DE19909637A1 - Verfahren zur Verbesserung des agronomischen Wertes und der ernährungsphysiologischen Eigenschaften von Pflanzen - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Beschreibung stellt Mittel und Verfahren der Transformation pflanzlicher Zellen, Samen, Gewebe oder vollständiger Pflanzen bereit, um Transformanten zu erhalten, die in der Lage sind, sämtliche Enzyme des Carotinoid-Biosyntheseweges zu exprimieren, welche für die betreffende Pflanze zur Akkumulation von gewünschten Carotinen und/oder Xanthophyllen essentiell sind. Durch die vorliegende Erfindung werden ferner zur Ausführung der Erfindung geeignete DNA-Moleküle sowie Plasmide und Vektorsysteme bereitgestellt, welche solche DNA-Moleküle umfassen. Des weiteren werden durch die vorliegende Erfindung transgene pflanzliche Zellen, Samen, Gewebe und vollständige Pflanzen bereitgestellt, welche eine verbesserte Ernährungsqualität aufweisen und solche DNA-Moleküle enthalten und/oder durch Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens generiert worden sind.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Transformation von Pflanzenzellen, Pflanzensamen und ganzen Pflanzen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Integration rekombinanter Nucleotidsequenzen, die für ein oder mehrere spezifische Enzyme des Carotinoid-Biosyntheseweges codieren, in pflanzliches Material, um dessen agronomischen Wert und ernährungsphysiologische Eigenschaften zu verbessern.

Hinterrund der Erfindung

Provitamin A(β-Carotin)-Defizienz stellt ein sehr ernstes Gesundheitsproblem mit schweren klinischen Folgen dar, und zwar in dem Teil der Weltbevölkerung, dessen Hauptnahrungsmittel, oft einziges Nahrungsmittel, aus Cerealien wie Reis besteht. Allein für Südost-Asien wird angenommen, daß jährlich 5 Millionen Kinder die Augenkrankheit Xerophthalmie entwickeln, von denen jährlich 0.25 Millionen erblinden (Sommer, 1988; Grant, 1991). Obwohl sich eine Vitamin- A-Defizienz nicht unmittelbar lethal auswirkt, steht sie ferner im Zusammenhang mit einer erhöhten Anfälligkeit für und schwerwiegende Verläufe von Infektionskrankheiten wie Durchfallerkrankungen, Atemwegserkrankungen und Kinderkrankheiten wie Masern (Grant, 1991). Nach Statistiken, die von der UNICEF erstellt wurden, könnten durch eine verbesserte Provitamin-A-Versorgung jährlich 1-2 Millionen Todesfälle bei Kindern im Alter von 1-4 Jahren, und weitere 0,25-0,5 Millionen Todesfälle während der weiteren Kindheit vermieden werden (Humphrey et al., 1992). Aus diesen Gründen ist es sehr wünschenswert, den Carotinoidgehalt in Grundnahrungsmitteln zu erhöhen. Darüber hinaus ist bekannt, daß Carotinoide präventive Wirkung bei der Bildung mancher Krebs-Arten besitzen. Weiterhin ist die Rolle von Lutein und Zeaxanthin in der Retina bekannt, wo sie die Degeneration der Macula verhindern (siehe z. B. Brown et al., 1998; Schalch, 1992).

Ferner werden Carotinoide in einem großen Anwendungsbereich als Farbstoffe in der menschlichen Ernährung und der Tierernährung sowie in Arzneimitteln eingesetzt. Darüber hinaus wächst das Interesse an Carotinoiden als Nahrungsbestandteile in sog. "functional food". Dies liegt daran, daß einige Carotinoide wie z. B. β-Carotin in Säugern Provitamin-A-Charakter aufweisen.

Carotinoide bestehen aus 40 Kohlenstoff-Atomen (C₄₀). Sie sind Isoprenoide, die durch die Kondensation von acht Isopren-Einheiten gebildet werden, welche sich aus dem biosynthetischen Vorläufer Isopentenyl-Diphosphat ableiten (siehe Abb. 1). In der Nomenklatur werden Carotinoide in zwei Klassen unterteilt, nämlich in Carotine, die Kohlenwasserstoffe darstellen, und Xanthophylle, die oxygenierte Derivate der Carotine sind. Ihre wesentliche Funktion in Pflanzen besteht im Schutz des plastidären photosynthetischen Apparates vor photo-oxidativer Zerstörung. Zusätzlich sind sie bei der Photosynthese an der Lichtsammlung beteiligt und repräsentieren integrale Komponenten von photosynthetischen Reaktionszentren. Carotinoide sind auch direkte Vorläufer des Phytohormons Abscisinsäure (ABA).

Der Carotinoid-Biosyntheseweg, schematisch in Abb. 1 dargestellt, wurde in Bakterien, Pilzen und Pflanzen erforscht und aufgeklärt (siehe, z. B. Britton, 1988). In Pflanzen werden Carotinoide in Plastiden gebildet.

Ein frühes Intermediat des Carotinoid-Biosyntheseweges ist Geranylgeranyl-Diphosphat (GGPP). Dieses wird durch das Enzym Geranylgeranyl-Diphosphat-Synthase aus Isopentenyl-Diphosphat (IPP) und Dimethylallyl-Diphosphat gebildet (DMAPP siehe Abb. 1). Der nachfolgende enzymatische Schritt, zugleich die erste Carotinoid-spezifische Reaktion, wird durch das Enzym Phytoen-Synthase katalysiert. Die Reaktion umfaßt zwei Schritte und resultiert in der Kopf/Kopf- Kondensation von zwei Molekülen GGPP zur Bildung des ersten - noch ungefärbten - Carotins Phytoen (Dogbo et al., 1988, Chamovitz et al., 1991; Linden et al., 1991; Pecker et al., 1992). Phytoen-Synthase kommt in zwei Formen vor, einer löslich-inaktiven und einer membrangebunden-aktiven Form, und benötigt zur Aktivität vicinale Hydroxylfunktionen, wie sie an der Oberfläche Galaktolipid-haltiger plastidärer Membranen vorhanden sind (Schledz et al., 1996).

Während die Bildung von Phytoen in Bakterien und Pflanzen ähnlich verläuft, unterscheidet sich dessen Metabolisierung beträchtlich.

In Pflanzen arbeiten zwei Genprodukte in sequentieller Weise, um das farbige Carotin Lycopin zu erzeugen (Beyer et al., 1989). Sie werden repräsentiert durch die Enzyme Phytoen-Desaturase (PDS, siehe z. B. Hugueney et al., 1992) und ζ-Carotin-Desaturase (ZDS, siehe z. B. Albrecht et al., 1996). Jedes dieser Enzyme fügt zwei Doppelbindungen ein, zur Bildung von ζ-Carotin über Phytofluen, und zur Bildung von Lycopin über Neurosporin. PDS scheint mechanistisch mit einer membrangebundenen Redoxkette verbunden zu sein (Nievelstein et al., 1995), die Plastochinon verwendet (Mayer et al., 1990; Schulz et al., 1993; Norris et al., 1995), während ZDS mechanistisch auf andere Weise wirkt (Albrecht et al., 1996). In Pflanzen scheint der gesamte Weg über cis-konfigurierte Intermediate zu verlaufen (Bartley et al., 1999). Im Gegensatz dazu wird in vielen Bakterien, wie in der Gattung Erwinia, die gesamte Desaturiertungssequenz, also die Bildung aller vier Doppelbindungen von nur einem Genprodukt bewerkstelligt (CrtI), welches Phytoen direkt zu Lycopin umsetzt (siehe z. B. Misawa et al., 1990; Armstrong et al., 1990, Hundle et al., 1994). Dieser bakterielle Desaturasetyp ist bekannt dafür, daß er gegenüber gewissen Bleich-Herbiziden, welche die pflanzliche Phytoen-Desaturase effizient inhibieren, unempfindlich ist.

In Pflanzen katalysieren zwei Genprodukte die Cyklisierung des Lycopins, nämlich α(ε)- und β- Lycopin-Cyclasen, die α(ε)- bzw. β-Ionon-Endgruppen ausbilden (siehe z. B. Cunningham et al., 1993, Scolnik und Bartley, 1995, Cunningham et al., 1996). In Pflanzen werden normalerweise β- Carotin mit zwei β-Ionon Endgruppen und α-Carotin mit einer α(ε)- und einer β-Ionon Endgruppe gebildet.

Weitere Oxygenierungsreaktionen erfolgen durch die Zeaxanthin-Epoxidase, welche die Einführung von Epoxy-Funktionen in den Positionen C5, C6 und C5', C6' des Zeaxanthin- Rückgrats katalysiert (Marin et al., 1996). Hierdurch werden Antheraxanthin und Violaxanthin gebildet. Diese Reaktion ist reversibel durch die Aktivität eines weiteren Gen-Produktes, Violaxanthin De-Epoxidase (Bugos und Yamamoto, 1996).

Das Genprodukt, das zur Bildung von Neoxanthin führt, ist bislang noch nicht identifiziert.

Für die Carotinoid-Biosynthese codierende Gene und cDNAs sind aus einer Vielzahl von Organismen, von Bakterien bis hin zu Pflanzen, kloniert worden. Bakterielle und cyanobakterielle Gene schließen solche ein aus Erwinia herbicola (Internationale Anmeldung WO 91/13078, Armstrong et al., 1990), Erwinia uredovora (Misawa et al., 1990), R capsulatus (Armstrong et al., 1989), Thermus thermophilus (Hoshino et al., 1993), dem Cyanobakterium Synechococcus sp. (Genbank-Zugriffsnummer X63873), Flavobacterium sp. Stamm R1534 (Pasamontes et al., 1997). Klonierte Gene und cDNAs, die für Enzyme des Carotinoid-Biosyntheseweges der höheren Pflanzen codieren, sind aus verschiedenen Quellen kloniert worden, einschließlich Arabidopsis thaliana, Sinapis alba, Capsicum annuum, Narcissus pseudonarcissus, Lycopersicon esculentum, etc., wie auch aus den öffentlichen Datenbanken ersichtlich.

Zur Zeit ist noch relativ wenig über die Verwendung der klonierten Gene in Transformationen höherer Pflanzen und den daraus resultierenden Effekten bekannt. Die Expression der Phytoen- Synthase aus Tomate kann den Carotinoid-Gehalt in Früchten beeinflussen (Bird et al., 1991; Bramley et al., 1992; Fray und Grierson, 1993). Es wurde auch berichtet, daß die konstitutive Expression einer Phytoen-Synthase in transformierten Tomatenpflanzen zu Zwergwuchs führt, was auf eine Um-Dirigierung des Metaboliten GGPP aus dem Gibberellin-Biosyntheseweg zurückzuführen ist (Fray et al., 1995). Derartige Probleme wurden bei konstitutiver Expression der Phytoen-Synthase aus Narcissus pseudonarcissus im Reis nicht beobachtet (Burkhardt et al., 1997). Es ist bekannt, daß die bakterielle Desaturase CrtI aus Erwinia in Pflanzen funktioniert und Resistenz gegenüber Bleich-Herbiziden vermittelt (Misawa et al., 1993).

Vielfältige Anstrengungen sind in den vergangenen Jahren unternommen worden, um die Carotinoid-Biosynthesewege in zahlreichen pflanzlichen Geweben wie in vegetativen Geweben oder in Samen oder Bakterien, zu verändern oder zu steigern. Siehe z. B. WO 96/13149, WO 98/06862, WO 98/24300, WO 96/28014, und US-Patent Nr. 5,618,988. All diese Anstrengungen beschränken sich auf die Manipulation bereits existierender Reaktionen der Carotinoid-Biosynthese in den Zellen. Andere Applikationen, die auf die Veränderung der Carotinoid-Biosynthese in ölreichen Samen gerichtet sind, unterscheiden sich insofern, als solche Samen einen Ort zur Aufnahme der aufgrund der Transformation überschüssig gebildeten Carotinoide zur Verfügung stellen.

Es besteht offensichtlich ein Bedarf an einem Verfahren zur Transformation von pflanzlichem Material, um Transformanten zu erhalten, die in der Lage sind, sämtliche zur Produktion gewünschter Carotine und Xanthophylle notwendigen Enzyme des Carotinoid-Biosyntheseweges zu exprimieren.

Zusammenfassung der Erfindung

Durch die vorliegende Erfindung werden Mittel und Verfahren bereitgestellt zur Transformation von pflanzlichen Zellen, Samen, Geweben oder ganzen Pflanzen, um Transformanten zu erhalten, die in der Lage sind, sämtliche Enzyme der Carotinoid-Biosynthese zu exprimieren, die in der Zielpflanze für die Akkumulation gewünschter Carotine und/oder Xanthophylle essentiell sind. Durch die vorliegende Erfindung werden ferner DNA-Moleküle, mit deren Hilfe das erfindungsgemäße Verfahren durchgeführt werden kann, sowie derartige Moleküle enthaltende Plasmide oder Vektorsysteme bereitgestellt. Desweiteren werden erfindungsgemäß transgene pflanzliche Zellen, Samen und Gewebe sowie ganze Pflanzen bereitgestellt, die eine verbesserte Nahrungsqualität aufweisen und solche DNA-Moleküle enthalten, und/oder die unter Anwendung der erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt worden sind.

Somit werden durch die vorliegende Erfindung sowohl die de-novo-Einführung und Expression der Carotinoid-Biosynthese - was besonders im Hinblick auf pflanzliches Material bedeutsam ist, welches bekanntermaßen im wesentlichen Carotinoid-frei ist, wie z. B. Reis-Endosperm und die Samen vieler anderer Cerealien - als auch die Modifizierung einer Prä-existierenden Carotinoid- Biosynthese, um die Akkumulierung bestimmter gewünschter Intermediate oder Produkte nach oben oder nach unten zu regulieren.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt den allgemeinen Carotinoid-Biosyntheseweg. Die Bezeichnungen der Enzyme sind fett angegeben. Die durch die bakterielle Carotin-Desaturase des CrtI-Typs katalysierten Reaktionen sind ebenfalls angegeben.

Fig. 2 zeigt, daß das Intermediat Geranylgeranyl-Diphosphat (GGPP) nicht nur in die Carotinoid-Biosynthese Eingang findet, sondern als Baustein zu verschiedenen anderen Biosynthesewegen Kontakt findet, und zwar über Prenylierungsreaktionen (z. B. Tocopherole, Chinone, Chlorophylle) oder über andere Reaktionen unter Ausschluß von nicht-Prenyl- Akzeptormolekülen (z. B. Gibberelline, Geschmack- und Aromasubstanzen).

Fig. 3 zeigt HPLC-Analysen von polierten Reissamen (dem Endosperm) von untransformierten (Fig. 3A) und transformierten (mit Plasmid A, Fig. 3B; mit Plasmid A plus B, Fig. 3C) Reispflanzen. Das Auftreten von Carotinoiden, cyklischen Carotinen und Xanthophyllen ist in den Chromatogrammen von transformierten Samen deutlich.

Fig. 4 illustriert schematisch die Expressionskassetten, die in "Plasmid A" und in "Plasmid B" verwendet wurden. LB, left border (linke Border-Squenz); RB, right border (rechte Border- Sequenz); psy, Phytoen-Synthase, cDNA aus Narcissus pseudonarcissus; crtI, Carotin- Desaturase-Gen aus Erwinia uredovora; cyc, Lycopin-Cyclase, cDNA aus Narcissus pseudonarcissus; aphIV, Hygromycin Phosphotransferase; Gt1, Reis-Glutelin1 Promotor; 35S, CaMV 35S Promotor; nos, Nopalin Synthase Terminator; nptII, Kanamycin-Resistenzgen.

Fig. 5A Northern blot mit RNA aus unbehandelten (Spur 1) und CPTA-behandelten (Spur 2) Narzissenblüten. Die immobilisierte RNA wurde wiederholt "gestripped", um die Hybridisierung mit verschiedenen markierten Sonden zu erlauben, und zwar A, Phytoen-Synthase; B, Phytoen- Desaturase; C, ζ-Carotin-Desaturase; E, Lycopin-Cyclase.

Fig. 5B Western blot mit Proteinextrakten aus unbehandelten (Spur 1) und behandelten (Spur 2) Narzissenblüten. Die Blots wurden mit Antikörpern entwickelt gegen A, Phytoen-Synthase; B, Phytoen-Desaturase; C, ζ-Carotin-Desaturase; D, Lycopin-Cyclase.

In der Beschreibung verwendete Abkürzungen

Die systematischen Bezeichnungen relevanter vorliegend erwähnter Carotinoide sind:

Phytoen: 7,8,11,12,7',8',11',12'-octahydro-ψ,ψ-Carotin
Phytofluen: 7,8,11,12,7',8',-hexahydro-ψ,ψ-Carotin
ζ-Carotin: 7,8,7',8'-tetrahydro-ψ,ψ-Carotin
Neurosporin: 7,8,-dihydro-ψ,ψ-Carotin
Lycopin: -ψ,ψ-Carotin
β-Carotin: β,β-Carotin
α-carotin: β,ε-Carotin
Zeaxanthin: β,β-Carotin-3,3'-diol
Lutein: β,ε-Carotin-3,3'-diol
Antheraxanthin: 5,6-epoxy-5,6-dihydro-β,β-Carotin-3,3'-diol
Violaxanthin: 5,6,5',6'-diepoxy-5,6,5',6',tetrahydro-β,β-Carotin-3,3'-diol
Neoxanthin: 5',6'-epoxy-6,7-didehydro-5,6,5',6'-tetrahydro-β,β-Carotin-3,5,3'-triol

Enzyme

PSY: Phytoen-Synthase
PDS: Phytoen-Desaturase
CrtI: bakterielle Carotin-Desaturase
ZDS: ζ(zeta)-Carotin-Desaturase
CYC: Lycopin-β-Cyclase

Nicht-Carotinoid-Intermediate

IPP: Isopentenyl-Diphosphat
DMAPP: Dimethylallyl-Diphosphat
GGPP: Geranylgeranyl-Diphosphat.

Der vorliegend verwendete Begriff "Pflanze" umfaßt allgemein eukaryotische Algen, Embryophyten einschließlich Bryophyta, Pteridophyta und Spermatophyta wie Gymnospermae und Angiospermae, wobei letztere Magnoliopsida, Rosopsida (Eu-Dicotyledonen), und Liliopsida (Monocotyledonen) einschließen. Repräsentative und bevorzugte Beispiele schließen Körner und Samen, z. B. von Reis, Weizen, Gerste, Hafer, Amaranth, Flachs, Triticale, Roggen, Mais, und andere Gräser; Ölsamen wie Brassica-Samen, Samen von Baumwolle, Soja, Färberdistel, Sonnenblume, Kokospalme, und dergleichen; andere eßbare Samen oder Samen mit eßbaren Anteilen wie Kürbisfrüchte, Sesam, Mohn, Wein, Mung-Bohnen, Erdnuß, Erbse, Bohne, Rettich, Alfalfa, Kakao, Kaffee, Hanf, Nußbäume wie Walnüsse, Mandeln, Kichererbsen etc., ein. Desweiteren Kartoffeln, Karotten, Süßkartoffeln, Tomaten, Paprika, Cassava, Weiden, Eichen, Ulmen, Ahorn, Äpfel, Bananen; ornamentale Blumen wie Lilien, Orchideen, Seggen, Rosen, Hahnenfuß, Petunien, Phlox, Veilchen, Sonnenblumen, und dergleichen. Die vorliegende Erfindung ist allgemein anwendbar auf ornamentale Arten, wie auch auf Arten, die zur Gewinnung von Nahrung, Fasern, Holzprodukten, Gerbmaterialien, Farbstoffen, Pigmenten, Gummimaterialien, Harzen, Latexprodukten, Fetten, Ölen, Drogen, Getränken und dergleichen angebaut werden. Die zur Transformation ausgewählte Zielpflanze wird bevorzugt zur Nahrungserzeugung angebaut, wie z. B. zur Gewinnung von Körnern, Wurzeln, Blättern, Nüssen, Gemüsen, Knollen, Früchten, Gewürzen und dergleichen.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Erfindungsgemäß werden Mittel und Verfahren zur Transformation von pflanzlichen Zellen, Samen, Geweben oder ganzen Pflanzen bereitgestellt, um Transformanten zu erzeugen, die in der Lage sind, sämtliche Enzyme des Carotinoid-Biosyntheseweges zu exprimieren, welche für die Zielpflanze essentiell sind, damit sie gewünschte Carotine und/oder Xanthophylle akkumulieren kann. Nach einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung können die Verfahren auch zum Modifizieren einer prä-existierenden Carotinoid-Biosynthese angewendet werden, um die Akkumulation gewünschter Intermediate und Produkte nach oben oder nach unten zu regulieren. Ferner werden spezifische DNA-Moleküle bereitgestellt, die Nukleotidsequenzen mit einer oder mehreren Expressionscassetten umfassen, welche in der Lage sind, die Bildung eines oder mehrerer, für die Carotinoid-Biosynthese charakteristischen Enzyme zu steuern, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

• - Phytoen-Synthase, abgeleitet aus Pflanzen, Pilzen oder Bakterien,
• - Phytoen-Desaturase, abgeleitet aus Pflanzen, Pilzen oder Bakterien,
• - ζ-Carotin-Desaturase, abgeleitet aus Pflanzen oder Cyanobakterien, und
• - Lycopin-Cyclase, abgeleitet aus Pflanzen, Pilzen oder Bakterien.

Nach einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt die oben erwähnte Expressionskassette ein oder mehrere Gene oder cDNAs, die für eine pflanzliche, pilzliche oder bakterielle Phytoen-Synthase, eine pflanzliche, pilzliche oder bakterielle Phytoen-Desaturase, eine pflanzliche oder cyanobakterielle ζ-Carotin-Desaturase, oder eine pflanzliche, pilzliche oder bakterielle Lycopin- Cyclase kodieren, jeweils operativ verknüpft mit einem geeigneten konstitutiven, induzierbaren oder gewebespezifischen Promotor, welcher dessen Expression in pflanzlichen Zellen, Samen, Geweben oder in ganzen Pflanzen erlaubt. Besonders bevorzugte Gene oder cDNAs codieren für pflanzliche Phytoen-Synthase, bakterielle Phytoen-Desaturase oder pflanzliche Lycopin-Cyclase. Eine bereits große, noch anwachsende Anzahl an Genen, die für Phytoen-Synthase (pflanzlich und bakteriell), Carotin-Desaturasen des CrtI-Typs (bakteriell) und Lycopin-Cyclasen (pflanzlich und bakteriell) kodieren, sind isoliert worden und sind in den Datenbanken zugänglich. Sie entstammen verschiedenen Quellen und stehen zur Verwendung in den Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Verfügung.

Vorzugsweise umfaßt das DNA-Molekül ferner mindestens ein selektierbares Markergen oder eine cDNA, die operativ mit einem geeigneten konstitutiven, induzierbaren oder gewebespezifischen Promotor verknüpft ist, wobei Hygromycin-Phosphotransferase als selektierbarer Marker unter Kontrolle eines konstitutiven Promotors am meisten bevorzugt ist. Obgleich der Fachmann jedweden erhältlichen, in pflanzlichem Material funktionell aktiven Promoter auswählen kann, ist es bei der Schaffung einer geeigneten, erfindungsgemäßen Expressionskassette bevorzugt, daß die jeweilige, für Phytoen-Desaturase, ζ-Carotin-Desaturase, oder Lycopin-Cyclase kodierende Nukleotid-Sequenz mit gewebespezifischen oder konstitutiven Promotoren operativ verknüpft wird, wohingegen die für Phytoen-Synthase kodierende Nukleotid-Sequenz vorzugsweise unter Kontrolle eines gewebespezifischen Promotors exprimiert wird, um eine Interferenz mit der Gibberellin-Biosynthese zu vermeiden.

Es ist davon auszugehen, daß die Nukleotidsequenz als funktionelles Element des erfindungsgemäßen DNA-Moleküls jegliche Kombination eines oder mehrerer der obigen Gene oder cDNAs umfassen kann. Nach einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt die Nukleotidsequenz funktionelle Expressionskassetten für sowohl Phytoen-Synthase als auch bakterielle oder pilzliche Phytoen-Desaturase und kann - nach Inkorporierung in ein geeignetes Plasmid oder Vektorsystem (Plasmid A) - in pflanzliches Material entweder allein oder zusammen mit einem zweiten Vektor (Plasmid B) eingebracht werden, welcher eine Nukleotidsequenz umfaßt, die für das Enzym Lycopin-Cyclase kodiert.

Durch die Erfindung werden ferner Plasmide oder Vektorsysteme bereitgestellt, die eine oder mehrere der obigen DNA-Moleküle oder Nukleotidsequenzen umfassen, welche vorzugsweise aus Agrobacterium tumefaciens abgeleitet sind.

Zusätzlich werden durch die vorliegende Erfindung transgene pflanzliche Zellen, Samen, Gewebe und ganze Pflanzen zur Verfügung gestellt, die eine verbesserte Nahrungsqualität aufweisen und ein oder mehrere der obengenannten DNA-Moleküle, Plasmide oder Vektoren enthalten, und/oder die durch Anwendung der erfindungsgemäßen Verfahren generiert worden sind.

Die vorliegende Erfindung basiert darauf, daß das frühe Intermediat Geranylgeranyl-Diphosphat (GGPP) nicht nur der Carotinoid-Biosynthese als Substrat dient, sondern einen Verzweigungspunkt darstellt, der in mehrere verschiedene Biosynthesewege einmündet (Fig. 2). Es wird daher geschlossen, daß dieser Vorläufer in Plastiden aller Pflanzengewebe vorhanden ist, und zwar unabhängig davon, ob dieses Carotinoid-haltig ist oder nicht, wie z. B. Reis-Endosperm. Die GGPP-Quelle kann daher zur Realisierung der Ziele der vorliegenden Erfindung genutzt werden, d. h. zur Einführung des vollständigen oder partiellen Carotinoid-Biosyntheseweges, und/oder zur Verstärkung oder Beschleunigung eines prä-existierenden Carotinoid- Biosyntheseweges.

Der vorliegend zur Differenzierung zwischen gewissen pflanzlichen Ziel-Zellen oder -Geweben verwendete Begriff "Carotinoid-frei" soll bedeuten, daß das entsprechende, nicht erfindungsgemäß transformierte pflanzliche Material dafür bekannt ist, normalerweise im wesentlichen keine Carotinoide zu enthalten, wie es z. B. bei verschiedenen Speichergeweben wie beispielsweise im Reis-Endosperm und dergleichen der Fall ist. Carotinoid-frei bedeutet nicht den Ausschluß solcher Zellen oder Gewebe, die Carotinoide in fast undetektierbaren Mengen enthalten. Vorzugsweise soll der Ausdruck pflanzliches Material mit einem Carotinoidgehalt von 0.001 Gew.- % oder niedriger definieren.

Hinsichtlich der Auswahl geeigneter Quellen für die Gewinnung von Enzymen der Carotinoid- Biosynthese wird darauf hingewiesen, daß kodierende Sequenzen aus Cyanobacterien, die zu den entsprechenden pflanzlichen Sequenzen homolog sind, ebenfalls verwendet werden können.

Nach einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Phytoen-Synthase einer höheren Pflanze operativ mit einem Promotor verbunden, der gewebespezifische Expression verleiht. Diese Einheit wird auf demselben Plasmid (Plasmid A) mit einer bakteriellen Phytoen- Desaturase des CrtI-Typs vereinigt, wobei letztere mit einer DNA-Sequenz fusioniert ist, die für ein Transit-Peptid kodiert und operativ mit einem Promotor verknüpft ist, der konstitutive Expression erlaubt. Die Transformation von Pflanzen mit diesem Konstrukt in einem geeigneten Vektor erlaubt die Bildung von Lycopin in dem Gewebe, das der die Phytoen-Synthase kontrollierende Promotor selektiert, z. B. in Carotinoid-freien Getreidesamen. Überraschenderweise kann diese Transformation allein bereits die Carotinoid-Biosynthese über die Lycopin-Bildung hinaus initiieren bis hin zu den Xanthophyllen, wie Lutein, Zeaxanthin, Antheraxanthin, Violaxanthin, und Neoxanthin, und zwar selbst in einem Carotinoid-freien Gewebe wie Reis-Endosperm. Zusätzlich wird die Bildung von α-Carotin beobachtet. Damit wird eine Carotinoid-Ausstattung erreicht, die der im grünen Blatt ähnelt. Dieses unerwartete Phänomen (hier auch als "Überschuß"-Mechanismus bezeichnet) kann seine Ursache in der konstitutiven Expression der entsprechenden späteren Gene haben (Lycopin-Cyclasen, β-Carotin- Hydroxylasen, Epoxidasen), die entweder durch die transformations-vermittelte Substratversor­ gung oder, alternativ, durch die mittels Transformation hervorgerufene Induktion der Expression von Carotinoid-Biosynthesegenen aktiviert werden. Für den Fall, daß der "Überschuß"- Mechanismus nicht greift, kann eine Co-Transformation (Plasmid B) mit einem Gen oder einer cDNA für Lycopin-Cyclase das Problem beseitigen und mindestens die Bildung von α- oder β- Carotin (Provitamin A) ermöglichen. In Fällen, bei denen der "Überschuß"-Mechanismus funktioniert, kann diese Co-Transformation die durch Phytoen-Synthase und durch die Carotin- Desaturase des CrtI-Typs hervorgerufenen Effekte verstärken. Damit schließt die vorliegende Erfindung auch die Einführung des Carotinoid-Biosyntheseweges jenseits bzw. stromabwärts desjenigen Punktes ein, der genetisch durch die Transformation mit Plasmid A oder mit A plus B vorgegeben ist.

Das Plasmid A ist auch in der Lage, die Carotinoid-Produktion in Carotinoid-haltigen Geweben zu verstärken. Diese Transformationen führen zur Erhöhung des ernährungsphysiologischen Wertes in der menschlichen Ernährung und in der Tierernährung. Ein weiterer Vorteil in der Verwendung der bakteriellen Desaturase vom CrtI-Typ bei der Transformation liegt darin, daß dieses Enzym auch in den Blatt-Chloroplasten exprimiert wird und damit Resistenz gegenüber Bleichherbiziden erreicht wird, die auf die Inhibition der pflanzlichen Phytoen-Desaturase zielen. Die vorliegende Erfindung schließt demgemäß auch die Nutzung der Resistenz gegenüber Bleichherbiziden in Verbindung mit transgenen Pflanzen ein, die mindestens Plasmid A aufweisen.

Das zweite Plasmid (B) kann ein Gen für eine pflanzliche Lycopin-Cyclase tragen. Alternativ kann eine bakterielle Lycopin-Cyclase, ausgestattet mit einer Transit-Sequenz, verwendet werden. Die Cyclase-Sequenz ist operativ mit einem Promotor verbunden, der bevorzugt die gleiche Gewebespezifität der Expression wie bei der Phytoen-Synthase in Plasmid A vermittelt. Die Co- Transformation von Plasmid A und B resultiert darin, daß das Zielgewebe wie Wurzel, Frucht, Knolle oder Samen mit der gesamten Information zur Durchführung des Carotinoid- Biosyntheseweges vom Geranylgeranyl-Diphosphat bis zum β-Carotin ausgestattet wird. Im Falle von prä-existierenden oder induzierten späteren Reaktionen des Biosyntheseweges führt diese Co- Transformation (siehe oben) zu erhöhtem Carotinoid-Gehalt und einer verstärkten Bildung von aus β-Carotin abgeleiteten Xanthophyllen.

Alle verwendeten Gene sind operativ mit einer DNA-Sequenz ausgestattet, die für ein Transit- Peptid kodiert, welches Plastiden-Import vermittelt. Dieses wird entweder durch rekombinante DNA-Technologie erreicht, oder die Transit-Sequenz ist in der verwendeten pflanzlichen cDNA vorhanden. Die Transformation erlaubt dann die Carotinoidbildung unter Verwendung des in den Plastiden lokalisierten Vorläufers Geranylgeranyl-Diphosphat. Diese zentrale Verbindung ist weder ein Carotinoid noch repräsentiert es einen Vorläufer, der lediglich in die Carotinoid- Biosynthese eingeht (siehe Abb. 2).

Die Pflanzen sollten das/die eingeführten Gene exprimieren und sind diesbezüglich bevorzugt homozygot. Im allgemeinen wird das Gen operativ mit einem Promotor verbunden, der in der Zielzelle einer spezifischen Pflanze funktionell aktiv ist. Die Expressionshöhe sollte derart sein, daß die gewünschten Gen-Eigenschaften erhalten werden. Beispielsweise sollte die Expression des selektierbaren Markergens die Selektion von Transformanten ermöglichen, die gemäß der Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten werden. In ähnlicher Weise sollte die Expression eines oder mehrerer Gene des Carotinoid- und Xanthophyll-Biosyntheseweges in der Verbesserung der ernährungsphysiologischen Qualität einer Pflanze resultieren. Diese sollte im Vergleich zu Pflanzen derselben Spezies, die nicht gemäß der vorliegenden Erfindung transformiert sind, einen relativ höheren Gehalt an einem oder mehreren Intermediaten oder Produkten des Stoffwechselweges aufweisen. Andererseits wird es generell wünschenswert sein, eine exzessive Expression des oder der fraglichen Gene zu limitieren, um eine signifikante nachteilige Beeinflussung der normalen Physiologie der Pflanze zu verhindern, durch die die Kultivierung derselben problematisch werden könnte.

Das Gen oder die Gene, die für das/die interessierenden Enzyme kodieren, können in Expressionskassetten zur Expression im transformierten Pflanzengewebe zur Anwendung kommen. Um die Ziele der vorliegenden Erfindung zu erreichen, d. h. um den Carotinoid- Biosyntheseweg in einer Zielpflanze zu komplementieren oder in sie einzuführen, wird die Pflanze mit mindestens einer Expressionskassette transformiert, die eine Transkriptions-Initiationsregion umfaßt, welche mit einem interessierenden Gen verknüpft ist.

Die Transkriptions-Initiation kann in Bezug auf den Wirt nativ oder analog sein, oder aber fremd oder heterolog. Fremd bedeutet, daß die Transkriptions-Initiationsregion nicht im Wildtyp- Rezipienten vorhanden ist.

Von besonderem Interesse sind jene Transkriptions-Initiationsregionen, die mit der Expression von Speicherproteinen assoziiert sind, wie Glutelin, Patatin, Napin, Cruciferin, β-Conglycinin, Phaseolin, oder dergleichen.

Die Transkriptionscassette schließt in der 5'-3'-Richtung der Transkription eine transkriptionelle und translationelle Initiierungsregion, eine interessierende DNA-Sequenz, und eine in Pflanzen funktionelle transkriptionelle und translationelle Terminator-Region ein. Die Terminator-Region kann nativ mit der transkriptionellen Initiierungsregion sein, oder nativ mit der interessierenden DNA-Sequenz, sie kann aber auch anderer Quelle entstammen. Häufig verwendete Terminator- Regionen stammen aus dem Ti-Plasmid von A. tumefaciens, wie die der Octopin-Synthase und Nopalin-Synthase (siehe auch, Guerineau et al., 1991; Proudfoot, 1991; Sanfacon et al., 1991; Mogen et al., 1990; Munroe et al., 1990; Ballas et al., 1989; Joshi et al., 1987).

Zum größten Teil werden die interessierenden Genprodukte der vorliegenden Erfindung zur Expression in die Plastiden adressiert, wie z. B. in Chloroplasten. Wenn das interessierende Gen nicht direkt in das Plastid insertiert wird, enthält die Expressionskassette zur Steuerung des interessierenden Gens zum Plastid zusätzlich eine Sequenz, die für ein Transit-Peptid kodiert. Solche Transit-Peptide sind bekannt (siehe z. B., Von Heijne et al., 1991; Clark et al., 1989; Della- Cioppa et al., 1987; Romer et al., 1993; und, Shah et al., 1986). Jedwede im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeigneten Gene des Carotinoid-Biosyntheseweges können in Verbindung mit nativen oder heterologen Transit-Peptiden verwendet werden.

Das Konstrukt kann auch jegliche andere notwendige Regulatoren einschließen, wie z. B. pflanzliche translationelle Konsensus-Sequenzen (Joshi, 1987), Introns (Luehrsen und Walbot, 1991) und dergleichen, in operativer Verbindung mit der interessierenden Nukleotidsequenz. Intron-Sequenzen innerhalb des einzuführenden Gens können dessen Expression durch Stabilisierung des Transkripts und durch dessen effiziente Translokation aus dem Nucleus erhöhen. Solche bekannten Intron-Sequenzen sind beispielsweise die des pflanzlichen Ubiquitin- Gens (Cornejo, 1993). Es ist weiterhin bekannt, daß die Insertion desselben Konstrukts in unterschiedliche loci des Genoms unterschiedliche Expressionshöhen in Pflanzen zur Folge haben kann. Es wird angenommen, daß dieser Effekt teilweise mit der Position des Gens auf dem Chromosom in Verbindung steht, d. h. individuelle Isolate zeigen unterschiedliche Expressionshöhen (siehe z. B. Hoever et al., 1994). Weitere regulatorische DNA-Sequenzen, die bei der Konstruktion von Expressionskassetten Verwendung finden können, schließen beispielsweise Sequenzen ein, die in der Lage sind, die Transkription einer assoziierten DNA- Sequenz in pflanzlichen Geweben im Sinne einer Induktion oder Repression zu regulieren.

Es existieren zum Beispiel gewisse Pflanzengene, von denen bekannt ist, daß sie durch verschiedene interne oder externe Faktoren induziert werden, wie durch Phytohormone, Hitzeschock, Chemikalien, Pathogene, Sauerstoff-Defizienz, Licht, Stress, etc.

Eine weitere Gruppe von regulierbaren DNA-Sequenzen schließen chemisch getriebene Sequenzen ein, wie sie z. B. in den PR (pathogenesis-related) Proteingenen des Tabaks vorhanden sind. Sie sind mittels chemischer Regulatoren induzierbar, wie in EP-A 0 332 104 beschrieben.

Ein weiterer Aspekt der Expression von Fremdgenen in Pflanzen betrifft das Ausmaß der Stabilität des transgenen Genoms, d. h. die Tendenz eines Fremdgens, aus der Population zu seggregieren. Wenn ein selektierbarer Marker mit dem interessierenden Fremdgen oder der Expressionskassette verbunden ist, kann für dessen Erhalt Selektionsdruck angewendet werden.

Das Vorhandensein von 5' Leader-Sequenzen in der Expressionskassette kann vorteilhaft sein. Solche Leader-Sequenzen sind in der Lage, die Translations-Effizienz zu erhöhen. Translations- Leader sind bekannt und umfassen: Picornavirus-Leader, EMCV-Leader (Encephalomyocarditis 5' nicht-kodierende Region; Elroy-Stein et al., 1989); Potyvirus-Leader, wie z. B. TEV-Leader (Tobacco Etch Virus; Allisson et al., 1986); Leader des menschlichen Bindeproteins der schweren Immunglobulin-Kette (BiP, Macejak und Sarnow, 1991); den untranslatierten Leader der Hüllprotein-mRNA des Alfalfa Mosaik Virus (AMV RNA 4; Jobling und Gehrke 1987); den Leader des Tabak Mosaic Virus (TMV; Gallie et al., 1989); den Leader des "maize chlorotic mottle virus" (MCMV; Lommel et al., 1991; siehe auch, Della-Cioppa et al., 1987).

In Abhängigkeit davon, wo die interessierende DNA-Sequenz exprimiert werden soll, kann es wünschenswert sein, die Sequenz mit pflanzlich bevorzugten Codonen, oder alternativ, mit von Chloroplasten bevorzugten Codonen auszustatten. Die pflanzlich bevorzugten Codonen können in interessierenden Pflanzen von den verwendeten Codonen höchster Frequenz bei Proteinen höchster Expression abgeleitet werden (siehe, EP-A 0 359 472; EP-A 0 386 962; WO 91/16432; Perlak et al., 1991; and Murray et al., 1989). Auf diese Weise können die Nukleotidsequenzen für die Expression in jedweder Pflanze optimiert werden. Es wird darauf hingewiesen, daß die ganze Sequenz oder jedwedes Teil derselben optimiert werden kann oder synthetisch ist. Das heißt, das synthetische oder partiell optimierte Sequenzen ebenfalls Verwendung finden können. Für die Konstruktion von präferierten Chloroplastengenen, siehe USPN 5,545,817.

Bei der Herstellung der Transkriptionskassette können die verschiedenen DNA-Fragmente so verändert werden, daß sie in der richtigen Orientierung und im richtigen Leserahmen vorliegen. Hierzu können Adaptoren oder Linker eingesetzt werden, um die DNA-Fragmente zu verknüpfen, oder andere Manipulationen können vorgenommen werden, um geeignete Restriktions- Schnittstellen einzuführen, überflüssige DNA zu entfernen, Restriktions-Schnittstellen zu entfernen, oder dergleichen. Für diesen Zweck und wenn immer Insertionen, Deletionen oder Substitutionen, z. B. Transitionen und Transversionen involviert sind, können in vitro Mutagenese, Primer Repair, Restriktion, Annelieren, Resektion, Ligation, oder dergleichen angewendet werden.

Die Expressionskassette, die das interessierende Gen trägt, wird mittels Standardverfahren in einen Expressionsvektor eingeführt. Die Auswahl eines geeigneten Expressionsvektors hängt von der Methode ab, mit der er in die Wirtszelle eingebracht werden soll. Ein typischer Expressionsvektor enthält: prokaryotische DNA-Elemente, die für einen bakteriellen Replikationsursprung stehen und ein Antibiotika-Resistenzgen, das die Vermehrung und die Selektion des Expressionsvektors in Bakterien ermöglicht, eine Klonierungsstelle für die Insertion einer exogenen DNA-Sequenz, welche in diesem Kontext für ein oder mehrere spezifische Enzyme des Carotinoid-Biosyntheseweges kodieren würde, eukaryotische DNA-Elemente, die die Initiation der Transkription des exogenen Gens ermöglichen, wie ein Promotor; und DNA- Elemente, die die Prozessierung von Transkripten kontrollieren, wie eine Transkriptions- Terminations/Polyadenylierungs-Sequenz. Er kann auch solche Sequenzen beinhalten, die für eine eventuelle Integration des Vektors in das Chromosom notwendig sind.

Nach einer bevorzugten Ausführungsform enthält der Vektor ebenfalls ein Gen, das für einen Selektionsmarker kodiert, wie z. B. Hygromycin-Phosphotransferase (von den Elzen et al., 1985), welcher funktionell mit einem Promotor verbunden ist. Weitere Beispiele für Gene, die Antibiotika-Resistenz vermitteln und damit als selektierbierbare Marker in Frage kommen, schließen solche ein, die für Neomycin-Phosphotransferase (Velten et al., 1984), das Kanamycin- Resistenzgen (NPT II) aus Tn5 (Bevan et al., 1983), das von Thompson et al. (1987) beschriebene PAT-Gen oder für Chloramphenicol-Acetyltransferase kodieren. Für eine allgemeine Beschreibung von Expressionsvektoren für Pflanzen und selektierbare Markergene, die in der vorliegenden Erfindung angewendet werden können, siehe Gruber et al., (1993).

Als Promotorelement, das zur Kontrolle der Expression des interessierenden Gens bzw. des Markergens verwendet wird, ist jeder gegenüber Pflanzen kompatible Promotor geeignet. Es können Promotoren pflanzlicher Gene verwendet werden, wie der der kleinen Untereinheit der Ribulose-1,5-bis-Phosphat-Carboxylase (RUBISCO), oder Promotoren aus tumorinduzierenden Plasmiden aus Agrobacterium turnefaciens, wie die der Nopalin-Synthase und Octopin-Synthase; sie können gleichermaßen viralen Ursprungs sein, wie die "Cauliflower Mosaic Virus" (CaMV) 19S und 35S Promotoren oder der "Figwort Mosaic Virus 35S Promotor. Vgl. z. B. Internationale Anmeldung WO 91/19806 als Übersicht über bekannte pflanzliche Promotoren, die im Zusammenhang mit der vorliegende Erfindung geeignet sind.

"Gewebespezifische" Promotoren bewirken, daß die Akkumulierung eines oder mehrerer Genprodukte in dem Gewebe, in dem die Produkte der Carotin- oder Xanthophyllbiosynthese gewünscht wird, besonders hoch ist, wobei eine gewisse geringe Expression in anderen Pflanzenteilen auftreten kann. Beispiele für bekannte gewebespezifische Promotoren sind der Glutelin 1 Promotor (Kim et al., 1993; Okita et al., 1989; Zheng et al., 1993), der knollenspezifische Klasse I Patatin Promotor (Bevan et al., 1986), die Promotoren der Kartoffelknollen-assoziierten ADPGPP Gene (Muller et al., 1990), der Promotor des β- Conglycinins aus Soja, das auch als 7S Protein bekannt ist, wobei dieser Promotor die Samen­ spezifische Transkription betreibt (Bray, 1987), und ferner samenspezifische Promotoren der Zein-Gene, die das Mais-Endosperm betreffen (Pedersen et al., 1982). Ein weiterer Promotortyp, der in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, ist ein pflanzlicher Ubiquitin- Promotor. Pflanzliche Ubiquitin-Promotoren sind gut bekannt, wie von Kay et al., (1987) und in EP-A 0 342 926 dargelegt. Gleichermaßen im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignet sind Aktin-Promotoren, Histon-Promotoren und Tubulin-Promotoren. Beispiele für bevorzugte chemisch induzierbare Promotoren wie der Tabak PR-1a Promotor sind in EP-A 0 332 104 gegeben. Eine weitere bevorzugte Promotor-Kategorie schließt solche ein, die durch Verwundung induzierbar sind. Bevorzugte Promotoren dieser Kategorie schließen solche ein, die die von Stanford et al., (1989), Xu et al., (1993), Logemann et al., (1989), Rohrmeier und Lehle, (1993), Firek et al., (1993), und Warner et al., (1993) beschrieben worden sind.

Die pflanzlichen Zellen, Samen, Gewebe und vollständigen Pflanzen, die im Kontext der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen werden, können durch verschiedenste Methoden erhalten werden. Fachleuten auf diesem Gebiet ist bekannt, daß die Auswahl der Methoden vom Pflanzentyp abhängt, ob beispielsweise eine den Monocotyledonen oder Dicotyledonen zugehörige Pflanze transformiert werden soll. Derartige Verfahren umfassen allgemein den direkten Gentransfer, den chemisch induzierten Gentransfer, die Elektroporation und die Micro- Injektion (Crossway et al., 1986; Neuhaus et al., 1987), Agrobacterium-vermittelten Gentransfer, ballistische Partikel-Beschleunigung unter beispielhafter Verwendung von Geräten von Agracetus, Inc., Madison, Wisconsin, und Dupont, Inc., Wilmington, Delaware (siehe z. B. Sanford et al., US-Patent 4,945,050; und Mc Cabe et al., 1988), und dergleichen.

Ein Verfahren zum Erhalt der vorliegenden transformierten Pflanzen oder Pflanzenteile ist der direkte Gentransfer, bei dem Pflanzenzellen in der Anwesenheit von DNA-Oligonucleotiden, die die gewünschte, in die Pflanze oder in Teile derselben einzuführende Nucleotidsequenz umfassen, unter geeigneten Bedingungen kultiviert oder sonstwie propagiert werden. Die Donor-DANN- Quelle ist typischerweise ein Plasmid oder ein anderer brauchbarer Vektor, der das gewünschte Gen oder die gewünschten Gene enthält. Der Einfachheit halber wird hier die Bezeichnung "Plasmid" verwendet mit der Implikation, daß andere geeignete Vektoren, die das gewünschte Gen oder die gewünschten Gene enthalten, ebenfalls umfaßt sind.

Jedes geeignete pflanzliche Gewebe, das das Plasmid aufnimmt, ist dem direkten Gentransfer zugänglich. Derartiges pflanzliches Gewebe schließt beispielsweise reproduktive Strukturen in einem frühen Entwicklungsstadium, besonders vor der Meiose, und speziell 1-2 Wochen vor der Meiose, ein. Im allgemeinen werden die prä-meiotischen reproduktiven Organe in einer Plasmid- Lösung gebadet, wie z. B. durch Injizieren einer Plasmid-Lösung direkt in die Pflanze in oder in der Nähe der reproduktiven Organe. Die Pflanzen werden dann mit Pollen einer anderen, in der gleichen Weise behandelten Pflanze selbstbestäubt oder fremdbestäubt. Die Plasmid-Lösung enthält typischerweise etwa 10-50 µg DNA in etwa 0.1-10 ml pro floraler Struktur, jedoch kann auch mehr oder weniger verwendet werden, je nach Größe und Form der Struktur. Das verwendete Lösungsmittel ist typischerweise steriles Wasser, Salzlösung, gepufferte Salzlösung, oder ein konventionelles Pflanzenmedium. Wenn gewünscht, kann die Plasmid-Lösung auch Agentien enthalten, die die Plasmid-Aufnahme chemisch induzieren oder verbessern, wie z. B. PEG, Ca²⁺ und dergleichen.

Nach der Plasmid-Behandlung der reproduktiven Organe wird die florale Struktur bis zur Reife kultiviert, und die Samen werden geerntet. Abhängig vom Plasmid-Marker erfolgt die Selektion der transformierten Pflanzen mit dem Markergen durch Keimung oder Wachstum der Pflanzen in bzw. auf einem Marker-sensitiven, oder vorzugsweise einem Marker-resistenten Medium. Beispielsweise werden transformierte Samen von Pflanzen, die mit einem Kanamycin-Resistenz vermittelnden Plasmid behandelt worden sind, auf dem entsprechenden Medium grün bleiben, während Keimlinge ohne das Markergen farblos auswachsen. Das Vorhandensein des gewünschten Gens und dessen Expression als mRNA und Peptid kann durch konventionelles Southern, Northern und Western Blotting nachgewiesen werden.

Eine weitere geeignete Methode zur Durchführung der vorliegenden Erfindung besteht in der Behandlung von pflanzlichen Protoplasten zur Aufnahme des Plasmids. Die Präparation von Protoplasten ist gut bekannt und beinhaltet typischerweise den Verdau von Pflanzenzellen mit Cellulase und anderen Enzymen für eine ausreichende Zeitdauer, um die Zellwand zu entfernen. Zumeist werden die Protoplasten aus der Mischung durch Sieben und Waschen isoliert. Sie werden dann in einem geeigneten Medium aufgenommen, wie Medium F, CC Medium, etc., und zwar meistens in einer Dichte von 10⁴-10⁷ Zellen/ml. Zu dieser Suspension wird dann die o. g. Plasmid-Lösung und ein induzierendes Agens zugefügt, wie Polyethylenglycol, Ca²⁺, Sendai Virus oder dergleichen. Alternativ können die Plasmide in Liposomen verpackt werden. Die Lösung von Protoplasten und Plasmiden wird dann über eine ausreichende Zeitdauer inkubiert, wie etwa 1 Stunde lang bei etwa 25°C. Es ist in manchen Fällen wünschenswert, einen kurzen Hitzeschock anzuwenden, indem man die Mischung z. B. 2-5 Minuten lang auf etwa 45°C erhitzt und dann schnell auf Inkubationstemperatur abgekühlt. Die behandelten Protoplasten werden dann kloniert und auf Expression des gewünschten Gens oder der gewünschten Gene selektiert, z. B. durch Expression des Markergens und konventionelle Blot-Techniken. Ganze Pflanzen werden nachfolgend unter Anwendung konventioneller Techniken regeneriert.

Die Technik der Elektroporation ist im Prinzip ähnlich mit der Ausnahme, daß typischerweise elektrischer Strom an die Mischung nackter Plasmide und Protoplasten angelegt wird, was in einer Elektroporationskammer in An- oder Abwesenheit von Polyethylenglycol, Ca²⁺, oder dergleichen erfolgt. Die Elektroporation verläuft zumeist mit 1-10 Pulsen bei 40-10.000 Volt Gleichstrom bei einer Pulsdauer von 1-2000 µs mit typischerweise 0,2 Sekunden lang andauernden Intervallen zwischen den Pulsen. Wechselstrompulse ähnlicher Stärke werden ebenfalls angewendet. Sehr häufig wird ein geladener Kondensator an der Elektroporations­ kammer entladen, die die Plasmid-Protoplastenmischung enthält. Diese Behandlung resultiert in einer reversiblen Permeabilitätserhöhung von Biomembranen und ermöglicht somit die Insertion der erfindungsgemäßen Fremd-DNA. Elektroporierte pflanzliche Protoplasten erneuern ihre Zellwand, sie teilen sich und bilden Callusgewebe (siehe z. B. Riggs et al., 1986).

Eine andere Methode zur Transformation von Zielzellen beinhaltet die Verwendung von Agrobacterium. Bei dieser Methode werden Agrobakterien, die das Plasmid mit dem gewünschten Gen oder den Gen-Kassetten enthalten dazu verwendet, Pflanzenzellen zu infizieren und das Plasmid in das Genom der Zielzellen zu integrieren. Die Zellen, die das gewünschte Gen exprimieren, werden dann wie oben selektiert und kloniert. Eine Methode zur Integration eines Gens in ein Zielgewebe wie z. B. Knolle, Wurzel, Samen oder Frucht, mittels eines Plasmids, z. B. eines Ri-Plasmides und eines Agrobacteriums, wie A. rhizogenes or A. turnefaciens, betrifft die Verwendung eines kleinen rekombinanten, zur Klonierung in Escherichia coli geeigneten Plasmids, in welches ein Fragment der T-DNA inseriert ist. Dieses rekombinante Plasmid wird an einer Stelle innerhalb der T-DNA geöffnet, und ein Stück "Passagier"-DNA wird in diese Stelle ligiert. Die "Passagier"-DNA besteht aus dem oder den erfindungsgemäßen Genen, die in die pflanzliche DNA inkorporiert werden soll, sowie einem selektierbaren Marker, wie z. B. einem Gen, das Antibiotika-Resistenz vermittelt. Dieses Plasmid wird danach in ein größeres Plasmid umkloniert und dann in einen Agrobacterium-Stamm mit unmodifiziertem Ri-Plasmid eingeführt. Während des Wachstums der Bakterien kommt es gelegentlich zu einer seltenen doppelten Rekombination und die resultierenden Bakterien tragen dann in ihrer T-DNA ein Insert: die "Passagier"-DNA. Solche Bakterien werden über ihre Lebensfähigkeit auf einem Medium identifiziert, welches das Antibiotikum enthält. Diese Bakterien werden dazu verwendet, ihre T- DNA (mit "Passagier"-DNA modifiziert) in ein Pflanzengenom zu übertragen. Diese Vorgehensweise unter Verwendung von A. rhizogenes oder A. tumefaciens resultiert in transformierten Pflanzenzellen, die in gesunde, lebensfähige Pflanzen regeneriert werden können (siehe, z. B. Hinchee et al., 1988).

Eine andere Vorgehensweise besteht in der Bombardierung der Zellen mit Mikroprojektilen, die mit der zu transformierenden DNA beschichtet sind (Wang et al., 1988), oder die mit einer Druckwelle durch eine DNA-enthaltende Lösung in Richtung der zu transformierenden Zellen beschleunigt werden, wodurch sie in einen feinen Nebel dispergiert werden (EP-A 0 434 616).

Microprojectil-Bombardierung ist mittlerweile anerkannt als eine wirksame Transformations­ technik für Zellen einschließlich Pflanzenzellen. Bei Sanford et al., (1987), wird berichtet, daß diese Methode effizient Nukleinsäuren in das Cytoplasma von Allium cepa (Zwiebel) transferiert. Christou et al., (1988) berichteten über die stabile Transformation von Soja-Calli mit einem Kanamycin-Resistenzgen mittels Mikroprojektil-Bombardierung. Dieselben Autoren berichten von der Penetration von etwa 0.1% bis 5% der Zellen und fanden nachweisbare NPTII- Enzymaktivität und Resistenz in den Transformierten Calli bis zu einer Konzentration von 400 mg/l Kanamycin. McCabe et al., (1988) berichten über die stabile Transformation von Glycine max (Sojabohne) mittels Microprojectil-Bombardierung. McCabe et al. berichten ferner über den Erhalt einer transformierten R₁ Pflanze aus einer R_o chimären Pflanze (siehe auch Weissinger et al., 1988; Datta et al., 1990 (Reis); Klein et al., 1988a (Mais); Klein et al., 1988b (Mais); Fromm et al., 1990; und Gordon-Kamm et al., 1990 (Mais).

Alternativ können pflanzliche Plastiden auch direkt transformiert werden. Über die stabile Transformation von Chloroplasten höherer Pflanzen wurde berichtet, siehe z. B. SVAB et al., (1990), SVAB und Maliga, (1993), Staub und Maliga, (1993). Die Methode beruht auf der homologen Rekombination von DNA mit dem Plastidengenom. Sie enthält einen selektierbaren Marker und wird mit der "particle gun" appliziert. Bei der Anwendung solcher Methoden wird die Genexpression in Plastiden durch einen plastidären Gen-Promotor gewährleistet oder durch die trans-Aktivierung eines stillen Transgens im Plastom, das für die Expression zu einer selektiven Promotorsequenz gestellt ist, die beispielsweise von der T7-RNA-Polymerase erkannt wird. Das stille Gen wird aktiviert durch die Expression der spezifischen RNA-Polymerase aus einem nukleären Expressionskonstrukt, das die Polymerase durch ein angefügtes Transit-Peptid in die Plastiden adressiert. Gewebespezifität wird dadurch erreicht, daß die Kern-kodierte und Plastiden­ adressierte RNA Polymerase unter die Kontrolle eines geeigneten gewebespezifischen Promotors gestellt wird. Ein solches System wurde von McBride et al., (1994) beschrieben.

Die Aufzählung der o. g. Transformationsmethoden dient lediglich der beispielhaften Veranschaulichung, erhebt keinen Anspruch auf Vollständigkeit und beabsichtigt keinerlei Einschränkung der vorliegenden Erfindung.

Die vorliegende Erfindung umfaßt daher auch transgenes pflanzliches Material, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Protoplasten, Zellen, Calli, Geweben, Organen, Samen, Embryonen, Eizellen, Zygoten, etc., und speziell, ganzen Pflanzen. Dieses Material ist mit Mitteln des erfindungsgemäßen Verfahrens transformiert worden und umfaßt die erfindungsgemäße rekombinante DNA in exprimierbarer Form. Ferner umfaßt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung des transgenen pflanzlichen Materials.

Positive Transformanten werden nach bekannten Methoden zu Pflanzen regeneriert (siehe z. B. McCormick et al., 1986). Die Pflanzen können aufgezogen werden und dann von demselben transformierten Stamm oder anderen Stämmen bestäubt werden, bevor die Nachkommenschaft auf das Vorhandensein der gewünschten Eigenschaften und/oder hinsichtlich des Ausmaßes, mit dem die gewünschten Eigenschaften vorhanden sind, untersucht werden. Eine erste Evaluierung könnte beispielsweise das Ausmaß einer bakteriellen/pilzlichen Resistenz der transformierten Pflanzen zum Gegenstand haben. Zwei oder mehr Generationen können herangezogen werden, um sicher zu gehen, daß die phänotypischen Charakteristika stabil beibehalten und vererbt werden. Es werden schließlich Samen geerntet, die für den erreichten Phänotyp stehen.

Weiterhin sind von der vorliegenden Erfindung transgene Pflanzen umfaßt, insbesondere transgene fertile Pflanzen, die durch die erfindungsgemäßen Mittel und Verfahren erzeugt worden sind, und deren sexuelle und/oder asexuelle Nachkommenschaft, die weiterhin die neue und erwünschte Eigenschaft oder Eigenschaften tragen, die sie als Folge der Transformation der Mutterpflanze besitzen.

Der Ausdruck "Nachkommenschaft" wird in der Weise verstanden und gebraucht, daß sowohl "asexuell" als auch "sexuell" generierte Nachkommenschaft transgener Pflanzen bezeichnet werden. Diese Definition schließt auch alle Mutanten und Varianten ein, die mittels bekannter Verfahren erhältlich sind, wie z. B. Zellfusionen oder Mutantenselektionen, und die weiterhin die charakteristischen Eigenschaften der ursprünglichen transformierten Pflanze tragen, zusammen mit allen Kreuzungs- und Fusionsprodukten des transformierten Pflanzenmaterials.

Teile solcher Pflanzen, wie beispielsweise Blüten, Stengel, Früchte, Blätter und Wurzeln, die von den mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erzeugten transgenen Pflanzen oder von deren Nachkommenschaft herstammen und daher mindestens zum Teil aus transgenen Zellen bestehen, sind ebenfalls Gegenstände der vorliegenden Erfindung.

Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung, nicht aber der Beschränkung der vorliegenden Erfindung.

Hinterlegung biologischen Materials

E. coli-Stämme, die die erfindungsgemäßen Expressions-Kassetten tragen, sind bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) in Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland, nach dem Budapester Vertrag unter den folgenden Zugriffsnummern hinterlegt worden:

Stamm
Zugriffsnummer
pRiceCYC TOP10 (Kassette Plasmid B)	DSM 12714
pBaal42 TOP10 (Kassette Plasmid A)	DSM 12713

Beispiele Einführung der Provitamin A(β-Carotin)- und Xanthophyll-Biosynthese in Carotinoid-freies Reis­ (Oryza sativa)-Endosperm Phytoenbildung (Burkhardt et al., 1997)

Vorangegangene biochemische Untersuchungen mit radioaktiv markiertem Isopentenyl- Diphosphat haben gezeigt, daß Reis-Endosperm über eine enzymatisch aktive GGPP-Synthase verfügt und damit in der Lage ist, einen wichtigen Vorläufer für die Carotinoid-Biosynthese zur Verfügung zu stellen. Aus diesem Grund wurde die Japonica Reis Modell-Varietät Taipei 309 mittels Microprojectil-Bombardierung mit einer DNA transformiert, die für Phytoen-Synthase aus der Narzisse kodiert (Narcissus pseudonarcissus; (Zugr.nr. X78814, Schledz und Beyer 1996; Schledz et al., 1996). Diese wurde in einem Fall unter die Kontrolle eines konstitutiven, in einem anderen Fall unter die Kontrolle eines Endosperm-spezifischen Promotors gestellt. Es konnte in den transgenen Pflanzen gezeigt werden, daß das Narcissus-Enzym aktiv war, denn es akkumulierte in vivo das ungefärbte Carotin Phytoen im Reis-Endosperm. Damit war erstmalig gezeigt, daß es prinzipiell möglich ist, den ersten für die Carotinoid-Biosynthese spezifischen Schritt in ein nicht-photosynthetisches und Carotinoid-freies Gewebe einzuführen.

Einführung des Carotinoid-Biosyntheseweges zur Bildung von Lycopin, β-Carotin (Provitamin A) und Xanthophyllen in Reis-Endosperm Konstruktion der Plasmide

(Für molekularbiologische Standard-Techniken siehe Sambrook et al., 1989. Eine Schemazeichnung der Konstrukte ist in Abb. 4. wiedergegeben). Die verwendeten Strukturgene des Carotinoid-Biosyntheseweges waren:
Psy: Phytoen-Synthase aus Narcissus pseudonarcissus (Zugr.nr. X78814).
crTl: Carotin (Phytoen)-Desaturase aus dem Bakterium Erwinia uredovora, fusioniert mit der Transit-Sequenz der Rubisco aus Erbse (Misawa et al., 1993).
cyc: Lycopin-Cyclase aus Narcissuspseudonarcissus (Zugr.nr. X98796).

Konstruktion von pB19hpc (im Text "Plasmid A" genannt)

Ein DNA-Fragment, das das intakte Phytoen-Desaturasegen (crtI) aus Erwinia uredovora mit der Transitpeptid-Sequenz Rubisco small subunit (tp) aus Erbse stromabwärts des CaMV 35S- Promotors und stromaufwärts des nos 3' Polyadenylierungssignals trägt, wurde von Misawa et al. (1993) konstruiert. Dieses wurde in HindIII/EcoRI verdauten pUC19 ligiert, um das Plasmid pUCET4 zu erhalten. Die crTI-Expressionskassette wurde aus pUCET4 als HindIII/EcoRI- Fragment ausgeschnitten und in HindIII/EcoRI verdauten pBluescriptKS ligiert, was zum Plasmid pBaal1 führte. Das Plasmid pGt1PsyH (Burckhardt et al., 1997), das eine psy- Expressionskassette aus Phytoen-Synthase (cDNA aus Narcissus pseudonarcissus; Zugr.nr. X78814) unter Kontrolle des Reis Glutelin 1 Promotors (Gt1; Kim et al., 1993; Okita et al., 1989; Zheng et al., 1993) sowie das nos 3' Polyadenylierungssignal trägt, wurde mit SacII verdaut und mittels T4-DNA- Polymerase mit glatten Enden versehen. Um die psy Expressionskassette zu erhalten, wurde ein zweiter Verdau mit KpnI durchgeführt. Das SacII("blunted")/KpnI-Fragment wurde dann in XhoI("blunted")/KpnI verdauten pBaal1 ligiert. Das resultierende Plasmid pBaal2 war damit mit einer crtI und einer psy Expressionskassette versehen.

Der Polylinker in pUC18 wurde zur Einführung folgender Restriktions-Schnittstellen in der angegebenen Reihenfolge ersetzt: Hind III, I-SceI, KpnI, NotI, SmaI, IsceI, EcoRI. Das resultierende Plasmid pUC 18M wurde mit KpnI und NotI verdaut. Ein DNA-Fragment mit den crtI und psy Expressionskassetten wurde aus pBaal2 mit KpnI und NotI ausgeschnitten und in den erwähnten restringierten pUC 18M ligiert. Das erhaltene Plasmid pBaal3 enthält die beiden Expressionskasetten, flankiert von zwei Meganuclease Restriktions-Schnittstellen (I-SceI).

Die Expressionskassette des Hygromycin Phosphotransferasegens aph IV, die den Resistenzmarker unter der Kontrolle des CaMV35S Promotors sowie ein CaMV 35S Polyadenylierungssignal trägt, wurde aus pRice (siehe Konstruktion des Plasmid B) als KpnI Fragment erhalten in KpnI-verdauten pBaal3 ligiert. Die erhaltenen Plasmide pBaal41 und pBaal42 enthalten die Hygromycin-Resistenzkassette in der gleichen Orientierung wie die psy Expressionskassette (pBaal41), oder in umgekehrter Orientierung (pBaal42).

Der Vektor pBin19 (Bevan, 1984) wurde mit EcoRI und HindIII verdaut und ein synthetisches Oligonukleotid wurde zur Herstellung des Plasmids pBin19M nach einem Standardprotokoll eingefügt. Es verfügte über die folgenden Restriktions-Schnittstellen in der angegebenen Reihenfolge: HindIII, I-SceI, KpnI, NotI, SmaI, IsceI, EcoRI.

Die Expressionskassetten von crtI, psy and aph IV wurden mit Hilfe der I-SceI-Meganuklease- Schnittstelle aus pBaal42 erhalten in pBin19M ligiert. Das resultierende Plasmid pB19hpc wurde dann zur Transformation verwendet.

Konstruktion von pZCycH (im Text "Plasmid B" genannt)

Der Glutelin 1 Promotor Gt1 wurde aus pKS1 (Okita et al., 1989) mit EcoR/BgIII ausgeschnitten und zum Erhalt des Plasmides pV34Gt1 in BamHI/MunI verdauten pV34 (Fütterer and Potrykus, unveröffentlicht) zwischen zwei I-SceI Meganuclease Schnittstellen ligiert. Die Expressions­ kassette des Hygromycin-Phosphotransferasegens aph IV, die das CaMV 35S Polyadenylierungssignal enthält, gefolgt von aph IV unter Kontrolle des CaMV35S Promotors und einem zweiten CaMV 35S Polyadenylierungssignal, wurde aus pCIB900 (Wünn et al., 1996) mit Hilfe von SalI und SacI ausgeschnitten. Nach Ligation eines XhoI-Adapters in der SacI- Schnittstelle des erhaltenen Fragments wurde die Kassette in pV34Gt1 ligiert zum Erhalt des Plasmides (pRice). Die Lycopin-Cyclase cyc (cDNA aus Narcissus pseudonarcissus, Zugr.nr. X98796) wurde aus dem Plasmid pGEM4CYC (Bonk et al., 1997) mit Hilfe von Ecl136II und BamHI ausgeschnitten. Nach Behandlung mit Klenow Fragment wurde cyc Ecl36II verdauten pRice ligiert zum Erhalt von pRiceCYC.

Der Vektor pPZP 100 (Hajdukiewicz et al., 1994) wurde mit EcoRI und HindIII verdaut und nach einem Standardprotokoll mit einem synthetischen Oligonucleotid versehen, das die folgenden Restriktions-Schnittstellen in der angegebenen Reihenfolge enthält: HindIII, I-SceI, KpnI, NotI, SmaI, IsceI, EcoRI. Dies ergab das Plasmid pPZP100M.

Die cyc aphIV Doppelkassette wurde aus pRiceCYC mit Hilfe der I-SceI Meganuclease ausgeschnitten und in I-Sce-I verdauten pPZPl00M ligiert. Dies ergab das Plasmid pZCycH.

Callusinduktion und Transformation

Callusinduktion: Unreife Samen ("milk stage") des Japonica Reis Kultivars TP 309 wurden im Gewächshaus gesammelt, mit 70% Ethanol (v/v) 1 min lang oberflächensterilisiert, in 6% Calzium Hypochlorid eine Stunde lang auf einem Schüttler behandelt und 3- bis 5mal mit sterilem destilliertem Wasser gewaschen. Von den sterilisierten Samen wurden unter einem Binokular unter sterilen Bedingungen unreife Embryonen isoliert und auf NB-Medium kultiviert (N6 Salze und B5 Vitamine, supplementiert mit 30 g/l Maltose, 500 mg/l Prolin, 300 mg/l Kasein Hydrolat, 500 mg/l Glutamin, und 2 mg/l 2,4-D, pH 5.8). Nach 4-5 Tagen wurden die Koleoptilen entfernt und die gequollenen Scutellen auf frischem NB-Medium für 3-5 Tage weiterkultiviert, bis zur Inokulation mit Agrobacterium.

Agrobacterium-vermittelte Transformation

Eine Woche alte vorkultivierte unreife Embryonen wurden mit einer Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 Zellsuspension behandelt, wie beschrieben (Uze et al. 1997). Zur Co-transformation der beiden separaten Vektoren, pZPsC und pZCycH wurden LBA4404/pZPsC (OD₆₆₀ = 2.0) mit einem gleichen Volumen an LBA4404/pZCycH (OD₆₀₀ = 1.0) gemischt und nach Acetonsyrigon-Induktion zur Inokulierung verwendet. Die inokulierten vorkultivierten Embryonen wurden für drei Tage auf NB Medium co­ kultiviert und mit 200 mM Acetonsyringone supplementiert, dann für eine Woche auf Cefotaxim­ haltiges Medium überführt (NB mit 250 mg/l Cefotaxim) und danach für 4-6 Wochen auf Selektionsmedium gebracht (NB Selektionsmedium in Anwesenheit von 30 mg/l Hygromycin und 250 mg/l Cefotaxim). Die Pflanzen wurden dann innerhalb von vier Wochen von resistenten Calli regeneriert (NB Medium mit 0.5 mg/l NAA und 3 mg/l BAP). Nach Bewurzelung wurden sie in das Gewächshaus transferiert.

Southern blotting

Zum Nachweis der Anwesenheit des Transgens wurden Southern blots nach Standard-Verfahren (Sambrook et al. (1989)) durchgeführt unter Verwendung der homologen markierten Sonden für Phytoen-Synthase, CrtI und Cyclase.

Carotinoid-Pigmentanalysen

Samen (1 g) von R0-Pflanzen wurden entspelzt und zur Entfernung der Samenschale 8 Stunden lang mit Schleifpapier auf einem Schüttler behandelt. Schon bei visueller Inspektion fiel bei den Transformanten eine deutlich erkennbare gelbliche Färbung auf, die auf das Vorhandensein von Carotinoiden hinwies. Darüberhinaus zeigte sich ein Seggregationsmuster, das in vielen Fällen sehr in der Nähe des erwarteten 3(gelb) zu 1(weiß) Verhältnisses lag.

Die Samen von individuellen Linien (je 50) wurden mit Hilfe eines Micro Dismembrators (Braun, Melsungen) zu einem feinen Pulver vermahlen. Dieses wurde wiederholt bis zur völligen Entfärbung mit Aceton extrahiert. Die kombinierten Extrakte wurden unter einem Stickstoffstrom getrocknet. Der Rest wurde in Chloroform gelöst und quantitativ der HPLC-Analyse zugeführt unter Verwendung eines Waters HPLC Systems, das mit einem Photodiodenarray Detektor und einer C₃₀ Umkehrphasensäule ausgerüstet war (YMC Europe GmbH). Die Trennung wurde mit folgendem Eluentensystem durchgeführt A: MeOH : tert Butylmethyl Ether (1 : 1, v/v) B: MeOH : tert Butylmethyl Ether : H₂O (6 : 1.2 : 1.2, v/v/v) unter Verwendung eines Gradienten 100% B to 43% B in 25 min. dann nach 0% B innerhalb weiterer 75 min. Diese Endbedingungen wurden für weitere 10 min beibehalten, bevor rück-äquilibriert wurde. Beispiele für die erhaltenen Ergebnisse zeigt Abb. 3A (eine untransformierte Kontrolle), Abb. 3B (Transformante mit Plasmid A) und Abb. 3C (Transformante mit Plasmid A und B). Es ist offensichtlich, daß in den Transformanten Carotinoide akkumulieren. Die Kontrollen zeigten manchmal in Spuren Carotinoide; diese entstammen sehr wahrscheinlich der Samenschale, deren vollständige Entfernung schwierig ist. Unter den detektierten Carotinoiden in den transformierten Samen war β-Carotin (Provitamin A) am häufigsten vertreten (bis 60%). Zusätzlich erwies sich der Xanthophyll-Biosyntheseweg als aktiv, was zur Bildung von Lutein und Zeaxanthin, wie auch gewisser Mengen an epoxidierten Carotinoiden führte. Es wird geschlossen, daß dieser spätere Teil des Biosyntheseweges durch die Transformation oder durch Produkte der Transformation induziert wird. Alternativ könnte der Xanthophyll-bildende Anteil des Biosyntheseweges konstitutiv im Reis-Endosperm exprimiert sein und dadurch zur Bildung der Xanthophylle Zeaxanthin und Lutein plus einiger zusätzlicher Komponenten, die epoxidierte Xanthophylle repräsentieren, führen.

Linien, die nur mit Plasmid A transformiert sind, zeigten im Prinzip dasselbe Carotinoidmuster, jedoch war der Carotinoidgehalt generell niedriger.

Speziell die Anwesenheit von Lutein und Zeaxanhin repräsentiert einen unerwarteten zusätzlichen Wert, wegen der durch sie hervorgerufenen positiven Effekte, z. B. beim Sehvorgang (siehe z. B. Brown et al., 1998; Schalch, 1992).

Es ist offenbar, daß viele Modifikationen und Variationen der vorliegenden Erfindung möglich sind, ohne den Grundgedanken der vorliegenden Erfindung zu verlassen. Es wird daher darauf hingewiesen, daß die vorliegende Erfindung im Rahmen der anhängenden Patentansprüche auch auf andere Weise als vorliegend detailliert beschrieben ausgeführt werden kann.

CPTA induziert Gene der Carotinoid-Biosynthese

Der altbekannte Lycopin-Cyclaseinhibitor CPTA (2-(4-chlorphenylthio)triethylamine hydrochloride) und verwandte Verbindungen (siehe z. B. El-Sayed Osman et al., 1984; Fosket und Radin, 1982) ahmen hinsichtlich der Lycopin-Akkumulierung die Transformation mit Plasmid A nach. Um eine Aufregulierung von Carotinoid-Biosynthesegenen nachzuweisen, wurde CPTA nach der Verfahren Scheutz und Baldwin (1957) synthetisiert und die Verbindung in einer 1 mM wässrigen Lösung an Narzissenblüten angewendet. Dieses photosynthetisch inaktive Gewebe reagierte, wie erwartet, mit Lycopin-Akkumulierung. Jedoch wurde der Gesamt-Carotinoidgehalt dabei mehr als verdoppelt, was durch die primäre CPTA-Wirkung (inhibitorisch!) nicht erklärbar ist. Es wurden daher Northern und Western Blot Analyse durchgeführt, um eine mögliche Induktion der Häufigkeit spezifischer Transkripte die für Carotinoid-Biosyntheseenzyme kodieren, oder der Häufigkeit carotinogener Enzyme nachzuweisen.

Abb. 5A zeigt die Resultate der Northern blots. Gesamt-RNA wurde von unbehandelten (Spur 1) und CPTA-behandelten Blüten isoliert. Die immobilisierte RNA wurde wiederholt gestripped, um aufeinanderfolgende Hybridisierungen mit Sonden für Phytoen-Synthase (B), Phytoen-Desaturase (C), ζ-Carotin-Desaturase und Lycopin-Cyclase zu ermöglichen. Es ist ersichtlich, daß, mit Ausnahme von ζ-Carotin-Desaturase, alle spezifischen carotinogenen RNAs, einschließlich der für Lycopin-Cyclase in ihrer Gleichgewichtskonzentration erhöht sind.

Für Western blot Analysen (siehe Fig. 5B) wurde Gesamt-Protein von unbehandelten und CPTA­ behandelten Blüten isoliert. Diese wurden nach SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (30 µg Protein pro Spur) auf Nitrozellulosemembranen überführt. Die Blots wurden dann mit Antikörpern gegen Phytoen-Synthase (A), Phytoen-Desaturase (B), ζ-Carotin-Desaturase (C) und Lycopin-Cyclase entwickelt. Es ist ersichtlich, daß auf Proteinebene ein Anstieg in der Häufigkeit der untersuchten Enzyme stattfindet.

Mit den Daten über Reis (s. o.) kann geschlossen werden, daß Carotinoide (oder davon abgeleitete Produkte) in der Lage sind, die Bildung von Carotinoiden in der Art eines "Feedback"- Mechanismus zu induzieren.

Die vorliegende Erfindung stellt damit Mittel bereit, um den Carotinoid-Biosyntheseweg mittels gentechnologischer Verfahren in Carotinoid-freie Gewebe einzuführen, oder um die Produktivität prä-existierender Carotinoid-Biosynthesewege zu erhöhen. Das Verfahren kann dazu verwendet werden, den ernährungsphysiologischen Wert, die pharmakologischen Eigenschaften und das farbliche Erscheinungsbild von Samen, Früchten, Knollen, Blüten oder Blättern zu verändern.

Die Erfindung ist insbesondere bei der Verbesserung von Nahrungs-Erfordernissen nützlich, denn dabei kommt es nicht primär darauf an, sehr hohe Carotinoidmengen zu erzeugen. Beispielsweise besteht Reis in seiner geschälten Form aus dem Endosperm, das keine detektierbaren Mengen an Carotinoiden enthält. Diese sind in der Samenschale enthalten, die während der Verarbeitung entfernt wird. Das Schälen ist notwendig, um eine längerfristige Lagerung der Reiskörner zu ermöglichen.

Die Erfindung repräsentiert das erste Beispiel einer de-novo-Einführung eines Carotinoid- Biosyntheseweges durch biotechnologische Verfahren. Sie ist auf andere Carotinoid-freie Gewebe agronomisch wichtiger Pflanzen, beispielsweise auf die Samen anderer Cerealien oder Wurzelgewebe, die keine gefärbten oder ungefärbten Carotinoide besitzen, anwendbar. Das schließt das Potential zur Steigerung oder Modifizierung prä-existierender Carotinoid- Biosynthesewege nicht aus.

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Claims (20)

1. Isoliertes DNA-Molekül, umfassend eine Nukleotidsequenz mit einer oder mehreren Expressions-Kassetten, welche in der Lage sind, die Bildung eines oder mehrerer, für die Carotinoid-Biosynthese spezifischen Enzyme zu steuern, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

• - Phytoen-Synthase, abgeleitet aus Pflanzen, Pilzen oder Bakterien,
• - Phytoen-Desaturase, abgeleitet aus Pflanzen, Pilzen oder Bakterien,
• - ζ-Carotin-Desaturase, abgeleitet aus Pflanzen oder Cyanobakterien und
• - Lycopin-Cyclase, abgeleitet aus Pflanzen, Pilzen oder Bakterien,

unter der Maßgabe, daß eine Expressions-Kassette, welche in der Lage ist, die Bildung von Phytoen-Synthase alleine zu steuern, ausgeschlossen ist.

2. DNA-Molekül nach Anspruch 1, bei dem die Expressions-Kassette ein oder mehrere Gene oder cDNAs umfaßt, die für pflanzliche, pilzliche oder bakterielle Phytoen-Synthase, pflanzliche, pilzliche oder bakterielle Phytoen-Desaturase, pflanzliche ζ-Carotin- Desaturase, oder pflanzliche, pilzliche oder bakterielle Lycopen-Cyclase kodieren, jeweils operativ verknüpft mit einem geeigneten konstitutiven, induzierbaren oder gewebespezifischen Promotor, welcher deren Expression in pflanzlichen Zellen, Samen, Geweben oder vollständigen Pflanzen erlaubt, unter der Maßgabe, daß eine Expressions-Kassette, welche ein allein für Phytoen-Synthase kodierendes Gen oder cDNA umfaßt, ausgeschlossen ist.

3. DNA-Molekül nach Anspruch 1 oder 2, ferner umfassend mindestens ein selektierbares Marker-Gen oder cDNA, operativ verknüpft mit einer konstitutiven, induzierbaren oder gewebespezifischen Promotor-Sequenz, welche dessen Expression in pflanzlichen Zellen, Samen, Geweben oder vollständigen Pflanzen erlaubt.

4. DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem die für Phytoen-Synthase kodierende Nukleotid-Sequenz aus Pflanzen abgeleitet ist, vorzugsweise exprimiert unter der Kontrolle eines gewebespezifischen Promotors.

5. DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem die für Phytoen-Desaturase kodierende Nukleotid-Sequenz aus Bakterien abgeleitet und mit einer geeigneten, für ein plastidäres Transit-Peptid kodierenden Sequenz fusioniert ist, wobei beide vorzugsweise unter der Kontrolle eines gewebespezifischen oder konstitutiven Promotors exprimiert werden.

6. DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem die für Lycopin-Cyclase kodierende Nukleotid-Sequenz aus Pflanzen abgeleitet ist, vorzugsweise exprimiert unter der Kontrolle eines gewebespezifischen oder konstitutiven Promotors.

7. DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 2 bis 6, bei dem das selektierbare Marker-Gen oder die cDNA-Hygromycin-Phosphotransferase unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors ist.

8. DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 7, bei dem die Nukleotid-Sequenz funktionelle Expressions-Kassetten sowohl für Phytoen-Synthase als auch für bakterielle oder pilzliche Phytoen-Desaturase umfaßt.

9. DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 7, bei dem die Nukleotid-Sequenz eine funktionelle Expressions-Kassette für Lycopen-Cyclase umfaßt.

10. DNA-Molekül nach Anspruch 5 oder 8, bei dem die plastidäre Transitpeptid-Sequenz von der kleinen Untereinheit der Bohne Rubisco (tp) abgeleitet ist.

11. Plasmid oder Vektorsystem, umfassend ein oder mehrere DNA-Moleküle gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10.

12. Plasmid oder Vektorsystem nach Anspruch 11, abgeleitet von Agrobacterium tumefaciens.

13. Transgene pflanzliche Zellen, Samen, Gewebe oder vollständige Pflanzen, enthaltend ein DNA-Molekül gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10.

14. Transgene pflanzliche Zellen, Samen, Gewebe oder vollständige Pflanzen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus eukaryotischen Algen, Embryophyten umfassend Bryophyta, Pteridophyta und Spermatophyta wie Gymnospermae und Angiospermae, wobei letztere Magnoliopsida, Rosopsida und Liliopsida (Monocotyledonen) einschließen.

15. Transgene pflanzliche Zellen, Samen, Gewebe oder vollständige Pflanzen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Körnern und Samen, wobei Reis, Weizen, Gerste, Hafer, Amaranth, Flachs, Triticale, Roggen und Mais bevorzugt sind; Ölsamen, wobei Brassica- Samen, Samen von Baumwolle, Soja, Färberdistel, Sonnenblume und Kokospalme bevorzugt sind; anderen eßbaren Samen oder Samen mit eßbaren Anteilen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Kürbisfrüchten, Sesam, Mohn, Wein, Mung-Bohnen, Erdnuß, Erbse, Bohne, Rettich, Alfalfa, Kakao, Kaffee, Hanf; Nußbäumen, wobei Walnüsse, Mandeln und Kichererbsen bevorzugt sind; Kartoffeln, Karotten, Süßkartoffeln, Tomaten, Paprika, Cassava, Weiden, Eichen, Ulmen, Ahorn, Äpfel, Bananen; ornamentalen Blumen, wobei Lilien, Orchideen, Seggen, Rosen, Hahnenfuß, Petunien, Phlox, Veilchen und Sonnenblumen bevorzugt sind.

16. Verfahren zur Transformation pflanzlicher Zellen, Samen, Gewebe oder vollständiger Pflanzen zum Erhalt von Transformanten, welche in der Lage sind, sämtliche Enzyme des Carotinoid-Biosyntheseweges zu exprimieren, die notwendig sind, um gewünschte Carotine und Xanthophylle zu bilden, umfassend die Transformation der pflanzlichen Zellen, Samen, Geweben oder vollständigen Pflanzen mit einem oder mehreren DNA- Molekülen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, oder mit einem Plasmid oder Vektorsystem gemäß Anspruch 11 oder 12.

17. Verfahren nach Anspruch 16, bei dem die zur Transformation ausgewählten pflanzlichen Zielzellen, -samen oder -gewebe normalerweise Carotinoid-frei sind.

18. Verfahren nach Anspruch 16, bei dem die zur Transformation ausgewählten pflanzlichen Zielzellen, -samen oder -gewebe normalerweise Carotinoide in Mengen enthalten, deren Vergrößerung oder Veränderung erwünscht ist.

19. Transformierte vollständige Pflanze, regeneriert aus Transformanten, die gemäß einem der Ansprüche 16 bis 18 erhalten wurden, oder Teile derselben, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus eukaryotischen Algen, Embryophyten umfassend Bryophyta, Pteridophyta und Spermatophyta wie Gymnospermae und Angiospermae, wobei letztere Magnoliopsida, Rosopsida und Liliopsida (Monocotyledonen) einschließen.

20. Transformierte vollständige Pflanze oder Teile derselben nach Anspruch 19, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Körnern und Samen, wobei Reis, Weizen, Gerste, Hafer, Amaranth, Flachs, Triticale, Roggen und Mais bevorzugt sind; Ölsamen, wobei Brassica- Samen, Samen von Baumwolle, Soja, Färberdistel, Sonnenblume und Kokospalme bevorzugt sind; anderen eßbaren Samen oder Samen mit eßbaren Anteilen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Kürbisfrüchten, Sesam, Mohn, Wein, Mung-Bohnen, Erdnuß, Erbse, Bohne, Rettich, Alfalfa, Kakao, Kaffee, Hanf; Nußbäumen, wobei Walnüsse, Mandeln und Kichererbsen bevorzugt sind; Kartoffeln, Karotten, Süßkartoffeln, Tomaten, Paprika, Cassava, Weiden, Eichen, Ulmen, Ahorn, Äpfel, Bananen; ornamentalen Blumen, wobei Lilien, Orchideen, Seggen, Rosen, Hahnenfuß, Petunien, Phlox, Veilchen und Sonnenblumen bevorzugt sind.