DE10030647A1 - Veränderung des Gehalts an Feinchemikalien in Organismen durch genetische Veränderung des Shikimatweges - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Feinchemikalien, insbesondere Vitamin E, Vitamin K und Ubichinon durch Kultivierung von Organismen, insbesondere Pflanzen, die gegenüber dem Wildtyp einen genetisch veränderten Shikimatweg aufweisen sowie die transgenen Organismen selbst.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein verfahren zur Herstellung von Feinchemikalien, insbesondere Vitamin E, Vitamin K und/oder Ubichinon durch Kultivierung von Organismen, insbesondere Pflanzen, die gegenüber dem Wildtyp einen genetisch veränderten Shikimatweg aufweisen, sowie die transgenen Organismen selbst.

Organismen, insbesondere Pflanzen, weisen eine Reihe von Stoff­ wechselprodukten auf, die als Feinchemikalien einen hohen wirt­ schaftlichen Wert haben. Als Feinchemikalien sind beispielsweise aromatische Aminosäuren, Salicylsäurederivate, Phenylpropanoide, Flavonoide, Stilbene, Xanthone und Chinone, insbesondere die gemischten Prenyllipid-Verbindungen mit Vitamin E oder Vitamin K Aktivität zu nennen.

In biotechnologischen Verfahren zur Herstellung von Fein­ chemikalien werden Organismen, die in der Lage sind diese Feinchemikalien herzustellen, kultiviert und die gewünschten Feinchemikalien aus den Organismen isoliert.

Für wirtschaftliche Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von Feinchemikalien, aber auch für die Verwendung der Organismen als prozessierte oder nicht prozessierte Lebens- oder Futter­ mittel, ist es wünschenswert, den Gehalt an Feinchemikalien in den Organismen gezielt zu verändern, wie beispielsweise den Gehalt der gewünschten Feinchemikalie zu erhöhen und/oder den Metabolitfluß zu nicht gewünschten Feinchemikalien zu hemmen.

Wirtschaftlich bedeutende Feinchemikalien sind beispielsweise Plastochinone, Ubichinone sowie Verbindungen mit Vitamin E- oder Vitamin K-Aktivität, die eine Isoprenoid-Seitenkette aufweisen, die mit einem aromatischen Kern verbunden ist.

Die in der Natur vorkommenden acht Verbindungen mit Vitamin E- Aktivität sind Derivate des 6-Chromanols (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A 27 (1996), VCH Verlagsgesell­ schaft, Chapter 4., 478-488, Vitamin E). Die Gruppe der Toco­ pherole (1a-d) weist eine gesättigte Seitenkette auf, die Gruppe der Tocotrienole (2a-d) eine ungesättigte Seitenkette:

1a, α-Tocopherol: R¹ = R² = R³ = CH₃
1b, β-Tocopherol: R¹ = R³ = CH₃, R² = H
1c, γ-Tocopherol: R¹ = H, R² = R³ = CH₃
1d, δ-Tocopherol: R¹ = R² = H, R³ = CH₃

2a, α-Tocotrienol: R¹ = R² = R³ = CH₃
2b, β-Tocotrienol: R¹ = R³ = CH₃, R² = H
2c, γ-Tocotrienol: R¹ = H, R² = R³ = CH₃
2d, δ-Tocotrienol: R¹ = R² = H, R³ = CH₃

In der vorliegenden Erfindung werden unter Vitamin E alle vor­ stehend erwähnten Tocopherole und Tocotrienole mit Vitamin-E- Aktivität verstanden.

Diese Verbindungen mit Vitamin-E-Aktivität sind wichtige natür­ liche fett-lösliche Antioxidantien. Ein Mangel an Vitamin E führt bei Menschen und Tieren zu pathophysiologischen Situationen. Vitamin E-Verbindungen haben daher einen hohen wirtschaftlichen Wert als Zusatzstoffe im Food- und Feed-Bereich, in pharma­ zeutischen Formulierungen und in kosmetischen Anwendungen.

Die in der Natur vorkommenden Verbindungen mit Vitamin K-Aktivi­ tät sind Derivate des 1,4-Naphthochinons (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A 27 (1996), VCH Verlagsgesell­ schaft, Chapter 5., 488-506, Vitamin K).

Phyllochinon (frühere Bezeichnung: Vitamin K1) weist eine größten­ teils gesättigte Seitenkette auf, während die Gruppe der Mena­ chinone-n (frühere Bezeichnung: Vitamin K2) eine ungesättigte Seitenkette mit 4 bis 13 Isoprenylresten aufweist.

In der vorliegenden Erfindung werden unter Vitamin K alle Ver­ bindungen mit Vitamin K-Aktivität verstanden, insbesondere die vorstehend erwähnten Verbindungen.

Ausgangspunkt der Biosynthese der Isoprenoidseitenkette ist Iso­ pentenylpyrophosphat (IPP). IPP steht im Gleichgewicht mit seinem Isomer Dimethylallyl Pyrophosphat (DMAPP). Eine Kondensation von IPP mit DMAPP in Kopf-Schwanz Anlagerung ergibt das Monoterpen (C10) Geranyl-Pyrophosphat (GPP). Die Addition von weiteren IPP Einheiten führt zum Sesquiterpen (C15) Farnesy-Pyrophosphat (FPP) und zum Diterpen (C20) Geranyl-Geranyl-Pyrophosphat (GGPP).

Phyllochinon enthält eine C20 Phytyl-Kette, in der nur die erste Isopren-Einheit eine Doppelbindung enthält. GGPP wird durch die Geranylgeranyl-Pyrophosphat-Oxidoreduktase (GGPPOR) zum Phytyl- Pyrophosphat (PPP) umgeformt, dem Ausgangsstoff für die weitere Bildung von Tocopherolen.

Bei den Ringstrukturen der gemischten Prenyllipide, die zur Bildung der Vitamine E und K führen, handelt es sich um Chinone, deren Ausgangsmetabolite aus dem Shikimat-Weg stammen.

Chorismat wird ausgehend von Erythrose-4-Phosphat und Phos­ phoenolpyruvat (PEP) durch deren Kondensation zu 3-deoxy-D- Arabino-heptulosonat-7-Phosphat (DAHP) über die Zwischenstufen 3'-Dehydroquinat, 3'-Dehydroshikimat, Shikimat, Shikimat-3- Phosphat und 5'-Enolpyruvylshikimat-3-Phosphat gebildet. Dabei wird das Erythrose-4-Phosphat vom Calvinzyklus gebildet und das PEP von der Glykolyse bereitgestellt.

In höheren Pflanzen wird Tyrosin ausgehend von Chorismat über Prephenate und Arogenat gebildet. Die aromatische Aminosäure Tyrosin wird in Hydroxyphenyl-Pyruvat umgewandelt, welches durch Dioxygenierung in Homogentisinsäure überführt wird.

Unter Shikimatweg wird in der vorliegenden Erfindung, ins­ besondere für höhere Pflanzen der vorstehend beschriebene Bio­ syntheseweg ausgehend von D-Erythrose-4-Phosphat über Shikimat, Chorismat, Prephenat, Arogenat, Tyrosin bis einschließlich zu 4-Hydroxyphenylpyruvat verstanden (G. Michal, Biochemical Pathways, Biochemie-Atlas, Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, Berlin, 1999, Seite 59 bis 60, Abb. 4.7-1 und Kapitel 4.7.1).

Die Homogentisinsäure wird anschließend an Phytylpyrophosphat (PPP) bzw. Geranylgeranylpyrophosphat gebunden, um die Vorläufer von α-Tocopherol und α-Tocotrienol, das 2-Methyl-6-phytylhydro­ chinon bzw. das 2-Methyl-6-geranylgeranylhydrochinon zu bilden. Durch Methylierungsschritte mit S-Adenosylmethionin als Methyl- Gruppen-Donor entsteht zunächst 2,3-Dimethyl-6-phytylquinol, dann durch Zyklisierung γ-Tocopherol und durch nochmalige Methylierung α-Tocopherol.

Es ist bekannt, durch Überexpression bzw. Herunterregulation von Biosynthesegenen des Tocopherolbiosyntheseweges, unter dem in der vorliegenden Erfindung der Biosyntheseweg von Hydroxyphenyl­ pyruvat bis Tocopherol verstanden wird, den Gehalt an Vitamin E in Pflanzen zu modifizieren.

WO 97/27285 beschreibt eine Modifikation des Tocopherol-Gehaltes durch verstärkte Expression bzw. durch Herunterregulation des Enzyms p-Hydroxyphenylpyruvatdioxygenase (HPPD).

WO 99/04622 bzw. D. Della Penna et al., Science 1998, 282, 2098-2100 beschreiben Gensequenzen codierend für eine γ-Toco­ pherolmethyltransferase aus Synechocystis PCC6803 und Arabidopsis thaliana und deren Einbau in transgene Pflanzen, die einen modifizierten Vitamin E-Gehalt aufweisen.

Ferner ist bekannt, durch Überexpression bzw. Herunterregulation von Biosynthesegenen des Biosyntheseweges der Isoprenoid-Seiten­ kette, den Gehalt an Vitamin E in Pflanzen zu modifizieren.

WO 99/23231 zeigt, daß die Expression einer Geranylgeranyl- Reductase in transgenen Pflanzen eine gesteigerte Tocopherol­ biosynthese zur Folge hat.

WO 00/08169 beschreibt Gensequenzen codierend eine 1-Deoxy-D-Xylose-5-Phosphat-Synthase und eine Geranyl-Geranyl- Pyrophosphat Oxidoreduktase und deren Einbau in transgene Pflanzen, die einen modifizierten Vitamin E-Gehalt aufweisen.

Alle diese Methoden liefern zwar Organismen, insbesondere Pflanzen, die einen modifizierten Gehalt an der Feinchemikalie Vitamin E aufweisen, dennoch ist oft die Höhe des Gehalts an Vitamin E für Verfahren zur Herstellung von Vitamin E durch Isolierung aus diesen transgenen Organismen noch nicht zufrieden­ stellend.

Weitere Nachteile dieser Methoden sind, daß häufig nur der Gehalt der Tocopherole und Tocotrienole verschoben wird, jedoch keine Erhöhung des Gesamt-Vitamin-E-Gehalts in Pflanzen erreicht wird.

Der Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde ein weiteres Ver­ fahren zur Herstellung von Feinchemikalien durch Kultivieren von Organismen, bzw. transgene Organismen die Feinchemikalien her­ stellen können, mit optimierten Eigenschaften zur Verfügung zu stellen, die die geschilderten Nachteile des Standes der Technik nicht aufweisen.

Demgemäß wurde ein Verfahren zur Herstellung von Feinchemikalien gefunden, indem man Organismen kultiviert, die gegenüber dem Wildtyp einen genetisch veränderten Shikimatweg aufweisen.

Unter Feinchemikalien werden Stoffwechselprodukte des Organismus verstanden, die aus dem Shikimatweg resultieren. Der Shikimatweg beginnt dabei bei D-Erythrose-4-Phosphat und endet bei 4-Hydroxy­ phenylpyruvat, wie vorstehend beschrieben. Für diese Stoff­ wechselprodukte stellen die Ausgangsverbindung D-Erythrose-4- Phosphat, die Endverbindung 4-Hydroxyphenylpyruvat sowie alle, vorstehend erwähnten, Zwischenstufen des Shikimatweges, die Ausgangsverbindungen, nachstehend auch Zwischenverbindungen bezeichnet, dar, die biosynthetisch vom Organismus in die Stoff­ wechselprodukte umgewandelt werden.

Vorzugsweise wird in der vorliegenden Erfindung unter Shikimat­ weg der Stoffwechselweg von Shikimat bis 4-Hydroxyphenylpyruvat, besonders bevorzugt der Stoffwechselweg von Chorismat bis 4-Hydroxyphenylpyruvat verstanden, wobei für Pflanzen der Stoffwechselweg ab Chorismat über Prephenat, Arogenat und Tyrosin verläuft.

Bevorzugte Feinchemikalien sind die aromatischen Aminosäuren, wie beispielsweise Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan, Salicyl­ säurederivate, Folsäurederivate, Phenylpropanoide, wie beispiels­ weise Lignin, Lignane oder Coumarine, insbesondere Scopoletin oder Scopolin, Flavonoide, wie beispielsweise Chalcone, Flava­ none, Flavanole, Anthocyanidine oder Isoflavonoide, Stilbene, Xanthone, oder Chinonderivate, wie beispielsweise Vitamin E, Vitamin K, Ubichinone, Plastochinone oder Shikonin.

Besonders bevorzugte Feinchemikalien sind Vitamin E, Vitamin K oder Ubichinon, insbesondere Vitamin E.

Je nachdem ob die genetische Veränderung des Shikimatweges zu einer Erhöhung oder Erniedrigung des Metabolitflusses zu einer bestimmten Zwischenverbindung - die Teil des Shikimatweges ist - führt, erhöht sich bzw. erniedrigt sich der Gehalt der Fein­ chemikalie die biosynthetisch im Organismus aus dieser Zwischen­ verbindung hergestellt wird.

Genetische Veränderung des Shikimatweges die zu einer Erhöhung des Metabolitflusses zu einer Zwischenverbindung und damit der entsprechenden Feinchemikalie führen, sind beispielsweise
die Überexpression eines Stoffwechselgens des Shikimatweges und damit die Erhöhung der entsprechenden Enzymaktivität, die zu dieser Zwischenverbindung führt,
das Ausschalten von negativen Regulationsmechanismen von zur Zwischenverbindung führenden Stoffwechselwegen, wie beispiels­ weise das Ausschalten der Feedback-Inhibierung oder das Ein­ bringen von orthologen Genen die im gewünschten Organismus keiner Regulation unterliegen,
die Inaktivierung von Genen die Enzyme kodieren, die mit den Enzymen des Stoffwechselwegs, der zum gewünschten Produkt führt, konkurrieren oder
die Expression eines Gens zu dem der Wildtyp kein orthologes Gen aufweist. Dieses Gen kann beispielsweise den Stoffwechselweg des Shikimatweges des Wildtyps überbrücken und durch die neue Gen­ funktion eine Erhöhung des Stofflusses zu der Zwischenverbindung bewirken, bei der die Überbrückung endet.

Genetische Veränderung des Shikimatweges die zu einer Erniedri­ gung des Metabolitflusses zu einer Zwischenverbindung und damit der entsprechenden Feinchemikalie führen, sind beispielsweise
die Überexpression eines Stoffwechselgens des Shikimatweges und damit die Erhöhung der entsprechenden Enzymaktivität, die von dieser Zwischenverbindung wegführt,
die Inaktivierung von Genen die Enzyme kodieren, die zu dieser Zwischenverbindung führen oder
die Expression eines Gens zu dem der Wildtyp kein orthologes Gen aufweist. Dieses Gen kann beispielsweise den Stoffwechselweg des Shikimatweges des Wildtyps überbrücken und durch die neue Gen­ funktion eine Erniedrigung des Stofflusses zu den überbrückten Zwischenverbindungen bewirken.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens führt die genetische Veränderung des Shikimatweges im Organismus zu einer Erhöhung des Metabolitflusses zu einer Zwischenverbindung und damit der entsprechenden gewünschten Feinchemikalie.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungs­ gemäßen Verfahrens erfolgt die genetische Veränderung des Shikimatweges im Organismus durch die Expression eines Gens zu dem der Wildtyp kein orthologes Gen aufweist. Dieses Gen codiert ein Enzym, daß den Stoffwechselweg des Shikimatweges des Wildtyps überbrücken kann und durch die neue enzymatische Aktivität eine Erhöhung des Stofflusses zu der Zwischenverbindung bewirkt, bei der die Überbrückung endet. Diese neue enzymatische Aktivität unterliegt keiner Regulation durch den Organismus, schließt also den Stoffwechselweg kurz um beispielsweise limitierende Regulationsstellen im Stoffwechsel zu umgehen. Dadurch ist es möglich, den Metabolitfluß zu limitierenden Substanzen von vor­ handenen Regulationen zu entkoppeln.

Dementsprechend betrifft die Erfindung vorzugsweise das vor­ stehend beschriebene, erfindungsgemäße Verfahren, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man den Shikimatweg des Organismus gegenüber dem Wildtyp durch Einbringen mindestens eines Gens verändert, zu dem der Wildtyp kein orthologes Gen aufweist.

Weiterhin betrifft die Erfindung insbesondere das vorstehend beschriebene erfindungsgemäße Verfahren, dadurch gekennzeichnet, daß man durch das mindestens eine eingebrachte Gen den Stoff­ wechselweg des Shikimatweges des Wildtyps überbrückt.

Unter einem zum Wildtyp orthologen Gen wird ein Gen verstanden, daß aus einem anderen Organismus stammt, wobei die Enzymaktivität die das Gen kodiert bereits im Wildtyp vorhanden ist.

Dementsprechend wird unter der Formulierung "Gen, zu dem der Wildtyp kein orthologes Gen aufweist" ein Gen aus einem anderen Organismus verstanden, wobei die Enzymaktivität die das Gen kodiert vor der Transformation im Wildtyp nicht vorhanden oder nicht aktiviert war.

Unter Organismen werden prokaryontische Organismen oder eukaryontische Organismen, wie beispielsweise Bakterien, Hefen, Algen, Moose, Pilze oder Pflanzen, verstanden, die in der Lage sind, als Wildtyp oder durch genetische Veränderung die vor­ stehend erwähnten Feinchemikalien herzustellen. Bevorzugte Organismen sind photosynthetisch aktive Organismen, wie bei­ spielsweise Cyanobakterien, Moose, Algen oder Pflanzen, die bereits als Wildtyp in der Lage sind, die vorstehend erwähnten Feinchemikalien herzustellen.

Besonders bevorzugte Organismen sind Pflanzen.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungs­ gemäßen Verfahrens verwendet man deshalb Pflanzen als zu transformierende Organismen. In diesem Fall eignen sich für das erfindungsgemäße Verfahren beispielsweise bakterielle Gene als Gene zu denen die Pflanze kein orthologes Gen aufweist.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Ver­ fahrens wird der Stoffwechselweg des Shikimatweges der Pflanze durch das mindestens eine eingebrachte Gen überbrückt.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungs­ gemäßen Verfahrens bringt man eine Nukleinsäure, codierend eine Chorismatmutase-Prephenatdehydrogenase, im folgenden auch tyrA genannt, oder eine Prephenatdehydrogenase in eine Pflanze ein. Für die bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Ver­ fahrens eignen sich alle Gene die eine Chorismatmutase-Prephenat­ dehydrogenase oder eine Prephenatdehydrogenase kodieren.

In einer insbesondere bevorzugten Ausführungsform des erfindungs­ gemäßen Verfahrens bringt man eine Nukleinsäure, codierend eine Chorismatmutase-Prephenatdehydrogenase in eine Pflanze ein. Da in den Pflanzen aber in der Regel die enzymatische Aktivität einer Chorismatmutase bereits vorhanden ist, ist diese Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens auch durch Einbringen einer Nukleinsäure, die eine Prephenatdehydrogenase codiert, ausführ­ bar.

Beispiele für Nukleinsäuren, die eine Prephenatdehydrogenase codieren und im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können sind die bekannten und beispielsweise in Datenbanken im Internet zugänglichen Prephenatdehydrogenasegene aus Lactococcus lactis (Accession X78413), Synechocystis spec PCC 6803 (slr2081), Deinococcus radiodurans (AAF10695) oder Bacillus subtilis (P20692). Weitere Beispiele können durch Vergleich der Homologien der Sequenzen mit diesen bekannten Prephenatdehydrogenasegenen gefunden werden, wie beispielsweise die potentiellen Prephenat­ dehydrogenase aus Termotoga maitima (AAD35430) oder Heliobacter pylori 26695 (Accession AAD08422).

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Ver­ fahren unter Verwendung eines Prephenatdehydrogenasegens bringt man man eine Nukleinsäure ein, die ein Protein kodiert, ent­ haltend die Aminosäuresequenz der Prephenatdehydrogenase aus Synechocystis spec PCC 6803 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Homologie von mindestens 30%, vorzugsweise mindestens 50%, bevorzugter mindestens 70%, besonders bevorzugt mindestens 90% auf Aminosäureebene mit der Sequenz der Pre­ phenatdehydrogenase aus Synechocystis spec PCC 6803 und die enzymatische Eigenschaft Prephenatdehydrogenase aufweist.

Es ist jedoch vorteilhaft, gegebenenfalls in Kombination mit der erfindungsgemäßen Überbrückung des Stoffwechselweges weitere Enzyme des Shikimatweges überzuexprimieren, um einen erhöhten Metabolitfluß zu den gewünschten Feinchemikalien zu erreichen.

Da das tyrA-Gen, ein Protein codiert, daß sowohl die enzymatischen Eigenschaften einer Chorismatmutase als auch einer Prephenatdehydrogenase aufweist, wird durch Einbringen einer Nukleinsäure eine enzymatische Aktivität überexprimiert, bzw. eine enzymatische Aktivität eingebracht, die keiner Regulation unterliegt (Chorismatmutase) und eine orthologe enzymatische Eigenschaft (Prephenatdehydrogenase) neu eingeführt.

Unter einer Chorismatmutase-Prephenatdehydrogenase wird ein Enzym verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, Chorismat über Prephenat in 4-Hydroxyphenylpyruvat umzuwandeln.

Unter einer Chorismatmutase-Prephenatdehydrogenase werden weiterhin auch zwei Enzyme verstanden, wobei das eine Enzym die Aktivität einer Chorismatmutase und das andere Enzym die Aktivität einer Prephenatdehydrogenase aufweist. Für diese Aus­ führungsform ist es notwendig, zwei verschiedene Nukleinsäuren, die jeweils eines dieser Enzyme kodieren, in die Pflanze ein­ zubringen.

Unter einer Chorismatmutase wird ein Enzym verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, Chorismat in Prephenat umzuwandeln.

Unter einer Prephenatdehydrogenase wird ein Enzym verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, Prephenat in 4-Hydroxy­ phenylpyruvat umzuwandeln.

Wie vorstehend ausgeführt, bringt man in einer insbesondere bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens mindestens eine Nukleinsäure, codierend eine Chorismatmutase- Prephenatdehydrogenase (tyrA) in eine Pflanze ein.

Abb. 1 zeigt beispielsweise das Biosyntheseschema ausgehend von Erythrose-4-Phosphat zu den Tocopherolen. Durch die zusätz­ liche Expression des tyrA-Gens wird der Shikimatweg des Wildtyps genetisch verändert und der Metabolitfluß zu Hydroxyphenylpyruvat erhöht. Das nun vermehrt zur Verfügung stehende Hydroxyphenylpy­ ruvat wird weiter in Richtung Tocopherole umgesetzt. Ein erhöhter Gehalt an Hydroxyphenylpyruvat kann auch zu einer erhöhten Umsetzung Richtung Tocotrienole und/oder Vitamin K führen.

In einer weiter besonders bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahren bringt man eine Nukleinsäure ein die ein Protein kodiert, enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO. 2 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Homologie von mindestens 30%, vorzugsweise mindestens 50%, bevorzugter mindestens 70%, besonders bevorzugt mindestens 90% auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO. 2 und die enzymatische Eigenschaft einer Chorismatmutase-Prephenatdehydro­ genase (tyrA) aufweist.

Die Nukleinsäure kann beispielsweise eine RNA-, DNA- oder cDNA- Sequenz sein.

Das Protein mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO. 2 stellt die Chorismatmutase-Prephenatedehydrogenase (tyrA) aus E. coli K12 dar.

Weitere bevorzugte Beispiele für Chorismatmutase-Prephenat­ dehydrogenasen bzw. die codierenden Nukleinsäuren, die erfindungsgemäß verwendet werden können sind beispielsweise die Chorismatmutase-Prephenatdehydrogenasegene aus Erwinia herbicola (Accession X60420; dieses Protein kann durch Deletion eins 109 Bp Bereiches am 5'Ende auch in eine monofunktionelle Prephenat­ dehydrogenase umgewandelt werden und dann beispielsweise wie vor­ stehend beschrieben als Prephenatdehydrogenase verwendet werden) oder Bordetella bronchiseptica (Accession AAF01289) oder lassen sich beispielsweise aus verschiedenen Organismen deren genomische Sequenz bekannt ist durch Homologievergleiche der Aminosäure­ sequenzen oder der entsprechenden rückübersetzten Nuklein­ säuresequenzen aus Datenbanken mit der SEQ ID. NO. 2 oder den anderen vorstehend beschriebenen Sequenzen leicht auffinden, wie beispielsweise die potentielle Chorismatmutase-Prephenatde­ hydrogenasegene aus Methanococcus janaschii (Accession Q58029).

Unter Substitution ist der Austausch einer oder mehrerer Amino­ säuren durch eine oder mehrere Aminosäuren zu verstehen. Bevor­ zugt werden sog. konservative Austausche durchgeführt, bei denen die ersetzte Aminosäure eine ähnliche Eigenschaft hat wie die ursprüngliche Aminosäure, beispielsweise Austausch von Glu durch Asp, Gln durch Asn, Val durch Ile, Leu durch Ile, Ser durch Thr.

Deletion ist das Ersetzen einer Aminosäure durch eine direkte Bindung. Bevorzugte Positionen für Deletionen sind die Termini des Polypeptides und die Verknüpfungen zwischen den einzelnen Proteindomänen.

Insertionen sind Einfügungen von Aminosäuren in die Polypeptid­ kette, wobei formal eine direkte Bindung durch ein oder mehrere Aminosäuren ersetzt wird.

Unter Homologie zwischen zwei Proteinen wird die Identität der Aminosäuren über die jeweils gesamte Proteinlänge verstanden, vorzugsweise die Identität die durch Vergleich mit Hilfe des Programmalgorithmus GAP (UWGCG, University of Wisconsin, Genetic Computer Group) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird:
Gap Weight: 12
Length Weight: 4
Average Match: 2,912
Average Mismatch: -2,003

Unter einem Protein, das eine Homologie von mindestens 30% auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO. 2 aufweist, wird dementsprechend ein Protein verstanden, das bei einem Ver­ gleich seiner Sequenz mit der Sequenz SEQ ID NO. 2, vorzugsweise nach obigen Programmalgorithmus mit obigem Parametersatz eine Homologie von mindestens 30% aufweist.

Weitere geeignete Nukleinsäuresequenzen sind durch Rücküber­ setzung der Polypeptidsequenz gemäß dem genetischen Code erhält­ lich.

Bevorzugt werden dafür solche Codons verwendet, die entsprechend der Organismus spezifischen codon usage häufig verwendet werden. Die codon usage läßt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene des betreffenden Organismus leicht ermitteln.

Soll das Protein beispielsweise in einer Pflanze exprimiert werden, so ist es häufig vorteilhaft, die codon usage der Pflanze bei der Rückübersetzung zu verwenden.

Weiter bevorzugte Nukleinsäuren codieren eine tyrA aus Bakterien.

Eine besonders bevorzugte Nukleinsäure hat die Sequenz SEQ ID NO. 1. Diese Nukleinsäure stellt eine prokaryontische genomische DNA aus E. Coli K12 dar, die die tyrA der Sequenz SEQ ID NO. 2 codiert.

Im erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von Fein­ chemikalien wird vorzugsweise dem Kultivierungsschritt der transgenen Organismen ein Ernten der Organismen und ein Iso­ lieren der Feinchemikalien aus den Organismen angeschlossen.

Das Ernten der Organismen erfolgt in an sich bekannter Weise dem jeweiligen Organismus entsprechend. Mikroorganismen, wie Bakterien, Moose, Hefen und Pilze oder Pflanzenzellen, die durch Fermentation in flüssigen Nährmedien kultiviert werden, können beispielsweise durch Zentrifugieren, Dekantieren oder Filtrieren abgetrennt werden. Pflanzen werden in an sich bekannter Weise auf Nährböden gezogen und entsprechend geerntet.

Die Isolierung der Feinchemikalien aus der geernteten Biomasse erfolgt in an sich bekannter Weise, beispielsweise durch Extraktion und gegebenenfalls weiterer chemische oder physika­ lischer Reinigungsprozesse, wie beispielsweise Fällungsmethoden, Kristallographie, thermische Trennverfahren, wie Rektifizier­ verfahren oder physikalische Trennverfahren, wie beispielsweise Chromatographie.

Die Isolierung von Vitamin E aus Ölhaltigen Pflanzen er­ folgt beispielsweise bevorzugt durch chemische Umwandlung und Destillation aus Pflanzenölen oder aus den bei der Desodorierung pflanzlicher Öle anfallenden Wasserdampfdestillate (Dämpfer­ kondensate).

Weitere Isolierverfahren von Vitamin E aus Dämpferkondensaten sind beispielsweise in DE 31 26 110 A1, EP 171 009 A2, GB 2 145 079, EP 333 472 A2 und WO 94/05650 beschrieben.

Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung der vorstehend beschriebenen Nukleinsäuren, die eine tyrA oder Prephenatde­ hydrogenase codieren oder die tyrA oder Prephenatdehydrogenase selbst zur Herstellung von transgenen Pflanzen.

Vorzugsweise weisen diese transgenen Pflanze gegenüber dem Wildtyp einen erhöhten Gehalt an Feinchemikalien, insbesondere an Ubichinon, Vitamin E und/oder Vitamin K auf.

Es ist bekannt, daß Pflanzen mit einem hohen Vitamin-E-Gehalt eine erhöhte Resistenz gegenüber ablotischem Streß aufweisen. Unter abiotischem Streß wird beispielsweise Kälte, Frost, Trockenheit, Hitze und Salz verstanden.

Daher betrifft die Erfindung weiterhin die Verwendung der vor­ stehend erwähnten Nukleinsäuren zur Herstellung transgener Pflanzen, die gegenüber dem Wildtyp eine erhöhte Resistenz gegenüber abiotischem Streß aufweisen.

Die nachstehenden Erläuterungen beziehen sich auf die bevorzugte Ausführungsform der Verwendung eines tyrA-Gens, sind aber nicht auf tyrA beschränkt sondern analog auf alle erfindungsgemäß ver­ wendbaren Nukleinsäuren übertragbar.

Die vorstehend beschriebenen tyrA-Proteine und tyrA-Gene können zur Herstellung von Feinchemikalien in transgenen Organismen, vorzugsweise zur Herstellung von Vitamin E, Vitamin K und/oder Ubichinon in transgenen Pflanzen verwendet werden.

Die Herstellung der transgenen Organismen, insbesondere Pflanzen erfolgt durch Transformation der Organismen, insbesondere Pflanzen, mit einem das tyrA-Gen enthaltenden Nukleinsäure­ konstrukt.

Vorzugsweise enthält dieses Nukleinsäurekonstrukt eine Expressionskassette, die die Expression des tyrA-Gens in dem Wirtsorganismus, insbesondere in Pflanzen gewährleistet. Dementsprechend betrifft die Erfindung ferner ein Nukleinsäure­ konstrukt, enthaltend eine, vorstehend beschriebene Nukleinsäure, codierend für eine tyrA, die mit einem oder mehreren Regulations­ signalen funktionell verknüpft sind, die die Transkription und Translation im Wirtsorganismus, insbesondere in Pflanzen gewähr­ leisten.

Zur Insertion in eine Expressionskassette geeignete kodierende Sequenzen sind, wie vorstehend beschrieben, beispielsweise solche, die für eine Chorismatmutase-Prephenatdehydrogenase kodieren und die dem Wirtsorganismus die Fähigkeit zur Erhöhung des Gehalts an Feinchemikalien, insbesondere von Vitamin E, Vitamin K oder Ubichinon verleihen.

Die Expressionskassetten beinhalten außerdem regulative Nuklein­ säuresequenzen, welche die Expression der kodierenden Sequenz in der Wirtszelle steuern. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt eine Expressionskassette stromaufwärts, d. h. am 5'-Ende der kodierenden Sequenz, einen Promotor und stromabwärts, d. h. am 3'-Ende, ein Polyadenylierungssignal und gegebenenfalls weitere regulatorische Elemente, welche mit der dazwischenliegenden kodierenden Sequenz für das tyrA-Gen operativ verknüpft sind. Unter einer operativen Verknüpfung versteht man die sequenzielle Anordnung von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und ggf. weiterer regulativer Elemente derart, daß jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann.

Im folgenden werden beispielhaft die bevorzugten Nukleinsäure­ konstrukte, Expressionskassetten für Pflanzen und Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen beschrieben.

Die zur operativen Verknüpfung bevorzugten aber nicht darauf be­ schränkten Sequenzen sind Targeting-Sequenzen zur Gewährleistung der subzellulären Lokalisation im Apoplasten, in der Vakuole, in Plastiden, im Mitochondrium, im Endoplasmatischen Retikulum (ER), im Zellkern, in Ölkörperchen oder anderen Kompartimenten und Translationsverstärker wie die 5'-Führungssequenz aus dem Tabak- Mosaik-Virus (Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15 (1987), 8693-8711).

Beispielhaft kann die pflanzliche Expressionskassette in ein Derivat des Transformationsvektors pBin-19 mit 35 s Promotor (Bevan, M., Nucleic Acids Research 12: 8711-8721 (1984)) ein­ gebaut werden. Abb. 2 zeigt ein Derivat des Transformations­ vektors pBin-19 mit samenspezifischem Legumin B4-Promotor.

Als Promotoren der Expressionskassette ist grundsätzlich jeder Promotor geeignet, der die Expression von Fremdgenen in Pflanzen steuern kann. Vorzugsweise verwendet man insbesondere einen pflanzlichen Promotor oder einen Promotor, der einem Pflanzen­ virus entstammt. Insbesondere bevorzugt ist der CaMV 35S-Promotor aus dem Blumenkohl-Mosaik-Virus (Franck et al., Cell 21 (1980), 285-294). Dieser Promotor enthält bekanntlich unterschiedliche Erkennungssequenzen für transkriptionale Effektoren, die in ihrer Gesamtheit zu einer permanenten und konstitutiven Expression des eingeführten Gens führen (Benfey et al., EMBO J. 8 (1989), 2195-2202).

Die Expressionskassette kann auch einen chemisch induzierbaren Promotor enthalten, durch den die Expression des exogenen tyrA- Gens in der Pflanze zu einem bestimmten Zeitpunkt gesteuert werden kann. Derartige Promotoren wie z. B. der PRP1-Promotor (Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993), 361-366), ein durch Salizylsäure induzierbarer Promotor (WO 95/19443), ein durch Benzenesulfonamid-induzierbarer (EP-A 388186), ein durch Tetra­ zyklin-induzierbarer (Gatz et al., (1992) Plant J. 2, 397-404), ein durch Abscisinsäure-induzierbarer (EP-A 335528) bzw. ein durch Ethanol- oder Cyclohexanon-induzierbarer (WO 93/21334) Promotor können u. a. verwendet werden.

Weiterhin sind insbesondere solche Promotoren bevorzugt, die die Expression in Geweben oder Pflanzenteilen sicherstellen, in denen beispielsweise die Biosynthese der entsprechenden Feinchemika­ lien, insbesondere Vitamin E bzw. dessen Vorstufen stattfindet. Insbesondere zu nennen sind Promotoren, die eine blattspezifische Expression gewährleisten. Zu nennen sind der Promotor der cyto­ solischen FBPase aus Kartoffel oder der ST-LSI Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989), 2445-245).

Mit Hilfe eines samenspezifischen Promotors konnte ein Fremd­ protein stabil bis zu einem Anteil von 0,67% des gesamten löslichen Samenproteins in den Samen transgener Tabakpflanzen exprimiert werden (Fiedler und Conrad, Bio/Technology 10 (1995), 1090-1094). Die Expressionskassette kann daher beispielsweise einen samenspezifischen Promotor (bevorzugt den Phaseolin- Promotor (US 5504200), den USP- (Baumlein, H. et al., Mol. Gen. Genet. (1991) 225 (3), 459-467), LEB4-Promotor (Fiedler und Conrad, 1995), Sucrose-Bindeprotein-Promotor (Zitat), das LEB4-Signalpeptid, das zu exprimierende Gen und ein ER-Retentionssignal enthalten.

Die Herstellung einer Expressionskassette erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einer geeigneten tyrA-Nuklein­ säure-Sequenz und vorzugsweise einer zwischen Promotor und tyrA- Nukleinsäure-Sequenz inserierten Nukleinsäure, die für ein chloroplastenspezifisches Transitpeptid kodiert, sowie einem Polyadenylierungssignal nach gängigen Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T. J. Silhavy, M. L. Berman und L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987) beschrieben sind.

Insbesondere bevorzugt sind Sequenzen, die ein Targeting in den Plastiden gewährleisten.

Es können auch Expressionskassetten verwendet werden, deren Nukleinsäure-Sequenz für ein tyrA-Fusionsprotein kodiert, wobei ein Teil des Fusionsproteins ein Transitpeptid ist, das die Translokation des Polypeptides steuert. Bevorzugt sind für die Chloroplasten spezifische Transitpeptide, welche nach Translo­ kation der Chorismatmutase-Prephenatdehydrogenase in die Chloro­ plasten vom tyrA-Teil enzymatisch abgespalten werden. Ins­ besondere bevorzugt ist das Transitpeptid, das von der plasti­ dären Nicotiana tabacum Transketolase oder einem anderen Transit­ peptid (z. B. dem Transitpeptid der kleinen Untereinheit der Rubisco oder der Ferredoxin NADP Oxidoreduktase als auch der Isopentenylpyrophosphat Isomerase-2) oder dessen funktionellem Äquivalent abgeleitet ist.

Besonders bevorzugt sind DNA-Sequenzen von drei Kassetten des Plastiden-Transitpeptids der plastidären Transketolase aus Tabak in drei Leserastern als KpnI/BamHI Fragmente mit einem ATG-Codon in der NcoI Schnittstelle:

Die inserierte Nukleotid-Sequenz kodierend für eine Chorismat­ mutase-Prephenatdehydrogenase kann synthetisch hergestellt oder natürlich gewonnen sein oder eine Mischung aus synthetischen und natürlichen DNA-Bestandteilen enthalten, sowie aus verschiedenen heterologen tyrA-Genabschnitten verschiedener Organismen bestehen.

Bevorzugt sind, wie vorstehend beschrieben, synthetische Nukleotid-Sequenzen mit Kodons, die von Pflanzen bevorzugt werden. Diese von Pflanzen bevorzugten Kodons können aus Kodons mit der höchsten Proteinhäufigkeit bestimmt werden, die in den meisten interessanten Pflanzenspezies exprimiert werden. Bei der Präparation einer Expressionskassette können verschiedene DNA-Fragmente manipuliert werden, um eine Nukleotid-Sequenz zu erhalten, die zweckmäßigerweise in der korrekten Richtung liest und die mit einem korrekten Leseraster ausgestattet ist. Für die Verbindung der DNA-Fragmente miteinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden.

Zweckmäßigerweise können die Promotor- und die Terminator- Regionen in Transkriptionsrichtung mit einem Linker oder Poly­ linker, der eine oder mehrere Restriktionsstellen für die Insertion dieser Sequenz enthält, versehen werden. In der Regel hat der Linker 1 bis 10, meistens 1 bis 8, vorzugsweise 2 bis 6 Restriktionsstellen. Im allgemeinen hat der Linker innerhalb der regulatorischen Bereiche eine Größe von weniger als 100 bp, häufig weniger als 60 bp, mindestens jedoch 5 bp. Der Promotor kann sowohl nativ bzw. homolog als auch fremdartig bzw. heterolog zur Wirtspflanze sein. Die Expressionskassette beinhaltet in der 5'-3'-Transkriptionsrichtung den Promotor, eine DNA-Sequenz die für ein tyrA-Gen codiert und eine Region für die transkriptionale Termination. Verschiedene Terminationsbereiche sind gegeneinander beliebig austauschbar.

Ferner können Manipulationen, die passende Restriktions­ schnittstellen bereitstellen oder die überflüssige DNA oder Restriktionsschnittstellen entfernen, eingesetzt werden. Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen wie z. B. Transitionen und Transversionen in Frage kommen, können in vitro-Mutagenese, "primerrepair", Restriktion oder Ligation verwendet werden. Bei geeigneten Manipulationen, wie z. B. Restriktion, "chewing­ back" oder Auffüllen von Überhängen für "bluntends", können komplementäre Enden der Fragmente für die Ligation zur Verfügung gestellt werden.

Bevorzugte Polyadenylierungssignale sind pflanzliche Poly­ adenylierungssignale, vorzugsweise solche, die im wesentlichen T-DNA-Polyadenylierungssignale aus Agrobacterium tumefaciens, insbesondere des Gens 3 der T-DNA (Octopin Synthase) des Ti-Plasmids pTiACH5 entsprechen (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984), 835 ff) oder funktionelle Äquivalente.

Zur Herstellung von genetisch veränderten Pflanzen, im folgenden auch transgene Pflanze bezeichnet, wird die fusionierte Expressionskassette, die für ein tyrA-Gen kodiert, vorzugsweise in einen Vektor, beispielsweise pBin19, kloniert, der geeignet ist, Agrobacterium tumefaciens zu transformieren. Mit einem solchen Vektor transformierte Agrobakterien können dann in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen, insbesondere von Kulturpflanzen verwendet werden, indem beispielsweise ver­ wundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden. Die Transformation von Pflanzen durch Agrobakterien ist unter anderem bekannt aus F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S. D. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15-38. Aus den transformierten Zellen der verwundeten Blätter bzw. Blattstücke können in bekannter Weise transgene Pflanzen regeneriert werden, die ein in die Expressionskassette integriertes Gen für die Expression eines tyrA-Gens enthalten.

Zur Transformation einer Wirtspflanze mit einer für eine Chorismatmutase-Prephenatdehydrogenase kodierenden DNA wird eine Expressionskassette als Insertion in einen rekombinanten Vektor eingebaut, dessen Vektor-DNA zusätzliche funktionelle Regulationssignale, beispielsweise Sequenzen für Replikation oder Integration enthält. Geeignete Vektoren sind unter anderem in "Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology" (CRC Press), Kap. 6/7, S. 71-119 (1993) beschrieben.

Unter Verwendung der oben zitierten Rekombinations- und Klonierungstechniken können die Expressionskassetten in geeignete Vektoren kloniert werden, die ihre Vermehrung, beispielsweise in E. coli, ermöglichen. Geeignete Klonierungsvektoren sind u. a. pBR332, pUC-Serien, M13mp-Serien und pACYC184. Besonders geeignet sind binäre Vektoren, die sowohl in E. coli als auch in Agro­ bakterien replizieren können.

Die Erfindung betrifft daher die Verwendung der vorstehend be­ schriebenen Nukleinsäure, codierend eine tyrA, der vorstehend be­ schriebenen Nukleinsäurekonstrukte, insbesondere der Expressions­ kassetten zur Herstellung von genetisch veränderten Pflanzen oder zur Transformation von Pflanzen, -zellen, -geweben oder Pflanzen­ teilen. Vorzugsweise ist Ziel der Verwendung die Erhöhung des Gehaltes der Pflanze oder Pflanzenteile an Feinchemikalien, ins­ besondere des Gehalts an Vitamin E, Vitamin K oder Ubichinon.

Dabei kann je nach Wahl des Promotors die Expression spezifisch in den Blättern, in den Samen, Blütenblättern oder anderen Teilen der Pflanze erfolgen.

Die Übertragung von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird als Transformation bezeichnet. Es werden dabei die beschriebenen Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation genutzt. Geeignete Methoden sind die Protoplasten­ transformation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnahme, das biolistische Verfahren mit der Genkanone - die sogenannte particle bombardment Methode, die Elektroporation, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung, die Mikroinjektion und der durch Agrobacterium vermittelte Gentransfer. Die genannten Verfahren sind beispielsweise in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S. D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128-143 sowie in Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225) beschrieben. Vorzugsweise wird das zu exprimierende Konstrukt in einen Vektor kloniert, der geeignet ist, Agrobacterium tumefaciens zu transformieren, beispielsweise pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711).

Mit einer Expressionskassette transformierte Agrobakterien können ebenfalls in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen, insbesondere von Tagetes, Sonnenblume, Arabidopsis, Tabak, Roter Pfeffer, Soja, Tomate, Aubergine, Paprika, Möhre, Karotte, Kartoffel, Mais, Salate und Kohlarten, Getreide, Alfalfa, Hafer, Gerste, Roggen, Weizen, Triticale, Hirse, Reis, Luzerne, Flachs, Baumwolle, Hanf, Brassicacaen wie beispielsweise Raps oder Canola, Zuckerrübe, Zuckerrohr, Nuß- und Weinspezies oder Holz­ gewächse wie beispielsweise Espe oder Eibe, verwendet werden, z. B. indem verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agro­ bakterienlösung gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden.

Die Expressionskassette kann über die Pflanzen hinaus auch zur Transformation von Bakterien, insbesondere Cyanobakterien, Moosen, Hefen, filamentösen Pilzen und Algen mit dem Ziel einer Erhöhung des Gehaltes an Feinchemikalien, insbesondere von Vitamin E, Vitamin K oder Ubichinon eingesetzt werden.

Dementsprechend betrifft die Erfindung ferner ein Verfahren zur Herstellung von genetisch veränderten Organismen indem man eine vorstehend beschriebene Nukleinsäure oder ein vorstehend beschriebenes Nukleinsäurekonstrukt in das Genom des Ausgangs­ organismus einführt.

Vorzugsweise betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Transformation einer Pflanze dadurch gekennzeichnet, daß man Expressionskassetten enthaltend eine tyrA-Sequenz in eine Pflanzenzelle oder Protoplasten von Pflanzen einbringt und diese zu ganzen Pflanzen regeneriert.

Die Erfindung betrifft auch die genetisch veränderte Organismen, wobei die genetische Veränderung den Metabolitfluß des Shikimat­ weges gegenüber dem Wildtyp verändert und der Organismus gegen­ über dem Wildtyp einen veränderten Gehalt an Feinchemikalien auf­ weist.

Wie vorstehend erwähnt, weisen bevorzugte Organismen einen erhöhten Gehalt an Feinchemikalien, insbesondere einen erhöhten Gehalt an Vitamin E, Vitamin K und Ubichinon gegenüber dem Wild­ typ auf.

In einer weiter bevorzugten Ausführungsform der genetisch ver­ änderten Organismen verursacht die genetische Veränderung gegen­ über dem Wildtyp die Genexpression einer Nukleinsäure, codierend eine tyrA.

Als Organismen und zur Herstellung von Organismen mit einem erhöhten Gehalt an Feinchemikalien im Vergleich zum Wildtyp werden in einer bevorzugten Ausführungsform, wie vorstehend erwähnt, photosynthetisch aktive Organismen wie beispielsweise Cyanobakterien, Moose, Algen oder Pflanzen, besonders bevorzugt Pflanzen als Ausgangsorganismen und dementsprechend auch als genetisch veränderte Organismen verwendet. Solche transgenen Pflanzen, deren Vermehrungsgut, sowie deren Pflanzenzellen, -gewebe oder -teile sind ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Pflanzen im Sinne der Erfindung sind mono- und dikotyle Pflanzen.

Bevorzugte Pflanzen sind, wie vorstehend erwähnt beispielsweise Tagetes, Sonnenblume, Arabidopsis, Tabak, Roter Pfeffer, Soja, Tomate, Aubergine, Paprika, Möhre, Karotte, Kartoffel, Mais, Salate und Kohlarten, Getreide, Alfalfa, Hafer, Gerste, Roggen, Weizen, Triticale, Hirse, Reis, Luzerne, Flachs, Baumwolle, Hanf, Brassicacaen wie beispielsweise Raps oder Canola, Zuckerrübe, Zuckerrohr, Nuß- und Weinspezies oder Holzgewächse wie beispiels­ weise Espe oder Eibe.

Besonders bevorzugt sind Arabidopsis thaliana, Tagetes erecta, Brassica napus, Nicotiana tabacum, Canola, Kartoffeln sowie weitere Ölsaaten, wie beispielsweise Soja.

Die genteisch veränderten Organismen, insbesondere Pflanzen können, wie vorstehend beschrieben zur Herstellung von Fein­ chemikalien, insbesondere zur Herstellung von Vitamin E, Vitamin K und Ubichinon verwendet werden.

Von Menschen und Tieren verzehrbare erfindungsgemäße, genetisch veränderte Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Feinchemikalien, insbesondere mit einem erhöhten Gehalt an Vitamin-E, Ubichinon und/oder Vitamin K können auch beispielsweise direkt oder nach an sich bekannter Prozessierung als Nahrungsmittel oder Futter­ mittel verwendet werden.

Erhöhung des Gehaltes an Feinchemikalien bedeutet im Rahmen der vorliegenden Erfindung die künstlich erworbene Fähigkeit einer erhöhten Biosyntheseleistung dieser Verbindungen in der Pflanze gegenüber der nicht gentechnisch modifizierten Pflanze für die Dauer mindestens einer Pflanzengeneration.

Im Falle der Erhöhung des Gehalts an Vitamin E kann sowohl der Gehalt an Tocopherolen oder Tocotrienolen gesteigert werden. Vor­ zugsweise wird der Gehalt an Tocopherolen gesteigert. Aber es ist auch möglich unter bestimmten Bedingungen vorzugsweise den Gehalt an Tocotrienolen zu steigern.

Der Biosyntheseort von Vitamin E beispielsweise ist in Pflanzen unter anderem das Blattgewebe, so daß eine blattspezifische Expression des tyrA-Gens sinnvoll ist. Dies ist jedoch nicht einschränkend, da die Expression auch in allen übrigen Teilen der Pflanze - besonders in fetthaltigen Samen - gewebespezifisch erfolgen kann.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform betrifft deshalb eine samenspezifische Expression des tyrA-Gens.

Darüberhinaus ist eine konstitutive Expression des exogenen tyrA- Gens von Vorteil. Andererseits kann aber auch eine induzierbare Expression wünschenswert erscheinen.

Die Wirksamkeit der Expression des transgen exprimierten tyrA- Gens kann beispielsweise in vitro durch Sproßmeristemvermehrung ermittelt werden. Zudem kann eine in Art und Höhe veränderte Expression des tyrA-Gens und deren Auswirkung auf die Tocopherol- Biosyntheseleistung an Testpflanzen in Gewächshausversuchen getestet werden.

Die Erfindung wird durch die nun folgenden Beispiele erläutert, ist aber nicht auf diese beschränkt:

Allgemeine Experimentelle Bedingungen Sequenzanalyse rekombinanter DNA

Die Sequenzierung rekombinanter DNA-Moleküle erfolgte mit einem Laserfluoreszenz-DNA-Sequenzierer der Firma Licor (Vertrieb durch MWG Biotech, Ebersbach) nach der Methode von Sanger (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463-5467).

Beispiel 1 Klonierung des tyrA-Gens kodierend für die Chorismatmutase- Prephenatdehydrogenase aus E. coli K12

Die DNA kodierend für das tyrA-Gen wurde mittels polymerase chain reaction (PCR) aus E. coli K12 unter Verwendung eines sense spezifischen Primers (tyrA5' SEQ ID NO. 3) und eines antisense spezifischen Primers (tyrA3' SEQ ID NO. 4) amplifiziert.

Die PCR Bedingungen waren die folgenden:
Die PCR erfolgte in einem 50 µl Reaktionsansatz in dem enthalten war:

• - 2 µl einer E. coli K12 Zellsuspension
• - 0,2 mM dATP, dTTP, dGTP, dCTP
• - 1,5 mM Mg(OAc)₂
• - 5 µg Rinderserum-Albumin
• - 40 pmol tyrA5'
• - 40 pmol tyrA3'
• - 15 µl 3,3 × rTth DNA Polymerase XLPuffer (PE Applied Biosystems)
• - 5 U rTth DNA Polymerase XL (PE Applied Biosystems)

Die PCR wurde unter folgenden Zyklus Bedingungen durchgeführt:
Schritt 1: 5 Minuten 94°C (Denaturierung)
Schritt 2: 3 Sekunden 94°C
Schritt 3: 1 Minute 55°C (Annealing)
Schritt 4: 2 Minuten 72°C (Elongation)
30 Wiederholungen der Schritte 2 bis 4
Schritt 5: 10 Minuten 72°C (Post-Elongation)
Schritt 6: 4°C (Warteschleife)

Das Amplikon wurde unter Verwendung von Standardmethoden in den PCR Klonierungsvektor pGEM-T (Promega) kloniert. Die Identität des erzeugten Amplikons wurde durch Sequenzierung unter Ver­ wendung des M13F (-40) Primers bestätigt.

Beispiel 2 Herstellung von Expressionskassetten enthaltend das tyrA-Gen

Transgene Nicotiana tabacum und Arabidopsis thaliana Pflanzen wurden erzeugt, die die Chorismatmutase-Prephenatdehydrogenase aus E. coli K12 unter Kontrolle des konstitutiven 35S-Promotor des CaMV (Blumenkohlmosaikvirus) (Franck et al., Cell 21: 285-294, 1980) exprimieren. Die Grundlage des zur konstitutiven Expression der Chorismatmutase-Prephenatdehydrogenase aus E. coli K12 erzeug­ ten Plasmides war der pBinAR-TkTp-10 (Ralf Badur, Dissertation Universität Göttingen, 1998). Dieser Vektor ist ein Derivat des pBinAR (Höfgen und Willmitzer, Plant Sci. 66: 221-230, 1990) und enthält den 35S-Promotor des CaMV (Blumenkohlmosaikvirus) (Franck et al., 1980) das Terminationssignal des Octopin-Synthase Gens (Gielen et al., EMBO J. 3 : 835-846, 1984) sowie die für das Transitpeptid der Nicotiana tabacurn plastidären Transketolase kodierenden DNA Sequenz. Die unter Berücksichtigung des korrekten Leserasters erfolgte Klonierung der Chorismatmutase-Prephenat­ dehydrogenase aus E. coli K12 in diesen Vektor, erzeugt eine Translationsfusion der Chorismatmutase-Prephenatdehydrogenase mit dem plastidären Transitpeptid. Dadurch erfolgt ein Transport des Transgens in die Plastiden.

Zur Erstellung dieses Plasmides wurde das tyrA-Gen unter Ver­ wendung der flankierenden SmaI bzw. SalI Restriktionsschnitt­ stellen aus dem Plasmid pGEM-T/tyrA isoliert. Dieses Fragment wurde unter Anwendung von Standardmethoden in einen SmaI/SalI geschnittenen pBinAR-TkTp-10 ligiert (siehe Abbildung. X) Dieses Plasmid (pBinAR-TkTp-10/tyrA) wurde zur Erzeugung transgener Nicotiana tabacum und A. thaliana Pflanzen verwendet.

Fragment A (529 bp) in Abb. 2 beinhaltet den 35S-Promotor des CaMV (Nukleotide 6909 bis 7437 des Blumenkohlmosaikvirus), Fragment B (245 bp) kodiert für das Transitpeptid der Nicotiana tabacum Transketolase, Fragment C (1232 Bp) kodiert für das tyrA-Gen aus E. coli K12, Fragment D (219 Bp) kodiert für das Terminationssignal des Octopin-Synthase Gens.

Beispiel 3 Erzeugung von DNA Konstrukten zur Expression der Chorismatmutase- Prephenatdehydrogenase aus E. coli K12 unter Kontrolle eines samenspezifischen Promotors

Zur Herstellung von chimären DNA Konstrukten zur Erzeugung trans­ gener Arabidopsos thaliana, Nicotiana tabacum bzw. Brassica napus Pflanzen, die die Chorismatmutase-Prephenatdehydrogenase aus E. coli K12 unter Kontrolle eines samenspezifischen Promotors exprimieren, wurde der Vektor pPTVkanLeP-IPP-TP-9 verwendet. Dieser Vektor ist ein Derivat des pGPTVkan (D. Becker, E. Kemper, J. Schell, R. Masterson. Plant Molecular Biology 20: 1195-1197, 1992) dem das uidA Gen deletiert wurde. Stattdessen enthält der Vektor pPTVkanLeP-IPP-TP-9 den samenspezifischen Promotor des Legumin B4 Gens (Kafatos et al., Nuc. Acid. Res., 14(6): 2707-2720, 1986), die Sequenz kodierend für das Transitpeptid der A. thaliana plastiden-spezifischen Isopentenyl-pyrophosphat Isomerase-2 (IPP-2) (Badur, unveröffentlicht) und das Terminationssignal der Nopalinsynthase aus A. tumefaciens (Depicker et al., J. Mol. Appl. Genet. 1, 561-73, 1982).

Das DNA Fragment kodierend für das tyrA-Gen aus E. coli K12 wurde als SmaI/SalI Fragment mit durch die T4-Polymerase aufgefüllten stumpfen Enden in den Vektor pPTVkanLeP-IPP-TP-9 (Abb. 3) kloniert, wodurch eine Translationsfusion mit dem Transitpeptid der IPP-2 erzeugt wurde. Somit konnte ein Import der Chorismat­ mutase-Prephenatdehydrogenase in die Plastiden gewährleistet werden. Dieses Plasmid (pPTVkanLeP-IPP-TP-9/TyrA) wurde zur Erzeugung transgener Nicotiana tabacum, A. thaliana bzw. Brassica napus Pflanzen verwendet.

Fragment A (2700 bp) in Abb. 3 beinhaltet den Promotor des Legumin B4 Gens aus Vicia faba, Fragment B (206 bp) Fragment kodierend für das Transitpeptid der A. thaliana Isopentenyl-pyro­ phosphat-Isomerase-2. Fragment C (1234 Bp) kodiert für das tyrA- Gen aus E. coli K12. Fragment D (272 Bp) für das Terminationssignal des Nopalin-Synthase Gens.

Beispiel 4 Herstellung transgener Arabidopis thaliana Pflanzen

Wildtyp Arabidopsis thaliana Pflanzen (Columbia) wurden mit dem Agrabacterium tumefaciens Stamm (GV3101 [pMP90]) auf Grundlage einer modifizierten Vakuuminfiltrationsmethode transformiert (Steve Clough und Andrew Bent. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium mediated transformation of A. thaliana. Plant J 16(6):735-43, 1998; der Bechtold, N. Ellis, J. und Pelltier, G., in: Planta Agrobacterium mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. CRAcad Sci Paris, 1993, 1144(2): 204-212). Die verwendeten Agrobacterium tumefaciens Zellen waren im Vorfeld mit den Plasmiden pBinAR-TkTp-10/tyrA bzw. pPTVkanLeP-IPP-TP-9/TyrA (Abb. 2 bzw. 3) transformiert worden.

Samen der Primärtransformanden wurden auf Grundlage der Antibiotikaresistenz selektioniert. Antibiotika resistente Keimlinge wurden in Erde gepflanzt und als vollentwickelte Pflanzen zur biochemischen Analyse verwendet.

Beispiel 5 Herstellung transgener Brassica napus Pflanzen

Die Herstellung transgener Raps Pflanzen orientierte sich an einem Protokoll von Bade, J. B. und Damm, B. (in Gene Transfer to Plants, Potrykus, I. und Spangenberg, G., eds, Springer Lab Manual, Springer Verlag, 1995, 30-38), in welchem auch die Zusammensetzung der verwendeten Medien und Puffer angegeben ist.

Die Transformationen erfolgten mit dem Agrobacterium tumefaciens Stamm GV3101 [pMP90]. Zur Transformation wurde das Plasmid pPTVkanLeP-IPP-TP-9/tyrA verwendet (Abb. 3). Samen von Brassica napus var. Westar wurden mit 70% Ethanol (v/v) ober­ flächensteril gemacht, 10 Minuten bei 55°C in Wasser gewaschen, in 1%iger Hypochlorit-Lösung (25% v/v Teepol, 0,1% v/v Tween 20) für 20 Minuten inkubiert und sechsmal mit sterilem Wasser für jeweils 20 Minuten gewaschen. Die Samen wurden drei Tage auf Filter­ papier getrocknet und 10-15 Samen in einem Glaskolben mit 15 ml Keimungsmedium zur Keimung gebracht. Von mehreren Keimlingen (ca. 10 cm groß) wurden die Wurzeln und Apices entfernt und die ver­ bleibenden Hypokotyle in ca. 6 mm lange Stücke geschnitten. Die so gewonnenen ca. 600 Explantate wurden 30 Minuten mit 50 ml Basalmedium gewaschen und in einem 300 ml Kolben überführt. Nach Zugabe von 100 ml Kallusinduktionsmedium wurden die Kulturen für 24 Stunden bei 100 U/min inkubiert.

Vom Agrobacterium Stamm wurde eine Übernachtkultur bei 29°C in Luria Broth-Medium mit Kanamycin (20 mg/l) angesetzt, davon 2 ml in 50 ml Luria Broth-Medium ohne Kanamycin für 4 Stunden bei 29°C bis zu einer OD₆₀₀ von 0,4-0,5 inkubiert. Nach der Pelletierung der Kultur bei 2000 U/min für 25 min wurde das Zellpellet in 25 ml Basalmedium resuspendiert. Die Konzentration der Bakterien in der Lösung wurde durch Zugabe von weiterem Basalmedium auf eine OD₆₀₀ von 0,3 eingestellt.

Aus den Raps-Explanten wurde das Kallus-Induktionsmedium mit sterilen Pipetten entfernt, 50 ml Agrobakterium-Lösung hinzu­ gefügt, vorsichtig gemischt und für 20 min inkubiert. Die Agro­ bacterien-Suspension wurde entfernt, die Raps-Explante für 1 min mit 50 ml Kallus-Induktionsmedium gewaschen und anschließend 100 ml Kallus-Induktionsmedium hinzugefügt. Die Co-Kultivierung wurde für 24 h auf einem Rotationsschüttler bei 100 U/min durch­ geführt. Die Co-Kultivierung wurde durch Wegnahme des Kallus- Induktionsmediums gestoppt und die Explante zweimal für jeweils 1 min mit 25 ml und zweimal für 60 min mit jeweils 100 ml Wasch­ medium bei 100 U/min gewaschen. Das Waschmedium mit den Explanten wurde in 15 cm Petrischalen überführt und das Medium mit sterilen Pipetten entfernt.

Zur Regeneration wurden jeweils 20 bis 30 Explante in 90 mm Petrischalen überführt, welche 25 ml Sproß-Induktionsmedium mit Kanamycin enthielten. Die Petrischalen wurden mit 2 Lagen Leukopor verschlossen und bei 25°C und 2000 lux bei Photoperioden von 16 Stunden Licht/8 Stunden Dunkelheit inkubiert. Alle 12 Tage wurden die sich entwickelnden Kalli auf frische Petrischalen mit Sproß-Induktionsmedium umgesetzt. Alle weiteren Schritte zur Regeneration ganzer Pflanzen wurden wie von Bade, J. B und Damm, B. (in: Gene Transfer to Plants, Potrykus, I. und Spangenberg, G., eds, Springer Lab Manual, Springer Verlag, 1995, 30-38) beschrieben durchgeführt.

Beispiel 6 Herstellung transgener Nicotiana tabacum Pflanzen

Zehn ml YEB-Medium mit Antibiotikum (5 g/l Rinder-Extrakt, 1 g/l Hefe-Extrakt, 5 g/l Pepton, 5 g/l Saccharose und 2 mM MgSO₄.) wurden mit einer Kolonie von Agrobacterium tumefaciens beimpft und über Nacht bei 28°C kultiviert. Die Zellen wurden 20 min bei 4°C, 3500 U/min in einer Tischzentrifuge pelletiert und danach in frischem YEB-Medium ohne Antibiotika unter sterilen Bedingungen resuspendiert. Die Zellsuspension wurde für die Transformation eingesetzt.

Die Wildtyp-Pflanzen aus Sterilkultur wurden durch vegetative Replikation erhalten. Dazu wurde nur die Spitze der Pflanze abgeschnitten und auf frisches 2MS-Medium in ein steriles Ein­ weckglas überführt. Vom Rest der Pflanze wurden die Haare auf der Blattoberseite und die Mittelrippen der Blätter entfernt. Die Blätter wurden mit einer Rasierklinge in etwa 1cm² große Stücke geschnitten. Die Agrobakterienkultur wurde in eine kleine Petrischale überführt (Durchmesser 2 cm). Die Blattstücke wurden kurz durch diese Lösung gezogen und mit der Blattunterseite auf 2MS-Medium in Petrischalen (Durchmesser 9 cm) gelegt, so daß sie das Medium berührten. Nach zwei Tagen im Dunkeln bei 25°C wurden die Explantate auf Platten mit Kallusinduktionsmedium überführt und in der Klimakammer auf 28°C temperiert. Das Medium mußte alle 7-10 Tage gewechselt werden. Sobald sich Kalli bildeten, wurden die Explantate in sterile Einweckgläser auf Sproßinduktionsmedium mit Claforan (0,6% BiTec-Agar (g/v), 2,0 mg/l Zeatinribose, 0,02 mg/l Naphtylessigsäure, 0,02 mg/l Gibberelinsäure, 0,25 g/ml Claforan, 1,6% Glukose (g/v) und 50 mg/l Kanamycin) überführt. Nach etwa einem Monat trat Organogenese ein und die gebildeten Sprosse konnten abgeschnitten werden. Die Kultivierung der Sprosse wurde auf 2MS-Medium mit Claforan und Selektionsmarker durchgeführt. Sobald sich ein kräftiger Wurzelballen gebildet hatte, konnten die Pflanzen in Pikiererde getopft werden.

Beispiel 7 Charakterisierung der transgenen Pflanzen

Es wurden die Tocopherol- und Tocotrienol-Gehalte in Blätter und Samen der mit den beschriebenen Konstrukten transformierten Pflanzen (Arabidopsis thaliana, Brassica napus und Nicotiana tabacum) analysiert. Dazu wurden die transgenen Pflanzen im Gewächshaus kultiviert und Pflanzen die das Gen kodierend für die Chorismatmutase-Prephenatdehydrogenase aus E. coli K12 exprimieren auf Northern- und Western Ebene analysiert. In Blättern und Samen dieser Pflanzen wurde der Tocopherolgehalt und der Tocotrienol­ gehalt mittels HPLC ermittelt. In allen Fällen war der Toco­ pherol- und oder Tocotrienol-Gehalt in transgenen Pflanzen, die zusätzlich ein tyrA-Gen exprimieren, im Vergleich zu nicht trans­ formierten Pflanzen erhöht.

Tabelle 1A (junge Blätter) und 1B (seneszierende Blätter) zeigen die Gehalte [µg/gFG] an α-Tocopherol, γ-Tocopherol, α-Tocotrienol und Gesamt-Vitamin E in Blättern unterschiedlichen Alters in Nicotiana tabacum, cv. SNN-Wildtyp (angegebene Werte MW +/-SD, n = 9) und Pflanzen, die das Tyr A Gen aus E. coli über­ exprimieren.

Tabelle A junge Blätter

Tabelle B seneszierende Blätter

SEQUENZPROTOKOLL

Claims (22)

1. Verfahren zur Herstellung von Feinchemikalien durch Kulti­ vierung von Organismen die gegenüber dem Wildtyp einen genetisch veränderten Shikimatweg aufweisen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Shikimatweg des Organismus gegenüber dem Wildtyp durch Einbringen mindestens eines Gens verändert, zu dem der Wild­ typ kein orthologes Gen aufweist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man durch das mindestens eine eingebrachte Gen den Stoffwechsel­ weg des Shikimatweges des Wildtyps überbrückt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man als Organismus eine Pflanze verwendet.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man mindestens eine Nukleinsäure codierend eine Chorismatmutase-Prephenatdehydrogenase oder eine Prephenat­ dehydrogenase in eine Pflanze einbringt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Nukleinsäure einbringt die ein Protein kodiert, ent­ haltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO. 2 oder eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Aminosäuren abgeleitete Sequenz, die eine Homologie von mindestens 30% auf Aminosäureebene mit der Sequenz SEQ ID NO. 2 und die enzymatische Eigenschaft einer Chorismatmutase-Prephenatdehydrogenase aufweist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Nukleinsäure bakterieller Herkunft verwendet.

8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Nukleinsäure verwendet, die die in SEQ ID NO. 1 dargestellten Sequenz enthält.

9. Verwendung einer Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 5 bis 8 zur Herstellung von transgenen Pflanzen.

10. Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die transgene Pflanze gegenüber dem Wildtyp einen erhöhten Gehalt an Feinchemikalien aufweist.

11. Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die transgene Pflanze gegenüber dem Wildtyp eine erhöhte Resistenz gegenüber abiotischem Streß aufweist.

12. Nukleinsäurekonstrukt, enthaltend eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 5 bis 8, die mit einem oder mehreren Regulationssignalen funktionell verknüpft sind, die die Transkription und Translation in Pflanzen gewährleisten.

13. Genetisch veränderter Organismus, wobei die genetische Ver­ änderung den Metabolitfluß des Shikimatweges gegenüber dem Wildtyp verändert und der Organismus gegenüber dem Wildtyp einen veränderten Gehalt an Feinchemikalien aufweist.

14. Genetisch veränderter Organismus nach Anspruch 13, wobei die genetische Veränderung die Genexpression einer Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 5 bis 8 gegenüber einem Wildtyp verursacht.

15. Genetisch veränderter Organismus nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß man als Organismus eine Pflanze verwendet.

16. Verwendung eines genetisch veränderten Organismus nach einem der Ansprüche 13 bis 15 zur Herstellung von Feinchemikalien.

17. Verfahren zur Herstellung von genetisch veränderten Organismen gemäß einem der Ansprüche 13 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 5 bis 8 oder ein Nukleinsäurekonstrukt gemäß Anspruch 12 in das Genom des Ausgangsorganismus einführt.

18. Verwendung der Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 5 bis 8 oder der Nukleinsäurekonstrukte gemäß Anspruch 12 zur Herstellung von genetisch veränderten Pflanzen.

19. Verwendung der Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 5 bis 8 oder der Nukleinsäurekonstrukte gemäß Anspruch 12 zur Er­ höhung des Gehalts an Feinchemikalien in Organismen.

20. Verwendung des Proteins gemäß Anspruch 5 oder 6 oder der Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 5 bis 8 zur Her­ stellung von Feinchemikalien in transgenen Organismen.

21. Verwendung nach Anspruch 20, wobei man als Feinchemikalie Vitamin E, Vitamin K oder Ubichinon herstellt.

22. Verwendung des Proteins gemäß Anspruch 5 oder 6 oder der Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 5 bis 8 nach Anspruch 20 zur Herstellung von Vitamin E, Vitamin K oder Ubichinon in transgenen Pflanzen.