicht liposomale Transfektionsreagenz FuGENE 6 von Roche Molecular Biochemicals [Mannheim] eingesetzt (Kurachi et al. 1998). Dazu wurden ca. 0,5-1,5 × 10⁵ Zellen in 2 ml Medium auf 35 mm große Gewebekulturschalen ausgebracht, in die für die spätere konfokale Laserscanning-Mikroskopie ein steriles, mit 1% Gelatine be schichtetes Objektträgergläschen gelegt wurde. Die Zellen wurden bei 37°C, 5% CO₂ und 95% Luftfeuchtigkeit über Nacht kultiviert. Vor der Transfektion wurde noch einmal das Medium gewechselt. Für die Transfektion wurden pro Reaktionsan satz 3 µl FuGENE 6 [Roche Molecular Biochemicals] in 97 µl serumfreiem Medium verdünnt und für 5 min. bei RT inkubiert. Tropfenweise wurden je 100 µl des ver dünnten FuGENE 6 pro Ansatz zu 1-2 µg Plasmid-DNA (0,5-1 µg/µl) pipettiert, vor sichtig gemischt und für weitere 15 min bei RT inkubiert. Danach wurde der komplette Reaktionsansatz tropfenweise zu den Zellen gegeben und durch leichtes Schwenken der Schale die Transfektionsmischung gleichmäßig verteilt. Die Zellen wurden ohne Mediumwechsel für 1-2 Tage weiterkultiviert. Bei jeder Transfektion wurden folgende 3 Negativkontrollen stets mit durchgeführt: Eine 35 mm-Gewebe kulturschale mit 0,5-1,5 × 10⁵ Zellen wurde nicht transfiziert, einer zweiten Schale wurde zwar DNA, aber kein FuGENE 6 im Transfektionsansatz zugesetzt und einer dritten Schale wurde FuGENE 6, aber keine DNA zugefügt.

Für eine stabile Transfektion wurde das gewünschte Plasmid HC110-R im richtigen Leseraster in den leicht modifizierten Expressionsvektor pSecTag A [Invitrogen, Leek, NL] bzw. pIRESneo [Clontech, Palo Alto, U.S.A.] kloniert. Diese Vektoren tragen ein Resistenzgen als Marker, so daß bei Zugabe von Zeozin bzw. G418 oder Bleomycin 48 72 h nach der transienten Transfektion und bei jedem folgenden Medi umwechsel nur erfolgreich transfizierte Zellen, die das Resistenzgenprodukt dauer haft exprimieren, überleben. Die optimale Konzentration des Zeozin- bzw. G418- haltigen Selektionsmediums wurde zuvor durch Anlegen einer Verdünnungsreihe für die jeweilige Zelllinie ermittelt.

19. Zelluläre Lokalisation rekombinanter Proteine in Säuger-Zellen

Die vollständige kodierende Region der HC110-R-DNA wurde in die HindIII/SalI- Stelle von pEGFP-N3 kloniert, um das HC110-R-Protein C-terminal mit GFP (Green Fluorescent Protein) zu verknüpfen. Das 137 kDa große Fusionsprotein wird in transient transformierten Empfängerzelllinien exprimiert, was durch Western-Blot- Analyse nachgewiesen werden kann. Die CLSM (Confocal Laser Scanning Micros copy) zeigt, dass das HC110-R-GFP-Fusionsprotein in COS-7 und HEK-293-Zellen im Cytoplasma lokalisiert ist sowie in geringerem Ausmaß auch an der Plasma membran.

Für die konfokale Laserscanning-Mikroskopie wurde ein Zeiss IM 35 Mikroskop [Zeiss, Oberkochen] mit einem Leica CLSM-Aufsatz TCS NT ["Confocal Laser Scanning Microscope Unit", Leica Lasertechnik, Heidelberg], Version 1.5.451, ver wendet. Die Fluoreszenz des GFP-Proteins sowie des Farbstoffes Fluoreszein-Iso thiocyanat (FITC) wurde bei 488 nm mit einem Argon-Laser, die für Rhodamin, Texas-Rot, Phycoerythrin, Alexa 568, LysoTracker™Red DND-99, MitoTracker™Red CMX Ros bzw. Propidiumiodid bei 568 nm mit einem Krypton- Laser angeregt. Z-Serien von optischen Schnitten durch die Zelle wurden mit einer Auflösung von 1024 × 1024 Pixel und einer Schichttiefe von 0,5 µm gescannt (Giese et al. 1995). Die Auswertung erfolgte mit der AVS Software [Advanced Visual Systems Inc., Waltham, M. A., U.S.A.] sowie später mit Adobe Photoshop 5.0 und Corel Draw 8.0 für Windows.

Das Fusionsprotein findet sich dabei vor allem in sauren Lysosomen, wie die Kolokalisierung mit Hilfe von Lysotracker™, eine Probe zur Markierung saurer Organellen, zeigt. Die das HC110-R-Protein enthaltenden Vesikel wurden vermehrt in der Nähe des Nukleus beobachtet. Zur Kontrolle wurden ein Fusionsprotein aus GFP und dem β₂-adrenergen GPCR aus der Maus hergestellt (Accession Number X155643, Nakada et al. 1989), dessen Transfektion im gleichen Verteilungsmuster innerhalb der Zelle resultierte wie im Falle des HC110-R-GFP-Fusionsproteins.

20. EGFP-Konstrukte für die transiente Expression

Die Vektoren pEGFP C1 und pEGFP N3 [Clontech, Palo Alto, CA, U.S.A.] wurden mit den Restriktionsenzymen HindIII und SalI geschnitten. Die Amplifizierung der HC110-R "full length" cDNA erfolgte mit dem P83EGFP_ATG HindIII 5'-Primer 5'-GGT AGA AGC TTT TCG GTT TAA TAC CAA CAT GAG G-3' und dem P3057EGFP_o.TGA SalI 3'-Primer 5'-CTG TGT CGA CAA CAT TTC GCC AAT AGT TAG G-3' bei einer Annealing-Temperatur von 65°C. Das PCR-Produkt wurde anschließend ebenfalls mit den Enzymen HindIII und SalI geschnitten und unter Erzeugung eines offenen Leserasters zwischen die HindIII und SalI-Schnittstellen des jeweiligen Vektors ligiert und transformiert. Das entstehende Fusionsprotein mit dem N-terminalen GFP-Tag wurde GFP-HC110-R, das mit dem C-terminalen EGFP- Tag HC110-R-GFP genannt. Ein β₂-Adrenerger Rezeptor aus der Maus (Gen Bank Accession Nr.: P18762; Nakada et al. 1989) wurde mit einem C-terminalen EGFP- Tag fusioniert, indem die "full length" cDNA mit dem P117Mausβ₂AR XhoI 5'- Primer 5'-TAC CTC GAG CTG CTA ACC TGC CAG CCA TG-3' und dem P1349Mausβ₂AR EcoRI 3'-Primer 5'-TGT AGA ATT CTT CCT TCC TTG GGA GTC AAC GCT-3' mit einer Annealingtemperatur von 55/60°C amplifiziert, mit den Restriktionsenzymen XhoI und EcoRI geschnitten und in den XhoI-EcoRI linearisieren pEGFP N3 ligiert wurde. Ebenfalls in den XhoI-EcoRI geschnittenen pEGFP N3-Vektor wurde die "full length" cDNA eines humanen muscarinischen Rezeptors 1 (huM1Rez; Gen Bank Accession Nr.: Y00508; Allard et al. 1987) ligiert, die zuvor mit dem P70HumM1Rez XhoI 5'-Primer 5'-ATA TCT CGA GAG CCC CAC CTA GCC ACC ATG AAC A-3' und dem P1465HumM1Rez EcoRI 3'- Primer 5'-GAC GAA TTC CAT TGG CGG GAG GGA GTG CGG T-3' bei 55/60°C amplifiziert wurde. Die resultierenden Fusionsproteine mit offenem Leseraster wurden Mausβ₂AR-EGFP und huM1Rez-EGFP genannt.

21. HC110-R-MycHis-Tag Konstrukte für die stabile oder transiente Transfektion

Der Vektor pMyc6xHis leitet sich von dem Vektor pSecTagA [Invitrogen, Leek, NL] durch Doppelverdau mit den Restriktionsenzymen NhiI und SfiI, gefolgt von "blunting" der Enden und Religation des Vektors. Die codierende Region von HC110-R wurde mit Hilfe der PCR-Primer P83MycTag_ATG BamHI 5'-Primer 5'- ATA GGA TCC TTC GGT TTA ATA CCA ACA TGA GG-3' und P3058MycTag_o.TGA XbaI 3'-Primer 5'-CCT GTC TAG AAA CAT TTC GCC AAT AGT TAG G-3' bei einer Annealingtemperatur von 56/60°C amplifiziert, mit den Enzymen BamHI und XbaI geschnitten und in den gleichfalls BamHI-XbaI linearisierten pMyc6xHis-Vektor ligiert und in E. coli DH5α-Zellen transformiert. Im folgenden wurden COS-7-Zellen stabil mit dem Konstrukt transfiziert und unter Zeocin-Selektionsdruck gehalten.

Parallel hierzu wurde die HC110-RMycHis-cDNA mit den Primern P83_ATGNotI- 5' 5'-ATA TTG CGG CCG CTT CGG TTT AAT ACC AAC ATG-3' und pMycHis_TGABamHI-3' 5'-CGC GGA TCC TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3' amplifiziert, nachgeschnitten und in den gleichfalls BamHI und NotI restringierten bicistronischen Expressionsvektor pIRES1neo (GenBank Accession Nr.: U89673) [Clontech, Palo Alto, U.S.A.] ligiert. Der pIRES1neo Vektor enthält zusätzlich eine interne Ribosomen-Bindestelle (IRES) des Enzephalomyocarditis-Virus (ECMV) kurz vor dem Start-ATG des Neomycin-Resistenzgens (Rees et al. 1996). Auf diese Weise werden zwei offene Leseraster, das des HC110-R und das des Antibiotika-Re sistenzmarkers, von nur einer mRNA mit einem humanen Cytomegalovirus-(CMV-) Promoter translatiert (Jackson et al. 1990; Jang et al. 1988). Die Selektion erfolgte durch G418 [Calbiochem-Novabiochem, La Jolla, CA, U.S.A.] in COS-7- und HEK- 293-Zellen.

22. Konfokale Laserscanning-Mikroskopie

Für die konfokale Laserscanning-Mikroskopie wurde ein Zeiss IM 35 Mikroskop [Zeiss, Oberkochen] mit einem Leica CLSM-Aufsatz TCS NT ["Confocal Laser Scanning Microscope Unit", Leica Lasertechnik, Heidelberg], Version 1.5.451, ver wendet. Die Fluoreszenz wurde bei 488 nm mit einem Argon-Laser, bei 568 nm mit einem Krypton-Laser angeregt. Z-Serien von optischen Schnitten durch die Zelle wurden mit einer Auflösung von 1024 × 1024 Pixel und einer Schichttiefe von 0,5 µm gescannt [Giese et al. 1995]. Die Auswertung erfolgte mit der AVS Software [Advanced Visual Systems Inc., Waltham, M. A., U.S.A.] sowie später mit Adobe Photoshop 5.0 und Corel Draw 8.0 für Windows.

23. Bindungsstudien von α-LTX an HC110-R Fragmente

Proteine (20 µg/Bahn) wurden durch SDS-PAGE (Lammli et al., 1970) aufgetrennt und auf Nitrocellulosemembranen elektrogeblotted. Im Falle von α-LTX-Bindungs experimenten wurden die Blots bei Raumtemperatur mit α-LTX bei einer Konzentration von 20 nM in TST für 2 h inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit TST wurde ein anti-α-LTX-Antikörper (aus Kaninchen, Calbiochem-Novabiochem) bei einer Konzentration von 0,1 µg/ml und ein mit Peroxidase konjugierter und gegen IgG aus Kaninchen gerichteter Antikörper (aus Ziege, Verdünnung: 1 : 25000) verwendet. Die Detektion der Antikörper erfolgte in allen Experimenten mit ECL (Amersham-Pharmacia).

24. Calcium-Imaging

Die intrazelluläre freie Ca²⁺-Konzentration [Ca²⁺]_i wurde in transient mit dem HC110-R-EGFP- bzw. β₂-AR-EGFP-Konstrukt transfizierten COS-7- und HEK293- Zellen mit Hilfe der Calcium-Imaging-Methode gemessen. Je 2 × 10⁵ COS-7- und HEK293-Zellen wurden auf ein mit 1%iger Gelatine beschichtetes 42 mm großes Deckgläschen in 55 mm großen Gewebekulturschalen mit 5 ml DMEM-Medium (mit 10% FCS und Pen/Strep) ausgebracht. Die Transfektion erfolgte mit Hilfe des nicht-liposomalen Transfektionsreagenzes FuGENE 6 [Roche Molecular Bio chemicals, Mannheim]. Dabei wurden 6 µl FuGENE 6 in 200 µl DMEM-Medium ohne FCS zunächst für 5 min bei RT und nach Zugabe von 4 µg Plasmid-DNA für weitere 15 min bei RT inkubiert, bevor der gesamte Transfektionsansatz tropfen weise zu den Zellen pipettiert wurde. Transfiziert wurden Konstrukte des HC110-R "full length" Klones mit einem im richtigen Leseraster fusionierten GFP-Tag und die komplette cDNA des β₂-Adrenergen Rezeptors, die ebenfalls mit einem GFP-Tag am 3'-Ende versehen worden war. Als Kontrolle dienten 4 µg Plasmid-DNA des reinen pEGFP-N3-Expressionsvektors [Clontech, Heidelberg], sowie nicht-transfizierte Zellen, denen das Transfektionsreagenz FuGENE 6 ohne DNA zugesetzt wurde.

Die Beladung der Zellen mit 1 µM Fura-2/Acetoxymethylester (Fura-2/AM) [Sigma, Deisenhofen] erfolgte 48 h nach der Transfektion in einer Na⁺-HBS-Lösung (150 mM NaCl; 5,4 mM KCl; 1,8 mM CaCl₂; 0,8 mM MgSO₄.7 H₂O; 20 mM Glucose; 20 mM Hepes in H₂O, pH 7,3) für 30 min bei 37°C, 5% CO₂ und 95% Luftfeuchtigkeit. Nach der Inkubation wurden die mit Fura-2/AM beladenen Zellen in einem Inversmikrokop [Zeiss, Aciovert; Germany] und parallel hierzu in einem digitalen "Imaging"-Fluoreszenzmikroskop (PTI) betrachtet und bei einer Wellen länge von 440 bzw. 490 nm in transfizierte, sowie nicht transfizierte Zellen unter schieden. Durchschnittlich wurden je 5-7 transfizierte und nicht transfizierte Zellen durch das Setzen eines ROI ("region of interest") ausgewählt. Die Messung der Extinktion erfolgte bei 340 nm (Calcium-gebundenes Fura-2/AM) und 380 nm (freies Fura-2/AM), die der Emission bei 510 nm. Die Auswertung erfolgte mit der Image Master 1.x-Software durch Bildung des Quotienten von 340 : 510 nm, 380 : 510 nm und des Ratio von 340/380 : 510 nm ("background corrected images") als eine Funktion des zugefügten Agens.

Die Zugabe von Agentien erfolgte stets 6 min nach Beginn der Messung durch Ab nahme eines entsprechenden Volumens Na⁺-HBS-Puffer und direktes Zupipettieren der Agentien in das Probengefäß für weitere 30 bis 50 min. Das Gesamtvolumen im Probengefäß betrug während des gesamten Versuches konstant 1,5 ml. Zu den das Fusionsprotein HC110-R-GFP exprimierenden COS-7-Zellen wurden zunächst 30 nM und 75 nM α-Latrotoxin [α-LTX, RBI. Natick, U.S.A.], zu den HC110-R- GFP exprimierenden HEK-293-Zellen wurden zur Ermittlung der Dosisabhängigkeit verschiedene Konzentrationen an α-LTX (7,5 nM; 25 nM; 50 nM, 75 nM, 90 nM und 120 nM), bzw. zur Ermittlung der optimalen Wirkkonzentration verschiedene Konzentrationen des zyklischen Depsipeptids BAY44-4400 (100 ng/ml (89,3 nM), 333 ng/ml (297 nM); 400 ng/ml (357 nM), 1 µg/ml (893 nM), 10 µg/ml (8,9 µM) in 0,1% DMSO) jeweils 6 min nach Versuchsbeginn zugesetzt. In einigen Experimenten wurden die HEK-293-Zellen für 90 min mit 4 bzw. 400 ng/ml BAY44-4400, bzw. mit 4 bzw. 400 ng/ml des anthelmintisch inaktiven optischen Antipoden PF1022-001 in Na⁺-HBS bei 37°C, 5% CO₂ und 97% Luftfeuchte vor inkubiert und die Zellen nach 60 min durch Zusetzen von 1 µM Fura-2/AM zur BAY44-4400-Lösung, bzw. zum PF1022-001, während der restlichen 30 min beladen. Nach dem Einbringen der Zellen in die Apparatur wurden auch hier 6 min nach Ver suchsbeginn 75 nM α-LTX zugesetzt. An HEK-293-Zellen, die den β₂-Adrenergen Rezeptor mit C-terminalem GFP-Tag (β₂-R-GFP) exprimieren, wurde die optimale α-LTX-Konzentration von 75 nM ausgetestet. CdCl₂ (je 1 µM und 10 µM) wurden in Na⁺-HBS, Nifedipin (15 µM) und EGTA (2 mM) in 0,1% DMSO gelöst. Die Zugabe von CdCl₂ und Nifedipin erfolgte direkt zu Versuchsbeginn und vor α-LTX- Zugabe, EGTA wurde sowohl zu Versuchsbeginn, als auch 4 min nach α-LTX-Zu gabe. Gelöstes α-LTX lag in einer Konzentration von 300 nM in 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, vor; BAY44-4400 wurde zunächst in reinem DMSO (Stammlösungen zwischen 0,004-10 µg/ml) gelöst. Die Stammlösungen wurden in dem Na⁺-HBS- Puffer auf die gewünschte Konzentration eingestellt. Die maximal lösbare Menge des Wirkstoffes BAY44-4400 bei einer Endkonzentration von 0,1% DMSO wurde durch Anlegen einer Verdünnungsreihe in Na⁺-HBS ermittelt. Weder 0,1% DMSO noch eine andere Testkomponente interagierte bei den gewählten Konzentrationen mit Fura-2/AM.

Die Daten wurden mit Hilfe des Tabellenkalkulationsprogrammes Excel 98 ausge wertet. Die Ergebnisse resultieren aus wenigstens 2-4 reproduzierten Versuchen zu je 4-8 transfizierten und nicht transfizierten Zellen (s. Standardabweichungen).

Die intrazelluläre Calcium-Konzentration wurde nach Grynkiewicz et al. (1985) nach vorausgehender Kalibrierung gemäß McCormack et al. (1991) berechnet.

25. Bindung von PF1022A an HC110-R

Im Folgenden soll die Bindung von PF1022A und dem Morpholin-Derivat BAY44-4400 an HC110-R durch SDS-PAGE, Liganden-Präzipitation und analytische Durch flußcytometrie gezeigt werden. Außerdem soll überprüft werden, ob PF1022A und seine Derivate - ähnlich wie α-LTX - zu Veränderungen der [Ca²⁺]_i in HC110-R transfizierten HEK-293-Zellen führen oder aber das HC110-R vermittelte α-LTX- "Signalling" beeinflussen.

Gelegentlich zeigen Antikörper oder Proteine, die in der Immunfluoreszenz deutliche Signale geben, keine Reaktion bei der Anwendung des Immunoblot-Verfahrens. Da zur Durchführung der SDS-PAGE eine Denaturierung der Proteine notwendig ist, kommt es gegebenenfalls zu einer Zerstörung konformationsabhängiger Epitope. Antikörper oder Proteine, die spezifisch solche Epitope erkennen, können deshalb nicht mehr binden. So kann auch weder mit dem biotinylierten Wirkstoff PF1022A, noch mit dem im Vergleich zum PF1022A besser löslichen Morpholin-Derivat BAY44-4400 eine HC110-R spezifische Bindung im Western Blot ausgemacht werden. BAY44-4400 unterscheidet sich von PF1022A durch 2 Morpholin-Reste, die kovalent an die Phenylringe der beiden D-Phenyllactyl-Reste von PF1022A gebun den sind. Renaturiert man die Proteine im SDS-Trenngel jedoch mit Hilfe von Harnstoff, der durch Aufhebung hydrophober Wechselwirkungen eine partielle Ent fernung des SDS bewirkt, so kann im Western Blot eine HC110-R spezifische Bindung nachgewiesen werden. Hierzu wurde Gesamtprotein aus nicht transfizierten, aus HC110-R-Myc/His transient exprimierenden HEK-293-Zellen sowie aus dem in E. coli exprimierten 54 kDa großen N- und dem 21 kDa großen C-Terminus von HC110-R durch SDS-PAGE aufgetrennt, renaturiert und wie gewohnt geblottet. Die Immundetektion erfolgte nach der Inkubation mit dem Liganden BAY44-4400, mit einem Kaninchen-anti-PF1022A-KLH-Immunserum und einem Ziege-anti-Kanin chen IgG-HRP-Antikörper. Ferner wurde ein partiell renaturiertes SDS-Polyacryl amidgel mit den Proteinfraktionen nicht transfizierter, HC110-R-Myc/His transient transfizierter HEK-293-Zellen sowie dem in E. coli exprimierten N-Terminus von HC110-R und Gesamtprotein aus H. contortus geblottet, mit PF1022A-Biotin inkubiert und über Streptavidin-HRP detektiert. Beide Blots wiesen je eine distinkte 116 kDa große Bande in den HC110-R-Myc/His stabil exprimierenden HEK-293- Zellen auf, wohingegen die Spuren mit nicht transfizierten Zellen keine Bande in dieser Höhe aufwiesen. Ferner banden sowohl das Morpholinderivat BAY44-4400, als auch das biotinylierte PF1022A an den 54 kDa großen N-Terminus von HC110-R, der 21 kDa große C-Terminus zeigte keine spezifische PF1022A- Bindung. Durch das biotinylierte PF1022A konnten in der Gesamt-Proteinfraktion adulter H. contortus Nematoden insgesamt 2 Banden detektiert werden: Eine 110 kDa große Bande und eine weitere ca. 88 kDa große Bande. Bei letzterer handelt es sich höchstwahrscheinlich um ein biotinyliertes Protein, wie es bereits für den Nematoden Heterakis spumosa mit 83 kDa beschrieben wurde, zumal es im Gegen satz zu der 110 kDa großen Bande selbst dann detektiert wird, wenn der Nachweis ausschließlich über Streptavidin-HRP erfolgt. HC110-R-Myc/His stabil transfizierte HEK-293-Zellen weisen dagegen allein unter Streptavidin-HRP keine 116 kDa große Bande mehr auf. Des Weiteren konnte ausgeschlossen werden, dass der verwendete Ziege-anti-Kaninchen IgG-HRP-Sekundärantikörper allein unspezifische Signale verursacht.

Um diese Ergebnisse weiter zu verifizieren, wurde folgende Liganden-Präzipitation durchgeführt. Je 2 mg und 4 mg magnetische Dynal M-280-Streptavidin-gekoppelte Beads wurden mit 500 µg biotinyliertem PF1022A versetzt. Einem Kontrollansatz mit 4 mg Dynal-Beads wurde TST-Puffer anstelle von PF1022A zugesetzt. Über schüssiges PF1022A-Biotin wurde durch magnetische Separation entfernt, bevor ein Gemisch aus den in E. coli exprimierten und zuvor über Affinitätschromatographie aufgereinigten HC110-R N- und C-Terminus zugegeben wurde. Nach erneuter mag netischer Separation zur Abtrennung nicht gebundener HC110-R-Fragmente wurde je ein Aliquot ausgehend von 2 mg und 4 mg Dynal-Beads über SDS-PAGE aufge trennt und geblottet. Die Detektion des Präzipitates erfolgte über das N-terminal fusionierte His-Tag mit einem Maus-anti-His IgG- und einem Kaninchen-anti-Maus IgG-HRP-Antikörper. Nur die N-terminale 54 kDa große Region von HC110-R wird durch PF1022A präzipitiert, folglich wird der nicht an PF1022A gebundene C- Terminus von HC110-R zuvor durch magnetische Separation entfernt. Unspezifische Bindungen des N- oder C-Terminus von HC110-R an die Streptavidin-gekoppelten Beads wurden ausgeschlossen, indem einem Reaktionsansatz kein biotinyliertes PF1022A zugesetzt wurde.

Die Bindung des Liganden PF1022A in vivo an HC110-R wurde außerdem mit Hilfe der FACS-Analyse überprüft (Abb. 13). Hierzu wurden in Dreifach-Ansätzen HEK-293-Zellen transient mit HC110-R-GFP oder GFP-HC110-R transfiziert oder aber transient mit HC110-R-Myc/His und GFP kotransfiziert. Zur Kontrolle wurden nicht transfizierte sowie transient mit dem β₂-R-GFP oder dem M1-R-GFP trans fizierte HEK-293-Zellen eingesetzt. 24 h nach der Transfektion wurden die Zellen mit biotinyliertem PF1022A inkubiert und PF1022A gebundene Zellen über Strep tavidin-Phycoerythrin detektiert und abschließend fixiert. Eine Negativkontrolle HC110-R-GFP transfizierter Zellen wurde ohne PF1022A-Biotin nur mit Strepta vidin-Phycoerythrin inkubiert.

Die Fluoreszenzanalyse von je 10000 HEK-293-Zellen erfolgte mit dem FACScan bei einer Anregungswellenlänge von 488 nm hinsichtlich ihrer Zellgröße, Granula rität und Fluoreszenzfärbung. Phycoerythrin besitzt - wie auch TRITC - ein mit EGFP überlappendes Absorptionsspektrum bei ausreichend getrennten Emissions spektren, so daß beide Fluorochrome bei nur einer Wellenlänge angeregt werden können. Zelitrümmer wurden durch das Setzen eines "Gate" auf die Haupt-Zellpopu lation von der Messung der Fluoreszenzintensität ausgeschlossen. Zur quantitativen Auswertung wurden die Grenzen für negative, ungefärbte und positive, GFP-fluores zierende Zellen anhand der nicht transfizierten und mit GFP transfizierten Zellen festgelegt. Die 4,6% grünfluoreszierenden, nicht transfizierten HEK-293-Zellen (Autofluoreszenz) wurden von den anderen GFP-fluoreszierenden Proben abge zogen; und der Wert für die unspezifische Färbung der Zellen durch das mit Phyco erythrin gekoppelte Streptavidin (5,4%) wurde von allen rotfluoreszierenden Zellen abgezogen (Tab. 1).

Tabelle 1

Nachweis der PF1022A-Bindung an HC110-R transfizierte HEK-293-Zellen durch FACScan

Berechnet man den prozentualen Anteil der grünfluoreszierenden Zellen, die nach Abzug der Autofluoreszenz bzw. der unspezifischen Rotfärbung durch Streptavidin- Phycoerythrin auch rotfluoreszierend waren, so binden 41,2% der HC110-R-GFP exprimierenden Zellen, 26,8% der GFP-HC110-R exprimierenden Zellen sowie 44,5% der mit HC110-R-Myc/His und GFP kotransfizierten Zellen PF1022A, da gegen binden nur 7,5% der GFP exprimierenden Zellen, 9,9% der β₂-R-GFP exprimierenden Zellen und 19,2% der M1-R-GFP exprimierenden Zellen PF1022A (Abb. 13).

26. Wechselwirkungen von PF1022A-Derivaten mit HC110-R vermittelter α-LTX Signaltransduktion

PF1022A zeigt neuropharmakologische in vitro Aktivität zwischen 10^-9-10^-3 mg/ml je nach Nematodenart. Um eine mögliche Interferenz von PF1022A und seiner Derivate mit HC110-R und dem durch HC110-R vermittelten α-LTX-"Signalling" festzustellen, wurde mit Hilfe der Ca²⁺-Imaging-Methode der Einfluß von BAY44-4400, einer besser löslichen Morpholin-Variante von PF1022A, auf HC110-R transient oder stabil exprimierende HEK-293-Zellen untersucht. Zur Kontrolle wurde der in vitro wie in vivo mehr als 100fach weniger wirksame optische Antipode zu PF1022A, PF1022-001, eingesetzt. BAY44-4400 und PF1022-001 wurden aufgrund ihrer Hydrophobizität zunächst in reinem DMSO gelöst. Die Stammkonzentration wurde dabei so gewählt, daß im Versuchsansatz stets nur 0,1% DMSO gegenwärtig waren. Für DMSO-Konzentrationen bis einschließlich 0,1% konnte in Kontrollversuchen ausgeschlossen werden, daß sie in nicht transfizierten wie HC110-R-GFP transfizierten HEK-293-Zellen zu einer Beeinträchtigung der Versuchsergebnisse führten (Abb. 14A). Fura-2 beladene nicht transfizierte sowie mit HC110-R-GFP transfizierte Zellen wurden zum einen mit 100, 300 oder 400 ng/ml sowie 1 oder 10 µg/ml BAY44-4400 und zum anderen mit den gleichen Konzentrationen PF1022-001 stimuliert. Bei keiner Konzentration konnte über den gesamten Zeitraum von 50 min eine Ca²⁺-vermittelte Antwort festgestellt werden. Abb. 14B und C zeigen exemplarisch die Stimulation HC110-R-GFP und M1-R-GFP transfizierter Zellen mit 400 ng/ml BAY44-4400 und PF1022-001. Da die PF1022A- Derivate möglicherweise auch von den Zellen aufgenommen werden und damit sekundär in Signaltransduktionswege eingreifen können und weil die PF1022A- Derivate je nach Parasit längere Zeit im Wurm verweilen, wurden die Zellen in einigen Versuchen für 90 min mit den Derivaten vorinkubiert. Zellen, die für 90 min mit 4 ng/ml oder 400 ng/ml BAY44-4400 oder PF1022-001 vorinkubiert wurden, zeigten keine Veränderung der [Ca²⁺]_i (Abb. 14D). Bei direkter Zugabe von Konzentrationen ab 300 ng/ml BAY44-4400 konnte - im Gegensatz zu dem optischen Antipoden - eine leichte, aber innerhalb weniger Minuten reversible Zell schwellung als unmittelbare Wirkung auf das Anthelmintikum in HC110-R-GFP transfizierten HEK-293-Zellen auf einem Monitor, der die Zellen 40fach vergrößert darstellte, beobachtet werden.

Von Piperazin weiß man neuesten Versuchen zufolge, daß es die Wirkung von PF1022A/BAY44-4400 in in vitro- wie in vivo-Versuchen mit Heterakis spumosa synergistisch verstärkt. Bei gleichzeitiger Gabe von 400 ng/ml BAY44-4400 mit 1 oder 10 µM Piperazin (Abb. 14F) konnte weder in nicht transfizierten, noch in HC110-R-GFP transient transfizierten HEK-293-Zellen eine Änderung der [Ca²⁺]_i festgestellt werden. Der Kontrollansatz mit 10 µM Piperazin führte ebenfalls in nicht transfizierten und HC110-R-GFP transfizierten Zellen zu keiner Veränderung des Ca²⁺-Haushaltes (Abb. 14E).

Im Gegensatz dazu beeinflußten sowohl BAY44-4400, als auch der optische Antipode PF1022-001, in Anwesenheit von 75 nM α-LTX die α-LTX-induzierte Signaltransduktion von HC110-R-GFP exprimierenden HEK-293-Zellen, wenngleich auch in unterschiedlichem Ausmaß (Abb. 14B-E). In einem Kontrollexperiment, in dem man HC110-R-GFP oder M1-R-GFP transfizierten Zellen 6 min vor der Stimulation mit 75 nM α-LTX 0,1% DMSO zusetzte, konnte ausgeschlossen werden, daß das für BAY44-4400 und auch PF1022-001 verwendete Lösungsmittel in dieser Konzentration einen Einfluß auf die durch α-LTX induzierte Veränderung der [Ca²⁺]_i ausübte. HC110-R-GFP exprimierende Zellen zeigten im Gegensatz zu den M1-R-GFP exprimierenden Zellen nach α-LTX-Zugabe den bereits geschilder ten biphasischen Verlauf mit vergleichbaren Werten für [Ca²⁺]_i (Abb. 15A). Inkubierte man HC110-R-GFP exprimierende Zellen 6 min vor der α-LTX-Zugabe mit 4 ng/ml BAY44-4400, so verringerte sich der beschriebene Einfluß des α-LTX auf die Ca²⁺-Konzentration: Der durch α-LTX induzierte erste kleine Anstieg der [Ca²⁺]_i verschwand und der zweite verzögerte Peak wurde 14 min nach der α-LTX- Zugabe auf 44 ± 60 nM Ca²⁺ reduziert (Abb. 15B). In Anwesenheit von 4 ng/ml PF1022-001 - die Zugabe erfolgte 6 min vor der Stimulation mit α-LTX - kam es zu einem schnellen sofortigen Anstieg von 103 ± 11,5 nM Ca²⁺ (Abb. 15B). Wurde HC110-R-GFP exprimierenden Zellen 6 min vor der α-LTX-Zugabe 400 ng/ml BAY44-4400 zugesetzt, kam es - ähnlich wie bei 4 ng/ml BAY44-4400 (Abb. 15B) - zu einer verzögerten Erhöhung der [Ca²⁺]_i um 49 ± 4,2 nM nach 23 min, die 8 min später auf ein verglichen mit den Ausgangswerten um 11 ± 1,4 nM leicht erhöhtes Plateau absank (Abb. 15C). Setzte man 400 ng/ml PF1022-001 6 min vor der Inkubation mit 75 nM α-LTX zu, so kam es zu einer schnellen Ca²⁺-Erhöhung um 112 ± 14,3 nM Ca²⁺ (Abb. 15C), wie sie bereits bei Zugabe von 4 ng/ml PF1022-001 beobachtet werden konnte (Abb. 15B). In einem anderen Versuchsansatz wurden HC110-R-GFP exprimierende HEK-293-Zellen jeweils mit 4 ng/ml (Abb. 15D) oder 400 ng/ml BAY44-4400 bzw. PF1022-001 (Abb. 15E) für 90 min vorinkubiert.

Nicht gebundener oder aufgenommener Wirkstoff wurde nach der Inkubation und Beladung der Zellen mit Fura-2/AM sorgfältig weggewaschen, bevor die Zellen mit 75 nM α-LTX stimuliert wurden. Mit dem optischen Antipoden PF1022-001 vorinkubierte HC110-R transfizierte Zellen zeigten bei 4 ng/ml PF1022-001 eine Erhöhung der [Ca²⁺]_i um 102 ± 6,4 nM (Abb. 15D) und bei 400 ng/ml eine vergleich bare Erhöhung um 109 ± 8,4 nM Ca²⁺ (Abb. 15E). Dieser bereits wenige Minuten nach α-LTX-Zugabe beobachtete Ca²⁺-Anstieg glich den bereits in Abb. 15B und C beobachteten schnellen Veränderungen der [Ca²⁺]_i, als PF1022-001 unmittelbar vor der Stimulation mit α-LTX zugegeben wurde. BAY44-4400 dagegen zeigte unter schiedliche Antworten bezüglich des α-LTX induzierten Ca²⁺-Einstroms: Wurden HC110-R-GFP exprimierende Zellen mit 4 ng/ml BAY44-4400 für 90 min vor inkubiert, kam es durch α-LTX-Induktion zu einer maximalen Erhöhung der [Ca²⁺]_i um 95 ± 20,5 nM bei 10 min, bevor sie auf ein um 23 ± 2,6 nM Ca²⁺ erhöhtes ausge dehntes Plateau absank (Abb. 15D). Bei Vorinkubation mit 400 ng/ml BAY44-4400 kam es nach α-LTX-Stimulation zu einer Ca²⁺-Erhöhung der [Ca²⁺]_i um maximal 65 ± 7,5 nM (Abb. 15D), die zudem noch 12 min verzögert gegenüber der Vor inkubation mit 4 ng/ml BAY44-4400 auftrat (Abb. 15C).

Setzte man stabil HC110-R-Myc/His exprimierenden HEK-293-Zellen 6 min vor der α-LTX-Zugabe 400 ng/ml BAY44-4400 zu, so wird die beobachtete direkte Er höhung der [Ca²⁺]_i um 267 ± 45,8 nM komplett inhibiert (Abb. 15F). Im Gegensatz dazu führt die Zugabe von 400 ng/ml PF1022-001 mit einer Ca²⁺-Erhöhung um 209 ± 33,4 nM Ca²⁺ zu keiner signifikanten Veränderung der [Ca²⁺]_i (Abb. 15F).

Um den spezifischen Einfluß von BAY44-4400 auf das α-LTX vermittelte Ca²⁺- "Signalling" in HC110-R exprimierenden Zellen zu zeigen, wurden folgende Kontrollexperimente durchgeführt: Zunächst wurden nicht transfizierte HEK-293- Zellen mit 1 mM Carbamylcholin-Chlorid (Carbachol), einem Liganden für muscarinische Acetylcholin-Rezeptoren, unter An- und Abwesenheit von 400 ng/ml BAY44-4400 stimuliert (Abb. 15G). In beiden Fällen kam es zu einer vergleichbaren sofortigen Erhöhung der [Ca²⁺]_i durch endogene, natürliche muscarinische Acetyl cholin-Rezeptoren um 58 ± 8,1 nM Ca²⁺ für HEK-293-Zellen bei Anwesenheit von BAY44-4400 und um 53 ± 6,8 nM Ca²⁺ bei Abwesenheit des Anthelmintikums. Die zusätzliche transiente Transfektion von HEK-293-Zellen mit dem C-terminal GFP- fusionierten, humanen muscarinischen M1-Acetylcholin-Rezeptor (M1-R-GFP) führte zu einer gegenüber nicht transfizierten Zellen (Abb. 15G) leichten Erhöhung der [Ca²⁺]_i um 89 ± 5.5 nM bei An- und um 85 ± 6,1 nM Ca²⁺ bei Abwesenheit von 400 ng/ml BAY44-4400 (Abb. 15H). Auch konnte kein signifikanter Einfluß von BAY44-4400 auf den M1-R-GPCR beobachtet werden. Stimulierte man in nicht transfizierten HEK-293-Zellen die endogen vorhandenen natürlichen β₂-adrenergen Rezeptoren mit 1 mM Isoproterenol oder die nicotinischen Rezeptoren mit 1 mM Arecolin - wie bereits für Carbachol beschrieben - unter An- und Abwesenheit von 400 ng/ml BAY44-4400, so kam es auch hier zu keinem signifikanten Unterschied der [Ca²⁺]_i (Abb. 15I). Isoproterenol induzierte einen Anstieg der [Ca²⁺]_i von 45 ± 4,7 nM in An- und eine Zunahme von 48 ± 5,7 nM Ca²⁺ in Abwesenheit von BAY44-4400. Infolge der Arecolin-Stimulation kommt es in Anwesenheit von BAY44-4400 zu einer Erhöhung um 28 ± 4,1 nM Ca²⁺, in Abwesenheit des Wirk stoffes um 27 ± 3,5 nM Ca²⁺ (Abb. 15I).

27. Gewinnung von Antikörpern

Zur Gewinnung von Antikörpern wurden weibliche NMRI-Mäuse sowie Kaninchen (Chinchilla-Bastarde) eingesetzt. Für die Immunisierung der NMRI-Mäuse wurden 3 × 15 µg des aufgereinigten 21 kD großen C-terminalen HC110-R Proteinfrag mentes in je 100 µl PBS^- zusammen mit 100 µl FCA gelöst und an den Tagen 1, 8 und 15 zwei naiven NMRI-Mäusen subkutan gespritzt. Die Blutabnahme und Serum gewinnung erfolgte am Tag 23.

Zur Serumgewinnung wurde das durch Herzpunktion gewonnene Blut zunächst für 1 h bei 37°C und dann für mindestens 2 h bei 4°C inkubiert. Anschließend wurden die zellulären Bestandteile zweimal für 10 min bei 3000 rpm und 4°C in der Beckman GPKR-Zentrifuge pelletiert und der Überstand daraufhin für 45 min bei 56°C inaktiviert. Nach einer weiteren 10minütigen Zentrifugation bei 13000 rpm und 4°C in der Heraeus Biofuge 15R konnte das Serum abgenommen und bis zum weiteren Gebrauch bei -20°C gelagert werden.

Zwei Kaninchen wurde nach der ersten Blutentnahme und Gewinnung des Prä immunserums zunächst 50 µg des C-terminalen 21 kD großen HC110-R Proteins, sowie des 54 kD großen N-terminalen HC110-R Proteins in einer zu gleichen Teilen aus PBS^- und FCA bestehenden Suspension subkutan injiziert. Zwei weitere Immuni sierungen mit je 100 µg Antigen erfolgten am Tag 31 und Tag 79 nach der ersten Immunisierung. Eine erste Blutentnahme wurde am Tag 43 durchgeführt. Eine zweite Blutentnahme und Serumgewinnung erfolgte am Tag 98 nach der ersten Immunisierung.

Beschreibung der Abbildungen Abb. 1 HC110-R mRNA und Protein

A) Northern Blot Analyse unter Verwendung von Gesamt-RNA aus Haemonchus contortus und der 3,6 kbp cDNA von HC110-R.
B) 10% SDS-PAGE-Fluorogramm von in vitro translatiertem ³⁵S-markierten HC110-R-Protein. In vitro-Translation von 1 µg in vitro transkribierter HC110-R mRNA (HC110-R), Negativ-Kontrolle ohne HC110-R mRNA (control), 1 µg Luciferase mRNA als Positiv-Kontrolle (luciferase).

Abb. 2 Full length cDNA-Sequenz von HC110-R und abgeleitete Aminosäuresequenz

Das Kozak-Motiv (Kozak, 1989) und das Polyadenylierungsignal von HC110-R (GenBank Accession Nr.: AJ272270) sind unterstrichen; das Startkodon in Position 100 ist fett gedruckt. Signalpeptid (Reste 1-21, fett), Lektin-ähnliche Sequenz (Reste 22-125, gepunktet), Thr-Stretch (Reste 128-147, grau unterlegt); Cystein-reicher Bereich der Struktur CX₉WX₁₂CX₉WXCX₅WX₉CX₃W (Reste 166-221, ge schwungene Linie, Cys- und Trp-Reste zusätzlich fett); 4-Cys-Region der Struktur CXWWX₆WX₄CX₁₁CXC (Reste 478-524, gestrichelt, Cys- und Trp-Reste zusätzlich fett); die 7 Transmembranregionen (zwischen Resten 563-772, fett und unterstrichen); der Prolin-reiche Stretch (Reste 845-861, grau unterlegt), die PEST- Region (Reste 915-933, grau unterlegt); die N-Glykosylierungstelle (Reste 26, 499 und 862, fett); die hochkonservierte putative Disulfidbindung des Cys-Cys-Paares zwischen Sekretin GPCRs (Position 595 und 666, fett und doppelt unterstrichen).

Abb. 3 Alignment der abgeleiteten Aminosäuresequenzen des H. contortus HC110-R und Caenorhabditis elegans Cosmid-Klons B0457 (CE- B0457: GenBank Accession Nr.: Z54306)

Signalpeptid (SP, Reste 1-21, fett), Lektin-ähnliche Sequenz (Lektin, Reste 22-125, gepunktet); Thr-Stretch (T-reich, Reste 128-147, grau unterlegt); Cys-reiche Region der Struktur CX₉WX₁₂CX₉WXCX₅WX₉CX₃W (C-Signatur, Reste 166-221, ge schwungene Linie, Cys- und Trp-Reste zusätzlich fett); 4-Cys-Motiv der Struktur CXWWX₆WX₄CX₁₁CXC (4 C-Region, Reste 478-524, gestrichelt, Cys- und Trp- Reste zusätzlich fett); die 7 Transmembranregionen (zwischen Resten 536-772, fett und unterstrichen); der Pro-reiche Stretch (P-reich, Reste 845-861, grau unterlegt); die PEST-Region (PEST, Reste 915-933, grau unterlegt); die N-Glykosylierungs stellen (Reste 26, 499 und 862, fett); die hochkonservierte putative Disulfidbindung des Cys-Cys-Paares zwischen Sekretin GPCRs (Position 595 und 666, fett und doppelt unterstrichen). Identische Aminosäuren sind mit Sternchen markiert, sehr nahe miteinander verwandte Aminosäuren mit einem Doppelpunkt, verwandte Aminosäuren mit einem einzelnen Punkt.

Abb. 4 Alignment des 7-Transmembranrezeptors HC110-R und mehrerer anderer Rezeptoren der Sekretin-Subfamilie

HC110-R: Haemonchus contortus heptahelikaler Orphan-Transmembranrezeptor (Accession Nr.: AJ272270); BTLAT3: Bos taurus Latrophilin-3 (mehrere Splicing- Varianten, Accession Nr.: G4164053-G4164075); RNLAT1: Rattus norvegicus Latrophilin-1 (Accession Nr.: U78105, U72487); MMEMR1: Mus musculus EMR1 Hormonrezeptor Vorläufer (Accession Nr.: Q61549); HSCD97: Homo sapiens Leukozyten Aktivierungsantigen CD97 (Accession Nr.: P48960); MMCADH: M. musculus Cadherin 7-Transmembranrezeptor-Vorläufer (Accession Nr.: G3800738); XLXRF1: Xenopus laevis Corticotropin Releasing Rezeptor-Vorläufer (Accession Nr.: O42602); RNVIP1: R. norvegicus vasoaktiver intestinaler Polypeptidrezeptor- Vorläufer 2 (Accession Nr.: Q02643). Die sieben Transmembrandomänen sind grau unterlegt (I-VII) und die hochkonservierte putative Disulfidbindung ist fett darge stellt.

Abb. 5 Alignment der abgeleiteten Aminosäuresequenzen des H. contortus HC11-R und R. norvegicus Latrophilin-1 (GenBank Acc. Nr. U78105, U72487)

Abb. 6 Struktur des HC110-R-Proteins und des Latrophilin-1 der Ratte

A) Hydrophobizitätsplot von HC110-R mit der 7-Transmembrandomäne.
B) Proteinstruktur von HC110-R mit den folgenden charakteristischen Motiven:
Signalsequenz (SP), Lektin-Domäne (lectin), Thr-Stretch (T-stretch), Cys- Motiv (signature), 4-Cys-Region (4C-region), 7-Transmembrandomäne (1-7, schwarz), das Pro-reiche Motiv (P-rich) und die PEST-Sequenz (PEST). Die putativen Glykosylierungsstellen sind unter dem Diagramm dargestellt (N), die Cys-Reste der 4C-Region und die beiden konservierten Cys-Reste der putativen Disulfidbindung ebenfalls (dünne Linie ohne Großbuchstaben).
C) Proteinstruktur von Latrophilin-1. Latrophilin-1 hat keinen Thr-Stretch, enthält aber ein zusätzliches Olfaktomedin-Bindungsmotiv (olfactomedin), eine Pro-Thr-Region (P-T-Region), eine Linker-Domäne (linker) und eine lange, mehrere Repeats enthaltende Region (long).

Abb. 7 Expression von HC110-R-GFP in HEK-293 und COS-7-Zellen

A) Gesamtprotein aus transient mit GFP (GFP) oder HC110-R-GFP (HC110-R) transfizierten sowie nicht transfizierten (n. t.) HEK-293- und COS-7-Zellen wurde 24 h nach der Transfektion über die Trizol-Methode isoliert.
B) Gesamtprotein aus transient mit β₂-R-GFP (β₂-R) oder M1-R-GFP (M1-R) transfizierten sowie nicht transfizierten (n. t.) HEK-293-Zellen wurde 24 h nach der Transfektion über die Trizol-Methode isoliert. SDS-Marker-Banden bei 116, 90, 70 und 55 kDa (Marker).

Je 20 µg Gesamtprotein pro Spur wurden über ein 10%iges SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt und auf eine Nitrocellulosemembran geblottet. Nach dem Blocken in Rotißlock-Lösung über Nacht erfolgte die Immundetektion mit dem monoklonalen Maus-anti-GFP IgG-Primär- (0,4 µg/ml) und dem monoklonalen Kaninchen-anti- Maus IgG-HRP-Sekundärantikörper (1 : 25000) durch das ECL-System.

Abb. 8 Zelluläre Lokalisation von HC110-R und β₂-R in transfizierten COS-7-Zellen by CLSM

COS-7-Zellen wurden mit HC110-R-GFP und β₂-R-GFP transfiziert, die beide einen C-terminalen GFP-Tag tragen. Die CSLM wurde 24 Stunden nach der Transfektion durchgeführt. Der Balken entspricht 10 µm.

A) HC110-R-GFP wird an der Plasmamembran und in cytoplasmischen Kompartimenten exprimiert. In der Nähe des Nukleus kann eine Verdichtung von cytoplasmischen Vesikeln beobachtet werden.
B) CSLM-Kolokalisation des grünen HC110-R-GFP-Proteins mit sauren Lysosomen, gefärbt mit LysoTracker Red DND-99 bei 37°C für 1 h.
C) β₂-R-GFP transfizierte Zellen zeigen ein ähnliches GFP-Fluoreszenzmuster wie HC110-R-GFP, bzw. wie unter Punkt (A) beschrieben. Der Rezeptor kann an der Plasmamembran und in Vesikeln lokalisiert werden und kann teilweise mit sauren Lysosomen, gefärbt mit LysoTracker Red DND-99 bei 37°C für 1 h, kolokalisiert werden.
D) Exprimierter β₂-R-GFP kolokalisiert teilweise mit dem endoplasmatischen Retikulum, gefärbt mit monoklonalen anti-KDEL-Antikörpern.

Abb. 9 Bindung von α-Latrotoxin an HC110-R

A) 5 µg Gesamtprotein isolierter Latrodectus revivensis Giftdrüsen (1) sowie reines 130 kDa großes α-LTX (2), ferner je 40 µg Gesamtprotein stabil mit dem HC110-R-Myc/His-Konstrukt in dem pIRES1neo-Vektor transfizierter HEK-293-Zellen (3), nicht transfizierter Zellen (4) und des in E. coli in duzierten 54 kDa großen N-Terminus (6) und 21 kDa großen C-Terminus (7) von HC110-R wurden in einem 10%igen SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt, geblottet und über Nacht geblockt. Die denaturierten Proteine wurden für 2 h mit 20 nM α-LTX inkubiert und mögliche Bindungen von α-LTX mit einem Kaninchen-anti-α-LTX IgG- (1 : 5000), einem Ziege-anti-Kaninchen IgG- HRP-Antikörper (1 : 25000) und dem ECL-System detektiert.
B) Je 40 µg Gesamtprotein des in E. coli induzierten C- (1) und N-Terminus (2) von HC110-R sowie nicht transfizierter (3) und stabil mit HC110-R-Myc/His transfizierter HEK-293-Zellen (4) und adulter H. contortus Nematoden (5) wurde in einem 10%igen SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt und mit einem 4 M Harnstoff-haltigem Renaturierungspuffer partiell renaturiert. Der Blot wurde über Nacht geblockt, mit 20 nM reinem α-LTX inkubiert und α-LTX bindende Proteine mit einem Kaninchen-anti-α-LTX IgG-Antikörper (1 : 5000), Biotin-Protein A (1 : 100), Streptavidin-Peroxidase (1 : 3000) und dem ECL-System nachgewiesen.

Abb. 10 Dosisabhängigkeit von α-LTX auf das HC110-R-vermittelte Ca²⁺-Signalling

HEK-293-Zellen wurden 48 h nach der transienten Transfektion mit HC110-R-GFP für 30 min mit 1 µM Fura-2/AM beladen. Die Stimulation der Zellen erfolgte 6 min mach Beginn der Messung mit unterschiedlichen α-LTX-Konzentrationen für weitere 44 min. Gemessen wurde der Quotient aus 340/380 nm (Ratio) in Abhängigkeit von der Zeit. n gibt die Anzahl der ausgewählten Zellen an.

A) HC110-R-GFP exprimierende Zellen wurden mit 7,5 nM (schwarze Linie) oder 25 nM α-LTX (graue Linie) stimuliert.
B) HC110-R-GFP exprimierenden Zellen wurde 50 nM (graue Linie) oder 75 nM α-LTX (schwarze Linie) zugesetzt.
C) HC110-R-GFP exprimierende Zellen wurden mit 90 nM (graue Linie) oder 120 nM α-LTX (schwarze Linie) stimuliert.
D) Auf der Abszisse ist die [Ca²⁺]_i in nM, auf der Ordinate sind die zur Stimulation von HC110-R-GFP exprimierenden HEK-293-Zellen einge setzten α-LTX-Konzentrationen (0, 7,5, 25, 50, 75, 90 und 120 nM) für den ersten schnellen Peak (1. Peak, graue Linie) und den zweiten verzögerten Peak (2. Peak, schwarze Linie) aufgetragen.

Abb. 11 Ca²⁺-Imaging von HC110-R transfizierten HEK 293-Zellen

A) C-terminal mit GFP getaggtes HC110-R (HC110-R-GFP): schwarze Linie.
N-terminal mit GFP getaggtes HC110-R (GFP-HC110-R): graue Linie.
B) 75 nM α-LTX mit nicht transfizierten HEK-293-Zellen (n. t., schwarze Linie) und GFP transfizierten Zellen (GFP, graue Linie).
C) 75 nM α-LTX mit Zellen, die mit C-terminal getaggtem humanen M1 muskarinischen Acetylcholinrezeptor (M1-R-GFP, graue Linie) und mit C-terminal getaggtem β₂-adrenergem Acetylcholinrezeptor aus der Maus (β₂- R-GFP, schwarze Linie) transfiziert wurden.
D) HC110-R-GFP transfizierte Zellen wurden 6 Minuten vor α-LTX-Zugabe (75 nM) mit 2 mM EGTA behandelt (+EGTA, graue Linie). In der Kontrolle wurde EGTA weggelassen (-EGTA, schwarze Linie).
E) 2 mM EGTA wurden 10 min nach α-LTX-Zugabe (75 nM) zugesetzt (+EGTA, graue Linie). Dem Kontrollansatz wurde kein EGTA zugesetzt (-EGTA, schwarze Linie).
F) Zur Kontrolle wurden nicht transfizierte (n. t., graue Linie) und HC110-R- GFP exprimierende Zellen (schwarze Linie) über 30 Minuten mit 2 nM EGTA versetzt.

Abb. 12 Störung der durch α-LTX bedingten Signalübertragung durch BAY44-4400

HEK-293-Zellen wurden transient mit GFP-getaggtem HC110-R-Protein transfiziert und 48 h nach der Transfektion stimuliert (Pfeile). Ca²⁺-Imaging wurde für 50 Mi nuten (Abb. A-D) durchgeführt, Kontrollexperimente mit verschiedenen endogenen natürlichen Rezeptoren nicht transfizierter HEK-293-Zellen für 20 Minuten. n = An zahl der Zellen.

A) Zugabe von 400 ng/ml BAY44-4400 (schwarze Linie) oder von PF1022-001 (graue Linie) zu den Zellen. Zur Kontrolle wurden die Zellen nach der Zugabe von BAY44-4400 oder PF1022-001 mit Na⁺-HBS-HEPES-Puffer (HBS) behandelt, der auch als Lösungsmittel für die jeweiligen Substanzen diente.
B) Durch α-LTX (75 nM) bedingte Signalübertragung in Gegenwart von 4 ng/ml BAY44-4400 (schwarze Linie) und PF1022-001 (graue Linie).
C) Durch α-LTX bedingte Signalübertragung in Zellen, die für 90 Minuten mit 4 ng/ml BAY44-4400 (schwarze Linie) oder PF 1022-001 (graue Linie) vor inkubiert wurden. Die Substanzen wurden vor der Zugabe von α-LTX wieder entfernt.
D) Durch α-LTX bedingte Signalübertragung in HC110-R-GFP transfizierten Zellen, die für 90 Minuten mit 400 ng/ml BAY44-4400 (schwarze Linie) oder PF1022-001 (graue Linie) vorinkubiert wurden. Die Substanzen wurden vor der Zugabe von α-LTX wieder entfernt.
E) Nicht transfizierte HEK-293-Zellen wurden mit 1 mM Carbamylcholine chlorid (Carbachol) für 100 s in An- (400 ng/ml BAY44-4400, schwarze Linie) oder Abwesenheit von 400 ng/ml BAY44-4400 (graue Linie, -BAY44-4400) stimuliert.
F) Nicht transfizierte HEK-293-Zellen wurden mit 1 mM Isoproterenol und mit 1 mM Arecolin für jeweils 100 s in An- (400 mg/ml BAY44-4400, scharze Linie) oder Abwesenheit von 400 ng/ml BAY44-4400 (-BAY44-4400, graue Linie) stimuliert.

Abb. 13 Nachweis der PF1022A-Bindung an HC110-R transfizierte HEK-293- Zellen durch FACScan

Je 5 × 10⁵ nicht transfizierte, transient mit GFP, HC110-R-GFP, GFP-HC110-R, β₂- R-GFP und M1-R-GFP transfizierte sowie transient mit HC110-R-Myc/His und GFP kotransfizierte HEK-293-Zellen wurden 24 h nach der Transfektion mit 0,5 µg/ml PF1022A-Biotin und Streptavidin-Phycoerythrin (1 : 300) inkubiert und anschließend fixiert. Als Negativkontrolle wurden HC110-R-GFP transfizierte Zellen ohne PF1022A-Biotin nur mit Streptavidin-Phycoerythrin inkubiert. Nach Abzug der Autofluoreszenz, d. h. der 4,6% nicht transfizierten Zellen (n. t.) im Grünkanal von allen grünfluoreszierenden Zellen und der durch Streptavidin-Phycoerythrin be dingten 4,4% unspezifischen Färbung im Rotkanal wurde der prozentuale Anteil der GFP-fluoreszierenden Zellen (GFP, HC110-R-GFP, GFP-HC110-R, β₂-R-GFP, M1-R-GFP und HC110-R-Myc/His + GFP) ermittelt, die PF1022A gebunden haben (PF1022A-Bindung in %). Die Standardabweichung ergibt sich durch die Bestim mung der Mittelwerte von Dreifach-Ansätzen.

Abb. 14 Einfluß von BAY44-4400 und dem optischen Antipoden PF1022-001 auf das HC110-R vermittelte Ca²⁺-"Signalling"

Die Beladung der Zellen mit 1 µM Fura-2/AM erfolgte in nicht transfizierten HEK- 293-Zellen sowie 48 h nach der transienten Transfektion mit HC10-R-GFP oder M1-R-GFP. Gemessen wurde der Quotient aus 340/380 nm (Ratio) in Abhängigkeit von der Zeit. n gibt die Anzahl der ausgewählten Zellen an.

A) nicht transfizierte (n. t., graue Linie) und HC110-R-GFP transfizierte (HC110-R-GFP, schwarze Linie) Zellen wurden zur Kontrolle nach 6 min mit 0,1% des Lösungsmittels DMSO in Na⁺-HBS-Puffer versetzt.
B) HC110-R-GFP (schwarze Linie) und M1-R-GFP (graue Linie) transfizierte Zellen wurden nach 6 min mit 400 ng/ml BAY44-4400 stimuliert.
C) Wie (B), HC110-R-GFP (schwarze Linie) und M1-R-GFP (graue Linie) transfizierte Zellen wurden nach 6 min mit 400 ng/ml PF1022-001 stimuliert.
D) HC110-R-GFP exprimierende Zellen wurden für 90 min mit 400 ng/ml BAY44-4400 (schwarze Linie) oder PF1022-001 (graue Linie) vorinkubiert und nicht gebundene Substanzen vor der Messung weggewaschen.
E) Nicht transfizierten (n. t., graue Linie) und HC110-R-GFP exprimierenden Zellen (HC110-R-GFP, schwarze Linie) wurde nach 6 min 10 µM Piperazin zugesetzt.
F) Wie (E), nur wurde nicht transfizierten (n. t., graue Linie) und HC110-R-GFP exprimierenden Zellen (HC110-R-GFP, schwarze Linie) nach 6 min ein Gemisch aus 10 µM Piperazin und 400 ng/ml BAY44-4400 verabreicht.

Abb. 15 Wechselwirkungen des HC110-R vermittelten α-LTX-"Signalling" durch PF1022A-Derivate

Die Beladung der Zellen mit 1 µM Fura-2/AM erfolgte in nicht transfizierten HEK- 293-Zellen sowie 48 h nach der transienten Transfektion mit HC110-R-GFP oder M1-R-GFP. Die eingesetzte α-LTX-Menge betrug stets 75 nM. Für die Versuche mit den Kontrollsubstanzen wurden die Zellen mit einer Fließgeschwindigkeit von 1,6 ml Na⁺-HBS/min umspült. Gemessen wurde der Quotient aus 340/380 nm (Ratio) in Abhängigkeit von der Zeit. n gibt die Anzahl der ausgewählten Zellen an.

A) HC110-R-GFP (schwarze Linie) und M1-R-GFP (graue Linie) exprimierende Zellen wurden 6 min vor der α-LTX-Stimulation mit 0,1% DMSO versetzt, um auszuschließen, daß DMSO Einfluß auf α-LTX induzierte Veränderungen der [Ca²⁺]_i nimmt.
B) HC110-R-GFP transfizierte Zellen wurden 6 min vor der α-LTX-Zugabe mit 4 ng/ml BAY44-4400 (schwarze Linie) oder PF1022-001 (graue Linie) ver setzt.
C) Wie (B), nur wurde HC110-R-GFP exprimierenden Zellen 6 min vor der Stimulation mit α-LTX 400 ng/ml BAY44-4400 (schwarze Linie) oder PF1022-001 (graue Linie) zugegeben.
D) HC110-R-GFP transfizierte Zellen wurden für 90 min mit 4 ng/ml BAY44-4400 (schwarze Linie) oder PF1022-001 (graue Linie) vorinkubiert und nicht gebundene Substanzen vor der Messung entfernt. Die Stimulation der Zellen erfolgte nach 6 min mit α-LTX.
E) Wie (D), nur wurden HC110-R-GFP transfizierte Zellen für 90 min mit 400 ng/ml BAY44-4400 (schwarze Linie) oder PF1022-001 (graue Linie) vorinkubiert, nicht gebundene Substanzen vor der Messung entfernt und die Zellen nach 6 min mit α-LTX stimuliert.
F) HC110-R-Myc/His stabil exprimierende Zellen wurden 6 min vor der Zugabe von α-LTX mit 400 ng/ml BAY44-4400 (schwarze Linie) oder PF1022-001 (graue Linie) versetzt.
G) Zur Kontrolle wurde nicht transfizierten Zellen in An- (400 ng/ml BAY44-4400, schwarze Linie) oder Abwesenheit (-BAY44-4400, graue Linie) von 400 ng/ml BAY44-4400 nach 6 min 1 mM Carbamylcholin- Chlorid (Carbachol) für 100 s zugesetzt und wieder mit Na⁺-HBS ausge waschen.
H) Wie (G), nur wurden M1-R-GFP transfizierte Zellen in An- (400 ng/ml BAY44-4400, schwarze Linie) oder Abwesenheit (-BAY44-4400, graue Linie) von 400 ng/ml BAY44-4400 nach 6 min mit 1 mM Carbachol für 100 s stimuliert und wieder mit Na⁺-HBS ausgewaschen.
I) Zur Kontrolle wurden nicht transfizierte Zellen in An- (400 ng/ml BAY44-4400, schwarze Linie) oder Abwesenheit (-BAY44-4400, graue Linie) von 400 ng/ml BAY44-4400 nach 3 min für 100 s mit 1 mM Iso proterenol und nach 12 min für 100 s mit 1 mM Arecolin stimuliert. Die Sub stanzen wurden nach den 100 s wieder mit Na⁺-HBS ausgewaschen.

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Claims

1. Verwendung von Calcium-Kanal-Transmembranrezeptoren aus Helminthen zum Identifizieren von anthelminthisch wirksamen Substanzen.

2. Verwendung von Calcium-Kanal-Transmembranrezeptoren aus Arthropoden zum Identifizieren von arthropodizid wirksamen Substanzen.

3. Verwendung von Transmembranrezeptoren gemäß Anspruch 1 oder 2, da durch gekennzeichnet, dass es sich um G-Protein gekoppelte Transmembran rezeptoren mit sieben Transmembran-Domänen handelt.

4. Verwendung von Transmembranrezeptoren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Transmembranrezeptoren der Sekretin-Subfamilie handelt.

5. Verwendung von Transmembranrezeptoren gemäß einem der Ansprüche 1, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Transmembranrezeptoren aus Nematoden handelt.

6. Verwendung von Transmembranrezeptoren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Transmembranrezeptoren aus Akarina handelt.

7. Verwendung von Transmembranrezeptoren gemäß einem der Ansprüche 1 und 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um den Transmembran rezeptor HC110-R aus Haemonchus contortus handelt.

8. Verwendung von Transmembranrezeptoren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass sie zum Transmembranrezeptor HC110-R homolog sind.

9. Verwendung von Transmembranrezeptoren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 zum Identifizieren von Calcium-Kanal-Blockern.

10. Verwendung von Transmembranrezeptoren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 zum Identifizieren von Calcium-Kanal-Blockern, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um alpha-Latrotoxin bindende Transmembranrezeptoren handelt.

11. Verwendung von alpha-Latrotoxin als Agonist von Transmembranrezeptoren gemäß einem der Ansprüche 1, 3 bis 5 und 7.

12. Verwendung von alpha-Latrotoxin als Nematizid.

13. Verwendung von alpha-Latrotoxin in einem Verfahren zum Identifizieren von nematizid und/oder arthropodizid wirksamen Verbindungen.

14. Verfahren zur Gewinnung des HC110-R Rezeptors sowie dazu homologer Proteine umfassend die Expression des Polypeptids oder Fragmenten davon in einem prokaryontischen oder eukaryontischen Expressionssystem.

15. Verfahren gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein eukaryontisches Expressionssystem handelt.

16. Verfahren gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass zur Expression HEK 293- oder COS7-Zellen verwendet werden.

17. Wirtszellen, die eine transiente Expression des Rezeptors HC110-R sowie dazu homologer Proteine ermöglichen.

18. Wirtszellen, die eine stabile Expression des Rezeptors HC110-R sowie dazu homologer Proteine ermöglichen.

19. Wirtszellen gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass sie Aequorin exprimieren.

20. Wirtszellen gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um die stabil transformierte Zelllinie der Hinterlegungsnummer DSM ACC2464 handelt.

21. Wirtszellen gemäß Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um die stabil transformierte Zelllinie der Hinterlegungsnummer DSM ACC2465 handelt.

22. Vektoren zur stabilen Transformation von Wirtszellen gemäß Anspruch 18 oder 19 und zur transienten Transformation von Wirtszellen gemäß Anspruch 17.

23. Verfahren zum Identifizieren von Agonisten und/oder Antagonisten von Calcium-Kanal-Transmembranrezeptoren aus Helminthen und/oder Arthro poden.

24. Verfahren gemäß Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um G- Protein gekoppelte Transmembranrezeptoren der Sekretin-Subfamilie oder Fragmente davon handelt.

25. Verfahren gemäß Anspruch 23 und 24, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um den Transmembranrezeptor HC110-R oder Fragmente davon sowie dazu homologer Proteine handelt.

26. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 23 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass man die Testsubstanz unter solchen Bedingungen mit dem Transmem branrezeptor in Kontakt bringt, die eine Interaktion der Rezeptormoleküle mit der Testsubstanz gestatten,

a) die erfolgte Bindung der Testsubstanz detektiert, und
b) die Aktivität des Rezeptormoleküls bei Anwesenheit der Testsubstanz mit dessen Aktivität bei Abwesenheit einer Testsubstanz vergleicht.

27. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 23 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass man ein auf Zellen basierendes Testsystem verwendet.

28. Verfahren gemäß Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass man Zellen ge mäß einem der Ansprüche 17 bis 21 verwendet.

29. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 22 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass man ein zellfreies Testsystem verwendet.

30. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 23 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass die Interaktion einer Testsubstanz mit dem Transmembranrezeptor durch die Verdrängung von daran gebundenem alpha-Latrotoxin detektiert wird.

31. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 23 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass die Interaktion einer Testsubstanz mit dem Transmembranrezeptor durch die Verdrängung von daran gebundenem Nifedipin detektiert wird.

32. Verwendung von Nifedipin in einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 23 bis 29.

33. Substanzen, die in einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 23 bis 32 identifiziert werden.

34. Verwendung von Substanzen gemäß Anspruch 33 zur Herstellung eines Mittels zur Bekämpfung von Helminthen und/oder Arthropoden.

35. Verwendung von Modulatoren des Rezeptors HC110-R sowie dazu homologer Proteine als Anthelminthika und/oder Arthropodizide.

36. Verwendung der für den Rezeptor HC110-R kodierenden DNA sowie dazu homologer DNA zur Herstellung transgener Invertebraten.

37. Transgene Invertebraten, die den Rezeptor HC110-R oder dazu homologe Proteine enthalten.

38. Transgene Invertebraten gemäß Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Drosophila melanogaster und Caenorhabditis elegans handelt.

39. Verwendung von DNA-Oligonukleotiden, die spezifisch an die für den Rezeptor HC110-R kodierende DNA hybridisieren, zur Detektion von DNA, die aus Helminthen stammt.

40. Verfahren zur Detektion von DNA aus Helminthen, dadurch gekennzeichnet, dass man

a) DNA-Oligonukleotide zur Verfügung stellt, die an die für den Rezeptor HC110-R kodierende DNA oder dazu komplementäre Stränge hybridisieren oder an die 5'- oder 3'-flankierenden Regionen derselben,
b) die DNA-Oligonukleotide mit einer DNA enthaltenden Probe in Kontakt bringt,
c) die Hybridisierung des DNA-Oligonukleotids detektiert,
d) die detektierte Sequenz sequenziert, und
e) die Sequenz mit der für den Rezeptor HC110-R kodierenden DNA- Sequenz vergleicht.

41. Diagnostischer Testkit umfassend eine für den Rezeptor HC110-R kodierende DNA-Sequenz oder Fragment davon oder dazu homologe DNA-Sequenzen.

42. Diagnostischer Testkit gemäß Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Sequenzen mit einem detektierbaren Marker versehen sind.

43. Verwendung des Rezeptors HC110-R oder Fragmenten davon sowie dazu homologer Proteine zur Herstellung von Vakzinen.