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DE602004011035T2 - Erhöhte ansammlung von karottenoiden in pflanzen - Google Patents

Erhöhte ansammlung von karottenoiden in pflanzen Download PDF

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DE602004011035T2
DE602004011035T2 DE602004011035T DE602004011035T DE602004011035T2 DE 602004011035 T2 DE602004011035 T2 DE 602004011035T2 DE 602004011035 T DE602004011035 T DE 602004011035T DE 602004011035 T DE602004011035 T DE 602004011035T DE 602004011035 T2 DE602004011035 T2 DE 602004011035T2
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polynucleotide
seed
sequence
plant
seq
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Caroline Rachel Bracknell DRAKE
Jacqueline Ann Bracknell PAINE
Catherine Ann Bracknell SHIPTON
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Syngenta Ltd
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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft unter anderem die rekombinante DNA-Technologie. Genauer gesagt betrifft die Erfindung die Bereitstellung verbesserter Polynucleotide, die eine verstärkte Anhäufung von Carotinoiden in Pflanzen bereitstellen, und insbesondere die Samen dieser Pflanzen. Die Erfindung stellt auch Pflanzenmaterial, Pflanzen und Samen bereit, welche die Polynucleotide enthalten, insbesondere Reispflanzenmaterial, Reispflanzen und Reissamen.
  • Carotinoide sind 40-Kohlenstoff(C40)-Isoprenoide, die durch Kondensierung von acht Isopreneinheiten gebildet werden, welche vom Biosynthese-Vorläufer Isopentenyldiphosphat abstammen. Nach der Nomenklatur fallen Carotinoide im Wesentlichen in zwei Klassen, d. h. Carotine und Xanthophylle. Ihre wesentlichen Funktionen in Pflanzen liegt darin, sie gegen photo-oxidative Schädigungen im Photosyntheseapparat der Plastide zu schützen. Zusätzlich dazu nehmen Carotinoide an der Lichternte während der Photosynthese teil und stellen integrale Bestandteile der Photosynthese-Reaktionszentren dar. Carotinoide sind die direkten Vorläufer des Phytohormons Abscisinsäure. Ein Teil des Carotinoid-Biosynthesewegs ist in 1 gezeigt.
  • Carotinoide mit Provitamin A-Aktivität sind wesentliche Bestandteile der menschlichen Nahrung. Zusätzlich gibt es überwältigende Hinweise darauf, die nahelegen, dass eine Diät, die an Carotinoiden reich ist, eine Anzahl schwerwiegender medizinischer Zustände in der Entwicklung hindern kann, einschließlich einiger Krebsformen (insbesondere der Lunge und Prostata), makulare Degeneration, Kataraktbildung und cardiovasculäre Erkrankungen. Carotinoide sind ebenfalls hinsichtlich ihrer immunmodulierenden Wirkungen beschrieben worden, wie beispielsweise der Reduzierung der UV-induzierten Immunsuppression. Carotinoide sind in der Lage, als wirksame Quencher für schädliche reaktive Sauerstoffspezies zu wirken, wie beispielsweise Einzel-Sauerstoff, und daher haben sie antioxidative Eigenschaften.
  • Mit der Zunahme der Weltbevölkerung bleibt die Notwendigkeit zur Herstellung von Nahrungsmitteln, die reich an Nährstoffen sind, die gesund sind, die schmecken und visuell ansprechen.
  • Die allgemeine Einschleusung von Genen, die an dem Carotinoid-Biosyntheseweg in Pflanzen beteiligt sind, ist in WO 00/53768 beschrieben. US 6,429,356 beschreibt Verfahren zur Herstellung von Pflanzen und Samen mit geänderter Fettsäure, Tocopherol und Carotinoid-Zusammensetzungen durch Insertion eines crtB-Gens. Die vorliegende Erfindung stellt unter anderem verbesserte Polynucleotide bereit, die, wenn sie in Pflanzenmaterial inseriert werden, eine überraschend hohe Anhäufung von Carotinoiden mindestens in den Samen der Pflanzen ermöglichen, welche aus diesem Material stammen. Genauer gesagt stellt die vorliegende Erfindung besondere Kombinationen aus Nucleotidsequenzen bereit, die, wenn sie in Pflanzenmaterial exprimiert werden, eine überraschend hohe Anhäufung von Carotinoiden mindestens in den Samen der Pflanzen bereitstellen, welche von diesem Material stammen.
  • Erfindungsgemäß wird ein Polynucleotid bereitgestellt, das umfasst: (a) einen Bereich, welcher als operativ verbundene Bestandteile (i) einen Promotor, welcher eine in Samen bevorzugte Expression bereitstellt; und (ii) eine Nucleotidsequenz, die von einem Bakterium abstammt, wobei die Sequenz eine Carotin-Desaturase kodiert; und (iii) einen Transkriptions-Beendigungsbereich umfasst; und (b) eine weitere Region, die als operativ verbundene Bestandteile (i) einen Promotor umfasst, welcher eine in Samen bevorzugte Expression bereitstellt; und (ii) eine Nucleotidsequenz, welche eine Phytoen-Synthase kodiert, wobei die Sequenz aus Mais (Zea sp.) oder Reis (Orzya sp.) stammt; und (iii) einen Transkriptions-Beendigungsbereich.
  • Ebenfalls offenbart ist ein Polynucleotid umfassend: (a) einen Bereich, welcher als operativ verbundene Bestandteile (i) einen Promotor umfasst, welcher eine in Samen bevorzugte Expression ermöglicht; und (ii) eine Nucleotidsequenz, die aus einem Bakterium stammt, wobei die Sequenz eine Carotin-Desaturase kodiert; und (iii) einen Transkriptions-Beendigungsbereich; und (b) einen weiteren Bereich, welcher als operativ verbundene Bestandteile (i) einen Promotor umfasst, welcher eine in Samen bevorzugte Expression ermöglicht; und (ii) eine Nucleotidsequenz, welche eine Phytoen-Synthase kodiert, wobei die Sequenz aus der Tomate (Lycopersicon sp.) oder Paprika (Capsicum sp.) oder einem Bakterium stammt; und (iii) einen Transkriptions-Beendigungsbereich.
  • In einer weiteren Ausführungsform ist diese Carotin-Desaturase aus Streptomyces, Straphylococcus, Synechocystis, Rhodobacter, Paracoccus, Erwinia und Xanthophyllomyces erhältlich. In einer weiteren Ausführungsform ist diese Carotin-Desaturase eine Phytoen-Desaturase. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist diese Phytoen-Synthase aus Zea mays oder Orzya sativa erhältlich.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird diese Phytoen-Synthase aus Zea mays oder Orzya sativa gewonnen. In noch einer weiteren Ausführungsform umfasst diese Phytoen-Synthase, wird umfasst von oder besteht aus der Sequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die in SEQ ID Nr. 10, 11, 12 und 13 dargestellt ist. In einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform umfasst die Phytoensynthase, ist umfasst von, oder besteht aus einer Sequenz, welche das Protein kodiert, welches in SEQ ID Nr. 14 dargestellt ist. Alternative Phytoen-Synthase kodierende Sequenzen können ebenfalls in Datenbanken erhältlich sein, die einem Fachmann auf dem Gebiet bekannt ist. Beispielsweise die Sequenzen, die in der EMBL-Datenbank unter den Zugangs-Nummern AY024351, AK073290, AK108154 und AY078162 dargestellt sind.
  • Ebenfalls offenbart ist eine Phytoen-Synthase, die aus Lycopersicon esculentum oder Capsicum anuum stammt, erhältlich ist oder daraus erhalten wurde. Noch weiter offenbart ist eine Phytoen-Synthase, wobei diese aus SEQ ID Nr. 15 oder SEQ ID Nr. 16 besteht, diese umfasst oder umfasst wird.
  • Weiter offenbart ist eine Phytoensynthase, die aus dem CrtB-Gen von Bakterien stammt, erhältlich ist oder daraus erhalten wird. Insbesondere umfasst diese CrtB, ist umfasst von oder besteht aus der CrtB-Sequenz, die in Shewmaker et al. (1999) Plant J. 20: 401–12, dargestellt ist. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung stammt die Sequenz, die eine Carotin-Desaturase eines Bakteriums kodiert, aus Erwinia sp., genauer gesagt aus Erwinia uredovora. In einer noch weiteren Ausführungsform stammt die Carotin-Desaturase aus dem CrtI-Gen von Erwinia uredovora. In einer noch weiteren Ausführungsform ist die Carotin-Desaturase das CrtI-Gen aus Erwinia uredovora. In einer noch weiteren Ausführungsform umfasst die Carotin-Desaturase, ist umfasst von oder besteht aus der Sequenz, die in SEQ ID Nr. 18 oder SEQ ID Nr. 19 dargestellt ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Polynucleotid bereit, das oben beschrieben worden ist, wobei dieser Promotor ausgewählt ist aus dem Glutelin 1-Promotor und dem Prolaminpromotor und der Transkriptions-Beendigungsbereich ausgewählt ist aus den Nos; CaMV 35S und PotP1-II Transkriptions-Beendigungsbereichen. Diese Glutelin 1- und Prolamin-Promotoren können aus Reis isoliert werden. In einer besonderen Ausführungsform umfasst dieser Promotor die Sequenz, die in SEQ ID Nr. 20 oder 21 dargestellt ist.
  • Weitere Promotoren schließen den Promotor ein, der vom Napin-Gen aus Brassica napus stammt und andere Promotoren, die von Genen stammen, die normalerweise im Endosperm des Samens exprimiert werden. Weitere Transkriptions-Beendigungsbereiche schließen den Terminatorbereich eines Gens von alpha-Tubulin ( EP-A 652,286 ) ein. Es ist ebenfalls möglich, andere regulatorische Sequenzen in Verbindung mit der Promotor-Regulierungssequenz zu verwenden, die zwischen dem Promotor und der Sequenz, die das Protein kodiert, liegen, wie beispielsweise Transkriptions- oder Translationsverstärker, z. B. Tobacco Etch Virus (TEV) Translationsaktivatoren, welcher in der internationalen Patentanmeldung, PCT Veröffentlichungs-Nr. WO 87/07644 beschrieben ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Polynucleotid bereit, das oben beschrieben worden ist, wobei die Sequenz, welche Carotin-Desaturase kodiert und die Sequenz, die Phytoensynthase kodiert, ferner eine Plastid-Zielsequenz umfassen. In einer besonderen Ausführungsform ist die Plastid-Zielsequenz eine, die aus der kleinen Unterheit der Ribulosebisphosphatcarboxylase (RUBISCO Ssu) von Pisum sativum stammt. In einer weiteren Ausführungsform ist diese RUBISCO Ssu Plastid-Zielsequenz 5' des Translationsstartpunkts dieses Carotin-Desaturasegens lokalisiert, welches aus CrtI stammt. In einer noch weiteren Ausführungsform ist diese RUBISCO Ssu Plastid-Zielsequenz 5' vom Translationsstartpunkt des Phytoensynthasegens lokalisiert, welches aus CrtB stammt. In einer weiteren Ausführungsform ist diese Plastid-Zielsequenz heterolog bezogen auf die Phytoensynthase und/oder Carotin-Desaturase. In noch einer weiteren Ausführungsform ist die Plastid-Zielsequenz autolog bezogen auf die Phytoensynthase und/oder die Carotin-Desaturase. Unter „heterolog" wird verstanden, dass sie aus einer anderen Quelle stammt, und entsprechend bedeutet „autolog" aus derselben Quelle stammend –, aber eher auf dem Gen als auf dem Organismen- oder Gewebeniveau. In noch einer weiteren Ausführungsform ist die Plastid- Zielsequenz, die mit der Carotin-Desaturase assoziiert ist, heterolog dazu und die Plastid-Zielsequenz, die mit der Phytoensynthase assoziiert ist, ist hiermit autolog. In noch einer weiteren Ausführungsform stellt die Plastid-Zielsequenz die Akkumulierung von Carotinoiden im Amyloplasten des Samens bereit.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Polynucleotid bereit, das oben beschrieben worden ist, wobei die Sequenz, welche die Carotin-Desaturase und/oder die Sequenz, welche die Phytoensynthase kodieren, ferner ein Intron umfassen. In einer besonderen Ausführungsform ist diese Intronregion zwischen der Promotorregion und der Region lokalisiert, welche die Carotin-Desaturase/Phytoensynthase kodiert. In noch einer weiteren Ausführungsform ist diese Intronregion zwischen der Promotorregion und der Plastidzielsequenz lokalisiert. In noch einer weiteren Ausführungsform ist diese Intronregion stromaufwärts dieser Carotin-Desaturase und/oder Phytoensynthase kodierenden Sequenzen lokalisiert. In noch einer weiteren Ausführungsform stammt dieses Intron aus dem Intron des ersten Gens des Catalasegens der Castorbohnenpflanze. In noch einer weiteren Ausführungsform stammt dieses Intron aus dem ersten Intron des Catalasegens der Castorbohnenpflanze. In noch einer weiteren Ausführungsform umfasst dieses Intron die Sequenz, die in SEQ ID Nr. 22 dargestellt ist. In noch einer weiteren Ausführungsform ist das Intron das Intron des Mais-Polyubiquitin-Gens.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Polynucleotid bereit, welches oben beschrieben worden ist, wobei die Sequenz, die die Carotin-Desaturase kodiert, 5' der Sequenz, die die Phytoensynthase kodiert, lokalisiert ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Polynucleotid bereit, das oben beschrieben worden ist, wobei diese Sequenz, die Phytoensynthase kodiert, 5' der Sequenz lokalisiert ist, die Carotin-Desaturase kodiert.
  • Die vorliegende Erfindung stellt weiter noch ein Polynucleotid bereit, das oben beschrieben worden ist, welches die Sequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die als SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 4, 5 und 6 wiedergegeben sind. In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung besteht das Polynucleotid aus einer Sequenz, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die in SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 4, 5 und 6 dargestellt sind. In einer weiteren Ausführungsform umfasst oder besteht das Polynucleotid der Erfindung aus SEQ ID Nr. 1. In noch einer weiteren Ausführungsform der Erfindung umfasst das Polynucleotid SEQ ID Nr. 2 oder besteht daraus. In noch einer weiteren Ausführungsform der Erfindung umfasst das Polynucleotid SEQ ID Nr. 3 oder besteht daraus. In noch einer weiteren Ausführungsform der Erfindung umfasst das Polynucleotid SEQ ID Nr. 4 oder besteht daraus. In noch einer weiteren Ausführungsform der Erfindung umfasst das Polynucleotid SEQ ID Nr. 6 oder besteht daraus. Die Erfindung stellt ferner auch ein Polynucleotid bereit, das oben beschrieben worden ist, welches eine Sequenz umfasst oder daraus besteht, welche aus der Gruppe ausgewählt ist, die in SEQ ID Nr. 7, 8 und 9 wiedergegeben ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner eine Polynucleotidsequenz bereit, welche komplementär zu einer ist, die mit einem Polynucleotid, welche im vorhergehenden Paragraph beschrieben worden ist, bei einer Temperatur von ungefähr 65°C in einer Lösung, die 6 × SSC enthält, 0,01% SDS und 0,25% Magermilchpulver hybridisiert, gefolgt vom Spülen bei der gleichen Temperatur in einer Lösung, die 0,2 × SSC und 0,1% SDS enthält, wobei die Polynucleotidsequenz auch eine Region umfasst, die eine Carotin-Desaturase kodiert, und eine weitere Region, die eine Phytoensynthase kodiert, und wobei die Polynucleotidsequenz in das Pflanzenmaterial des Samens einer Pflanze inseriert ist, welche aus diesem Material regeneriert wird, und eine erhöhte Menge an Carotinoiden herstellt, wenn es mit Kontroll-Samen verglichen wird. Der Fachmann auf dem Gebiet kann alternativ die folgenden Hybridisierungsbedingungen auswählen, d. h. eine Hybridisierung bei einer Temperatur von zwischen 60°C und 65°C in 0,3 starker Zitrat-gepufferter Salzlösung, die 0,1% SDS enthält, gefolgt vom Spülen bei der gleichen Temperatur mit einer 0,3-fachen Stärke an Zitrat-gepufferter Salzlösung, die 0,1% SDS enthält, gefolgt von einer Bestätigung, dass, wenn die so identifizierte Polynucleotidsequenz in Pflanzenmaterial inseriert ist, die Samen einer Pflanze, welche aus diesem Material regeneriert worden ist, eine erhöhte Menge an Carotinoiden herstellt, wenn sie mit Kontroll-Samen verglichen wird. Der Fachmann auf dem Gebiet kann ferner auch die Hybridisierungsbedingungen auswählen, die ebenfalls als „hochstringente" Bedingungen verstanden werden. In einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, wenn die Polynucleotidsequenz in Pflanzenmaterial inseriert worden ist, produziert der Samen einer aus diesem Material regenerierten Pflanze mindestens einen 60-mal mehr an Carotinoiden, verglichen mit einem Kontroll-Samen. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung, produziert, wenn die Polynucleotidsequenz in das Pflanzenmaterial inseriert worden ist, der Samen einer aus diesem Material regenerierten Pflanze mindestens hundertmal mehr an Carotinoiden verglichen mit Kontroll-Samen. In noch einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform, wenn die Nucleotidsequenz in Pflanzenmaterial inseriert ist, produziert der Samen eine aus diesem Material regenierten Pflanze mindenstens einhundertfünfzigmal mehr an Carotinoiden verglichen mit einem Kontroll-Samen. In noch einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform, wenn die Nucleotidsequenz in Pflanzenmaterial inseriert ist, produziert der Samen eine aus diesem Material regenierten Pflanze mindenstens zweihundertmal mehr an Carotinoiden verglichen mit einem Kontroll-Samen. In noch einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform, wenn die Nucleotidsequenz in Pflanzenmaterial inseriert ist, produziert der Samen eine aus diesem Material regenierten Pflanze mindenstens zweihundertfünfzigmal mehr an Carotinoiden verglichen mit einem Kontroll-Samen. In noch einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform, wenn die Nucleotidsequenz in Pflanzenmaterial inseriert ist, produziert der Samen eine aus diesem Material regenierten Pflanze mindenstens dreihundertmal mehr an Carotinoiden verglichen mit einem Kontroll-Samen. In noch einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform, wenn die Nucleotidsequenz in Pflanzenmaterial inseriert ist, produziert der Samen eine aus diesem Material regenierten Pflanze mindenstens dreihundertfünfzigmal mehr an Carotinoiden verglichen mit einem Kontroll-Samen. In noch einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform, wenn die Nucleotidsequenz in Pflanzenmaterial inseriert ist, produziert der Samen eine aus diesem Material regenierten Pflanze mindenstens vierhundertmal mehr an Carotinoiden verglichen mit einem Kontroll-Samen. In noch einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform, wenn die Nucleotidsequenz in Pflanzenmaterial inseriert ist, produziert der Samen eine aus diesem Material regenierten Pflanze mindenstens fünfhundertmal mehr an Carotinoiden verglichen mit einem Kontroll-Samen.
  • Der Begriff Kontroll-Samen betrifft Samen, die im Wesentlichen ähnlich denen gemäß der Erfindung sind, wobei die Kontroll-Samen aber nicht die Polynucleotide oder die Polynucleotidsequenzen gemäß der Erfindung enthalten. Typischerweise umfasst ein Kontroll-Samen einen Samen der gleichen oder ähnlichen Pflanzenart, wobei der der Kontrolle dienende Samen nicht transformiert worden ist. Der erhöhte Carotinoidgehalt der Samen, die die Polynucleotide oder Polynucleotidsequenzen gemäß der Erfindung umfassen, kann ebenfalls mit einem Vergleich der Samen mit Samen nachgewiesen werden, die TDNA umfassen, welche im Plasmid A der 4 in WO 00/53768 wiedergegeben ist, wobei die Phytoensynthase (psy) aus der Narzisse (Narcissus pseudonarcissus) stammt. Typischerweise würde ein derartiger Vergleich gemacht werden, wenn der Samen mit der gleichen oder einer im Wesentlichen ähnlichen Pflanzenart zu vergleichen ist. In einer besonderen Ausführungsform enthält der Samen, welcher die Polynucleotid oder Polynucleotidsequenzen gemäß der Erfindung umfasst, mindestens drei Mal die Menge an Carotinoiden, wenn diese mit einem Samen verglichen werden, welcher die TDNA umfasst, welche Plasmid A der 4 der WO 00/53768 wiedergegeben ist, wobei die Phytoensynthase (psy) aus der Narcisse stammt (Narcissus pseudonarcissus). In noch einer weiteren Ausführungsform enthält der Samen, welcher die Polynucleotide oder Polynucleotidsequenzen gemäß der Erfindung umfasst, mindestens vier Mal oder mindestens fünf Mal oder mindestens sechs Mal oder mindestens sieben Mal oder mindestens acht Mal oder mindestens neun Mal oder mindestens zehn Mal oder mindestens fünfzehn Mal oder mindestens zwanzig Mal oder mindestens dreißig Mal oder mindestens vierzig Mal oder mindestens fünfzig Mal die Menge an Carotinoiden, wenn er mit dem Samen verglichen wird, welcher die TDNA umfasst, die Plasmid A der 4 der WO 00/53768 wiedergegeben ist, wobei die Phytoensynthase (psy) aus der Narcisse (Narcissus pseudonarcissus) stammt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner eine Polynucleotidsequenz, die oben beschrieben worden ist, bereit, wobei die Polynucleotidsequenz, wenn sie in Pflanzenmaterial inseriert worden ist, der Samen einer Pflanze, welcher aus diesem Material regeneriert wird, Carotinoide auf einem Niveau von mindestens 3 μg/g des Endosperms dieses Samens herstellt. In einer weiteren Ausführungsform, wenn die Polynucleotidsequenz, die oben beschrieben worden ist, in Pflanzenmaterial inseriert ist, produziert der Samen einer aus diesem Material regenerierten Pflanze Carotinoide in einer Menge von mindestens 4 μg/g des Endosperms dieses Samens. In einer weiteren Ausführungsform, wenn die Polynucleotidsequenz, die oben beschrieben worden ist, in Pflanzenmaterial inseriert ist, produziert der Samen einer aus diesem Material regenerierten Pflanze Carotinoide in einer Menge von mindestens 5 μg/g des Endosperms dieses Samens. In einer weiteren Ausführungsform, wenn die Polynucleotidsequenz, die oben beschrieben worden ist, in Pflanzenmaterial inseriert ist, produziert der Samen einer aus diesem Material regenerierten Pflanze Carotinoide in einer Menge von mindestens 6 μg/g des Endosperms dieses Samens. In einer weiteren Ausführungsform, wenn die Polynucleotidsequenz, die oben beschrieben worden ist, in Pflanzenmaterial inseriert ist, produziert der Samen einer aus diesem Material regenerierten Pflanze Carotinoide in einer Menge von mindestens 7 μg/g des Endosperms dieses Samens. In einer weiteren Ausführungsform, wenn die Polynucleotidsequenz, die oben beschrieben worden ist, in Pflanzenmaterial inseriert ist, produziert der Samen einer aus diesem Material regenerierten Pflanze Carotinoide in einer Menge von mindestens 8 μg/g des Endosperms dieses Samens. In einer weiteren Ausführungsform, wenn die Polynucleotidsequenz, die oben beschrieben worden ist, in Pflanzenmaterial inseriert ist, produziert der Samen einer aus diesem Material regenerierten Pflanze Carotinoide in einer Menge von mindestens 9 μg/g des Endosperms dieses Samens. In einer weiteren Ausführungsform, wenn die Polynucleotidsequenz, die oben beschrieben worden ist, in Pflanzenmaterial inseriert ist, produziert der Samen einer aus diesem Material regenerierten Pflanze Carotinoide in einer Menge von mindestens 10 μg/g des Endosperms dieses Samens. In einer weiteren Ausführungsform, wenn die Polynucleotidsequenz, die oben beschrieben worden ist, in Pflanzenmaterial inseriert ist, produziert der Samen einer aus diesem Material regenerierten Pflanze Carotinoide in einer Menge von mindestens 11 μg/g des Endosperms dieses Samens. In einer weiteren Ausführungsform, wenn die Polynucleotidsequenz, die oben beschrieben worden ist, in Pflanzenmaterial inseriert ist, produziert der Samen einer aus diesem Material regenerierten Pflanze Carotinoide in einer Menge von mindestens 12 μg/g des Endosperms dieses Samens. In einer weiteren Ausführungsform, wenn die Polynucleotidsequenz, die oben beschrieben worden ist, in Pflanzenmaterial inseriert ist, produziert der Samen einer aus diesem Material regenerierten Pflanze Carotinoide in einer Menge von mindestens 13 μg/g des Endosperms dieses Samens. In einer weiteren Ausführungsform, wenn die Polynucleotidsequenz, die oben beschrieben worden ist, in Pflanzenmaterial inseriert ist, produziert der Samen einer aus diesem Material regenerierten Pflanze Carotinoide in einer Menge von mindestens 14 μg/g des Endosperms dieses Samens. In einer weiteren Ausführungsform, wenn die Polynucleotidsequenz, die oben beschrieben worden ist, in Pflanzenmaterial inseriert ist, produziert der Samen einer aus diesem Material regenerierten Pflanze Carotinoide in einer Menge von mindestens 15 μg/g des Endosperms dieses Samens. In einer weiteren Ausführungsform, wenn die Polynucleotidsequenz, die oben beschrieben worden ist, in Pflanzenmaterial inseriert ist, produziert der Samen einer aus diesem Material regenerierten Pflanze Carotinoide in einer Menge von mindestens 20 μg/g des Endosperms dieses Samens. In einer weiteren Ausführungsform, wenn die Polynucleotidsequenz, die oben beschrieben worden ist, in Pflanzenmaterial inseriert ist, produziert der Samen einer aus diesem Material regenerierten Pflanze Carotinoide in einer Menge von mindestens 25 μg/g des Endosperms dieses Samens. In einer weiteren Ausführungsform, wenn die Polynucleotidsequenz, die oben beschrieben worden ist, in Pflanzenmaterial inseriert ist, produziert der Samen einer aus diesem Material regenerierten Pflanze Carotinoide in einer Menge von mindestens 30 μg/g des Endosperms dieses Samens. In einer weiteren Ausführungsform, wenn die Polynucleotidsequenz, die oben beschrieben worden ist, in Pflanzenmaterial inseriert ist, produziert der Samen einer aus diesem Material regenerierten Pflanze Carotinoide in einer Menge von mindestens 35 μg/g des Endosperms dieses Samens. In einer weiteren Ausführungsform, wenn die Polynucleotidsequenz, die oben beschrieben worden ist, in Pflanzenmaterial inseriert ist, produziert der Samen einer aus diesem Material regenerierten Pflanze Carotinoide in einer Menge von mindestens 40 μg/g des Endosperms dieses Samens. In einer weiteren Ausführungsform, wenn die Polynucleotidsequenz, die oben beschrieben worden ist, in Pflanzenmaterial inseriert ist, produziert der Samen einer aus diesem Material regenerierten Pflanze Carotinoide in einer Menge von mindestens 45 μg/g des Endosperms dieses Samens. In einer weiteren Ausführungsform, wenn die Polynucleotidsequenz, die oben beschrieben worden ist, in Pflanzenmaterial inseriert ist, produziert der Samen einer aus diesem Material regenerierten Pflanze Carotinoide in einer Menge von mindestens 50 μg/g des Endosperms dieses Samens. In einer weiteren Ausführungsform, wenn die Polynucleotidsequenz, die oben beschrieben worden ist, in Pflanzenmaterial inseriert ist, produziert der Samen einer aus diesem Material regenerierten Pflanze Carotinoide in einer Menge von mindestens 55 μg/g des Endosperms dieses Samens. In einer weiteren Ausführungsform, wenn die Polynucleotidsequenz, die oben beschrieben worden ist, in Pflanzenmaterial inseriert ist, produziert der Samen einer aus diesem Material regenerierten Pflanze Carotinoide in einer Menge von mindestens 60 μg/g des Endosperms dieses Samens. In einer weiteren Ausführungsform, wenn die Polynucleotidsequenz, die oben beschrieben worden ist, in Pflanzenmaterial inseriert ist, produziert der Samen einer aus diesem Material regenerierten Pflanze Carotinoide in einer Menge von mindestens 65 μg/g des Endosperms dieses Samens. In einer besonderen Ausführungsform wird die Menge an Carotionoiden als μg/g des Trockengewichts des Endosperms dieses Samens gerechnet.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner eine Polynucleotidsequenz bereit, welche das Komplement einer ist, die mit einem Polynucleotid hybridisiert, welches aus einer Sequenz besteht, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die in SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 4, 5 und 6 wiedergegeben ist, bei einer Temperatur von ungefähr 65°C in einer Lösung, die 6 × SSC, 0,01% SDS und 0,25% Magermilchpulver enthält, gefolgt vom Spülen bei der gleichen Temperatur in einer Lösung, die 0,2 × SSC und 0,1% SDS enthält, wobei die Polynucleotidsequenz immer noch einen Bereich umfasst, welcher eine Carotin-Desaturase kodiert und einen weiteren Bereich, welcher eine Phytoen-Synthase kodiert, wobei die Polynucleotidsequenz in Pflanzenmaterial des Samens einer Pflanze inseriert ist und Samen der Pflanze, welche aus diesem Material regeneriert worden ist, Carotinoide herstellt, die bis zu mindestens 80% des Carotinoidgehalts eines Samens ausmachen, welche ein Polynucleotid umfasst, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die in SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 4, 5 und 6 wiedergegeben ist. In einer weiteren Ausführungsform, wenn das Polynucleotid in Pflanzenmaterial inseriert worden ist, produziert der Samen einer Pflanze, die aus diesem Material regeneriert worden ist, mindestens 85% des Carotinoidgehalts eines Samens, welcher ein Polynucleotid umfasst, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die in SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 4, 5 und 6 wiedergegeben ist. In einer weiteren Ausführungsform, wenn das Polynucleotid in Pflanzenmaterial inseriert worden ist, produziert der Samen einer Pflanze, die aus diesem Material regeneriert worden ist, mindestens 90% des Carotinoidgehalts eines Samens, welcher ein Polynucleotid umfasst, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die in SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 4, 5 und 6 wiedergegeben ist. In einer weiteren Ausführungsform, wenn das Polynucleotid in Pflanzenmaterial inseriert worden ist, produziert der Samen einer Pflanze, die aus diesem Material regeneriert worden ist, mindestens 95% des Carotinoidgehalts eines Samens, welcher ein Polynucleotid umfasst, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die in SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 4, 5 und 6 wiedergegeben ist. In einer weiteren Ausführungsform, wenn das Polynucleotid in Pflanzenmaterial inseriert worden ist, produziert der Samen einer Pflanze, die aus diesem Material regeneriert worden ist, mindestens 100% des Carotinoidgehalts eines Samens, welcher ein Polynucleotid umfasst, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die in SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 4, 5 und 6 wiedergegeben ist. In einer besonderen Ausführungsform stellt die Polynucleotidsequenz einen Prozentsatz des Carotinoidgehalts eines Samens bereit, welcher oben beschrieben worden ist, wobei der Samen, mit dem der Vergleich gemacht wird, das Polynucleotid umfasst, das in SEQ ID Nr. 1 dargestellt ist. In einer besonderen Ausführungsform stellt die Polynucleotidsequenz einen Prozentsatz des Carotinoidgehalts eines Samens bereit, welcher oben beschrieben worden ist, wobei der Samen, mit dem der Vergleich gemacht wird, das Polynucleotid umfasst, das in SEQ ID Nr. 2 dargestellt ist. In einer besonderen Ausführungsform stellt die Polynucleotidsequenz einen Prozentsatz des Carotinoidgehalts eines Samens bereit, welcher oben beschrieben worden ist, wobei der Samen, mit dem der Vergleich gemacht wird, das Polynucleotid umfasst, das in SEQ ID Nr. 3 dargestellt ist. In einer besonderen Ausführungsform stellt die Polynucleotidsequenz einen Prozentsatz des Carotinoidgehalts eines Samens bereit, welcher oben beschrieben worden ist, wobei der Samen, mit dem der Vergleich gemacht wird, das Polynucleotid umfasst, das in SEQ ID Nr. 4 dargestellt ist. In einer besonderen Ausführungsform stellt die Polynucleotidsequenz einen Prozentsatz des Carotinoidgehalts eines Samens bereit, welcher oben beschrieben worden ist, wobei der Samen, mit dem der Vergleich gemacht wird, das Polynucleotid umfasst, das in SEQ ID Nr. 6 dargestellt ist.
  • Es wird bevorzugt, dass in dem Fall, dass der Carotinoidgehalt des Samens, der diese Polynucleotidsequenz umfasst, mit dem Samen verglichen wird, der das Polynucleotid umfasst, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, die in SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 4, 5 und 6 wiedergegeben ist, die Samen von Pflanzen von im Wesentlichen der gleichen Art sind. Es wird weiter bevorzugt, dass, wenn der Carotinoidgehalt des Samens, welcher diese Polynucleotidsequenz umfasst, mit dem Samen verglichen wird, welcher das Polynucleotid umfasst, das aus der Gruppe in SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 4, 5 und 6 wiedergegeben ist, der Samen von Pflanzen ist, die im Wesentlichen genetisch identisch sind, außer hinsichtlich des Vorhandenseins dieses Polynucleotids oder dieser Polynucleotidsequenz. Es ist weiter bevorzugt, dass in dem Fall, dass der Carotinoidgehalt des Samens, welcher diese Polynucleotidsequenz umfasst, mit dem Samen verglichen wird, welcher das Polynucleotid umfasst, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, welche in SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 4, 5 und 6 wiedergegeben ist, der Samen aus Pflanzen stammt, welche unter Aussetzung gegenüber gleichen Umwelt-Wachstumsbedingungen gezüchtet wurden.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner auch eine Polynucleotidsequenz bereit, welche das Komplement einer ist, die mit einem Polynucleotid, welches eine Sequenz ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche in den SEQ ID Nr. 7, 8 und 9 wiedergegeben ist, bei einer Temperatur von ungefähr 65°C in einer Lösung hybridisiert, die 6 × SSC und 0,25% Magermilchpulver enthält und gefolgt wird vom Spülen bei der gleichen Temperatur in einer Lösung, die 0,2 × SSC und 0,1% SDS enthält, wobei diese Polynucleotidsequenz immer noch einen Bereich umfasst, welcher eine Carotin-Desaturase kodiert, und einen weiteren Bereich, welcher eine Phytoen-Synthase kodiert, und wobei diese Polynucleotidsequenz in Pflanzenmaterial des Samens einer Pflanze inseriert ist, welche aus diesem Material regeniert wurde, Carotinoide herstellt, die bis zu mindestens 80% des Carotinoidgehalts eines Samens ausmachen, welche eine Polynucleotid umfasst, das aus der Gruppe ausgewählt ist, welche in den SEQ ID Nr. 7, 8 und 9 wiedergegeben ist.
  • Es wird bevorzugt, dass in dem Fall, dass der Carotinoidgehalt des Samens, welcher diese Polynucleotidsequenz umfasst, mit dem Samen verglichen wird, welcher das Polynucleotid umfasst, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, welche in SEQ ID Nr. 7, 8 und 9 wiedergegeben ist, der Samen aus Pflanzen von im Wesentlichen der gleichen Art stammt. Es ist weiter bevorzugt, dass in dem Fall, dass der Carotinoidgehalt des Samens, welcher diese Polynucleotidsequenz umfasst, mit dem Samen verglichen wird, welcher das Polynucleotid umfasst, das aus der Gruppe ausgewählt ist, welches in SEQ ID Nr. 7, 8 und 9 wiedergegeben ist, der Samen aus Pflanzen stammt, die im Wesentlichen genetisch identisch sind, ausgenommen hinsichtlich des Vorhandenseins dieses Polynucleotids oder dieser Polynucleotidsequenz.
  • In einer besonderen Ausführungsform der Polynucleotidsequenzen gemäß der Erfindung, welche aufgrund ihrer Hybridisierung (unter den angegebenen Bedingungen) mit Sequenzen identifiziert werden, die in der Sequenzliste beschrieben sind, welche die gleichen Proteine kodieren, wie jene, die durch die Sequenzen in der Sequenzliste bereitgestellt werden. In einer weiteren Ausführungsform können diese Polynucleotidsequenzen Proteine kodieren, die die gleiche oder eine ähnliche Funktion haben, wie die Proteine, die durch diese Sequenzen in der Sequenzliste kodiert werden. In noch einer weiteren Ausführungsform umfassen die Proteine, die durch die Polynucleotidsequenz gemäß der Erfindung kodiert werden, Aminosäuresubstitutionen und/oder -deletionen, wenn sie mit Proteinen verglichen werden, die durch die Sequenzen in der Sequenzliste kodiert werden. In noch einer weiteren Ausführungsform sind diese Aminosäuresubstitutionen „konservative" Substitutionen. Eine „konservative" Substitution wird so verstanden, dass sie bedeutet, dass die Aminosäure durch eine Aminosäure ersetzt wurde, die weitestgehend ähnliche chemische Eigenschaften hat. Insbesondere können „konservative" Substitutionen zwischen Aminosäuren innerhalb der folgenden Gruppen gemacht werden: (i) Alanin und Glycin; (ii) Threonin und Serin; (ii) Glutaminsäure und Asparaginsäure; (iii) Arginin und Lysin; (iv) Asparagin und Glutamin; (v) Isoleucin und Leucin; (vi) Valin und Methionin; und (vii) Phenylalanin und Tryptophan.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Polynucleotid oder eine Polynucleotidsequenz bereit, die oben beschrieben worden sind, welche, wenn sie in Pflanzenmaterial inseriert sind, Samen, die aus dem Material der Pflanzen regeneriert werden, Carotinoide in Mengen herstellen lassen, die höher sind als solche, die in nativen Samen vorhanden sind. Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Polynucleotid oder eine Polynucleotidsequenz, die oben beschrieben wurde, bereit, welche, wenn sie in Pflanzenmaterial inseriert wird, den Samen, der aus dem Material regenierten Pflanze die Fähigkeit, Carotinoide in Mengen herzustellen verleiht, welche höher sind als jene in nicht transformierten ähnlichen Samen.
  • In einer besonderen Ausführungsform sind die Carotinoide, die erhöht werden, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Lycopen; Alpha-Carotin; Lutein; Beta-Carotin; Zeaxanthin; Betacryptoxanthin; Antheraxanthin; Violaxanthin und Neoxanthin oder einer Kombination daraus. In einer weiteren Ausführungsform werden die Carotinoide, welche erhöht werden, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Lycopen; Alpha-Carotin; Lutein; Beta-Carotin; Zeaxanthin; Beta-Cryptoxanthin oder einer Kombination daraus. In einer weiteren Ausführungsform werden die Carotinoide, welche verstärkt hergestellt werden, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Alpha-Carotin; Lutein; Beta-Carotin; Zeaxanthin; Beta-Cryptoxanthin oder einer Kombination daraus. In noch einer weiteren Ausführungsform schließen die Carotine, welche erhöht werden, mindestens Phytoen und Beta-Carotin ein. In noch einer weiteren Ausführungsform schließen die Carotinoide, welche erhöht werden, mindestens Beta-Carotin ein. In noch einer weiteren Ausführungsform ist das Carotinoid, welches erhöht wird, Beta-Carotin. In noch einer weiteren Ausführungsform sind die Carotinoide, welche erhöht werden, farbige Carotinoide.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Polynucleotid oder eine Polynucleotidsequenz, die oben beschrieben wurde, bereit, wobei dieser Samen ein Reissamen ist. In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung, bevor die Samen hinsichtlich ihres Carotinoidgehalts analysiert werden, werden die Samen vor der Analyse präpariert. Eine derartige Präparierung kann beispielsweise bezüglich eines Reissamen das „Enthülsen" und „Polieren" einschließen. Des Weiteren kann eine derartige Präparierung die Entfernung der Pflanzenteile einschließen, welche mit dem Samen assoziiert sind, wobei die Pflanzenteile nicht normalerweise für den menschlichen Verzehr beabsichtigt sind.
  • Die Menge an Carotinoiden in den Samen kann unter Verwendung von Techniken, die wohlbekannt sind, bestimmt werden, und die Fachleuten auf dem Gebiet verfügbar sind. Solche Techniken schließen ein, sind aber nicht notwendigerweise beschränkt auf, Hochleistungsflüssigchromatographie(HPLC)-Analyse und Spectrophotometrie.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner auch ein Polynucleotid oder eine Polynucleotidsequenz, die oben beschrieben wurde, bereit, welche ferner einen Bereich umfasst, welcher einen selektierbaren Marker kodiert. In einer besonderen Ausführungsform umfasst dieser selektierbare Marker ein Mannose-6-phosphat-Isomerasegen. In noch einer weiteren besonderen Ausführungsform ist der selektierbare Marker, der verwendet wird, das Mannose-6-phosphat-Isomerasegen gemäß dem PositechTM-Selektionssystem. In einer spezifischen Ausführungsform ist dieser selektierbare Marker der, der in der Europäischen Patent-Anmeldeveröffentlichungs-Nr. EP 0 896 063 und EP 0 601 092 beschrieben ist. Alternativ dazu kann der selektierbare Marker, der verwendet wird, insbesondere Resistenz gegenüber Kanamycin, Hygromycin oder Gentamycin verleihen. Weitere geeignete selektierbare Marker schließen Gene ein, die Resistenz gegenüber Herbiziden, wie beispielsweise Glyphosat-basierenden Herbiziden (z. B. die EPSPS-Gene wie in USP 5510471 oder WO 00/66748 ) oder eine Resistenz gegenüber Toxinen, wie beispielsweise Eutypin verleihen. Andere Formen der Selektion sind ebenfalls verfügbar, beispielsweise auf Hormonen basierende Selektionssysteme, wie beispielsweise das Multi-Auto-Transformations(MAT)-System von Hiroyrasu Ebinuma et al. 1997. PNAS Vol. 94, S. 2117–2121; visuelle Selektionssysteme, welche Fluoreszenzproteine verwenden, β-Glucoronidase und andere Selektionssysteme, wie beispielsweise Xyloseisomerase und 2-Deoxyglucose (2-DOG).
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner auch ein Polynucleotid oder eine Polynucleotidsequenz gemäß der Erfindung bereit, welche zur Expression in einer besonderen Pflanzenspezies Codon-optimiert ist. In einer besonderen Ausführungsform ist das Polynucleotid oder die Polynucleotidsequenz zur Expression in Reis (Orzya sp.) oder Mais (Zea sp.) Codon-optimiert. Eine derartige Codon-Optimierung ist einem Fachmann auf dem Gebiet wohl bekannt und die Tabelle unten stellt ein Beispiel der von Pflanzen bevorzugten Codons in Reis und Mais dar.
    Aminosäure Reispräferenz Maispräferenz
    Alanin GCC GCC
    Arginin CGC AGG
    Asparagin AAC ACC
    Asparaginsäure GAC GAC
    Cystein TGC TGC
    Glutamin CAG CAG
    Glutaminsäure GAG GAG
    Glycin GGC GGC
    Histidin CAC CAC
    Isoleucin ATC ATC
    Leucin CTC CTG
    Lysin AAG AAG
    Methionin ATG ATG
    Phenylalanin TTC TTC
    Prolin CCG CCG
    Serin TCC AGC
    Threonin ACC ACC
    Tryptophan TGG TGG
    Tyrosin TAC TAC
    Valin GTG GTG
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner einen Vektor bereit, welcher ein Polynucleotid oder eine Polynucleoidsequenz, die oben beschrieben worden ist, umfasst. In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung umfasst dieser Vektor ein Polynucleotid, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, welche in SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 4, 5 und 6 dargestellt ist. In einer besonderen Ausführungsform umfasst der erfindungsgemäße Vektor eine Polynucleotidsequenz, welche aus der Gruppe ausgewählt ist, die in den SEQ ID Nr. 7, 8 und 9 wiedergegeben ist. In einer besonderen Ausführungsform ermöglicht dieser Vektor die Replikation dieses Polynucleotids oder der Polynucleotidsequenz in einem Bakterium.
  • Erfindungsgemäß wird weiter ein Vektor bereitgestellt, der oben beschrieben worden ist, welcher ein Pflanzen-Expressionsvektor ist.
  • In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung kann die Sequenz um die Translations-Startposition(en) der Phytoen-Synthase und/oder der Carotin-Desaturase kodierenden Sequenzen, die oben beschrieben worden sind, so modifiziert sein, dass sie „Kozak"-bevorzugt ist. Was darunter gemeint wird, ist dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt. Beispiele für Kozak-Konsensus-Sequenzen, welche dem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt sind, schließen cagcc(atg) oder agcc(atg) ein. Die Phytoen-Synthase und/oder die Carotin-Desaturase kodierenden Sequenzen, welche oben beschrieben wurden, können ferner eine Sequenz umfassen, die eine Rückhaltung in einer bestimmten intrazellulären Organelle ermöglicht.
  • In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Erhöhung des Carotinoidgehalts von Samen bereitgestellt, welches das Inserieren eines Polynucleotids oder einer Polynucleotidsequenz oder eines Vektors, der oben beschrieben worden ist, in Pflanzenmaterial umfasst; und das Regenerieren einer samenhaltigen Pflanze aus diesem Material sowie die Identifizierung der Samen, welche Carotinoide in höheren Mengen enthalten als solche von Kontroll-Samen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zum Erhöhen des Carotinoidgehalts von Samen bereit, welches das Inserieren eines Polynucleotids in Pflanzenmaterial umfasst, welches eine Sequenz umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die in den SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 4, 5 und 6 wiedergegeben ist, und das Regenieren einer samenhaltigen Pflanze aus diesem Material sowie die Identifizierung der Samen, die Carotinoide in größeren Mengen enthalten, als solche der Kontroll-Samen. In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung enthalten die Samen, die durch dieses Verfahren gewonnen werden, mindestens einen 60-fachen Anstieg an Carotinoiden, wenn sie mit einem Kontroll-Samen verglichen werden. In einer weiteren Ausführungsform enthalten die auf diese Weise gewonnenen Samen mindestens einen 100-fachen Anstieg an Carotinoiden, wenn sie mit Kontroll-Samen verglichen werden. In einer weiteren Ausführungsform enthalten die auf diese Weise gewonnenen Samen mindestens einen 150-fachen Anstieg an Carotinoiden, wenn sie mit Kontroll-Samen verglichen werden. In einer weiteren Ausführungsform enthalten die auf diese Weise gewonnenen Samen mindestens einen 200-fachen Anstieg an Carotinoiden, wenn sie mit Kontroll-Samen verglichen werden. In einer weiteren Ausführungsform enthalten die auf diese Weise gewonnenen Samen mindestens einen 250-fachen Anstieg an Carotinoiden, wenn sie mit Kontroll-Samen verglichen werden. In einer weiteren Ausführungsform enthalten die auf diese Weise gewonnenen Samen mindestens einen 300-fachen Anstieg an Carotinoiden, wenn sie mit Kontroll-Samen verglichen werden. In einer weiteren Ausführungsform enthalten die auf diese Weise gewonnenen Samen mindestens einen 350-fachen Anstieg an Carotinoiden, wenn sie mit Kontroll-Samen verglichen werden. In einer weiteren Ausführungsform enthalten die auf diese Weise gewonnenen Samen mindestens einen 400-fachen Anstieg an Carotinoiden, wenn sie mit Kontroll-Samen verglichen werden. In einer weiteren Ausführungsform enthalten die auf diese Weise gewonnenen Samen mindestens einen 500-fachen Anstieg an Carotinoiden, wenn sie mit Kontroll-Samen verglichen werden.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren bereit, das oben beschrieben worden ist, wobei diese Samen Carotinoide in einer Menge von mindestens 3 μg/g des Endosperms dieses Samens enthalten. In einer besonderen Ausführungsform enthält dieser Samen Carotinoide in einer Menge von mindestens 4 μg/g Endosperm dieser Samen. In einer besonderen Ausführungsform enthält dieser Samen Carotinoide in einer Menge von mindestens 5 μg/g Endosperm dieser Samen. In einer besonderen Ausführungsform enthält dieser Samen Carotinoide in einer Menge von mindestens 6 μg/g Endosperm dieser Samen. In einer besonderen Ausführungsform enthält dieser Samen Carotinoide in einer Menge von mindestens 7 μg/g Endosperm dieser Samen. In einer besonderen Ausführungsform enthält dieser Samen Carotinoide in einer Menge von mindestens 8 μg/g Endosperm dieser Samen. In einer besonderen Ausführungsform enthält dieser Samen Carotinoide in einer Menge von mindestens 9 μg/g Endosperm dieser Samen. In einer besonderen Ausführungsform enthält dieser Samen Carotinoide in einer Menge von mindestens 10 μg/g Endosperm dieser Samen. In einer besonderen Ausführungsform enthält dieser Samen Carotinoide in einer Menge von mindestens 15 μg/g Endosperm dieser Samen. In einer besonderen Ausführungsform enthält dieser Samen Carotinoide in einer Menge von mindestens 20 μg/g Endosperm dieser Samen. In einer besonderen Ausführungsform enthält dieser Samen Carotinoide in einer Menge von mindestens 25 μg/g Endosperm dieser Samen. In einer besonderen Ausführungsform enthält dieser Samen Carotinoide in einer Menge von mindestens 30 μg/g Endosperm dieser Samen. In einer besonderen Ausführungsform enthält dieser Samen Carotinoide in einer Menge von mindestens 35 μg/g Endosperm dieser Samen. In einer besonderen Ausführungsform enthält dieser Samen Carotinoide in einer Menge von mindestens 40 μg/g Endosperm dieser Samen. In einer besonderen Ausführungsform enthält dieser Samen Carotinoide in einer Menge von mindestens 45 μg/g Endosperm dieser Samen. In einer besonderen Ausführungsform enthält dieser Samen Carotinoide in einer Menge von mindestens 50 μg/g Endosperm dieser Samen. In einer besonderen Ausführungsform enthält dieser Samen Carotinoide in einer Menge von mindestens 55 μg/g Endosperm dieser Samen. In einer besonderen Ausführungsform enthält dieser Samen Carotinoide in einer Menge von mindestens 60 μg/g Endosperm dieser Samen. In einer besonderen Ausführungsform enthält dieser Samen Carotinoide in einer Menge von mindestens 65 μg/g Endosperm dieser Samen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zum Erhöhen des Carotinoidgehalts von Samen bereit, welches das Inserieren einer Polynucleotidsequenz wie oben beschrieben umfasst und das Regenerieren einer samenhaltigen Pflanze aus diesem Material und die Identifizierung der Samen, die Carotinoide enthalten, welche mindestens 80% des Carotinoidgehalts eines Samens ausmachen, welcher ein Polynucleotid umfasst, welcher aus der Gruppe ausgewählt ist, die in den SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 4, 5 und 6 wiedergegeben ist. In einer weiteren Ausführungsform produzieren die Samen einer aus diesem Material regenerierten Pflanze mindestens 85% des Carotinoidgehalts eines Samens, welcher ein Polynucleotid umfasst, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, welche in SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 4, 5 und 6 wiedergegeben ist. In einer weiteren Ausführungsform produzieren die Samen einer aus diesem Material regenerierten Pflanze mindestens 90% des Carotinoidgehalts eines Samens, welcher ein Polynucleotid umfasst, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, welche in SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 4, 5 und 6 wiedergegeben ist. In einer weiteren Ausführungsform produzieren die Samen einer aus diesem Material regenerierten Pflanze mindestens 95% des Carotinoidgehalts eines Samens, welcher ein Polynucleotid umfasst, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, welche in SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 4, 5 und 6 wiedergegeben ist. In einer weiteren Ausführungsform produzieren die Samen einer aus diesem Material regenerierten Pflanze mindestens 100% des Carotinoidgehalts eines Samens, welcher ein Polynucleotid umfasst, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, welche in SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 4, 5 und 6 wiedergegeben ist. In einer besonderen Ausführungsform ermöglicht die Polynucleotidsequenz, dass der Prozentsatz des Carotinoidgehalts eines Samens, der oben beschrieben worden ist, wobei der Samen, mit dem ein Vergleich gemacht wird, das Polynucleotid umfasst, welches in SEQ ID Nr. 1 wiedergegeben ist. In einer besonderen Ausführungsform ermöglicht die Polynucleotidsequenz einen Prozentsatz des Carotinoidgehalts eines Samens, welcher oben beschrieben worden ist, wobei der Samen, mit dem der Vergleich gemacht wird, das Polynucleotid umfasst, welches in SEQ ID Nr. 2 wiedergegeben ist. In einer besonderen Ausführungsform ermöglicht die Polynucleotidsequenz einen Prozentsatz des Carotinoidgehalts eines Samens, welcher oben beschrieben worden ist, wobei der Samen, mit dem der Vergleich gemacht wird, das Polynucleotid umfasst, welches in SEQ ID Nr. 3 wiedergegeben ist. In einer besonderen Ausführungsform ermöglicht die Polynucleotidsequenz einen Prozentsatz des Carotinoidgehalts eines Samens, welcher oben beschrieben worden ist, wobei der Samen, mit dem der Vergleich gemacht wird, das Polynucleotid umfasst, welches in SEQ ID Nr. 4 wiedergegeben ist. In einer besonderen Ausführungsform ermöglicht die Polynucleotidsequenz einen Prozentsatz des Carotinoidgehalts eines Samens, welcher oben beschrieben worden ist, wobei der Samen, mit dem der Vergleich gemacht wird, das Polynucleotid umfasst, welches in SEQ ID Nr. 6 wiedergegeben ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zum Erhöhen des Carotinoidgehalts von Samen bereit, welches das Inserieren eines Polynucleotids in Pflanzenmaterial umfasst, welches eine Sequenz umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die in SEQ ID Nr. 7, 8 und 9 wiedergegeben ist, sowie das Regenerieren einer samenhaltigen Pflanze aus diesem Material und die Identifizierung der Samen, welche Carotinoide in höheren Konzentrationen enthalten als solche der Kontroll-Samen. In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung enthalten die Samen, die auf diese Weise gewonnen werden, mindestens einen 50-fachen Anstieg an Carotinoiden, wenn sie mit Kontroll-Samen verglichen werden.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren bereit, das oben beschrieben worden ist, wobei der Samen Carotinoide in einer Konzentration von mindestens 3 μg/g des Endosperms dieses Samens enthält.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zum Erhöhen des Carotinoidgehalts von Samen bereit, umfassend das Inserieren einer Polynucleotidsequenz, die oben beschrieben worden ist, in Pflanzenmaterial und das Regenerieren einer samenhaltigen Pflanze aus diesem Material sowie das Identifizieren des Samens, welcher Carotinoide enthält, die mindestens 80% des Carotinoidgehalts eines Samens ausmachen, welcher ein Polynucleotid umfasst, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die in SEQ ID Nr. 7, 8 und 9 wiedergegeben ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren bereit, das oben beschrieben worden ist, wobei die Carotinoide, welche erhöht werden, ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: Lycopen; Alpha-Carotin, Lutein, Beta-Carotin, Zeaxanthin, Beta-Cryptoxanthin, Antheraxanthin, Violaxanthin und Neoxanthin oder einer Kombination daraus. In einer weiteren Ausführungsform sind die Carotinoide, welche erhöht werden, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Lycopen, Alpha-Carotin, Lutein, Beta-Carotin, Zeaxanthin, Beta-Cryptoxanthin oder einer Kombination daraus. In noch einer weiteren Ausführungsform schließen die Carotinoide, welche erhöht werden, mindestens Phytoen und Beta-Carotin ein. In noch einer weiteren Ausführungsform schließen die Carotinoide, welche erhöht werden, mindestens Beta-Carotin ein. In noch einer weiteren Ausführungsform ist das Carotinoid, welches erhöht wird, Beta-Carotin. In noch einer weiteren Ausführungsform sind die Carotinoide, welche erhöht werden, farbige Carotinoide.
  • Das Polynucleotid oder die Polynucleotidsequenz oder der Vektor, der oben beschrieben worden ist, kann in Pflanzenmaterial durch Pflanzen-Transformationstechniken inseriert werden, die dem Fachmann auf dem Gebiet wohl bekannt sind. Solche Techniken schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, Partikel-vermittelte biolistische Transformation, Agrobacterium-vermittelte Transformation, Protoplasten-Transformation (gegebenenfalls in Gegenwart von Polyethylenglycolen), Beschallung von Pflanzengeweben, Zellen oder Protoplasten in einem Medium, welches das Polynucleotid oder den Vektor umfasst; Microinsertion des Polynucleotids oder des Vektors in totipotentes Pflanzenmaterial (gegebenenfalls unter Verwendung der bekannten Silikoncarbid-„Whisker"-Technik), Elektroporation und ähnliche. In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung wird Reispflanzenmaterial gemäß Verfahren transformiert, die in den Beispielen, die hier offenbart sind, transformiert. In einer besonderen Ausführungsform ist das Agrobacterium, welches verwendet wird, ein Stamm, der modifiziert worden ist, um die Wahrscheinlichkeit in der Rekombination zwischen Sequenzen mit einem hohen Grad an Ähnlichkeit zwischen der TDNA-Region oder dem Bakterium zu reduzieren. Des Weiteren können Techniken und Elemente, wie beispielsweise solche, auf die Bezug genommen wird in WO 99/01563 , US 6,265,638 , US 5,731,179 und US 5,591,616 , als Teil des Transformationsprozesses benutzt werden.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner Samen bereit, welche erhalten werden oder durch das oben beschriebene Verfahren erhältlich sind. In einer spezifischen Ausführungsform sind diese Samen Reissamen. In einer weiteren Ausführungsform sind diese Samen Maissamen.
  • In der Beschreibung können die Begriffe „Samen" und „Samen" ausgetauscht werden durch die Begriffe „Korn" oder „Körner". Insbesondere beziehen sich die Begriffe „Samen" und „Samen" auf essbare Samen oder Samenteile, insbesondere das Endosperm von Samen.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst weiter eine Pflanze, die einen Samen gemäß dem vorhergehenden Paragraphen umfasst.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner eine Pflanze oder Pflanzenmaterial bereit, welches ein Polynucleotid oder eine Polynucleotidsequenz oder einen Vektor, der oben beschrieben worden ist, umfasst. In einer besonderen Ausführungsform ist diese Pflanze oder Pflanzenmaterial eine Reispflanze oder Reispflanzenmaterial oder eine Maispflanze oder Maispflanzenmaterial. In noch einer weiteren Ausführungsform ist die Pflanze oder das Pflanzenmaterial der vorliegenden Erfindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Wassermelone, Melone, Mango, Sojabohne, Baumwolle, Tabak, Zuckerrüben, Ölsaatraps, Raps, Flachs, Sonnenblumen, Kartoffeln, Tomaten, Alfalfa, Salat, Mais, Weizen, Hirse, Roggen, Banane, Gerste, Hafer, Rasen, Futtergras, Zuckerrohr, Paprika, Erbsen, Feldbohnen, Reis, Pinien, Poplar, Äpfel, Pfirsiche, Weintrauben, Erdbeeren, Carotten, Kohl, Zwiebeln, Zitrusfrüchte, Getreide oder Nusspflanzen, oder irgendwelche anderen Zierpflanzen. In einer besonderen Ausführungsform ist diese Pflanze eine Reispflanze.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner eine Pflanze oder einen Samen gemäß der Erfindung bereit, welcher ferner ein Gen umfasst, wobei das Gen ein Enzym kodiert, welches in der Lage ist, Carotin in ein Retinoid umzuwandeln. Ein Beispiel eines solchen Gens ist das Gen, das β-Carotindioxygenase kodiert, welches in WO 01/48162 und/oder WO 01/48163 beschrieben ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner eine Pflanze gemäß der Erfindung bereit, welche ferner ein Polynucleotid umfasst, welches eine Spur bereitstellt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus: Insektenresistenz und/oder -toleranz; Nematodenresistenz und/oder -toleranz; Herbizidresistenz und/oder -toleranz; verbesserte Resistenz und/oder Toleranz gegenüber Stress; eine Substanz mit pharmazeutischer Aktivität und/oder irgendeine andere gewünschte landwirtschaftliches Merkmal.
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem eine Pflanze gemäß der Erfindung bereit, welche ferner ein Polynucleotid umfasst, das auch eine weitere Erhöhung der Isoprenoidbiosynthese und/oder Carotinoidanhäufung in der Pflanze ermöglicht. In einer besonderen Ausführungsform stellt dieses Polynucleotid einen Transkriptionsfaktor bereit, welcher eine weitere Verstärkung der Isoprenoidbiosynthese und/oder Carotinoidanhäufung in der Pflanze ermöglicht.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner eine Pflanze gemäß der Erfindung bereit, welche ferner ein Polynucleotid umfasst, welches einen Anstieg an Plastiden innerhalb der Pflanze ermöglicht. In einer besonderen Ausführungsform umfasst dieses Polynucleotid das PhyA-Gen aus Hafer oder Arabidopsis, welches Gene sind, die dem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt sind. In einer weiteren Ausführungsform umfasst dieses Polynucleotid das Hp1- oder Hp2-Gen aus der Tomate, welche dem Fachmann ebenfalls gut bekannt sind.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner einen molekularen Marker bereit, welcher ein Marker ist, der in der Lage ist, das Pflanzenmaterial zu identifizieren, welches eine Sequenz umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die in den SEQ ID Nr. 1–9 wiedergegeben ist, wobei der molekulare Marker mindestens ungefähr 25 durchgehende Nucleotide einer Sequenz umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche aus den SEQ ID Nr. 1 bis 9 besteht.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zum Identifizieren von Pflanzenmaterial gemäß der Erfindung über die Verwendung von beispielsweise der Polymerasekettenreaktion (PCR) bereit. Geeignete Primer können unter Verwendung von Parametern entworfen werden, die Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt sind und auf den Sequenzen beruhen, die in der Sequenzliste aufgeführt sind. Der Fachmann auf dem Gebiet ist in Nucleinsäure-Extraktionstechniken gut versiert, und sobald eine Testprobe isoliert worden ist, kann sie hinsichtlich des Vorhandenseins der Sequenz gemäß der Erfindung unter Verwendung von Techniken, die in dem Fachgebiet gut bekannt sind, analysiert werden. Diese schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf PCr, RAPIDS, RFLPs und AFLPs.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Kit bereit, wobei das Kit ein Mittel zum Gewinnen einer Testprobe umfasst, und ein Mittel zum Nachweisen des Vorhandenseins der Sequenzen der Erfindung innerhalb dieser Testprobe. Es können auch Kits entworfen werden, die in der Lage sind, den Carotinoidgehalt einer Testprobe zu testen, und das kann gegebenenfalls mit den Merkmalen eines Kits, der in dem vorhergehenden Satz beschrieben worden ist, kombiniert werden.
  • In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung eines Polynucleotids, einer Polynucleotidsequenz oder eines Vektors bereitgestellt, welche oben beschrieben worden sind, für ein Verfahren zur Herstellung von Samen, die mehr Carotinoide enthalten. In einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung eines Polynucleotids bereitgestellt, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, die SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 4, 5 und 6 wiedergegeben ist, zur Herstellung von Samen, welche Carotinoide in größeren Konzentrationen enthalten, als solche eines Kontroll-Samens.
  • Nach einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung eines Polynucleotids, einer Polynucleotidsequenz und eines Vektors, die oben beschrieben worden sind, in einem Verfahren zur Herstellung von Samen bereitgestellt, die erhöhte Carotinoidgehalte enthalten. In einer besonderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Polynucleotids bereit, das aus der Gruppe ausgewählt ist, welche in SEQ ID Nr. 7, 8 und 9 wiedergegeben ist, zur Herstellung von Samen, welche Carotinoide in größeren Mengen enthalten, als die der Kontroll-Samen.
  • In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die Verwendung eines Polynucleotids, einer Polynucleotidsequenz oder eines Vektors, welche oben beschrieben worden sind, in einem Verfahren zur Herstellung einer Pflanze, welche das Polynucleotid diese Polynucleotidsequenz oder diesen Vektor umfasst, bereitgestellt. Nach einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die Verwendung eines Polynucleotids bereitgestellt, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, die in SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 4, 5 und 6 dargestellt ist, in einem Verfahren zur Herstellung einer Pflanze, welche dieses Polynucleotid umfasst.
  • Nach einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die Verwendung eines Polynucleotids bereitgestellt, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, die in SEQ ID Nr. 7, 8 und 9 dargestellt ist, in einem Verfahren zur Herstellung einer Pflanze, die dieses Polynucleotid umfasst.
  • Nach einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Erhöhen des Carotinoidgehalts von Samen bereitgestellt, welches das Inserieren in Pflanzenmaterial von (a) eines ersten Polynucleotids umfasst, welches als operativ verbundene Bestandteile (i) einen Promotor umfasst, welcher eine durch die Samen bevorzugte Expression ermöglicht; und (ii) eine Nucleotidsequenz, die von einem Bakterium stammt, wobei die Sequenz eine Carotin-Desaturase kodiert; und (iii) einen Transkriptions-Beendigungsbereich; und (b) ein zweites Polynucleotid, welches als operativ gebundene Bestandteile (i) einen Promotor umfasst, welcher eine durch Samen bevorzugte Expression ermöglicht; und (ii) eine Nucleotidsequenz, welche eine Phytoen-Synthase kodiert, wobei die Sequenz aus Mais (Zea sp.) oder Reis (Orzya sp.) stammt; und (iii) einen Transkriptions-Beendigungsbereich; und (c) das Regenerieren einer samenhaltigen Pflanze aus diesem Material und die Identifizierung der Samen, welche Carotinoide in größeren Konzentrationen enthalten, als solche der Kontroll-Samen.
  • Weiter offenbart ist ein Verfahren zur Erhöhung des Carotinoidgehalts von Samen, welches das Inserieren in Pflanzenmaterial von (a) einem ersten Polynucleotid umfasst, welches operativ verbundene Bestandteile (i) einen Promotor, welcher eine in Samen bevorzugte Expression ermöglicht, und (ii) eine Nucleotidsequenz, welche aus einem Bakterium stammt, umfasst, wobei die Sequenz eine Carotin-Desaturase kodiert; und (iii) einen Transkriptions-Beendigungsbereich; und (b) ein zweites Polynucleotid, welches als operativ gebundene Bestandteile (i) einen Promotor umfasst, welcher eine in Samen bevorzugte Expression ermöglicht; und (ii) eine Nucleotidsequenz, welche ein Phytoensynthase kodiert, wobei die Sequenz aus der Tomate (Lycopersicon sp.) oder Paprika (Capsicum sp.); oder aus einem Bakterium stammt; und (iii) einen Transkriptions-Beendigungsbereich; und (c) das Regenerieren einer samenhaltigen Pflanze aus diesem Material sowie das Identifizieren der Samen, welche Carotinoide in größeren Konzentrationen enthalten, als solche der Kontroll-Samen.
  • In einer besonderen Ausführungsform wird Schritt (a) des vorhergehenden Paragraphs vor Schritt (b) durchgeführt. In einer weiteren Ausführungsform wird Schritt (b) des vorhergehenden Paragraphen vor Schritt (a) durchgeführt. In noch einer weiteren Ausführungsform stammen der Promotor, die Sequenz, welche die Carotin-Desaturase kodiert, die Sequenz, die Phytoen-Synthase kodiert, und der Terminatorbereich aus Sequenzen, die in der Sequenzliste wiedergegeben sind. In noch einer weiteren Ausführungsform ist diese Carotin-Desaturase das CrtI-Gen aus Erwinia sp. In noch einer weiteren Ausführungsform umfasst die Carotin-Desaturase die Sequenz, welche in SEQ ID Nr. 18 oder 19 wiedergegeben ist, oder besteht daraus. In einer weiteren Ausführungsform stammt diese Phytoen-Synthase aus Mais oder Reis. In noch einer weiteren Ausführungsform ist diese Phytoen-Synthase aus Mais oder Reis. In noch einer weiteren Ausführungsform umfasst diese Phytoen-Synthase eine Sequenz, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die in SEQ ID Nr. 10, 11, 12 und 13 wiedergegeben ist oder daraus besteht.
  • In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Erhöhen des Carotinoidgehalts von Samen bereitgestellt, welches das Kreuzen (a) einer ersten Pflanze umfasst, die ein Polynucleotid umfasst, welches als operativ verbundene Bestandteile (i) einen Promotor umfasst, welcher eine durch Samen bevorzugte Expression bereitstellt; und (ii) eine Nucleotidsequenz, welche aus einem Bakterium stammt, wobei die Sequenz eine Carotin-Desaturase kodiert; und (iii) einen Transkriptions-Beendigungsbereich; mit (b) einer weiteren Pflanze, welche ein Polynucleotid umfasst, welches als operativ verbundene Bestandteile (i) einen Promotor umfasst, welcher eine durch Samen bevorzugte Expression bereitstellt; und (ii) eine Nucleotidsequenz, welche eine Phytoen-Synthase umfasst, wobei die Sequenz aus Mais (Zea sp.) oder Reis (Orzya sp.) stammt; und (iii) einen Transkriptions-Beendigungsbereich; und (c) das Ernten von Samen des weiblichen Elternteils der so gekreuzten Pflanzen; und (d) das Züchten dieser Samen, um Pflanzen zu produzieren, die weitere Samen umfassen und das Identifizieren dieser weiteren Samen, welche Carotinoide in größeren Mengen enthalten als solche der Kontrollsamen.
  • Weiter offenbart ist ein Verfahren zum Erhöhen des Carotinoidgehalts von Samen, welche das Kreuzen von (a) einer ersten Pflanze umfasst, die ein Polynucleotid umfasst, welches als operativ verbundene Bestandteile (i) einen Promotor umfasst, welcher eine durch Samen bevorzugte Expression ermöglicht; und (ii) eine Nucleotidsequenz, welche aus einem Bakterium stammt, wobei die Sequenz eine Carotin-Desaturase kodiert; und (iii) einen Transkriptions-Beendigungsbereich; mit (b) einer weiteren Pflanze, welche ein Polynucleotid umfasst, welches als operativ verbundene Bestandteile (i) einen Promotor umfasst, welcher eine durch Samen bevorzugte Expression ermöglicht; und (ii) eine Nucleotidsequenz, welche eine Phytoen-Synthase kodiert, mit einer Sequenz, die aus der Tomate (Lycopersicon sp.) oder der Paprika (Capsicum sp.) stammt; oder aus einem Bakterium; und (iii) einen Transkriptions-Beendigungsbereich; und (c) Ernten der Samen des weiblichen Elternteils dieser derart gekreuzten Pflanzen; und (d) das Züchten dieser Samen, um Pflanzen herzustellen, die weitere Samen umfassen und das Identifizieren dieser weiteren Samen, welche Carotinoide in höheren Konzentrationen enthalten, als die der Kontroll-Samen.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform sind der Promotor, die Sequenz, welche die Carotin-Desaturase kodiert, die Sequenz, die Phytoen-Synthase kodiert und der Terminatorbereich aus Sequenzen erhältlich, die in der Sequenzliste wiedergegeben sind. In noch einer weiteren Ausführungsform ist diese Carotin-Desaturase das CrtI-Gen aus Erwinia Sp. In noch einer weiteren Ausführungsform umfasst die Carotin-Desaturase die Sequenz, die als SEQ ID Nr. 18 oder 19 wiedergegeben ist, oder besteht daraus. In noch einer weiteren Ausführungsform stammt diese Phytoen-Synthase aus Mais oder Reis. In noch einer weiteren Ausführungsform ist diese Phytoen-Synthase aus Mais oder Reis. In einer weiteren Ausführungsform ist diese Phytoen-Synthase eine Sequenz, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID Nr. 10, 11, 12 und 13 besteht oder diese umfasst.
  • In noch einem weiteren Aspekt der Erfinfung wird ein Polynucleotid bereitgestellt, welches (a) einen Bereich umfasst, welcher als operativ verbundene Bestandteile umfasst (i) einen Promotor, welcher eine in Samen bevorzugte Expression ermöglicht; und (ii) eine Nucleotidsequenz, die aus einem Bakterium stammt, wobei die Sequenz eine Carotin-Desaturase oder eine Nucleotidsequenz, welche eine Carotin-Desaturase kodiert, die aus einer Pflanze stammt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Tomate (Lycopersicon sp.); Paprika (Capsicum sp.); Mais (Zea sp.); Reis (Orzya sp.) und (iii) einen Transkriptions-Beendigungsbereich; und (b) einen weiteren Bereich, welcher als operativ verbundene Bestandteile (i) einen Promotor umfasst, welcher eine durch Samen bevorzugte Expression ermöglicht; und (ii) eine Nucleotidsequenz, welche eine Phytoen-Synthase kodiert, welche eine Sequenz ist, die aus einem Bakterium stammt, oder aus einer Pflanze, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Mais (Zea sp.) und Reis (Orgya sp.) besteht; und (iii) einen Transkriptions-Beendigungsbereich; und (c) einen weiteren Bereich, welcher als operativ verbundene Bestandteile (i) einen Promotor enthält, welcher eine durch Samen bevorzugte Expression ermöglicht; und (ii) eine Nucleotidsequenz, welche eine Zeta-Carotin-Desaturase (ZDS) kodiert, die aus einem Bakterium stammt, oder aus einer Pflanze, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus: Tomate (Lycopersicon sp.); Paprika (Capsicum sp.); Mais (Zea sp.); Reis (Orgya sp.); und (iii) einen Transkriptions-Beendigungsbereich. In einer besonderen Ausführungsform stammen die Carotin-Desaturase und die Phytoen-Synthase aus Mais (Zea sp.) und die Zeta-Cartotin-Desaturase (ZDS) stammt aus Paprika (Capsicum sp.). Nach einer weiteren Ausführungsform stammt die Carotin-Desaturase und die Phytoen-Synthase aus Mais (Zea sp.) und die Zeta-Carotin-Desaturase (ZDS) aus Paprika (Capsicum sp.).
  • Die obenen beschriebenen Polynucleotide können verwendet werden, um Polynucleotidsequenzen zu identifizieren, die eine ähnliche Funktion bereitstellen, basierend auf Hybridisierungsbedingungen, die oben beschrieben worden sind. Diese Polynucleotide und die Polynucleotidsequenzen, die die Zeta-Carotin-Desaturase umfassen, können ebenfalls in Verfahren zur Erhöhung des Carotinoidgehalts von Samen in analoger Weise zu den oben beschriebenen Verfahren verwendet werden.
  • Nach einem anderen erfindungsgemäßen Aspekt wird ein Polynucleotid bereitgestellt, welches als operativ verbundene Bestandteile (i) einen Promotor umfasst, welcher eine von Samen bevorzugte Expression ermöglicht; und (ii) eine Nucleotidsequenz, die aus einem Bakterium stammt, wobei die Sequenz eine Carotin-Desaturase oder eine Nucleotidsequenz kodiert, die eine Carotin-Desaturase kodiert, die aus einer Pflanze stammt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus: Tomate (Lycopersicon sp.); Paprika (Capsicum sp.); Mais (Zea sp.); Reis (Orgya sp.) und (iii) eine Nucleotidsequenz, die eine Phytoen-Synthase kodiert, wobei die Sequenz aus einer Pflanze stammt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus: Mais (Zea sp.) und Reis (Orzya sp.) und (iv) eine Nucleotidsequenz, die Zeta-Carotin-Desaturase (ZDS) kodiert, die aus einem Bakterium stammt oder aus einer Pflanze, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus: Tomate (Lycopersicon sp.); Paprika (Capsicum sp.); Mais (Zea sp.); Reis (Orzya sp.) und (v) einen Transkriptions-Beendigungsbereich.
  • Jede der in dieser Beschreibung definierten Regionen kann durch einen Bereich getrennt sein, welcher ein sich selbst prozessierendes Polypeptid bereitstellt, welches in der Lage ist, Proteine zu spalten, beispielsweise das sich selbst prozessierende Polypeptid, das beschrieben ist in US 5,846,767 oder irgendein ähnlich funktionierendes Element. Alternativ dazu können die Bereiche durch eine Sequenz getrennt werden, welche als Zielstelle für ein externes Element dient, das in der Lage ist, die Proteinsequenzen zu trennen. Alternativ dazu kann das Polynucleotid ein Polyprotein bereitstellen, welches eine Vielzahl an Proteinfunktionen umfasst. In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die Proteine des Polyproteins tandemartig angeordnet sein. Der Fachmann auf dem Gebiet wird in Erwägung ziehen, dass, wenn ein Polynucleotid erzeugt wird, welches ein derartiges Polyprotein kodiert, eine Expression eines derartigen Polyproteins durch die Verwendung eines einzelnen Promotors erreicht werden kann, wobei der Promotor hier beschrieben ist.
  • Alle innerhalb dieser Beschreibung beschriebenen Polynucleotide und Polynucleotidsequenzen können unter Verwendung von Techniken isoliert und konstruiert werden, die dem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt sind. Beispielsweise können die Polynucleotide unter Verwendung von Standard-Polynucleotidsynthesegeräten synthetisiert werden. Solche synthetischen Polynucleotide können synthetisiert und dann ligiert werden, um längere Polynucleotide gemäß der Erfindung zu bilden. Die Polynucleotide und die Polynucleotidsequenzen können ebenfalls aus anderen Konstrukten/Vektoren isoliert werden, welche diese Sequenzen enthalten, und dann können sie in weitere Konstrukte/Vektoren inseriert werden, um die erfindungsgemäßen herzustellen. Die Sequenzen können auch aus Bibliotheken, z. B. aus cDNA und gDNA, unter Verwendung der Sequenzinformationen isoliert werden, die in der Sequenzliste bereitgestellt wird, um geeignete Sonden/Primer zum Zwecke der Identifizierung dieser Sequenzen in diesen Bibliotheken herzustellen. Sobald sie isoliert sind, können die Sequenzen zusammengebaut werden, um die Polynucleotide und die Polynucleotidsequenzen gemäß der Erfindung zu erzeugen. Die erfindungsgemäßen Sequenzen können ebenfalls verwendet werden, um ähnliche Sequenzen mit Hybridisierungsbedingungen zu identifizieren, die oben beschrieben worden sind. Bei der Identifizierung solcher ähnlicher Sequenzen mag der Fachmann auf dem Gebiet beabsichtigen, ähnliche Sequenzen eines oder mehrerer Komponententeile der in der Sequenzliste wiedergegebenen Sequenzen zu identifizieren, und diese ähnlichen Sequenzen dann in einer ähnlichen Weise wie die Anordnung der Sequenzen, die in der Sequenzliste wiedergegeben sind, zusammenzubauen. Beispielsweise kann gewünscht sein, den Bereich, der nur das Phytoen-Synthase-Gen kodiert, zu modifizieren. Sobald die modifizierte Phytoen-Synthase kodierende Sequenz identifiziert worden ist, könnte versucht werden, die Phytoen-Synthase kodierende Sequenz in einer der Sequenzen, die in der Sequenzliste wiedergegeben sind, zu ersetzen. Alternativ dazu könnte die modifizierte Phytoen-Synthase in der Herstellung einer neuen Sequenz verwendet werden, wobei alle Teile der Komponenten gleich sind, wie die Sequenz in der Sequenzliste, ausgenommen der Phytoen-Synthase. In einem weiteren Beispiel können alle Bestandteile modifiziert sein, und dann können alle der modifizierten Bestandteile in der gleichen Weise, wie die Sequenzen in der Sequenzliste angeordnet werden, beispielsweise Promotor-Intron-Zielsequenz-Carotindesaturase-Terminator-Promotor-Intron-(Zielsequenz)-Phytoen-Synthase-Terminator. Der Grad der Modifizierung wird die Fähigkeit der so modifizierten Sequenz, mit einer Sequenz in der Sequenzliste unter den oben beschriebenen Bedingungen zu hybridisieren, beeinflussen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner eine Pflanze bereit, welche ein Polynucleotid oder eine Polynucleotidsequenz, die oben beschrieben worden ist, umfasst. In einer besonderen Ausführungsform ist diese Pflanze eine Reis- oder Maispflanze.
  • Nach einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Polynucleotid oder eine Polynucleotidsequenz wie oben beschrieben bereitgestellt, wobei der Promotor/die Promotoren Gewebe-bevorzugte und/oder Organ-bevorzugte sind. In einer besonderen Ausführungsform ermöglicht der Promotor/die Promotoren die bevorzugte Expression in der Frucht. In einer weiteren Ausführungsform ermöglicht der Promotor/die Promotoren eine hohe Expression in der Frucht. In einer weiteren Ausführungsform ist diese Frucht eine Banane. In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird auch ein Polynucleotid bereitgestellt, welches umfasst: (a) einen Bereich, welcher als operativ verbundene Bestandteile umfasst: (i) einen Promotor, der eine in Früchten bevorzugte Expression ermöglicht; und (ii) eine Nucleotidsequenz, die aus einem Bakterium stammt, dessen Sequenz eine Carotin-Desaturase kodiert; und (iii) einen Transkriptions-Beendigungsbereich; und (b) einen weiteren Bereich, welcher als operativ verbundene Bestandteile (i) einen Promotor umfasst, welcher eine in Früchten bevorzugte Expression bereitstellt; und (ii) eine Nucleotidsequenz, die eine Phytoen-Synthase kodiert, wobei die Sequenz aus Mais (Zea sp.) oder Reis (Orzya sp.) stammt; und (iii) einen Transkriptions-Beendigungsbereich.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform wird ein Verfahren zum Erhöhen des Carotinoidgehalts von Früchten bereitgestellt, umfassend das Inserieren eines Polynucleotids in Pflanzenmaterial umfassend: (a) einen Bereich, welcher als operativ verbundene Bestandteile (i) einen Promotor umfasst, welcher eine in Früchten bevorzugte Expression bereitstellt; und (ii) eine Nucleotidsequenz, die aus einem Bakterium stammt, wobei die Sequenz eine Carotin-Desaturase kodiert; und (iii) einen Transkriptions-Beendigungsbereich; und (b) einen weiteren Bereich, welcher als operativ verbundene Bestandteile (i) einen Promotor umfasst, welcher eine in Früchten bevorzugte Expression bereitstellt; und (ii) eine Nucleotidsequenz, welche eine Phytoen-Synthase kodiert, wobei die Sequenz aus Mais (Zea sp.) oder Reis (Orzya sp.) stammt; und (iii) einen Transkriptions-Beendigungsbereich und das Regenerieren einer fruchttragenden Pflanze aus diesem Material sowie das Identifizieren der Frucht, welche Carotinoide in Niveaus enthält, die größer sind als solche der als Kontrolle dienenden Frucht. Die vorliegende Erfindung stellt ferner Polynucleotide bereit, die die Phytoen-Synthase kodierenden Sequenzen und Carotin-Desaturase kodierenden Sequenzen, die oben erwähnt worden sind, umfassen, wobei die Sequenzen operativ an Promotoren gebunden sind, die eine für Früchte bevorzugte oder Gewebe- oder Organ-bevorzugte Expression bereitstellen. Solche geeigneten Promotoren können von Fachleuten auf dem Gebiet identifiziert werden.
  • In einem weiteren erfindungsgemäßen Aspekt wird die Verwendung eines Polynucleotids oder einer Polynucleotidsequenz, die oben beschrieben worden ist, in einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen bereitgestellt, welche resistent und/oder tolerant gegenüber einem Herbizid sind.
  • In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer Pflanze bereitgestellt, welche resistent und/oder tolerant gegenüber einem Herbizid ist, welches das Inserieren eines Polynucleotids oder einer Polynucleotidsequenz, die oben beschrieben worden sind, in ein Pflanzenmaterial umfasst, und das Regenerieren einer morphologisch normalen Pflanze aus diesem Material. Die Herbizidresistenz und/oder Toleranz der Pflanze, welche das Polynucleotid oder die Polynucleotidsequenz der Erfindung enthält, kann mit einer Kontrollpflanze verglichen werden. Der Begriff Kontrollpflanze betrifft Pflanzen, die im Wesentlichen ähnlich denen gemäß der Erfindung sind, aber die Kontrollpflanzen enthalten nicht die Polynucleotide oder Polynucleotidsequenzen gemäß der Erfindung. Typischerweise umfasst eine der Kontrolle dienende Pflanze eine Pflanze der gleichen oder ähnlichen Pflanzenart, wobei die Kontrollpflanze eine native Pflanze ist oder eine Pflanze, die nicht transformiert worden ist.
  • In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Polynucleotid bereitgestellt, welches die Sequenz umfasst, welche in SEQ ID Nr. 13 wiedergegeben ist. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Polynucleotid bereitgestellt, welches aus der Sequenz besteht, die in SEQ ID Nr. 13 wiedergegeben ist. Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Polynucleotid bereit, welches das Protein kodiert, welches in SEQ ID Nr. 14 wiedergegeben ist. Die vorliegende Erfindung stellt ferner eine Polynucleotidsequenz bereit, welche mindestens 87% Identität mit der Sequenz aufweist, die in SEQ ID Nr. 13 wiedergegeben ist, wobei die Sequenz immer noch eine Phytoen-Synthase kodiert. Die vorliegende Erfindung stellt ferner eine Polynucleotidsequenz bereit, welche mindestens 90% Identität mit der Sequenz, die in SEQ ID Nr. 13 wiedergegeben ist, besitzt, wobei die Sequenz immer noch eine Phytoen-Synthase kodiert. Die vorliegende Erfindung stellt ferner eine Polynucleotidsequenz bereit, welche mindestens 91% Identität mit der Sequenz, die in SEQ ID Nr. 13 wiedergegeben ist, besitzt, wobei die Sequenz immer noch eine Phytoen-Synthase kodiert. Die vorliegende Erfindung stellt ferner eine Polynucleotidsequenz bereit, welche mindestens 92% Identität mit der Sequenz, die in SEQ ID Nr. 13 wiedergegeben ist, besitzt, wobei die Sequenz immer noch eine Phytoen-Synthase kodiert. Die vorliegende Erfindung stellt ferner eine Polynucleotidsequenz bereit, welche mindestens 93% Identität mit der Sequenz, die in SEQ ID Nr. 13 wiedergegeben ist, besitzt, wobei die Sequenz immer noch eine Phytoen-Synthase kodiert. Die vorliegende Erfindung stellt ferner eine Polynucleotidsequenz bereit, welche mindestens 94% Identität mit der Sequenz, die in SEQ ID Nr. 13 wiedergegeben ist, besitzt, wobei die Sequenz immer noch eine Phytoen-Synthase kodiert. Die vorliegende Erfindung stellt ferner eine Polynucleotidsequenz bereit, welche mindestens 95% Identität mit der Sequenz, die in SEQ ID Nr. 13 wiedergegeben ist, besitzt, wobei die Sequenz immer noch eine Phytoen-Synthase kodiert. Die vorliegende Erfindung stellt ferner eine Polynucleotidsequenz bereit, welche mindestens 96% Identität mit der Sequenz, die in SEQ ID Nr. 13 wiedergegeben ist, besitzt, wobei die Sequenz immer noch eine Phytoen-Synthase kodiert. Die vorliegende Erfindung stellt ferner eine Polynucleotidsequenz bereit, welche mindestens 97% Identität mit der Sequenz, die in SEQ ID Nr. 13 wiedergegeben ist, besitzt, wobei die Sequenz immer noch eine Phytoen-Synthase kodiert. Die vorliegende Erfindung stellt ferner eine Polynucleotidsequenz bereit, welche mindestens 98% Identität mit der Sequenz, die in SEQ ID Nr. 13 wiedergegeben ist, besitzt, wobei die Sequenz immer noch eine Phytoen-Synthase kodiert. Die vorliegende Erfindung stellt ferner eine Polynucleotidsequenz bereit, welche mindestens 99% Identität mit der Sequenz, die in SEQ ID Nr. 13 wiedergegeben ist, besitzt, wobei die Sequenz immer noch eine Phytoen-Synthase kodiert.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Protein mit der Sequenz, die in SEQ ID Nr. 14 wiedergegeben ist oder eine Variante bereit, welche mindestens 82% Identität mit der SEQ ID Nr. 14 hat, wobei die Variante immer noch Phytoen-Synthase-Aktivität ermöglicht. In einer weiteren Ausführungsform hat diese Variante mindestens 85% Identität zur SEQ ID Nr. 14, wobei die Variante immer noch Phytoen-Synthase-Aktivität bereitstellt. In noch einer weiteren Ausführungsform hat diese Variante mindestens 90% Identität mit SEQ ID Nr. 14, wobei die Variante immer noch Phytoen-Synthase-Aktivität bereitstellt. In noch einer weiteren Ausführungsform hat diese Variante mindestens 91% Identität mit SEQ ID Nr. 14, wobei die Variante immer noch Phytoen-Synthase-Aktivität bereitstellt. In noch einer weiteren Ausführungsform hat diese Variante mindestens 92% Identität mit SEQ ID Nr. 14, wobei die Variante immer noch Phytoen-Synthase-Aktivität bereitstellt. In noch einer weiteren Ausführungsform hat diese Variante mindestens 93% Identität mit SEQ ID Nr. 14, wobei die Variante immer noch Phytoen-Synthase-Aktivität bereitstellt. In noch einer weiteren Ausführungsform hat diese Variante mindestens 94% Identität mit SEQ ID Nr. 14, wobei die Variante immer noch Phytoen-Synthase-Aktivität bereitstellt. In noch einer weiteren Ausführungsform hat diese Variante mindestens 95% Identität mit SEQ ID Nr. 14, wobei die Variante immer noch Phytoen- Synthase-Aktivität bereitstellt. In noch einer weiteren Ausführungsform hat diese Variante mindestens 96% Identität mit SEQ ID Nr. 14, wobei die Variante immer noch Phytoen-Synthase-Aktivität bereitstellt. In noch einer weiteren Ausführungsform hat diese Variante mindestens 97% Identität mit SEQ ID Nr. 14, wobei die Variante immer noch Phytoen-Synthase-Aktivität bereitstellt. In noch einer weiteren Ausführungsform hat diese Variante mindestens 98% Identität mit SEQ ID Nr. 14, wobei die Variante immer noch Phytoen-Synthase-Aktivität bereitstellt. In noch einer weiteren Ausführungsform hat diese Variante mindestens 99% Identität mit SEQ ID Nr. 14, wobei die Variante immer noch Phytoen-Synthase-Aktivität bereitstellt. In noch einer weiteren Ausführungsform wird ein Polynucleotid bereitgestellt, welches diese Variante kodiert. Unter Phytoen-Synthase-Aktivität wird verstanden, dass die Proteinvariante die gleiche oder ähnliche Funktion des Proteins aufweist, welches in SEQ ID Nr. 14 wiedergegeben ist. Der Prozentsatz an Sequenzidentität für Proteine wird durch Vergleich zweier optimal angelagerter Sequenzen über ein Vergleichsfenster bestimmt, wobei der Anteil der Aminosäuresequenz in dem Vergleichsfenster Additionen oder Deletionen (d. h. Lücken) verglichen mit der ursprünglichen Referenzsequenz (welche die Addition oder Deletion nicht umfasst) umfassen kann, für eine optimale Anlagerung der zwei Sequenzen. Der Prozentsatz wird durch Bestimmung der Anzahl an Positionen berechnet, bei denen identische Aminosäurereste in beiden Sequenzen auftreten, um die Anzahl an übereinstimmenden Positionen zu ergeben, dann durch das Dividieren der Anzahl der übereinstimmenden Positionen durch die gesamte Anzahl an Positionen in dem Fenster zum Vergleich und das Multiplizieren der Ergebnisse mit 100, um den Prozentsatz der Sequenzidentität zu ergeben. Eine optimale Anlagerung von Sequenzen zum Vergleich kann ebenfalls durch computerisierte Implementierungen bekannter Algorithmen, wie beispielsweise von Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller und David J. Lipman (1997), „Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of Protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402, durchgeführt werden. Es gibt auch Algorithmen, die Fachleuten auf dem Gebiet verfügbar sind, die eine Berechnung der prozentualen Sequenzidentität zwischen Polynucleotidsequenzen ermöglichen. Die Variante kann sich von dem Protein, welches in SEQ ID Nr. 14 wiedergegeben ist, insbesondere durch konservative Substituierungen, unterscheiden. Diese konservativen Substitutionen sind wie oben beschrieben.
  • Die vorliegende Erfindung wird nun durch die folgenden, nicht beschränkenden Beispiele unter Bezugnahme auf die folgenden Figuren und die Sequenzliste beschrieben, worin:
    • SEQ ID Nr. 1 = 12423 = Glu-Cat-SSU-srtI-Nos-Glu-Cat-Psy (Mais-gb)-nos
    • SEQ ID Nr. 2 = 12421 = Glu-Cat-SSU-crtI-Nos-Glu-Cat-Psy (Mais-E1B)-nos
    • SEQ ID Nr. 3 = 12422 = Glu-SSU-crtI-Nos-Glu-Psy (Mais-E1B)-nos
    • SEQ ID Nr. 4 = 12424 = Glu-SSU-crtI-Nos-Glu-Psy (Mais-gb)-nos
    • SEQ ID Nr. 5 = Glu-Cat-SSU-crtI-Nos-Glu-Cat-Psy (Mais)-nos
    • SEQ ID Nr. 6 = 11586 = Glu-Cat-SSU-crtI-Nos-Glu-Cat-Psy (Reis)-nos
    • SEQ ID Nr. 7 = 7651 = Glu-Cat-SSU-crtI-Nos-Glu-Cat-Psy (Paprika)-nos
    • SEQ ID Nr. 8 = 7650 = Glu-Cat-SSU-crtI-Nos-Glu-Cat-Psy (Tomate)-nos
    • SEQ ID Nr. 9 = Glu-Cat-SSU-crtI-Nos-Glu-Cat-SSU-Psy (crtB)-nos
    • SEQ ID Nr. 10 = Phytoen-Synthase gb (Mais)
    • SEQ ID Nr. 11 = Phytoen-Synthase (Mais) von SEQ ID Nr. 5 oben
    • SEQ ID Nr. 12 = Phytoen-Synthase E1B (Mais)
    • SEQ ID Nr. 13 = Phytoen-Synthase (Reis)
    • SEQ ID Nr. 14 = Phytoen-Synthase (Reis) PROTEIN
    • SEQ ID Nr. 15 = Phytoen-Synthase (Paprika)
    • SEQ ID Nr. 16 = Phytoen-Synthase (Tomate)
    • SEQ ID Nr. 17 = Phytoen-Synthase (Erwinia crtB)
    • SEQ ID Nr. 18 = Carotin-Desaturase (Erwinia crtI), verwendet in SEQ ID Nr. 1–4
    • SEQ ID Nr. 19 = Carotin-Desaturase (Erwinia crtI)
    • SEQ ID Nr. 20 = der in Samen bevorzugte Glutelin-Promotor
    • SEQ ID Nr. 21 = der in Samen bevorzugte Prolamin-Promotor
    • SEQ ID Nr. 22 = Intron aus dem Catalasegen
    • SEQ ID Nr. 23 = Transitpeptid (kleine Untereinheit Rubisco)
    • SEQ ID Nr. 24 = Transkriptions-Beendigungsbereich des Nopalin-Synthase-Gens
    • SEQ ID Nr. 25 = Transkriptions-Beendigungsbereich aus 35S CaMV
    • SEQ ID Nr. 26 = Transkriptions-Beendigungsbereich des Proteinase-Inhibitors der Kartoffel
    • SEQ ID Nr. 27 = Carotin-Desaturase (Tomate)
    • SEQ ID Nr. 28 = Carotin-Desaturase (Paprika)
    • SEQ ID Nr. 29 = Carotin-Desaturase (Mais)
    • SEQ ID Nr. 30 = Carotin-Desaturase (Reis)
    • SEQ ID Nr. 31 = Zeta-Carotin-Desaturase (Tomate)
    • SEQ ID Nr. 32 = Zeta-Carotin-Desaturase (Paprika)
    • SEQ ID Nr. 33 = Zeta-Carotin-Desaturase (Mais)
    • SEQ ID Nr. 34 = Zeta-Carotin-Desaturase (Reis)
    • SEQ ID Nr. 35 bis 38 = Primer
    • Glu = der in Samen bevorzugte Glutelin-Promotor
    • Pro = der in Samen bevorzugte Prolamin-Promotor
    • Cat = Intron des Catalase-Gens
    • SSU = Transitpeptid (kleine Untereinheit Rubisco)
    • CrtI = Carotin-Desaturase aus Erwinia
    • Pds = Carotin-Desaturase (die Quelle wird in Klammern angegeben)
    • Psy = Phytoen-Synthase (Quelle angegeben in Klammern)
    • Zds = Zeta-Carotin-Desaturase
    • Pds = Phytoen-Desaturase
    • Nos = Transkriptions-Beendigungsbereich des Nopalin-Synthase- Gens
    • 35S Term = Transkriptions-Beendigungsbereich aus 35S CaMV
    • PotP1-II Term = Transkriptions-Beendigungsbereich des Proteinase-Inhibitors der Kartoffel
  • 1 = Teil des Carotinoid-Biosynthesewegs ausgehend von GGPP (Geranylgeranyldiphosphat).
  • 2 = Konstrukt pPRP0117.
  • Beispiele
  • Allgemeine molekularbiologische Verfahren werden gemäß Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2. Ausgabe. Cold Spring Harbour Lab. Press, durchgeführt.
  • 1.0 Konstruktion binärer Pflanzenvektoren
  • Die Referenzen der Gensequenzen unten werden angegeben, so, wie sie in der EMBL-Datenbank aufgelistet sind. Diese Datenbank wird von dem European Bioinformatics Institute (Patricia Rodriguez-Tomé, Peter J. Stoehr, Graham N. Cameron und Tomas P. Flores, „The European Bioinformatics Institute (EBI) databases", Nucleic Acids Res. 24: (6–13), 1996, www.ebi.ac.uk) gepflegt und verteilt.
  • Ein auf pUC basierender Vektor pPRP0117 (2) wurde zur Klonierung aller Pflanzentransformationsvektoren verwendet. Dieser enthält die Nucleotide –806 bis +33 des Reisglutelin-Gens als Promotor (Y00687), das erste Intron des Catalase-1-Gens aus der Castorbohne, welches verändert wurde, um die ATG-Sequenz zu entfernen, eine gus-kodierende Region und einen nos-Terminator. Die gus-kodierende Sequenz wurde durch einen Verdau von pPRP0117 mit NcoI und SfiI entfernt und ersetzt durch die kodierenden Regionen der Carotinoid-Phytoen-Synthasegene oder Phytoen-Desaturasegene, oder als eine gus::nos Cassette durch den Verdau von pPRP0117 mit NcoI und PacI entfernt und ersetzt durch die Carotinoid-kodierende Region/nos-Terminatorfusion, welche unten beschrieben ist.
  • 1.1 Konstruktion des pPRP0117 + crtI-Vektors
  • Eine Kassette des Signalpeptids der kleinen Untereinheit der Erbsenribulosebiphosphatcarboxylase (SSU) (X00806), welche mit der bakteriellen Phytoen-Desaturase CrtI (D90087) und einem nos-Terminator fusioniert ist, wurde in die NcoI- und PacI-Schnittstellen von pPRP0117 kloniert. Die crtI-Sequenz in den Konstrukten 7651, 7650 und 11586 hat 9 zusätzliche Nucleotide (3 Alanine), welche nach dem ersten ATG inseriert sind, um die NotI-Restriktionsschnittstelle zu Klonierungszwecken einzuschließen.
  • 1.2 Konstruktion des binären pJH0104HygCrtI-Vektors
  • Die SgfI Gt::Intron::SSUcrtI::nos-Kassette wurde in die PacI-Schnittstelle des binären Vektors pJH0104 + Hyg kloniert (welcher ein Hygromycinresistenzgen für die Antibioticaselektion enthält), um das Konstrukt pJH0104HygSSUCrtI zu ergeben.
  • 1.3 Paprika psy + crtI-Konstrukt 7651
  • Das Catalase-Intron und das Paprika-psy (X68017) wurden separat mittels PCR unter Verwendung von Primern amplifiziert, die beide Sequenzen überlappen, und dann mittels rekombinanter PCR fusioniert und in die EcoRI- und SfiI-Schnittstellen von pPRP0117 kloniert. Die Gt::Intron::Paprika psy::nos-Kassette wurde mittels SgfI-Verdau gewonnen und in die PacI-Schnittstelle von pJH0104HygCrtI kloniert, um das Konstrukt 7651 zu ergeben.
  • 1.4 Tomaten psy + crtI-Konstrukt 7650
  • Das Catalase-Intron und das Tomaten-psy (Y00521) wurden separat mittels PCR unter Verwendung von Primern amplifiziert, die beide Sequenzen überlappen, und dann mittels rekombinanter PCR fusioniert und in die EcoRI- und SfiI-Schnittstellen von pPRP0117 kloniert. Die Gt::Intron::Tomate psy::nos-Kassette wurde mittels SgfI gewonnen und in die PacI-Schnittstelle von pJH0104HygCrtI kloniert, um das Konstrukt 7650 zu ergeben.
  • 1.5 Reis psy + crtI-Konstrukt 11586
  • PolyA mRNA wurde aus Reisblättern (Asanohikari) extrahiert. Die Synthese des ersten Strangs der Reis-psy cDNA wurde unter Verwendung des Antisense-Primers 5' cgtcggcctgcatggccctacttctggctatttctcagtg 3' (SEQ ID Nr. 35) synthetisiert und cDNA wurde dann durch PCR-Amplifikation mit diesem Antisense-Primer und dem Sense-Primer 5' ctgtccatggcggccatcacgctcct 3' (SEQ ID Nr. 36) erhalten. Diese wurde mit NcoI und SfiI verdaut und in pPRP0117 kloniert. Das Gt::Intron::Reis psy::nos-Fragment wurde dann in den binären Vektor pJH0104Hyg transferiert. Eine HindIII/PacI Gt::Intron::SSUcrtI::nos-Kassette wurde an den Enden geglättet und in die PmeI-Schnittstelle des pJH0104Hyg Reis-psy-Vektors kloniert, um das Konstrukt 11586 zu ergeben.
  • 1.6 Mais psy (E1B) + crtI-Konstrukt 12421
  • PolyA mRNA wurde aus Maisblättern extrahiert. Die Synthese des ersten Strangs der Mais-psy (Sequenz bezeichnet als „E1B") cDNA wurde unter Verwendung des Antisense-Primers 5' cgatggcctgcatggccctaggtctggccatttctcaatg 3' (SEQ ID Nr. 37) synthetisiert und cDNA wurde dann mittels PCR-Amplifikation mit diesem Antisense-Primer und dem Sense-Primer 5' taggataagatagcaaatccatggccatcata 3' (SEQ ID Nr. 38) erhalten. Diese wurde mit NcoI und mit SfiI verdaut und dann in die NcoI- und SfiI-Schnittstellen von pPRP0117 basierenden Vektoren kloniert. Die Gt::Intron::Mais psy::nos-Kassette wurde mittels HindIII-/PacI-Verdau gewonnen und in einen binären Vektor kloniert, der die Gt::Intron::SSUcrtI::nos-Kassette enthält, um das Konstrukt 12421 zu ergeben.
  • 1.7 Mais-psy (E1B) + crtI-Konstrukt 12422
  • Der Vektor mit der Gt::Intron::Mais psy::nos-Kassette in dem pPRP0117-Hintergrund (aus der Konstruktion von 12421 oben) wurde mit den Restriktionsenzymen verdaut, die das Intron flankieren, gefolgt von einer Religierung des Vektors, um das Catalase-Intron zu entfernen. Die Gt:Mais psy::nos-Kassette wurde mittels HindIII-/PacI-Verdau entfernt und in einen binären Vektor kloniert, welcher eine Gt:SSUcrtI::nos-Kassette enthält, um das Konstrukt 12422 zu ergeben.
  • 1.8 Mais psy + crtI-Konstrukt 12423
  • Die Y1-Mais-psy (U32636) cds-Sequenz wurde mit NcoI- und SfiI-Restriktions-Verdau-Stellen, die an die 5'- bzw. 3'-Enden angefügt waren, synthetisiert. Dieses wurde in die NcoI- und SfiI-Schnittstellen des auf pPRP0117 basierenden Vektors kloniert. Die Gt::Intron::Mais psy::nos-Kassette wurde mittels HindIII-/PacI-Verdau entfernt und in einen binären Vektor kloniert, der eine Gt::Intron::SSUcrtI::nos-Kassette enthält, um das Konstrukt 12423 zu ergeben.
  • 1.9 Mais-psy + crtI-Konstrukt 12424
  • Der Vektor mit der Gt::Intron::Mais psy::nos-Kassette in dem pPRP0117 Hintergrund (aus der Konstruktion von 12423 oben) wurde mit den Restriktionsenzymen verdaut, die das Intron flankieren, gefolgt von einer Relegierung des Vektors, um das Catalase-Intron zu entfernen. Die Gt::Intron psy::nos-Kassette wurde mittels HindIII-/PacI-Verdau gewonnen und in einem binären kloniert, der die Gt::SSUcrtI::nos-Kassette enthält, um das Konstrukt 12424 zu ergeben.
  • 2.0 Konstruktion von Vektoren zur Pflanzentransformation
  • Wenn Vektoren für die Pflanzentransformation bereitgestellt werden, welche Agrobacterium verwenden, ist es bevorzugt, dass die Sequenzen gemäß der Erfindung zwischen die Grenzbereiche einer einzelnen TDNA-Region inseriert werden. Agrobacterium kann gemäß Verfahren transformiert werden, die Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt sind und/oder durch die hier beschriebenen Verfahren.
  • 3.0 Transformation von Reis
  • Auf Grundlage des Protokolls, das von Hiei et al. (1994 The Plant Journal, 6 (2), 271–282) veröffentlicht wurde. Die Schlüsselmodifizierung schließt die Verwendung eines supervirulenten Stammes in Kombination mit einem binären Standard-Vektor ein.
  • Das grundlegende Verfahren ist wie folgt:
    Reife Reissamen (Asanohikari) werden enthülst und die Oberfläche mit 70% Ethanol für eine Minute, gefolgt von 4% Natriumhypochlorid + Tween für 30 Minuten sterilisiert. Die Samen werden dann in Callus-Induktionsmedium (CIM) (N6-Salze, N6-Vitamine, 30 g/l Saccharose, 1 g/l Caseinhydrolysat, 2 mg/l 2,4-D, pH 5,8, 4 g/l Gelrite) ausgesät und bei 30°C in die Dunkelheit gestellt. Nach drei Wochen werden embryogene Calli isoliert und auf CIM ausplattiert und unter gleiche Bedingungen gehalten. Zum gleichen Zeitpunkt werden Agrobacterium-Kulturen (AGL1-Stamm plus binär) durch Verteilen eines Inoculums auf LB-Platten plus Kanamycin (50 mg/l) etabliert. Nach drei Tagen wird Agrobacterium von der Platte abgekratzt und in AA1 + AS (AA-Salze, B5-Vitamine, AA-Aminosäuren, 68,5 g/l Saccharose, 36 g/l Glucose, 0,5 g/l Caseinhydrolysat, 100 μM Acetosyringon, pH 5,2) resuspendiert bei einer optischen Dichte von 0,1 bei 600 nm. Die embryogenen Calli werden für 10 Minuten mit der Agrobacterium-Lösung inokuliert, worauf die Calli auf Platten aus R2COMAS (R2 Mikrosalze, 1/2 R2 Makrosalze, B5-Vitamine, 20 g/l Saccharose, 10 g/l Glucose, 1 g/l Caseinhydrolysat, 2 mg/l 2,4-D, 100 μM Acetosyringon, pH 5,2) ausgebreitet und in der Dunkelheit bei 26°C aufbewahrt werden. Nach drei Tagen werden die Calli auf Selektionsmedium überführt (N6-Salze, N6-Vitamine, 30 g/l Saccharose, 1 g/l Caseinhydrolysat, 2 mg/l 2,4-D, 300 mg/l Timentin, 50 mg/l Hygromycin, 4 g/l Gelrite, pH 5,8) und bei Licht und 30°C aufbewahrt. Alle folgenden Schritte werden unter den gleichen Wachstumsbedingungen (Licht, 30°C) durchgeführt. Nach drei Wochen werden die möglichen transgenen Calli auf ein Präregenerationsmedium (N6-Salze und Vitamine, 30 g/l Saccharose, 1 g/l Caseinhydrolysat, 1 mg/l 2,4-D, 300 mg/l Timentin, 50 mg/l Hygromycin, 6 g/l Gelrite, pH 5,8) überführt. Nach zwei Wochen werden die embryonalen Calli von guter Qualität in Regenerationsmedium überführt (N6 Mikro, 1/2 N6 Makro, N6-Vitamine, AA-Aminosäuren, 20 g/l Saccharose, 1 g/l Caseinhydrolysat, 0,2 mg/l NAA, 1 mg/l Kinetin, 50 mg/l Hygromycin, pH 5,8, Gelrite 6 g/l). Nach drei Wochen werden die regenerierten Pflänzchen auf Wurzelbildungsmedium regeniert (1/2 MS-Salze, 1/2 B5-Vitamine, 10 g/l Saccharose, 25 mg/l Hygromycin, pH 5,8, 8 g/l Microagar). Nach zwei Wochen werden die Pflänzchen, die ein robustes Wurzelsystem haben, in den Boden überführt (50% John Innes #3, 50% Torf, 26°C, eine 16-stündige Fotoperiode) und mit einem Flies bedeckt, bis die Pflanzen sich entwickelt haben.
  • 4.0 Analyse der Carotinoide in Reistransformanten
  • Carotinoide werden aus Samen extrahiert, die im reifen Zustand geerntet wurden. Die Samen werden unter Verwendung eines TR-200 Electromotion-Rice-Husker enthülst und dann für 1 min. mit einem Pearlest-Polisher (Kett) enthülst. Alle weißen oder entfärbten Samen werden entfernt und 0,5 g der Probe wird für 2 min. unter Verwendung einer Glen-Creston 8000 Mixer/Mill gemahlen. Insgesamt 1 g des gemahlenen Materials pro Pflanze kann durch dieses Verfahren erhalten werden. Dies kann vor der Extraktion von 2 × 0,5 g Portionen des Pulvers gut zusammengemischt werden. Eine Standardverbindung kann dann zu den Proben zur Quantifizierung der Ausbeuten hinzugegeben werden. Astaxanthin und Echinenon sind Beispiele von Standards, die verwendet werden können. Proben werden mit 1 ml Wasser hydratiert und unter Verwendung eines Vortex-Gerät für einige wenige Sekunden gemischt. 6 ml Aceton werden dann hinzugegeben und die Proben werden für 2 min. beschallt. Die Proben werden für 5 min. bei 3.500 UpM zentrifugiert. Die Überstände werden dekantiert und die Proben werden zweimal mehr mit 3 ml Aceton reextrahiert, wobei die Beschallungs/Zentrifugationsschritte zwischen den Extraktionen wiederholt werden. Eine Extraktion mit 2 ml tert-Methylbutylether wird durchgeführt, einschließlich der Beschallung/Zentrifugationsschritte und alle Überstände einer Probe werden zusammengegeben. Das Gesamtvolumen jedes Extraktes wird mit Aceton auf 14 ml eingestellt und der Zentrifugationsschritt wird wiederholt. Ein 2 ml Aliquot jeder Probe wird bis zur Trockenheit in einen Stickstoffgasstrom verdampft. Diese Aliquots werden in 75 μl Ethylacetat erneut gelöst, für 5–10 sec. gevortext und dann in Amber-HPLC-Insert-Gefäßchen überführt. Die Gefäßchen werden direkt danach versiegelt und wieder bei 3.500 UpM vor der HPLC-Analyse zentrifugiert.
  • Die HPLC-Quantifizierung beruht auf dem Reaktionsfaktor, der für jeden der Referenzstandards bestimmt wurde. Die Gesamtkonzentration der hergestellten und gelösten Referenzstandards wird spectrophotometrisch auf Grundlage der veröffentlichten molaren Extinktionskoeffizienten und/oder der Absorption gemessen, die bei einer Lösung einer 1% Konzentration gemessen wird, indem eine 1 cm Wellenlänge (A1%1 cm) (Ref: Britton G., Liaanen-Jensen S. und Pfander H. P. (1995) Carotenoids: Spectroscopy Vol 1B S. 57–62, Birkhauser Verlag, Basel, ISBN 3-7643-2909-2) verwendet wird. Bei jeder Standard-Ausgangslösung wird die Reinheit des Hauptbestandteils durch HPLC bestimmt. Bei Bestandteilen, für die kein Referenzstandard verfügbar ist, z. B. verschiedene cis-Isomere, werden die quantitativen Ergebnisse unter Verwendung des Reaktionsfaktors von β-Carotin ausgedrückt. 4.1 HPLC-Ausrüstung und Bedingungen
    Pumpe : Agilent 1100 Quaternary oder Binäre Pumpe; Modell Nr. G1311A bwz. G1312A
    Entgasungsvorrichtung : Agilent 1100 Degasser, Modell Nr. G1322A
    Temperaturkontrollierter automatischer Probenzieher : Agilent 1100 Automatic Liquid Sampler, Modell Nr. G1313A, ausgerüstet mit einer automatischen Temperaturproben-Kontrolle Modell Nr. G1330A
    Detektor : Agilent 1100 Diode Array Detector; Modell Nr. G1315A oder G1315B Agilent 1100 Fluorescence Detector, Modell Nr. G1321A (nur für die Tocopherol-Analyse)
    Säulenofen : Agilent 1100 Column Compartment; Modell Nr. G1316A
    Instrumentenbedingungen
    Säule : YMC C30 3 μm Partikel in 25 cm × 4,6 mm ID Edelstahlsäule + 1 cm × 4 mm 5 μm YMC C30 Guard Column
    Säulentemperatur : 25°C
    Probentemperatur : 4°C
    Mobile Phase : Lösungsmittel A = MeOH/H2O/tert-Buylmethylether (TMBE) + 1,3 mM NH4-Acetat (70/25/5 v/v) Lösungsmittel B = MeOH/H2O/TBME + 1,3 mM NH4-Acetat (7/3/90 v/v)
    Stopp-Zeit 30 min.
    Post-Zeit 0 min.
    Fließrate 1 ml min–1
    Injektionsvolumen 25 μl in Ethylacetat
    Gradientenbedingungen (6%/min.)
    Zeit (min.) A% B%
    MeOH/H2O/TBME + 1,3 mM NH4-Acetat (70/25/ v/v) MeOH/H2O/TBME + 1,3 mM NH4-Acetat (7/3/90 v/v)
    0 95 5
    15,83 0 100
    22 0 100
    24 95 5
    30 95 5
  • 5.0 Ergebnisse der HPLC-Quantifizierung der Carotinoide
  • Die Ergebnisse der Reispflanzen, die mit dem Konstrukt 11586 transformiert sind (das Konstrukt, das in 1.5 oben beschrieben worden ist):
    Probenidentität μg/g Trockengewicht Endosperm
    Wildtyp 0,05
    11586-10 4,19
    11586-7 6,11
    11586-25 6,32
    11586-15 7,55
    11586-30 7,69
    11586-28 9,05
    11586-14 11,82
    11586-20 12,82
    11586-1 13,29
    11586-12 18,59
    Sequenz ID Nr. Bestandteile μg/g Trockengewicht Endosperm
    7 crtI + Paprika psy > 3
    8 crtI + Tomate psy > 3
    9 crtI + crtB > 5
    - Nicht transformierte Kontrolle 0
    • 6.0 Transformation von Reis-Verfahren, das zur Transformation von Reis mit Agrobacterium verwendet wird, welches die Konstrukte 12421, 12422, 12423 und 12424 umfasst (Konstrukte, die in den Beispielen 1.6, 1.7, 1.8 bzw. 1.9 beschrieben sind).
  • In diesem Beispiel wird Reis (Oryza sativa) zur Erzeugung transgener Pflanzen verwendet. Verschiedene Reiskultivare können verwendet werden (Hiei et al., 1994, Plant Journal 6: 271–282; Dong et al., 1996, Molecular Breeding 2: 267–276; Hiei et al., 1997, Plant Molecular Biology, 35: 205–218). Auch die verschiedenen Medienbestandteile, die unten beschrieben sind, können entweder in der Konzentration variieren oder substituiert werden. Embryogene Reaktionen werden iniiziiert und/oder die Kulturen werden etabliert aus reifen Embryonen durch die Kultivierung auf MS-CIM-Medium (MS Basalsalze, 4,3 g/l, B5-Vitamine (200×), 5 ml/l; Saccharose, 30 g/l; Prolin, 500 mg/l; Glutamin, 500 mg/l; Caseinhydrolysat, 300 mg/l; 2,4-D (1 mg/ml), 2 ml/l; Einstellen auf den pH-Wert von 5,8 mit 1 N KOH; Phytagel, 3 g/l). Entweder reife Embryonen in den anfänglichen Stadien der Kulturreaktion oder etablierte Kulturlinien werden inokuliert und mit dem Agrobacterium-Stamm LBA4404 co-kultiviert, der die gewünschte Vektorkonstruktion enthält.
  • Agrobacterium wird aus Glycerol-Stocks auf festem YPC-Medium (100 mg/l Spectinomycin und irgendein anderes geeignetes Antibioticum) für ungefähr 2 Tage bei 28°C kultiviert. Agrobacterium wird in flüssigem MS-CIM-Medium resuspendiert. Die Agrobacterium-Kultur wird auf eine OD von 600 von 0,2–0,3 verdünnt und Acetosyringon wird bis zu einer Endkonzentration von 200 μM hinzugegeben. Agrobacterium wird mit Acetosyringon vor dem Mischen der Lösung mit den Reiskulturen induziert. Für die Inokulierung werden die Kulturen in der bakteriellen Suspension getränkt. Die flüssige Bakteriensuspension wird entfernt und die inokulierten Kulturen werden auf Co-Kultivierungsmedium gegeben und für zwei Tage bei 22°C inkubiert. Die Kulturen werden dann auf MS-CIM-Medium mit Ticarcillin (400 g/l) überführt, um das Wachstum von Agrobacterium zu inhibieren. Für Konstrukte, die das PMI-Selektions-Markergen benutzen (Reed et al., In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant 37: 127–132), werden Kulturen auf Selektionsmedium, welches Mannose als Kohlenhydratquelle enthält (MS mit 2% Mannose, 300 mg/l Ticarcillin) nach 7 Tagen überführt, und für 3–4 Tage in Dunkelheit kultiviert. Resistente Kolonien werden dann auf Regenerations-Induktionsmedium transferiert (MS ohne 2,4-D, 0,5 mg/l IAA, 1 mg/l Zeatin, 200 mg/l Timentin, 2% Mannose und 3% Sorbitol) und in der Dunkelheit für 14 Tage gezüchtet. Proliferierende Kolonien werden dann für eine weitere Runde in Regenerations-Induktionsmedium überführt und in einen belichteten Wachstumsraum gestellt. Die regenerierten Schösslinge werden in GA7-1 Medium (MS ohne Hormone und 2% Sorbitol) für 2 Wochen überführt und dann in das Treibhaus überführt, wenn sie groß genug sind und geeignete Wurzeln haben. Die Pflanzen werden in den Boden des Treibhauses transplantiert und bis zur Reife gezüchtet.
    • 7.0 Verfahren zur Extraktion/Quantifizierung von Carotinoiden – für Pflanzen, die gemäß Beispiel 6.0 transformiert wurden (a) Die Probe wird mit einem Geno/Grinder für 40 Sekunden bei 1.600 UpM gemahlen. (b) Entsprechende Mengen an homogenisierter Probe (0,1 g) werden in ein geeignetes Extraktionsgefäß eingewogen (z. B. ein 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen), das Probengewicht wird aufgezeichnet. (c) Die Proben werden mit Wasser (200 μl) hydratiert und für ungefähr 2–3 Sekunden gevortext, dann für ungefähr 10 min. stehen gelassen. (d) Aceton (1,2 ml) wird zu der Probe zugegeben. (e) Ultrabeschallung der Probe für 5 Minuten. (f) Zentrifugieren der Probe für 3 Minuten bei 6.000 UpM, dann Überführung des Überstandes in ein anderes geeignet großes Röhrchen. (g) Schritte (d) bis (f) werden wiederholt und mit dem vorherigen Extrakt kombiniert. (h) Schritte (d) bis (f) werden mit tert-Butylmethylether (400 μl) wiederholt und dann mit Acetonextrakten kombiniert. (i) Alle der kombinierten Extrakte werden in ein Röhrchen der geeigneten Größe überführt und bis zur Trockenheit in einem Stickstoffgasstrom verdampft. (j) Proben werden in 2 ml Ethylacetat + 0,5% BHT erneut gelöst, gevortext oder für 5–10 Sekunden ultrabeschallt und dann bei 3.500 UpM für 5 Minuten vor der HPLC-Analyse zentrifugiert. (k) Absorption bei der Wellenlänge 450 nm wird gemessen mit einem Spectrophotometer für alle Proben, und die gesamte Carotinoid-Konzentration wird basierend auf einem ε-Wert von 124865 berechnet.
    8.0 Ergebnisse des Verfahrens des Beispiels 7.0
    Konstrukt Proben-ID Berechnete Carotinoide (μg/g)
    12421 RIGQ2003001046A4A 48,7
    12421 RIGQ2003001063A43A 42,7
    12421 RIGQ2003001063A4A 36,9
    12421 RIGQ2003001063A99A 31,4
    12421 RIGQ2003001063A59A 30
    12421 RIGQ2003001063A75A 28,7
    12421 RIGQ2003001048A3A 28,5
    12421 RIGQ2003001050A23A 28
    12421 RIGQ2003001050A13A 26,8
    12421 RIGQ2003001048A25A 26,8
    12421 RIGQ2003001048A61A 26,1
    12421 RIGQ2003001049A46A 23,4
    12421 RIGQ2003000993A63A 21,7
    12421 RIGQ2003001049A43A 20,6
    12421 RIGQ2003001049A26A 10,5
    12421 RIGQ2003001050A18A 5,7
    Konstrukt Proben-ID Berechnete Carotinoide (μg/g)
    12422 RIGQ2003001045A30A 58,8
    12422 RIGQ2003001045A51A 54
    12422 RIGQ2003000995A29A 43,6
    12422 RIGQ2003000995A31A 43,1
    12422 RIGQ2003001043A10A 42,4
    12422 RIGQ2003001043A8A 42
    12422 RIGQ2003000995A19A 41,9
    12422 RIGQ2003000995A17A 40,9
    12422 RIGQ2003001060A23A 37,2
    12422 RIGQ2003001052A56A 35
    12422 RIGQ2003001051A75A 32
    12422 RIGQ2003001045A68A 30,6
    12422 RIGQ2003001045A86A 29,8
    12422 RIGQ2003001045A49A 29,2
    12422 RIGQ2003001060A25A 28,9
    12422 RIGQ2003001051A64A 26,4
    12422 RIGQ2003001051A34A 25,2
    12422 RIGQ200300094A7A 22,8
    12422 RIGQ2003001045A74A 20,3
    12422 RIGQ2003001051A46A 16,6
    12422 RIGQ2003000995A7A 13,8
    12422 RIGQ2003000995A26A 8,1
    12422 RIGQ2003000995A41A 6,8
    12422 RIGQ2003000995A8A 3,8
    Konstrukt Proben-ID Berechnete Carotinoide (μg/g)
    12423 RIGQ2003001097A42A 52,80
    12423 RIGQ2003001097A15A 50,40
    12423 RIGQ2003001097A41A 48,00
    12423 RIGQ2003001114A10A 44,20
    12423 RIGQ2003001099A8A 40,00
    12423 RIGQ2003001098A2A 28,80
    12423 RIGQ2003001099A42A 26,00
    12423 RIGQ2003001097A30A 24,00
    12423 RIGQ2003001186A80A 23,30
    12423 RIGQ2003001097A18A 21,60
    12423 RIGQ2003001099A60A 17,60
    12423 RIGQ2003001098A5A 17,40
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    Konstrukt Proben-ID Berechnete Carotinoide (μg/g)
    12424 RIGQ2003001121A60A 51,9
    12424 RIGQ2003001121A20A 51,8
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    12424 RIGQ2003001093A58A 27,3
    12424 RIGQ2003001118A84A 26
  • Obwohl die Erfindung mit Hilfe der oben angegebenen Beispiele und der darin angegebenen Sequenzlisten und Figuren beschrieben worden ist, ist klar, dass Modifizierungen und Veränderungen durchgeführt werden können, welche innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung bleiben. Referenzen:
    Name Datenbank Zugangs-Nr. Beschreibung Referenz
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    ZDS AF054629 Reis
  • SEQUENZLISTE
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Claims (23)

  1. Polynucleotid umfassend: (a) einen Bereich, welcher als operativ verbundene Bestandteile (i) einen Promotor, welcher eine in Samen bevorzugte Expression ermöglicht; und (ii) eine Nucleotidsequenz, die von einem Bakterium stammt, wobei die Sequenz eine Carotin-Desaturase kodiert; und (iii) einen Transkriptions-Beendigungsbereich umfasst; und (b) einen weiteren Bereich, welcher als operativ verbundene Bestandteile (i) einen Promotor, der eine in Samen bevorzugte Expression ermöglicht; und (ii) eine Nucleotidsequenz, die eine Phytoensynthase kodiert, wobei die Sequenz aus Mais (Zea sp.) oder Reis (Orzya sp.) stammt; und (iii) einen Transkriptions-Beendigungsbereich umfasst.
  2. Polynucleotid gemäß Anspruch 1, wobei die Sequenz, die die Carotin-Desaturase kodiert, aus Erwinia sp. stammt.
  3. Polynucleotid gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei der Promotor ausgewählt ist aus dem Glutelin 1-Promotor und dem Prolamin-Promotor, und der Transkriptions-Beendigungsbereich ausgewählt ist aus Nos; CaMV 35S und dem PotP1-II-Transkriptions-Beendigungsbereich.
  4. Polynucleotid gemäß irgend einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Sequenz, welche die Carotin-Desaturase kodiert, und die Sequenz, welche die Phytoen-Synthase kodiert, weiter eine Sequenz umfasst, die eine Plastid-Zielsequenz kodiert.
  5. Polynucleotid gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, welches eine Sequenz umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die in den SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 4 und 6 wiedergegeben ist.
  6. Polynucleotidsequenz, welche das Komplement einer ist, die mit einem Polynucleotid gemäß Anspruch 5 bei einer Temperatur von ungefähr 65°C in einer Lösung hybridisiert, die 6 × SSC, 0,01% SDS und 0,25% Magermilchpulver enthält, gefolgt vom Spülen bei der gleichen Temperatur in einer Lösung, die 0,2 × SSC und 0,1% SDS enthält, wobei die Polynucleotidsequenz noch einen Bereich umfasst, der eine Carotin-Desaturase kodiert und einen weiteren Bereich, welcher eine Phytoen-Synthase kodiert, und wobei, wenn die Polynucleotidsequenz in Pflanzenmaterial inseriert ist, der Samen einer Pflanze, der aus diesem Material regeneriert wird, Carotinoide in einer Konzentration von mindestens 10 μg/g des Endosperms dieses Samens produziert.
  7. Polynucleotidsequenz, welche das Komplement einer ist, die mit einem Polynucleotid gemäß Anspruch 5 bei einer Temperatur von ungefähr 65°C in einer Lösung hybridisiert, die 6 × SSC, 0,01% SDS und 0,25% Magermilchpulver enthält, gefolgt vom Spülen bei der gleichen Temperatur in einer Lösung, die 0,2 × SSC und 0,1% SDS enthält, wobei die Polynucleotidsequenz noch einen Bereich umfasst, welcher eine Carotin-Desaturase kodiert, und einen weiteren Bereich, welcher eine Phytoen-Synthase kodiert, und wenn die Polynucleotidsequenz in Pflanzenmaterial inseriert ist, Samen einer Pflanze, die aus diesem Material regeneriert ist, Carotinoide herstellen, die bis zu 80% des Carotinoidgehalts eines Samens ausmachen, welcher ein Polynucleotid umfasst, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die in SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 4, 5 und 6 wiedergegeben ist.
  8. Polynucleotidsequenz gemäß irgendeinem der Ansprüche 6 bis 7, wobei der Samen ein Reissamen ist.
  9. Polynucleotid oder eine Polynucleotidsequenz gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, welche ferner einen Bereich umfasst, welcher einen selektierbaren Marker kodiert.
  10. Polynucleotid oder eine Polynucleotidsequenz gemäß Anspruch 9, wobei der selektierbare Marker das Mannose-6-phosphatisomerase-Gen umfasst.
  11. Polynucleotid oder Polynucleotidsequenz gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10, welche für die Expression in einer besonderen Pflanzenspezies Kodon-optimiert sind.
  12. Polynucleotid oder Polynucleotidsequenz gemäß Anspruch 11, wobei die Pflanzenart Reis ist (Orzya sp.).
  13. Vektor umfassend ein Polynucleotid oder eine Polynucleotidsequenz gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 12.
  14. Verfahren zur Erhöhung des Carotinoidgehalts von Samen, welches das Inserieren eines Polynucleotids oder einer Polynucleotidsquenz gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 12 oder eines Vektors gemäß Anspruch 13 umfasst; und Regenerieren einer samenhaltigen Pflanze aus diesem Material sowie das Identifizieren der Samen, die Carotinoide in größeren Konzentrationen als die der Kontrollsamen enthalten.
  15. Verfahren zum Erhöhen des Carotinoidgehalts eines Samens, welches das Inserieren eines Polynucleotids in Pflanzenmaterial umfasst, welches eine Sequenz umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die in SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 4, 5 und 6 wiedergegeben ist, und Regenerieren einer samenhaltigen Pflanze aus diesem Material und Identifizieren der Samen, welche Carotinoide in Konzentrationen enthalten, die größer sind als die der Kontrollsamen.
  16. Verfahren gemäß Anspruch 14 oder Anspruch 15, wobei diese Samen mindestens einen 60-fachen Anstieg an Carotinoiden enthalten, wenn sie mit einem Kontrollsamen verglichen werden.
  17. Verfahren gemäß Anspruch 14 oder Anspruch 15, wobei dieser Samen Carotinoide in einer Konzentration von mindestens 10 μg/g des Endosperms dieses Samens enthält.
  18. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 14 bis 17, wobei diese Carotinoide ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: Lycopen, Alpha-Carotin, Lutein, Beta-Carotin, Zeanthin, Antheraxanthin, Violaxanthin und Neoxanthin oder einer Kombination daraus.
  19. Eine Pflanze oder Pflanzenmaterial, welche ein Polynucleotid oder eine Polynucleotidsequenz gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 12 oder einen Vektor gemäß Anspruch 13 umfassen.
  20. Eine Pflanze oder Pflanzenmaterial gemäß Anspruch 19, welche eine Reispflanze oder Reispflanzenmaterial sind.
  21. Eine Pflanze oder Pflanzenmaterial gemäß Anspruch 19, welche eine Maispflanze oder Maispflanzenmaterial sind.
  22. Verwendung eines Polynucleotids oder einer Polynucleotidsequenz gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 12 oder eines Vektors gemäß Anspruch 13 in einem Verfahren zur Herstellung von Samen, welche mehr Carotinoide enthalten.
  23. Verwendung eines Polynucleotids ausgewählt aus der Gruppe, die in SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 4, 5 und 6 wiedergegeben ist, zur Herstellung eines Samens, welcher Carotinoide in größeren Konzentrationen als die in Kontrollsamen enthält.
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