MXPA01009034A

MXPA01009034A - Metodo para mejorar el valor agronomico y nutritivo de las plantas.

Info

Publication number: MXPA01009034A
Application number: MXPA01009034A
Authority: MX
Inventors: Peter Beyer
Original assignee: Syngenta Participations Ag
Priority date: 1999-03-05
Filing date: 2000-03-03
Publication date: 2002-09-18
Also published as: AU3285500A; WO2000053768A1; JP4727043B2; ID29890A; CN1347454A; KR20010105373A; EP1159428B1; US20080276332A1; AU776160B2; DE19909637A1; HUP0105167A2; BR0009258A; US7838749B2; HK1043811A1; JP2002537841A; ZA200106948B; EP1159428A1; ATE340860T1; DE60030961T2; ES2269110T3

Abstract

La presente invencion proporciona medios y metodos de transformar celulas, semillas, tejidos de plantas o plantas enteras con el fin de producir transformantes capaces de expresar todas las enzimas de la ruta de biosintesis de los carotenoides, que son esenciales para que la planta hospedante establecida como diana acumule carotenos y/o xantofilas que presentan interes. La presente invencion proporciona tambien moleculas de ADN disenadas para ser adecuadas para llevar a cabo el metodo del invento, y sistemas de plasmidos o vectores que comprenden dichas moleculas. Ademas, la presente invencion proporciona celulas, semillas, tejidos de plantas transgenicas y plantas enteras que presentan una calidad nutritiva mejorada y contienen dichas moleculas de ADN y/o que han sido generadas por uso de los metodos de la presente invencion.

Description

DE LAS PLANTAS La presente invención se refiere al sector de transformación de células, semillas, tejidos de plantas y plantas enteras. Más específicamente, el presente invento se refiere a la introducción de secuencias de nucleótidos recombinantes que codifican una o más de las enzimas específicas de la ruta de biosíntesis de los carotenoides en un material de plantas con el fin de mejorar su valor agronómico y nutritivo. 10 ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La deficiencia en provitamina A (ß-caroteno) constituye un problema sanitario muy grave que conduce a síntomas clínicos graves en la 15 parte de la población mundial que vive de cereales tales como arroz como el alimento de consumo principal o casi único. Solamente en el Sureste Asiático se estima que desarrollan cada año la enfermedad ocular xeroftalmia 5 millones de niños, de los que 0,25 millones quedan finalmente ciegos (Sommer, 1988; Grant, 1991). Además, aunque la deficiencia en vitamina A no es un determinante 20 próximo de muerte, está correlacionada con una susceptibilidad aumentada a afecciones fatales potenciales tales como diarrea, enfermedades respiratorias y enfermedades de la infancia, tales como sarampión (Grant, 1991). De acuerdo - - con las estadísticas compiladas por la UNICEF, una mejorada nutrición con provitaminas podría evitar de 1 - 2 millones de muertes anualmente entre los niños con una edad de 1 - 4 años, y 0,25-0,5 millones de muertes durante la infancia posterior (Humphrey y colaboradores, 1992). Por estas razones, es muy deseable aumentar los niveles de los carotenoides en los alimentos de consumo. Además, se sabe que los carotenoides ayudan a evitar diversos tipos de cánceres, y se ha demostrado el cometido de la luteína y la zeaxantina en la retina evitando la degeneración de las máculas (véase p.ej. Brown y colaboradores, 1998; Schalch, 1992). Además, los carotenoides tienen una amplia gama de aplicaciones como colorantes en alimentos humanos y piensos de animales así como en productos farmacéuticos. Además, se presenta un interés creciente en carotenoides como compuestos nutricéuticos en "alimentos funcionales". Esto se debe a que algunos carotenoides, por ejemplo, el ß-caroteno, exhiben un carácter de provitamina-A en mamíferos. Los carotenoides son isoprenoides de 40 carbonos (C^) formados por condensación de ocho unidades de isopreno derivadas del compuesto precursor biosintético difosfato de isopentenilo (véase la Figura 1 ). Según la nomenclatura, los carotenoides entran dentro de dos clases, a saber los carotenos, que constituyen hidrocarburos, mientras que los derivados oxigenados son citados como xantófilas. Su función esencial en las plantas es la de proteger frente al daño foto-oxidativo en el aparato fotosintético de los plástidos. Además, ellos - - ¡"ara participan en la recogida de luz durante la fotosíntesis y representan componentes integrales de centros de reacciones fotosintéticas. Los carotenoides son los precursores directos de la fitohormona ácido abscísico. La biosíntesis de los carotenoides, como se reproduce 5 esquemáticamente en la Figura 1 , se ha investigado y se ha explicado su ruta en bacterias, hongos y plantas (véase por ejemplo, Britton, 1988). En las plantas, los carotenoides se conforman como plástidos. El compuesto intermedio temprano de la ruta de biosíntesis de los carotenoides es el difosfato de geranilgeranilo (GGPP), formado por la enzima sintasa de difosfato de geranil-geranilo ío a partir de difosfato de isopentenilo (IPP) y difosfato de dimetil-aliio (DMAPP, véase la Figura 1). La subsiguiente operación enzimática, que también representa la primera reacción específica para carotenoides, es catalizada por la enzima sintasa de fitoeno. La reacción constituye una reacción en dos etapas que da como resultado una condensación de cabeza con cabeza de dos 15 moléculas de GGPP para formar el primer producto de caroteno todavía sin colorear, el fitoeno (Dogbo y colaboradores, 1988; Chamovitz y colaboradores, 1991 ; Linden y colaboradores, 1991 ; Pecker y colaboradores, 1992). La sintasa de fitoeno se presenta en dos formas una soluble e inactiva y otra fijada a una membrana y activa, y requiere funciones hidroxi vecinas para presentar actividad 20 como se presenta en la superficie de las membranas que contienen galactolípidos de plástidos (Schledz y colaboradores, 1996). Aunque la formación de fitoeno es similar en bacterias y en plantas, - - la metabolización del fitoeno difiere pronunciadamente. En las plantas, dos productos de genes actúan de una manera consecutiva para generar el caroteno coloreado licopeno (Beyer y colaboradores, 1989). Estos productos están representados por las enzimas desaturasa de fitoeno (PDS, véase por ejemplo, 5 Hugueney y colaboradores, 1992) y desaturasa de ?-caroteno (ZDS, véase por ejemplo. Albrecht y colaboradores, 1996). Cada una de ellas introduce dos dobles enlaces proporcionando ?-caroteno pasando por fitoflueno, y licopeno pasando por neurosporeno, respectivamente. Se cree que la PDS está enlazada mecanísticamente con una cadena redox fijada a una membrana (Nievelstein y lo colaboradores, 1995) que emplea plastoquinona (Mayer y colaboradores, 1990; Schuiz y colaboradores, 1993; Norris y colaboradores, 1995), mientras que la ZDS actúa mecanísticamente de una manera diferente (Albrecht y colaboradores, 1996). En las plantas, parece ser que toda la ruta implica compuestos intermedios en configuración cis (Bartley y colaboradores, 1999). En 15 contraste, en muchas bacterias, tal como en las del género Erwinia, la secuencia de desaturación entera que forma la totalidad de los cuatro dobles enlaces se realiza por un único producto de gen (la Crtl), que convierte el fitoeno en licopeno directamente (véanse por ejemplo, Miawa y colaboradores, 1990; Armstrong y colaboradores, 1990; Hundle y colaboradores, 1994). Este tipo de desaturasa 20 bacteriana es conocido por no ser susceptible a ciertos herbicidas blanqueantes que inhiben eficientemente a la desaturasa de fitoeno del tipo de plantas. En las plantas, dos productos de genes catalizan la ciclización de - - Bcopeno, a saber las ciclasas de a(e)- y ß-licopeno, formando grupos extremos de a(e)- y ß-ionona, respectivamente (véanse p.ej. Cunningham y colaboradores, 1993; Scolnik y Bartley, 1995, Cunningham y colaboradores, 1996). En las plantas, se forman normalmente ß-carotenos que llevan dos grupos extremos de ß-ionona y a-caroteno, que llevan un grupo extremo de a(e)-ionona y un grupo extremo de ß-ionona. La formación de las xantófilas de plantas es mediada en primer lugar por dos productos de genes, las a- y ß-hidroxilasas (Masamoto y colaboradores, 1998) que actúan en las posiciones C3 y C3' del entramado caroténico de los a- y ß-carotenos, respectivamente. Las resultantes xantófilas son denominadas luteína y zeaxantina. Las reacciones de oxigenación ulteriores son catalizadas por la epoxidasa de zeaxantina, que cataliza la introducción de funciones epoxi en las posiciones C5.C6 y C5',C6' del entramado zeaxantínico (Marín y colaboradores, 1996). Esto conduce a la formación de anteraxantina y violaxantina. La reacción es hecha reversible por la acción de un diferente producto de gen, la desepoxidasa de violaxantina (Bugos y Yamamoto, 1996). Queda todavía por identificar el producto de gen que conduce a la formación de neoxantina. Se han clonado genes y ADNc's (ácidos desoxirribonucleicos cromosomales) que codifican genes de biosíntesis de los carotenoides a partir de una diversidad de organismos, que van desde bacterias hasta plantas. Los ^ - - * genes de bacterias y cianobacterias incluyen Erwinia herbicola (Solicitud de Patente Internacional WO 91/13078, Armstrong y colaboradores, 1990), Erwinia uredovora (Misawa y colaboradores, 1990), R. capsulatus (Armstrong y colaboradores, 1989), Thermus thermophilus (Hoshino y colaboradores, 1993), la 5 cianobacteria Synechococcus sp. (número de acceso al Banco de genes X63873), Flavobacterium sp. cepa R1534 (Pasamontes y colaboradores, 1997). Se han clonado genes y ADNc's, que codifican enzimas en la ruta de biosíntesis de los carotenoides en plantas superiores, a partir de diversas fuentes, inclusive Arabidopsis thaliana, Sinapis alba, Capsicum annuum, Narcissus 10 pseudonarcissus, Lycopersicon esculentum, etc., como se puede deducir de las bases públicas de datos. Actualmente se sabe relativamente poco acerca del uso de los genes clonados en transformaciones de plantas superiores y de los efectos resultantes. La expresión de la sintasa de fitoeno a partir del tomate puede 15 afectar a los niveles de los carotenoides en el fruto (Bird y colaboradores, 1991 ; Bramley y colaboradores, 1992; Fray y Gperson, 1993). Se ha informado de que la expresión constitutiva de una sintasa de fitoeno en plantas de tomate transformadas da como resultado un enanismo, debido a que se redirige al metabolito GGPP desde la ruta de biosíntesis de la gibberelina (Fray y 20 colaboradores, 1995). No se observó ninguno de tales problemas después de expresar constitutivamente la sintasa de fitoeno procedente de Narcissus pseudonarcissus en el endospermo de arroz (Burkhardt y colaboradores, 1997). «•tr - - Se sabe que la Crtl de Erwinia uredovora, como una desaturasa bacteriana, actúa en plantas y confiere resistencia a herbicidas blanqueantes (Misawa y colaboradores, 1993). Se han hecho muchos intentos a lo largo de los años de alterar o intensificar las rutas de biosíntesis de los carotenoides en diversos tejidos de plantas, tales como tejidos vegetativos o semillas, o en bacterias. Véanse, por ejemplo, los documentos WO 96/13149, WO 98/06862, WO 98/ 24300, WO 96/28014, y la Patente de los EE.UU. Número 5.618.988. Todos estos documentos están restringidos a la manipulación de reacciones de biosíntesis de los carotenoides previamente existentes en las células. Otras aplicaciones que buscan alterar la biosíntesis de los carotenoides en semillas ricas en aceite son diferentes, puesto que proporcionan un sumidero o vertedero para acomodar un exceso de los carotenoides que se forma debido al incremento provocado por la transformación. Es evidente que se necesita un método para transformar un material de plantas con el fin de proporcionar transformantes que sean capaces de expresar todas las enzimas de la ruta de biosíntesis de los carotenoides, necesarias para producir carotenos y xantófilas que presentan interés.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona medios y métodos de -> transformar células, semillas, tejidos de plantas o plantas enteras con el fin de - proporcionar transformantes capaces de expresar todas las enzimas de la ruta de biosíntesis de los carotenoides, que son esenciales para que la planta hospedante establecida como diana acumule carotenos y xantófilas que 5 presentan interés. El presente invento proporciona también moléculas de ADN diseñadas para que sean apropiadas a fin de llevar a cabo el método del invento, y sistemas de plásmidos o vectores que comprenden dichas moléculas. Además, la presente invención proporciona células, semillas, tejidos de plantas y plantas enteras transgénicas, que presentan una calidad nutritiva mejorada y que 10 contienen dichas moléculas de ADN y/o que se han generado por uso de los métodos de la presente invención. Por lo tanto, la presente invención proporciona tanto la introducción de novo (de nuevas) como la expresión de la biosíntesis de los carotenoides, que son particularmente importante con respecto a un material de plantas del que se 15 sabe que está esencialmente exento de carotenoides, tal como el endospermo de arroz y las semillas de muchos otros cereales, y la modificación de la biosíntesis de carotenoides previamente existentes con el fin de regular en aumento o descenso la acumulación de ciertos compuestos intermedios o productos que presentan interés. 20 BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS - - . - " La Figura 1 muestra una ruta general de biosíntesis de los carotenoides de plantas. Los nombres de las enzimas se presentan en letra negrita. También se indica la reacción catalizada por una desaturasa de carotenos del tipo de Crtl bacteriana. 5 La Figura 2 indica que el compuesto intermedio difosfato de geranilgeranilo (GGPP) no solamente está implicado en la biosíntesis de los carotenoides, sino que sirve además como un bloque de construcción en rutas que conducen a diferentes compuestos a través de reacciones de prenilación (por ejemplo, tocoferoles, quinonas, clorofilas) o por una reacción diferente que 10 no emplea moléculas aceptoras no prenílicas (por ejemplo, gibberelinas, sustancias para sabor y aroma). La Figura 3 presenta análisis por HPLC (cromatografía de líquido con alta resolución) de semillas de arroz pulido (del endospermo) a partir de plantas de arroz sin transformar (Figura 3A) y transformadas (con el plásmido A, 15 Figura 3B; con los plásmidos A más B, Figura 3C). La aparición de carotenoides, carotenos cíclicos y xantófilas es evidente en las trazas que representan a semillas transformadas. La Figura 4 ilustra esquemáticamente las casetes de expresión usadas en el "plásmido A" y en el "plásmido B", LB, del borde izquierdo; RB, del 20 borde derecho; psy, sintasa de fitoeno, ADNc procedente de Narcissus pseudonarcissus; Crtl gen de desaturasa de carotenos procedente de Erwinia uredovora; cyc, ciclasa de licopeno; ADNc procedente de Narcissus - - r pseudonarcissus; aphlV, fosfotransferasa de higromicina; Gtl, promotor de glutelina 1 de arroz; 35S, promotor de CaMV 35S; nos, terminador de sintasa de nopalina; Nptll, gen de resistencia a kanamicina. La Figura 5: A, borrón de transferencia Northern usando flores de narciso atrompetado sin tratar (pista 1 ) y tratadas con CPTA (pista 2). El ARN inmovilizado fue extraído por arrastre repetidamente para permitir una hibridación usando sondas marcadas para B, sintasa de fitoeno; B, desaturasa de fitoeno; C, desaturasa de ?-caroteno; E, ciclasa de licopeno. B, borrón de transferencia Western usando extractos procedentes de flores de narciso atrompetado sin tratar (pista 1) y tratadas (pista 2). Los borrones de transferencia fueron sondeados con anticuerpos dirigidos contra A, sintasa de fitoeno; B, desaturasa de fitoeno; C, desaturasa de ?-caroteno; D, ciclasa de licopeno.

ABREVIATURAS USADAS A LO LARGO DE MEMORIA DESCRIPTIVA Los nombres sistemáticos de los carotenoides relevantes aquí mencionados son: Fitoeno: 7,8, 11 , 12, 7', 8', 11 ', 12'-octahidro-?,?-caroteno Fitoflueno: 7,8,11 ,12,7',8'-hexahidro-?,?-caroteno ?-caroteno: 7,8,7',8'-tetrahidro-?,?-caroteno Neurosporeno: 7,8-dihidro-?,?-caroteno Licopeno: ?,?-caroteno a-caroteno: ß,e-caroteno Zeaxantina: ß,ß-caroteno-3,3'-diol Luteína: ß,e-caroteno-3,3'-diol Anteraxantina: 5,6-epoxi-5,6-dihidro-ß,ß-caroteno-3,3'-diol Violaxantina: d.e.d'.e'-diepoxi-d.d.d'.e'-tetrahidro-ß.ß-caroteno-S.S'- diol Neoxantina: d'.d'-epoxi-ßj-dideshidro-d^.d'.d'- tetrahidro-ß.ß-caroteno-S.d.S'-triol lo Enzimas: PSY: sintasa de fitoeno PDS: desaturasa de fitoeno Crtl: desaturasa de caroteno bacteriano ZDS: desaturasa de ?(zeta)-caroteno 15 CYC: ß-ciclasa de licopeno Compuestos intermedios que no son carotenos: IPP: difosfato de ispentenilo DMAPP: difosfato de dimetil-alilo 20 GGPP: difosfato de geranil-geranilo. Como se usa en el presente contexto, el término "plantas" incluye en términos generales algas eucarióticas, embriofitos que incluyen Bryophyta, - - Pteridophyta y Spermatophyta tales como Gymnospermae y Angiospermae, incluyendo estas últimas Magnoliopsida, Rosopsida (eu-"dicotiledóneas"), LHiopsida ("monocotiledóneas"). Ejemplos representativos y preferidos incluyen semillas de cerales y otros granos, por ejemplo, de arroz, trigo, cebada, avena, amaranto, lino, triticale, centeno, maíz y otras gramíneas; semillas oleaginosas tales como semillas de Brassica oleaginosas, semillas de algodón, soja, alazor, girasol, nuez de coco, palma, y similares; otras semillas comestibles o semillas que tienen partes comestibles, inclusive las de calabaza común, calabaza oleaginosa, sésamo, adormidera, uva, habas de garbanzo Mung, cacahuete, guisantes, judías, rábano, alfalfa, cacao, café, cáñamo; nueces de árboles tales como las de nogales, almendros, pecanas, garbanzos, etc. Además, patatas, zanahorias, boniatos, tomates, pimentones, mandiocas, sauces, robles, olmos, arces, manzanos, bananos; flores ornamentales, tales como lirios, orquídeas, juncias, rosas, ranúnculos, petunias, flox, violetas, girasoles, y similares. En términos generales, el presente invento es aplicable tanto a especies ornamentales como también a especies cultivadas para producción de alimentos, fibras, productos de madera, materiales curtientes, tintes, pigmentos, gomas, resinas, productos de látex, grasas, aceites, fármacos, bebidas, y similares. Preferiblemente, la planta diana seleccionada para su transformación es cultivada para la producción de un alimento, tal como, por ejemplo, granos, raíces, legumbres, nueces, vegetales, tubérculos, frutos, especias y similares. - - rü "V* DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN De acuerdo con la invención en cuestión, se proporcionan medios y métodos de transformar células, semillas, tejidos de plantas o plantas enteras, 5 para producir transformantes capaces de expresar todas las enzimas de la ruta de biosíntesis de los carotenoides, que son esenciales para que la planta hospedante establecida como diana acumule carotenos y/o xantófilas que - presentan interés. De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, dichos métodos se pueden usar también para modificar la biosíntesis de los lo carotenoides previamente existentes con el fin de regular en aumento o descenso la acumulación de ciertos compuestos intermedios o productos que presentan interés. Además, se proporcionan moléculas de ADN específicas que comprenden secuencias de nucleótidos que llevan una o más casetes de expresión capaces de dirigir la producción de una o más enzimas características 15 para la ruta de biosíntesis de los carotenoides, seleccionadas entre el grupo que consta de: sintasa de fitoeno derivada de plantas, hongos o bacterias, desaturasa de fitoeno derivada de plantas, hongos o bacterias, desaturasa de ?-caroteno derivada de plantas o cianobacterias, y 20 ciclasa de licopeno derivada de plantas, hongos o bacterias. De acuerdo con una realización preferida, la anterior cásete de expresión comprende uno o más genes o ADNc's que codifican una sintasa de hongos o bacterias, una desaturasa de ?-caroteno de plantas, o una ciclasa de licopeno de plantas, hongos o bacterias, cada una de ellas enlazada operativamente a un apropiado promotor constitutivo, inducible o específico para tejidos, que permite su expresión en células, semillas, tejidos de plantas o plantas enteras. Los genes o ADNc's particularmente preferidos codifican una sintasa de fitoeno de plantas, una desaturasa de fitoeno de bacterias o una ciclasa de licopeno de plantas. Se ha aislado un número grande, todavía en aumento, de genes que codifican una sintasa de fitoeno (de plantas y bacterias), 10 una desaturasa de carotenos del tipo Crtl (de bacterias) y una ciclasa de licopeno (de plantas y bacterias) y éstos son accesibles a partir de las bases de datos. Estos proceden de diversas fuentes y todos ellos están disponibles para su uso en los métodos de la presente invención. Se prefiere que las moléculas de ADN comprendan además por lo 15 menos un gen o ADNc marcador seleccionable enlazado operativamente a un apropiado promotor constitutivo, inducible o específico para tejidos, siendo la fosfotransferasa de higromicina la más preferida como el marcador seleccionable bajo el control de un promotor constitutivo. Aunque la persona experta implicada puede seleccionar cualquier promotor disponible, activo funcionalmente en un 20 material de plantas, en el diseño de apropiadas casetes de expresión de acuerdo con el invento se prefiere enlazar operativamente la respectiva secuencia de nucleótidos que codifica una desaturasa de fitoeno, una desaturasa de ?- - - & & caroteno o una ciclasa de licopeno para promotores específicos para tejidos o constitutivos, mientras que la secuencia de nucleótidos que codifica una sintasa de fitoeno es expresada preferiblemente bajo el control de un promotor específico para tejidos, con el fin de evitar una interferencia con la formación de gibberelina. Ha de entenderse que la secuencia de nucleótidos como un elemento funcional de la molécula de ADN de acuerdo con el invento, puede comprender cualquier combinación de uno o más de los genes o ADNc's antes mencionados. En una realización particularmente preferida del presente invento, dicha secuencia de nucleótidos comprende casetes de expresión funcionales tanto para una sintasa de fitoeno como para una desaturasa de fitoeno de bacterias u hongos, y después de su incorporación en un apropiado sistema de plásmido o vector (plásmido A) se puede introducir en el material de las plantas dianas, ya sea a solas o en común con un segundo vector (plásmido B) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una ciclasa de licopeno. La invención proporciona además sistemas de plásmidos o vectores que comprenden una o más de las anteriores moléculas de ADN o secuencias de nucleótidos, que preferiblemente se derivan de Agrobacterium tumefaciens. El presente invento en cuestión proporciona adicionalmente células, semillas, tejidos de plantas y plantas enteras transgénicas que presentan una calidad nutritiva mejorada y contienen una o más de las/los anteriores moléculas de ADN, plásmidos o vectores, y/o que se han generado por uso de los métodos de presente invención. La invención actual está basado en el hecho de que el compuesto intermedio temprano difosfato de geranil-geranilo (GGPP) no solamente sirve para la carotenogénesis sino que además representa un punto de ramificación 5 que sirve para diferentes rutas de biosíntesis (Figura 2). Se saca por lo tanto la conclusión de que este compuesto precursor se presenta en los plástidos de todos los tejidos de plantas, sean o no portadores de carotenoides, tales como el endospermo de arroz. La fuente de GGPP se puede usar por lo tanto para alcanzar los objetivos del presente invento, es decir la introducción de la ruta de 10 biosíntesis de los carotenoides en parte o como un conjunto, y/o la intensificación o aceleración de una ruta de biosíntesis de los carotenoides, previamente existente. El término "exento de carotenoides" usado a lo largo de toda la memoria descriptiva para diferenciar entre ciertas células o ciertos tejidos de 15 plantas dianas, significará que el respectivo material de plantas que no se ha transformado de acuerdo con el invento es conocido normalmente por estar esencialmente exento de carotenoides, tal como se da el caso por ejemplo, en órganos de almacenamiento tales como, por ejemplo, el endospermo de arroz y similares. El término "exento de carotenoides" no significa que se excluyan las 20 células o los tejidos que acumulan carotenoides en cantidades casi imposibles de detectar. Preferiblemente, dicho término definirá un material de plantas que tenga un contenido de carotenoides de 0,001% p/p (en peso/peso) o menor.

- - S*""í Con respecto a la selección de fuentes apropiadas a partir de las que se pueden obtener las enzimas de la ruta de los carotenoides, ha de entenderse que las secuencias de codificación procedentes de Cyanobacteria que sean homologas con las respectivas secuencias de plantas, se pueden usar 5 también de acuerdo con el presente invención. En una realización preferida de la presente invención, una sintasa de fitoeno de una planta superior es enlazada operativamente a un promotor que confiere expresión específica para un tejido. Esta se reúne en el mismo plásmido (plásmido A) con una desaturasa de fitoeno (del tipo Crtl) de bacterias, estando 10 esta última fusionada a una secuencia de ADN que codifica un péptido de tránsito y enlazada operativamente a un promotor que permite una expresión constitutiva. La transformación de plantas con esta estructura artificial (construcción) en un vector apropiado dirigirá la formación de licopeno en el tejido seleccionado por el promotor que controla a la sintasa de fitoeno, por 15 ejemplo en las semillas de cereales exentas de carotenoides. Sofrendentemente, esta transformación por sí sola puede iniciar la síntesis de carotenoides más allá de la formación de licopenos en dirección a xantófilas situadas corriente abajo de la ruta, tales como luteína, zeaxantina, anteraxantina, violaxantina y neoxantina, incluso en un tejido exento de carotenoides, tal como 20 el endospermo de arroz. Además, se observa la formación de a-caroteno. Por lo tanto, se forma un complemento de carotenoides que es similar al que está presente en las hojas verdes. Este fenómeno inesperado (denominado aquí - - "mecanismo de disparo en exceso") puede ser debido a la expresión constitutiva de los respectivos genes tardíos (ciclasas de licopeno, hidroxilasas de ß-caroteno, epoxidasas), que resultan activados por el suministro de substrato mediado por la transformación o, alternativamente, por la inducción de la expresión de los genes de biosíntesis de los carotenoides, provocada por la transformación. En el caso de que el mecanismo de "disparo en exceso" no funcione, la transformación conjunta (del plásmido B) con un gen o ADNc que codifica una ciclasa de licopeno puede solventar este problema y hacer posible por lo menos la formación de a- o ß-caroteno (provitamina A). En los casos de que funcione el mecanismo de "disparo en exceso", esta transformación conjunta puede aumentar los efectos provocados por la sintasa de fitoeno y la desaturasa de caroteno del tipo Crtl. La presente invención incluye por lo tanto la introducción de la ruta de biosíntesis de los carotenoides más allá del punto establecido genéticamente por transformación con el plásmido o con los plásmidos A más B. El plásmido A es capaz también de intensificar la producción de carotenoides en tejidos portadores de carotenoides. Estas transformaciones conducen a intensificar el valor nutritivo de un alimento para seres humanos y de un pienso para animales. Una ventaja adicional de usar una desaturasa de fitoeno de bacterias del tipo de Crtl en la transformación, consiste en que dicha enzima será expresada también en cloroplastos de las hojas, confiriendo con ello resistencia a herbicidas blanqueantes que tienen como diana una desaturasa de "*_f - - t ' fitoeno de plantas. La presente invención incluye por lo tanto también aprovechar la resistencia a los herbicidas blanqueantes en conjunción con plantas transgénicas que son portadoras por lo menos del plásmido A. El segundo plásmido B puede llevar el gen para una ciclasa de licopeno de 5 plantas; alternativamente, se puede usar una ciclasa de licopeno de bacterias, equipada con una secuencia de tránsito. Ésta se halla enlazada operativamente a un promotor, confiriendo preferiblemente la misma especificidad de expresión para tejidos que con la sintasa de fitoeno en el plásmido A. La transformación conjunta de los plásmidos A y B da como resultado la complementación del tejido 10 diana tal como una raíz, un tubérculo de fruto o una semilla con la información completa para llevar a cabo la ruta de biosíntesis de los carotenoides a partir del difosfato de geranil-geranilo para formar el ß-caroteno. En el caso de reacciones previamente existentes o inducidas posteriormente de la ruta, esta transformación conjunta (véase anteriormente) hace posible un contenido 15 acrecentado de carotenoides y una formación acrecentada de xantófilas derivadas de ß-caroteno. Todos los genes usados están equipados operativamente con una secuencia de ADN que codifica una secuencia de tránsito que permite la importación de un plástido. Esto se hace o bien mediante una tecnología de ADN 20 recombinante o la secuencia de tránsito está presente en el ADNc en uso de las plantas. La transformación permite entonces la formación de carotenoides usando una colección del compuesto precursor difosfato de geranil-geranilo s ua o en p st os. compuesto prmor ial ni es un carotenoide ni tampoco representa un compuesto precursor que solamente está dedicado a la biosíntesis de los carotenoides (véase la Figura 2). Las plantas deberán expresar el o los gen(es) introducido(s), y 5 preferiblemente son homocigóticas para su expresión. Generalmente, el gen estará enlazado operativamente a un promotor activo funcionalmente en las células hospedantes establecidas como diana de la planta particular. La expresión deberá efectuarse a un nivel tal que se obtenga la característica que se desea del gen. Por ejemplo, la expresión del gen del marcador seleccionable ío deberá proporcionar una selección apropiada de transformantes producidos de acuerdo con los métodos del presente invento. Similarmente, la expresión de uno o más genes de la ruta de biosíntesis de los carotenoides y las xantófilas para obtener una calidad nutritiva aumentada, deberá dar como resultado una planta que tenga un contenido relativamente mayor de uno o más de los compuestos 15 intermedios o productos de la ruta en comparación con el de la misma especie que no ha sido sometida al método de transformación del presente invento. Por otra parte, se deseará generalmente limitar la expresión excesiva del gen o de los genes que presentan interés con el fin de que se evite afectar desfavorablemente de modo significativo a la fisiología normal de la planta, es 20 decir hasta un grado tal que se haga difícil la cultivación de ésta. El gen o los genes que codifica(n) la enzima o las enzimas que presentan interés se pueden usar en casetes de expresión para la expresión en - - los tejidos de plantas transformadas. Para conseguir los objetivos de la presente invención, es decir para introducir o complementar la ruta de biosíntesis de los carotenoides en una planta diana que presenta interés, la planta es transformada con por lo menos una cásete de expresión que comprende una región de iniciación de la transcripción enlazada a un gen que presenta interés. La iniciación de la transcripción puede ser nativa o análoga al hospedante o bien ajena o heteróloga al hospedante. Por el término "ajena" se entiende que la región de iniciación de la transcripción no es hallada en el hospedante de tipo salvaje en el que se ha introducido la región de iniciación de la transcripción. Presentan interés particular las regiones de iniciación de la transcripción que están asociadas con proteínas de almacenamiento, tales como glutelina, patatina, napina, cruciferina, ß-conglicinina, faseolina, o similares. La cásete de transcripción incluirá, en la dirección 5'-3' de la transcripción, una región de iniciación de la transcripción y de la traducción, una secuencia de ADN que presenta interés, y una región de terminación de la transcripción y la traducción, que es funcional en plantas. La región de terminación puede ser nativa con la región de iniciación de la transcripción, puede ser nativa con la secuencia de ADN que presenta interés, o se puede derivar de otras fuentes. Convenientes regiones de terminación están disponibles a partir del plásmido Ti de A. tumefaciens, tales como las regiones de terminación de la sintasa de octopina y la sintasa de nopalina (véanse también, Guerineau y - - colaboradores, 1991 ; Proudfoot, 1991; Sanfacon y colaboradores, 1991; Mogen y colaboradores, 1990; Munroe y colaboradores, 1990; Bailas y colaboradores, 1989; Joshi y colaboradores, 1987). En su mayor parte, el gen o los genes de la presente invención que presenta(n) interés se dirigirá(n) como diana a plástidos, tales como cloroplastos, para su expresión. De esta manera, cuando el gen que presenta interés no ha sido introducido directamente en el plástido, la cásete de expresión contendrá adicionalmente una secuencia que codificará un péptido de tránsito para dirigir el gen que presenta interés hacia el plástido. Dichos péptidos de tránsito son conocidos en el sector de la técnica (véanse, por ejemplo, Von Heijne y colaboradores, 1991 ; Clark y colaboradores, 1989; Della-Cioppa y colaboradores, 1987; Romer y colaboradores, 1993, y Shah y colaboradores, 1986). Cualesquiera genes de la ruta de los carotenoides, útiles en la invención, pueden utilizar péptidos de tránsito nativos o heterólogos. La estructura artificial puede incluir también otros necesarios reguladores tales como secuencias de consenso de la traducción de plantas (Joshi, 1987), intrones (Luehrsen y Walbot, 1991 ) y similares, enlazadas/os operativamente a la secuencia de nucleótidos que presenta interés. Las secuencias de intrones situadas dentro del gen que se desea introducir pueden aumentar su nivel de expresión estabilizando el transcrito y permitiendo su translocación eficaz fuera del núcleo. Entre dichas secuencias de intrones que son conocidas se encuentran los intrones del gen de ubiquitina de plantas - (Cornejo, 1993). Además, se ha observado que la misma estructura artificial es introducida en diferentes loci del genoma pueden variar en el nivel de expresión en plantas. Se cree que el efecto es debido por lo menos en parte a la posición del gen en el cromosoma, es decir, materiales aislados individuales que tengan diferentes niveles de expresión (véase, por ejemplo Hoever y colaboradores, 1994). Otras secuencias de ADN reguladoras que se pueden usar para la construcción de casetes de expresión incluyen, por ejemplo, secuencias que son capaces de regular la transcripción de una secuencia de ADN asociada en tejidos de plantas en el sentido de una inducción o represión. Hay, por ejemplo, ciertos genes de plantas de los que se sabe que son inducidos por diversos factores internos y externos, tales como hormonas de plantas, choque de calor, productos químicos, patógenos, deficiencia de oxígeno, luz, estrés, etc. Un grupo adicional de secuencias de ADN que se pueden regular, comprende secuencias impulsadas químicamente que están presentes, por ejemplo, en los genes de proteínas PR (de pathogenesis-related, relacionadas con patogénesis) del tabaco y son inducibles por medio de reguladores químicos tales como los descritos en el documento de Solicitud de Patente Europea EP-A- 0.332.104. Todavía otra cuestión a considerar en la expresión de genes ajenos en plantas es el nivel de estabilidad del genoma transgénico, es decir, la tendencia de un gen ajeno a segregarse desde la población. Si un marcador - - _*4 seleccionable está enlazado al gen o a la cásete de expresión que presenta Interés, entonces se puede aplicar la selección a mantener a la planta transgénica. Puede ser beneficioso incluir secuencias directoras en d' en la 5 estructura artificial de cásete de expresión. Dichas secuencias directoras pueden actuar para intensificar la traducción. Las directoras de la traducción son conocidas en el sector de la técnica e ¡ncluyen: directoras de picornavirus, por ejemplo, la directora de EMCV (región no codificadora de encefalomiocarditis en 5'; Elroy-Stein y colaboradores, 1989); directoras de potyvirus, por ejemplo, la lo directora de TEV (de Tobacco Etch Virus = virus de corrosión del tabaco; Allison y colaboradores, 1986); y la proteína de fijación de cadenas pesadas de inmunoglobulinas humanas (BiP, Macejak y Sarnow, 1991 ); la directora sin traducir procedente del ARNm de una proteína de revestimiento del virus del mosaico de alfalfa (AMV RNA 4; Jobling y Gehrke, 1987); la directora del virus 15 de mosaico del tabaco (TMV; Gallie y colaboradores, 1989); y la directora del virus de manchas cloróticas del maíz (MCMV; Lommel y colaboradores, 1991 ; véase también Della-Cioppa y colaboradores, 1987). Dependiendo de donde se haya de expresar la secuencia de ADN que presenta interés, puede ser deseable sintetizar la secuencia con codones 20 preferidos para plantas, o alternativamente con codones preferidos para cloroplastos. Los codones preferidos para plantas pueden ser determinados a partir de los codones de más alta frecuencia en las proteínas expresadas en la - - mayor cantidad en la especie de planta particular que presenta interés (véanse por ejemplo, los documentos de solicitud EP-A 0.359.472; EP-A 0.386.962; WO 91/16432; Perlak y colaboradores, 1991 ; y Murray y colaboradores, 1989). De esta manera, las secuencias de nucleótidos se pueden optimizar para su 5 expresión en cualquier planta. Se reconoce que la totalidad o cualquier parte de la secuencia del gen puede ser optimizada o sintética. Esto quiere decir que se pueden usar también secuencias sintéticas o parcialmente optimizadas. Para la construcción de genes preferidos para cloroplastos véase el documento de Patente de los EE.UU. USPN 5.d4d.817. ío Para preparar la cásete de transcripción, los diversos fragmentos de ADN pueden ser manipulados, de manera tal que proporcionen las secuencias de ADN en la orientación apropiada y, como sea adecuado en el cuadro de lectura apropiado. A este fin, se pueden emplear adaptadores o enlazadores para unir los fragmentos de ADN o pueden estar implicadas otras 15 manipulaciones para proporcionar convenientes sitios de restricción, eliminación de ADN superfluos, eliminación de sitios de restricción, o similares. Con esta finalidad, se pueden emplear mutagénesis in vitro, reparación de cebadores, restricción, reanillamiento, resección, ligación, o similares, cuando pueden estar implicadas inserciones, deleciones o sustituciones, por ejemplo, transiciones y 20 transversiones. La cásete de expresión que lleva el gen que presenta interés es colocada dentro de un vector de expresión por métodos clásicos. La selección - - de un apropiado vector de expresión dependerá del método de introducir el vector de expresión en células hospedantes. Un típico vector de expresión contiene: elementos de ADN procarióticos que codifican un origen de replicación en bacterias y un gen de resistencia a antibióticos para proporcionar el crecimiento y la selección del vector de expresión en el hospedante bacteriano; un sitio de clonación para la inserción de una secuencia de ADN exógena, que en este contexto codificaría una o más enzimas específicas de la ruta de biosíntesis de los carotenoides; elementos de ADN eucarióticos que controlan la iniciación de la transcripción del gen exógeno, tal como un promotor; y elementos de ADN que controlan el tratamiento de transcritos, tales como la secuencia de terminación de la transcripción y de poliadenilación. También puede contener aquellas secuencias que se necesiten para la integración eventual final del vector en el cromosoma. En una realización preferida, el vector de expresión contiene también un gen que codifica un marcador de selección, tal como, porejemplo, fosfotransferasa de higromicina (van den Elzen y colaboradores, 198d), que está enlazada funcionalmente a un promotor. Ejemplos adicionales de genes que confieren resistencia a antibióticos y por lo tanto son apropiados como marcadores seleccionables, incluyen los que codifican fosfotransferasa de neomicina resistencia a kanamicina (Velten y colaboradores, 1984); el gen de resistencia a kanamicina (NPT II) derivado de Tnd (Bevan y colaboradores, 1983); el gen de PAT descrito en la cita de Thompson y colaboradores, 1987); - - y la acetiltransferasa de cloranfenicol. Para una descripción general de los vectores de expresión de plantas y de los genes de marcadores seleccionables, apropiados de acuerdo con la presente invención, véase Gruber y colaboradores, (1993). Tal como se ha señalado anteriormente, también es posible omitir un marcador de selección adicional procedente de una cásete de expresión que comprenda crtl bacteriano, cuyo producto de gen se ha mostrado que confiere resistencia a herbicidas blanqueantes. En esta realización específica, se prefiere que el crtl esté bajo el control de un promotor constitutivo o específico para un tejido. En una realización muy preferida, el crtl es controlado por un promotor específico para tejidos o células activos/as en la fotosíntesis verde y funcionalmente activo en tales tejidos o células. Un elemento promotor empleado para controlar la expresión del gen que presenta interés y el gen marcador, respectivamente, puede ser cualquier promotor compatible con plantas. Puede tratarse de promotores de genes de plantas tales como el promotor para la subunidad pequeña de carboxilasa de ribulosa-1 ,d-bis-fosfato (RUBISCO) o promotores procedentes de plásmidos inductores de tumores de Agrobacterium tumefaciens tales como los promotores de sintasa de nopalina y de sintasa de octopina, o promotores víricos tales como los promotores 19S y 3dS del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) o el promotor 3dS del virus del mosaico de la escrofularia. Véase la solicitud de patente internacional WO 91/19806, por ejemplo, acerca de una recopilación de conocidos promotores de plantas que son apropiados para su uso la presente - - invención. Los promotores "específicos para tejidos" proporcionan que la acumulación de uno o más de dichos productos de genes sea particularmente alta en el tejido en el que se habrán de expresar los productos de la ruta de biosíntesis de los carotenoides o de las xantófilas; una cierta expresión puede producirse en otras partes de la planta. Ejemplos de conocidos promotores específicos para tejidos incluyen el promotor de glutelina I (Kim y colaboradores, 1993; Okita y colaboradores, 1989; Zheng y colaboradores, 1993), el promotor de patatina de la clase I dirigido a tubérculos (Bevan y colaboradores, 1986); los promotores asociados con los genes de ADPGPP de tubérculos de patata (Muller y colaboradores, 1990); el promotor de ß-conglicinina en soja, también conocido como la proteína 7S que impulsa la transcripción dirigida a semillas (Bray, 1987); y promotores dirigidos a semillas procedentes de los genes para ceína del endospermo del maíz (Pedersen y colaboradores, 1982). Un tipo adicional de promotor que se puede usar de acuerdo con la invención es un promotor de ubiquitina de plantas. Los promotores de ubiquitina de plantas son bien conocidos en el sector de la técnica, como se evidencia por la cita de Kay y colaboradores, (1987), y por el documento EP-A-0.342.926. Son igualmente apropiados para la presente invención los promotores de actina, los promotores de histona y los promotores de tubulina. Ejemplos de preferidos promotores inducibles químicamente tales como el promotor PR-1a del tabaco, se detallan en el documento EP-A-0.332.104. Otra categoría preferida de promotores es la - - ?ue es inducible por laceraciones. Promotores preferidos de esta clase incluyen fos descritos por Stanford y colaboradores. (1989), Xu y colaboradores, (1993), Logemann y colaboradores, (1989), Rohrmeier & Lehle, (1993), Firek y colaboradores, (1993), y Warner y colaboradores, (1993). Las células, semillas, tejidos de plantas y plantas enteras que se consideran en el contexto de la presente invención se pueden obtener por uno cualquiera entre varios métodos. Los expertos en la materia apreciarán que la elección del método puede depender del tipo de planta, ya sea monocotiledónea o dicotiledónea, a la que se establece como diana para la transformación. Dichos métodos incluyen generalmente la transferencia directa de genes, la transferencia inducida químicamente de genes, la electroporación, la microinyección (Crossway y colaboradores, 1986; Neuhaus y colaboradores, 1987), la transferencia de genes mediada por Agrobacterium, la aceleración de partículas balísticas usando, por ejemplo, dispositivos disponibles a partir de Agracetus, Inc., Madison, Wisconsin, y Dupont, Inc., Wilmington, Delaware (véanse, por ejemplo, la patente de los EE.UU. 4.94d.0d0 de Sanford y colaboradores; y McCabe y colaboradores, 1988) y similares. Un método para obtener las presentes plantas transformadas o partes de las mismas, es la transferencia directa de genes en que las células de plantas son cultivadas o hechas crecer de otro modo en apropiadas condiciones en la presencia de oligonucleótidos de ADN que comprenden la secuencia de nucleótidos que se desea introducir en la planta o en la parte de ésta. La fuente Xr; t„. - 30 - % ée ADN del donante es típicamente un plásmido u otro vector apropiado que contenga el o los gen(es) que se desea(n). Por razones de conveniencia, se hace aquí referencia a plásmidos, en el entendimiento de que se consideran también otros vectores apropiados que contienen el o los gene(s) que se 5 desea(n). Cualquier apropiado tejido de planta que recoja el plásmido puede ser tratado por transferencia directa de genes. Un tejido de planta de este tipo incluye, por ejemplo, estructuras reproductivas en una etapa temprana de desarrollo, particularmente antes de la meiosis, y especialmente 1-2 semanas 10 antes de la meiosis. Generalmente, los órganos reproductivos previos a la meiosis son bañados en una solución del plásmido, tal como, por ejemplo, por inyección de una solución del plásmido directamente dentro de la planta junto a o cerca de los órganos reproductivos. Las plantas son entonces auto-polinizadas, o polinizadas de modo cruzado con el polen procedente de otra planta tratada 15 de la misma manera. La solución del plásmido contiene típicamente alrededor de 10-50 µg de ADN en aproximadamente 0,1-10 ml por estructura floral, pero se puede usar más o menos que esta cantidad dependiendo del tamaño de la estructura floral particular. El disolvente es típicamente agua estéril, una solución salina o una solución salina tamponada, o bien un medio convencional para 20 plantas. Si se desea, la solución del plásmido puede contener también agentes que induzcan o intensifiquen químicamente la recogida del plásmido, tales como, por ejemplo, PEG, Ca2+ o similares.

- - - - Después de la exposición de los órganos reproductivos al plásmido, la estructura floral se hace crecer hasta madurez y las semillas se cosechan. Dependiendo del marcador de plásmido, la selección de las plantas transformadas con el gen marcador se hace por germinación o crecimiento de 5 las plantas en un medio sensible al marcador o preferiblemente resistente al marcador. Por ejemplo, las semillas obtenidas a partir de plantas tratadas con plásmidos que tienen el gen de resistencia a kanamicina permanecerán verdes, mientras que las que carecen de este gen marcador son albinas. La presencia de la deseada transcripción en genes de ARNm procedentes de éstos y 10 expresión del péptido se puede demostrar adicionalmente por técnicas convencionales de transferencia de borrones Southern, Northern y Western. En otro método apropiado para llevar a cabo la presente invención, los protoplastos de plantas se tratan para inducir la recogida del plásmido. La preparación de los protoplastos es bien conocida en el sector de la técnica y 15 típicamente implica la digestión de células de plantas con una celulasa y otras enzimas durante un período de tiempo suficiente para eliminar la pared celular. Típicamente, los protoplastos son separados respecto de la mezcla de digestión por tamizado y lavado. Luego los protoplastos son suspendidos en un medio apropiado, tal como, por ejemplo, el medio F, el medio CC, etc., típicamente a 20 razón de 104- 107 células/ml. A esta suspensión se le añaden luego la solución de plásmido antes descrita y un inductor tal como polietilen-glicol, Ca2+, el virus de Sendai o similares. Alternativamente, los plásmidos se pueden encapsular en v 1 X j#? líposomas. Las soluciones de plásmidos y protoplastos se incuban luego durante un período de tiempo apropiado, típicamente alrededor de 1 hora a aproximadamente 25°C. En algunos casos, puede ser deseable someter a choque por calor a la mezcla calentándola brevemente a alrededor de 4d°C, por 5 ejemplo, durante 2-d minutos, y enfriándola con rapidez hasta la temperatura de incubación. Los protoplastos tratados son luego clonados y seleccionados en cuanto a expresión del o los gen(es) deseado(s), por ejemplo, por expresión del gen marcador y convencionales técnicas de transferencia de borrones. Las plantas enteras son regeneradas luego a partir de los clones de una manera 10 convencional. La técnica de electroporación es similar excepto que se aplica típicamente una corriente eléctrica a la mezcla de plásmidos y protoplastos desnudos, dentro de una cámara para electroporación en la ausencia o presencia de polietilen-glicol, Ca2+ o similar. Una electroporación típica incluye 15 1-10 impulsos de 40-10.000 voltios de corriente continua (CC) por una duración de.1-2.000 µs típicamente a intervalos de 0,2 segundos (s) entre impulsos. Se pueden usar también impulsos de corriente alterna de rigurosidad similar. Más típicamente, un condensador eléctrico cargado es descargado a través de la cámara de electroporación que contiene la suspensión de protoplastos del 20 plásmido. Este tratamiento da como resultado un aumento reversible en la permeabilidad de las biomembranas y permite por lo tanto la introducción del ADN de acuerdo con el invento. Los protoplastos de plantas electroporadas - - renuevan su pared celular, se dividen y forman tejido de callos (véase, por ejemplo, la cita de Riggs y colaboradores, 1986). Otro método apropiado para transformar células dianas implica el uso de Agrobacterium. En este método, una Agrobacterium que contiene el 5 plásmido con el gen o las casetes de gen que se desean, se usa para infectar células de plantas e introducir el plásmido en el genoma de las células dianas. Las células que expresan el gen deseado se seleccionan y clonan luego como antes se ha descrito. Por ejemplo, un método para la introducción de un gen que presenta interés dentro de un tejido diana, por ejemplo, un tubérculo, una raíz, 10 un grano o una legumbre, por medio de un plásmido, por ejemplo, un plásmido Ri y una Agrobacterium, p.ej. A. rhizogenes o A. tumefaciens, consiste en utilizar un pequeño plásmido recombinante apropiado para su clonación en Escherichia coli, dentro de la que se ha empalmado un fragmento de ADN-T (ADN de transformación). Este plásmido recombinante es abierto por disociación en un 15 sitio dentro del ADN-T. Un trozo de ADN "pasajero" es empalmado en esta abertura. El ADN pasajero consiste en el o los gen(es) de este invento que se ha(n) de incorporar en el ADN de la planta así como un marcador seleccionable, por ejemplo, un gen de resistencia a un antibiótico. Este plásmido es luego vuelto a clonar dentro de un plásmido de mayor tamaño y a continuación introducido en 20 una cepa de Agrobacterium que lleva un plásmido Ri sin modificar. Durante el crecimiento de las bacterias, tendrá lugar algunas veces una rara recombinación doble que dará como resultado bacterias cuyo ADN-T alberga un inserto: el ADN %f , pasajero. Dichas bacterias son identificadas y seleccionadas en cuanto a su supervivencia en medios que contienen el antibiótico. Estas bacterias se usan para introducir su ADN-T (modificado con ADN pasajero) en el genoma de una planta. Este procedimiento que utiliza A. rhizogenes o A. tumefaciens da lugar 5 a células de plantas transformadas que se pueden regenerar para formar plantas viables y sanas (véase, por ejemplo, Hinchee y colaboradores, 1988). Otro enfoque apropiado consiste en bombardear las células con microproyectiles que están revestidos con el ADN de transformación (Wang y colaboradores, 1988) o son acelerados a través de una solución que contiene ío ADN en la dirección de las células que se han de transformar por un impacto de presión, siendo de este modo dispersados finamente para formar una niebla con la solución como resultado del impacto de presión (véase el documento EP-A-0 434 616). El bombardeo con microproyectiles ha sido adelantado como una 15 técnica eficaz de transformación para células, inclusive células de plantas. En la cita de Sanford y colaboradores, (1987), se informó de que el bombardeo con microproyectiles era eficaz para suministrar ácido nucleico al citoplasma de las células de plantas de Allium cepa (cebolla). Christou y colaboradores, (1988), informaron sobre la transformación estable de callos de soja con un gen de *20 resistencia a kanamicina a través de un bombardeo con microproyectiles. Los mismos autores informaron sobre la penetración en aproximadamente 0,1 % a d% de las células y se encontraron niveles observables de actividad de la enzima - - HH PTII y de resistencia a ella en los callos transformados, de hasta 400 mg/l de kanamicina. McCabe y colaboradores, (1988), informaronn sobre la transformación estable de Glycine max (soja) usando un bombardeo con microproyectiles. McCabe y colaboradores informaron además sobre la 5 recuperación de una planta transformada R^ a partir de una planta quimérica Rg (véanse también, Weissinger y colaboradores, 1988; Datta y colaboradores, 1990 (para arroz); Klein y colaboradores, 1988a (para maíz); Klein y colaboradores, 1988b (para maíz); Fromm y colaboradores, 1990; y Gordon- Kamm y colaboradores, 1990 (para maíz). 10 Alternativamente, un plástido de plantas puede ser transformado directamente. Sopbre la transformación estable de cloroplastos se ha informado en plantas superiores, véanse, por ejemplo, SVAB y colaboradores, (1990); SVAB y Maliga, (1993); Staub y Maliga, (1993). El método recurre al suministro con un cañón de partículas de un ADN que contiene un marcador seleccionable 15 y a la dirección a diana del ADN hacia el genoma del plástido a través de una recombinación homologa. En dichos métodos, la expresión de genes en plástidos se puede conseguir por uso de un promotor de genes en plástidos o por trans-activación de un trans-gén llevado por un plástido tácito, colocado para su expresión a partir de una secuencia de promotor selectiva, tal como se 20 reconoce por la polimerasa de ARN de T7. El gen de plástido tácito es activado por expresión de la polimerasa de ARN específica a partir de una estructura artificial de expresión nuclear y por dirección a diana de la polimerasa hacia el La expresión específica de un tejido se puede obtener en dicho método por uso de una polimerasa de ARN específica codificada nuclearmente y dirigida a un plástido, expresada a partir de un promotor apropiado específico para un tejido de planta. Dicho sistema ha sido 5 informado en McBride y colaboradores, (1994). No se reivindica que sea completa la lista de posibles métodos de transformación que se da anteriormente por vía de ejemplo, y no se pretende que limite el objeto de la invención de ninguna de las maneras. Por lo tanto, la presente invención comprende también un material ío de plantas transgénicas, seleccionado entre el grupo que consta de protoplastos, células, callos, tejidos, órganos, semillas, embriones, óvulos, cigotos, etc., y, especialmente, plantas enteras, que se ha transformado por medio del método de acuerdo con el invento y comprende el ADN recombinante de la invención en forma expresable, y procedimientos para la producción de dicho material de 15 plantas transgénicas. Los transformantes positivos son regenerados para dar plantas siguiendo procedimientos bien conocidos en el sector de la técnica (véase, por ejemplo, McCormick y colaboradores, 1986). Luego estas plantas se pueden hacer crecer, y o bien se pueden polinizar con la misma selección de cepas 20 transformadas o con diferentes cepas antes de que la progenie se pueda evaluar en cuanto a la presencia de las deseadas propiedades y/o a la extensión en la que las deseadas propiedades son expresadas y se pueda evaluar el resultante - - híbrido que tenga las deseadas características fenotípicas. Una primera evaluación puede incluir, por ejemplo, el nivel de resistencia a bacterias/hongos de las plantas transformadas. Se pueden hacer crecer dos o más generaciones para asegurar que la característica fenotípíca en cuestión sea mantenida establemente y heredada, y luego se pueden cosechar las semillas para asegurar que se haya conseguido el deseado fenotipo u otra propiedad. Están comprendidas además dentro del alcance de la presente inveción plantas transgénicas, en particular plantas fértiles transgénicas que han sido transformadas por medio del método de la invención, y su progenie asexual y/o sexual, que todavía presente la(s) nueva(s) y deseable(s) propíedad(es) debido a la transformación de la planta madre. Se entiende que el término "progenie" abarca la progenie generada tanto "asexualmente" como "sexualmente" de plantas transgénicas. Se entiende que esta definición incluye también todas las mutantes y variantes obtenibles por medio de procedimientos conocidos tales como por ejemplo fusión de células o selección de mutantes, y que todavía exhiban las características propiedades de la planta inicial transformada, juntamente con todos los productos de cruce y fusión del material de plantas transformadas. Las partes de plantas, tales como por ejemplo flores, tallos, frutas, hojas, raíces, que se originan en plantas transgénicas o su progenie previamente transformada por medio del método de la invención y que consisten por lo tanto, al menos en parte, en células transgénicas, son también un objeto de la presente i vención. Los siguientes ejemplos son ilustrativos pero no limitativos de la presente invención.

Deposición de material biológico Las cepas de E. coli que llevan las casetes de expresión de acuerdo con la presente invención han sido depositadas de lo previsto en el Tratado de Budapest en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares = Deutsche Sammiung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) en Braunschweig, Alemania, bajo los siguientes números de acceso: Cepa N° de acceso PRiceCYC TOP10 (cásete del plásmido B) DSM 12714 Pbaal42 TOP10 (cásete del plásmido A) DSM 12713 Ejemplos Introducción de la biosíntesis de provitamina A (ß-caroteno) y xantofilas en un endospermo de arroz (Oryza sativa) exento de carotenoides. Formación de fitoeno (Burkhardt y colabores, 1997) Investigaciones bioquímicas anteriores, que usaron difosfato de isopentenilo marcado radiológicamente, han demostrado que el endospermo de arroz posee sintasa de GGPP enzimáticamente activa, proporcionando de esta manera un precursor importante para la biosíntesís de los carotenoides. Por lo - - tanto, el modelo en arroz Japónica variedad Taipei 309 se transformó mediante bombardeo con microproyectiles con un ADNc que codificaba la sintasa de fitoeno procedente de narciso atrompetado (Narcissus pseudonarcissus; (número de acceso X78814, Schledz y Beyer, 1996; Schledz y colaboradores, 1996) bajo el control de un promotor constitutivo y bajo el control de un promotor específico para el endospermo. En plantas de arroz transgénico se mostró que la enzima de narciso atrompetado era activa por la acumulación in vivo del caroteno sin colorear fitoeno en el endospermo de arroz. Se demostró por lo tanto por primera vez que era posible en principio tratar por ingeniería genética la primera etapa enzimática específica para caroteno en una biosíntesis de carotenoides dentro de un tejido no fotosintético, que carecía de carotenoides. - 4 - fe y *^ * ^* INTRODUCCIÓN DE LA RUT P6 BIOSINTESIS DE CAROTENOIDES HACIA LICOPENO, ß-CAROTENO (PROVITAMINA A) Y XANOFILAS EN ENDOSPERMO DE ARROZ 5 Construcción del plásmido (Acerca de las técnicas clásicas de biología molecular véase Sambrook y colaboradores, 1989. Para una representación esquemática de las estructuras artificiales, véase la Figura 4). Los genes estructurales que codifican enzimas para la biosíntesis de los carotenoides fueron: 10 Psy. sintasa de fitoeno procedente de Narcissus pseudonarcissus (número de acceso X 78814). crtl: desaturasa de carotenos procedente de la bacteria Erwinia uredovora fusionada con la secuencia de tránsito del guisante Rubisco (Misawa y colaboradores, 1993), 15 cyc: ciclasa de licopeno procedente de Narcissus pseudonacissus (número de acceso X 98796).

Construcción de pB19hpc (denominado "plásmido A" en el texto): Un fragmento de ADN que lleva el gen intacto de desaturasa de 20 fitoeno (crtl) procedente de Erwinia uredovora con la secuencia del péptido de tránsito de la subunidad pequeña (tp) de guisante de Rubisco, situada secuencia abajo del promotor de 3dS de CaMV y secuencia arriba de la señal de - - poliadenilación en 3' nos, ha sido construido por Misawa y colaboradores (1993) y ligado dentro de pUC19 digerido con HindIII/EcoRI para obtener el plásmido pUCET4. La cásete de expresión de crtl se escindió a partir de pUCET4 como un fragmento para HindIII/EcoRI y se ligó dentro de pBluescriptKS digerido con HindIII/EcoRI, proporcionando el plásmido pBaall. El plásmido pGtIPsyH (Burckhardt y colaboradores, 1997) que lleva una cásete de expresión de psy que consta del ADNc de sintasa de fitoeno procedente de Narcissus pseudonarcissus (número de acceso X78814) bajo el control del promotor de glutelina 1 de arroz (Gtl; Kim y colaboradores, 1993; Okita y colaboradores, 1989; Zheng y colaboradores, 1993) y de la señal de poliadenilación en 31 nos, se digirió con Sacll y se terminó en extremos romos usando la polimerasa de ADN de T4. Para obtener la cásete de expresión de psy, se llevó a cabo una segunda digestión con Kpnl. El fragmento para Sacll (terminado de modo romo)/Kpnl se ligó luego dentro del pBaah digerido con Xhol (terminado de modo romo)/Kpnl para obtener el plásmido pBaal2 que lleva unas casetes de expresión de crtl y psy. Los sitios con polienlazadores del pUC18 se reemplazaron para contener los siguientes sitios de restricción en el siguiente orden: HindIH, l-Scel, Kpnl, Notl, Smal, Iscel, EcoRl. El resultante plásmido pUC18M se digirió con Kpnl y Notl. Un fragmento de ADN que llevaba las casetes de expresión de crtl y psy se escindió desde el pBaal2 usando Kpnl y Notl y se ligó en el pUC18M digerido que antes se ha mencionado. El obtenido plásmido pBaal3 contiene las - - dobles casetes de expresión flanqueadas por dos sitios de restricción con meganucleasas (l-Scel). La cásete de expresión del gen de fosfotransferasa de higromicina aph IV, que contiene aph IV bajo el control del promotor de CaMV3dS y la señal de poliadenilación de CaMV 3dS, se escindió a partir de pRice (véase la construcción del plásmido B) como un fragmento para Kpnl y se ligó dentro del pBaal3 digerido con Kpnl. Los plásmidos obtenidos pBaal42 y pBaal43 contienen la cásete de resistencia a higromicina en la misma orientación que la de la cásete de expresión de psy (pBaal42) o en la orientación opuesta a ella (pBaal41). El vector pBin19 (Bevan, 1984) se digirió con EcoRI y Hindlll y una secuencia de oligonucleótido sintético que contiene los siguientes sitios de restricción en el siguiente orden: Hindlll, l-Scel, Kpnl, Smal, Iscel, EcoRI se introdujo usando un protocolo apropiado, que constituyó el pBin19M. Las casetes de expresión de crtl, psy y aph IV se escindieron a partir de pBaal42 usando los sitios de meganucleasas l-scel, y se ligaron dentro del pBin19M después de digestión con l-secl. El resultante plásmido pB19hpc se usó luego para transformación.

Construcción de pZCvcH (denominado "plásmido B" en el texto): El promotor de glutelina 1 Gtl se escindió a partir de pKS1 (Okita y colaboradores, 1989) usando EcoRI/BglII y se ligó dentro de pV34 digerido con - - $?c$f BamHI/Munl (Füttere y Potrykus, sin publicar) entre dos sitios para meganucleasas I-Sec1 para obtener el plásmido pV34Gt1. La cásete de expresión del gen de fosfotransferasa de higromicina aph IV que contenía una señal de poliadenilación de CaMV 3dS, seguida por aph IV bajo el control del 5 promotor de CaMV 3dS y una segunda señal de poliadenilación de CaMV 3dS, se escindió después de ello a partir de pCIB900 (Wünn y colaboradores, 1996) usando Salí y Sacl. Después de ligación de un adaptador con Xhol al sitio para Salí con el fragmento obtenido, la cásete se ligó dentro de pV34Gtl para obtener el plásmido (pRice). La ciclasa de licopeno cyc procedente de Narcissus 10 pseudonarcissus (número de acceso X98796) se escindió a partir del plásmido pGEM4CYC (Bonk y colaboradores, 1997) usando Ecl136ll y BamHl. Después del tratamiento con el fragmento Klenow, la cyc se ligó dentro de pRice digerido con Ecl36ll para obtener el pRiceCYC. El vector pPZPIOO (Hajdukiewicz y colaboradores, 1994) se digirió 15 con EcoRI y Hindlll y se introdujo una secuencia de oligonucleótido sintético que contenía los siguientes sitios de restricción en el siguiente orden: Hindlll, l-Scel, Kpnl, Notl, Smal, Iscel, EcoRI usando un protocolo clásico, que constituyó el pPZPIOOM. La doble cásete cyc aphlV se escindió a partir de pRiceCYC 20 usando la meganucleasa Iscel y se ligó dentro de un pPZPIOOM digerido con Iscel para obtener el plásmido de transformación pZCycHH.

- - Inducción v transfonyación de callos Inducción de callos: Semillas inmaduras de arroz japónico varidad cultivar TP 309 en la etapa de leche se recogieron a partir de plantas que habían crecido en un invernadero, se esterilizaron superficialmente en etanol al 70% (v/v) durante 1 min, se incubaron en hipoclorito de calcio al 6% durante una hora en un agitador y se enjuagaron 3-5 veces con agua destilada estéril. Luego los embriones inmaduros fueron aislados a partir de las semillas esterilizadas bajo un microscopio binocular en una mesa de laboratorio limpia con flujo de aire, y cultivadas sobre un medio NB (sales N6 y vitaminas B5, suplementadas con 30 g/l de maltosa, 500 mg/l de prolina, 300 mg/l de material hidrolizado de caseína, 500 mg/l de glutamina y 2 mg/l de 2,4-D, de pH 5,8). Después de 4-d días se retiraron los coleóptilos, y los escudetes hinchados se subcultivaron sobre un medio NB de nueva aportación durante 3-d días hasta la inoculación de Agrobacterium. Transformación mediada por Agrobacterium: Embriones inmaduros previamente cultivados en la edad de una semana se sumergieron en una suspensión de células de Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 como se ha descrito (por Uze y colaboradores, 1997). Para la transformación conjunta de los dos vectores separados, pZPsC y pZCycH, se usaron para inoculación LBA4404/pZPsC (DO600 = 2,0) mezcladas con un volumen igual de LBA4404/pZCycH (DO600 = 1 ,0) después de inducción con acetona-siringona. Los embriones previamente cultivados e inoculados se cultivaron conjuntamente sobre un medio NB suplementado con acetona-siringona 200 mM durante 3 días, se subcultivaron sobre un medio de recuperación (NB con 2d0 mg/l de cefotaxima) durante una semana y luego se transfirieron a un medio de selección NB en presencia de 30 mg/l de higromicina y 2d0 mg/l de cefotaxima durante 4-6 semanas. Las plantas se regeneraron a partir de callos resistentes recuperados sobre un medio NB suplementado con 0,d mg/l de NAA y 3 mg/l de BAP en 4 semanas, se enraizaron y transfirieron a un invernadero.

Transferencia de borrones Southern Para probar la presencia de los trans-genes, se llevaron a cabo transferencias de borrones Southern de acuerdo con métodos clásicos (Sambrook y colaboradores, (1989)) usando las sondas marcadas homologas derivadas de sintasa de fitoeno, Crtl y ciclasa.

Análisis de pigmentos de carotenoides Semillas (1 g) de plantas RO se descascarillaron y trataron durante 8 h con papel de esmeril sobre un sacudidor, para eliminar el revestimiento de las semillas. Por inspección visual las líneas transformadas mostraron un color amarillento claramente detectable debido a la presencia de carotenoides. Además, era detectable un modelo de segregación que en algunos casos era muy próximo a la relación esperada de 3 (amarillo) a 1 (blanco). La suma de semillas procedentes de líneas individuales (60, cada - - una) se trituraron para dar un polvo fino usando un micro-desmembrador (Braun, Melsungen). Este material se extrajo repetidamente con acetona para completar la descoloración. Los extractos combinados se secaron bajo una corriente de nitrógeno. El residuo se disolvió en cloroformo y se aplicó cuantitativamente a un análisis por HPLC usando un sistema para HPLC de Waters equipado con un detector por conjuntos de fotodiodos y una columna de fase inversa C30 (YMC Europe GmbH). La separación se llevó a cabo usando los sistemas de disolventes A: MeOH y terc.-butil-metil-éter (1 :1 , v/v) B: MeOH, terc.-butil-metil-éter y H20 (6:1 ,2:1 ,2, v/v/v) usando un gradiente desde 100% de B hasta 43% de B en el transcurso de 2d min y luego hasta 0% de B en el transcurso de 7d min adicionales. Estas condiciones finales se mantuvieron durante 10 min adicionales antes de la reequilibración. Ejemplos de los resultados obtenidos se dan en la Figura 3A para un testigo sin transformar, en la Figura 3B para una línea que lleva solamente el plásmido A y en la Figura 3C para una línea que lleva los plásmidos A y B. Evidentemente, los carotenoides se acumulan en los transformantes. Los testigos exhibieron algunas veces ciertas cantidades trazas de carotenoides que se pueden atribuir en su mayor parte al revestimiento de las semillas, que es difícil de eliminar por completo. Entre los carotenoides detectados en las semillas transformadas, el ß-caroteno (provitamina A) representa el producto principal (hasta 60%). Además, la ruta de formación de xantófilas era activa conduciendo a la formación de luteína y zeaxantina, así como de ciertas cantidades de carotenoides epoxidados. Se saca la conclusión - - de que esta parte tardía de la ruta es o bien inducida por la transformación o por productos derivados de la transformación. Alternativamente, la ruta de formación de xantófilas es expresada constitutivamente en el endospermo de arroz, dando como resultado la formación de las xantófilas zeaxantina y luteína más algunos componentes minoritarios adicionales, que representan xantófilas epoxidadas. Las líneas transformadas con el plásmido A a solas mostraron en principio el mismo modelo de carotenoides, pero el contenido de carotenoides era generalmente más bajo, por lo que las conclusiones anteriores se prolongan a una ciclasa de licopeno en el endospermo de arroz. Especialmente, las presencias de luteína y zeaxantina son consideradas como un valor añadido inesperado debido a sus efectos positivos, por ejemplo, sobre la visión (véase, por ejemplo. Brown y colaboradores, 1998; Schalch, 1992). Evidentemente, son posibles muchas modificaciones y variaciones de la presente invención a la luz de las enseñanzas anteriores. Se ha de entender, por lo tanto, que dentro del alcance de las reivindicaciones anejas, el invento se puede practicar de una manera distinta de la que se ha descrito específicamente.

El precursor difosfato de qeranil-geranilo se presenta ubicuamente en un material de plantas Para ensayar en cuanto a la presencia de GGPP en otros tejidos distintos que los de arroz, se llevaron a cabo experimentos de incubación, de una manera análoga a como se ha dj scrito para el endospermo de arroz, con el aislado el endospermo aislado a partir de dos variedades de trigo de laboratorio, dos variedades de cebada y del fruto de banana de Cavendish. Los granos inmaduros de trigo y cebada se descascarillaron, el endospermo se separó exprimiendo y el embrión se retiró. Los experimentos de incubación se llevaron a cabo en un tampón Tris/HCl 100 mM de pH 7,4, MgCI2 10 mM, MnCI2 1 mM, ATP 3 mM en la presencia de 0,d µCi de [1-14C]difosfato de isopentenilo durante 6 h a 2d°C. Los análisis individuales se suplementaron con fosfatasa alcalina para permitir la desfosforilación de los prenil-difosfatos formados. Después de 3- 6 h, se aislaron materiales solubles en lípidos que incluían los correspondientes prenil-alcoholes mediante extracción con una mezcla de cloroformo y metanol (2/1 , v/v). Esto fue seguido por un análisis por HPLC, como se señala anteriormente. En el endospermo procedente de las variedades de trigo examinadas (estando ambas esencialmente exentas de carotenoides) se observó una señal muy pronunciada que, usando GGPP desfosforilado auténtico (producido con la ayuda de sintasa de GGPP recombinante procedente de Sinapis alba), demostró que representaba geranil-geraniol. Por lo tanto, la instalación por transformación de la biosíntesis de provitamina A en trigo parece tan factible como en arroz. Cantidades más pequeñas pero detectables de GGPP en la forma del correspondiente alcohol se observaron en cebada, como una expresión del hecho de que el endospermo de cebada exhibe algún - - pequeño fundamento de formación de carotenoides. Similarmente, la banana de Cavendish produce carotenoides y por lo tanto no fue sorprendente la presencia de actividades formadoras de GGPP, que se observaron especialmente en un estado maduro.

Genes de biosíntesis de carotenoides que inducen CPTA El inhibidor de ciclasa de licopeno CPTA (hidrocloruro de 2-(4-cloro- fenil-tio)trietil-amina) conocido desde hace mucho tiempo, y compuestos afines (véase por ejemplo, El-Sayed Osman y colaboradores, 1984; Fosket y Radin, 1982) imitan, con respecto a la acumulación de licopeno, a la transformación con el plásmido A. Buscando demostrar una regulación en sentido de ascenso de los genes de biosíntesis de los carotenoides, los presentes autores hemos sintetizado CPTA de acuerdo con el método presentado por Scheutz y Baldwin (19d7) aplicando este compuesto en una solución acuosa 1 mM a flores de narciso atrompetado. Este tejido fotosintéticamente inactivo respondió acumulando licopeno, como se esperaba. Sin embargo, de modo inexplicable por la acción principal de CPTA (¡que es un inhibídor¡) el contenido de carotenoides casi se duplicó. Por lo tanto se llevaron a cabo análisis de transferencia de borrones Northern y Western para demostrar una posible inducción de la abundancia en transcritos que codifican las enzimas de biosíntesis de los carotenoides, o un aumento de la abundancia de enzimas. La Figura 5A presenta los resultados de las transferencias de borrones Northern. El ARN total se aisló a partir de flores sin tratar (pista 1 ) y de flores tratadas con CPTA. El ARN inmovilizado se extrajo por arrastre repetidamente para permitir una subsiguiente hibridación con sondas para sintasa de fitoeno (B), desaturasa de fitoeno (C), desaturasa de ?-caroteno y 5 ciclasa de licopeno. Es evidente que, con la excepción de la desaturasa de ?- caroteno, todos los ARNs carotenogénicos específicos, inclusive la ciclasa de licopeno, aumentan en su abundancia. Para análisis de transferencia Western (véase la Figura 5B), las proteínas totales se aislaron a partir de flores sin tratar y de flores tratadas con -. ío CPTA y, a continuación de una electroforesis en gel de SDS-poli-(acrilamida) (30 µg de proteína por pista) se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Los borrones fueron los revelados con anticuerpos dirigidos contra sintasa de fitoeno (A), desaturasa de fitoeno (B), desaturasa de ?-caroteno (C) y ciclasa de licopeno. Es evidente que al nivel de las proteínas tiene lugar un aumento en la 15 abundancia de enzimas después de un tratamiento con CPTA. Con los datos de arroz dados anteriormente hemos sacado la conclusión de que los carotenoides (o productos derivados de ellos) inducen genéticamente la formación de carotenoides en una especie de mecanismo de retroacción. 20 La presente invención proporciona por lo tanto medios de ingeniería genética con el fin de introducir la ruta de biosíntesis de los carotenoides en tejidos exentos de carotenoides o de aumentar la productividad de rutas de biosíntesis de ca? >4enoides previamente existentes. El método se puede usar para mejorar el valor nutritivo, la farmacología y el aspecto visual de semillas, frutas, tubérculos, flores u hojas. La invención es principalmente útil para mejorar las demandas de nutrición, donde no es particularmente relevante producir grandes cantidades de carotenoides. Por ejemplo, el arroz en su forma molida consta del endospermo, que no contiene carotenoides coloreados detectables. Éstos se presentan en el revestimiento de las semillas, que se elimina durante el tratamiento. Este tratamiento es requerido para hacer posible un almacenamiento a largo plazo de granos de arroz. Esta invención representa el primer ejemplo de un desarrollo por ingeniería de novo de una ruta de biosíntesis de los carotenoides, y es aplicable a otros tejidos de plantas útiles exentas de carotenoides, agronómicamente importantes, por ejemplo otras semillas de cereales, o a tejidos de raíces que están exentos de carotenoides coloreados o sin colorear. Esto no excluye el potencial del método para aumentar o modificar los carotenoides previamente existentes.

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Biol. 22, 573-588 Zheng y colaboradores (1993) Plant J. 4, 357-366 INDICACIONES RELACIONADAS CON EL DEPOSITO DE UN MICROORGANISMO (Reglamento de PCT ?Zbis) A. Las indicaciones expresadas a continuación se relacionan con el microorganismo al que se hace referencia en la descripción en la página 20 línea 32 .

B. IDENTIFICACIÓN DE DEPOSITO otros depósitos se identifican en una página adicional. El Nombre de la institución depositante DSMZ-Deutsche Sammiung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH Domicilio de la institución depositante (incluyendo código postal y páis) Mascheroder Weg Ib 38124 Braunscheweig Alemania Fecha de depósito Número de acceso 5 de marzo de 1999 DSM 12714 C INDICACIONES ADICIONALES (dejar en blanco si no es aplicable). Esta información continua en una página adicional D D. ESTADOS DESIGNADOS PARA LOS QUE SE HACEN INDICACIONES (de no aparecer las indicaciones para todos los estados designados) E.CARACTERISTICAS SEPADAS DE INDICACIONES (dejar en blanco de no ser aplicable) Las indicaciones y listadas a continuación se presentarán a la oficina Internacional posteriormente (especifique la naturaleza general de las indicaciones, por ejemplo, "número de acceso de depósito") Para uso exclusivo de la oficina de recepción Para uso exclusivo de la oficina Internacional El Esta página se recibió con la solicitud O La oficina Internacional recibió esta página en: internacional Funcionario autorizado Funcionario autorizado FIRMADO Forma PCT/RO/134 (julio de 1992) INDICACIONES RELACIONADAS CON EL DEPOSITO DE UN MICROORGANISMO (Reglamento de PCT 136/s) A. Las indicaciones expresadas a continuación se relacionan con el microorganismo al que se hace referencia en la descripción en la página 20 línea 33 .

B. IDENTIFICACIÓN DE DEPOSITO otros depósitos se identifican en una página adicional. D Nombre de la institución depositante DSMZ-Deutsche Sammiung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH Domicilio de la institución depositante (incluyendo código postal y páis) Mascheroder Weg Ib 38124 Braunscheweig Alemania Fecha de depósito Número de acceso 5 de marzo de 1999 DSM 12714 C. INDICACIONES ADICIONALES (dejar en blanco si no es aplicable) Esta información continua en una página adicional D D. ESTADOS DESIGNADOS PARA LOS QUE SE HACEN INDICACIONES (de no aparecer las indicaciones para todos los estados designados) E.CARACTERISTICAS SEPADAS DE INDICACIONES (dejar en blanco de no ser aplicable) Las indicaciones y listadas a continuación se presentarán a la oficina Internacional postenormente (especifique la naturaleza general de las indicaciones, por ejemplo, "número de acceso de depósito") Para uso exclusivo de la oficina de recepción Para uso exclusivo de la oficina Internacional (SI Esta página se recibió con la solicitud D La oficina Internacional recibió esta página en: internacional Funcionario autorizado Funcionario autorizado FIRMADO Forma PCT/RO/134 (julio de 1992)

Claims

- - NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una molécula de ADN aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que proporciona una o más casetes de expresión capaces de dirigir la producción de dos o tres enzimas específicas para la ruta de biosíntesis de los carotenoides, que son: una sintasa de fitoeno derivada de plantas u hongos, y una desaturasa de fitoeno derivada de hongos o bacterias, o una desaturasa de fitoeno y una desaturasa de ß-caroteno derivada de plantas.

2.- La molécula de ADN de acuerdo con la reivindicación 1 , en la que dicha cásete de expresión comprende genes o ADNc's que codifican una sintasa de fitoeno de plantas u hongos, una desaturasa de fitoeno de hongos o bacterias o una desaturasa de fitoeno de plantas y una desaturasa de ?-caroteno, cada una de ellas enlazada operativamente a un adecuado promotor constitutivo, inducible o específico para tejidos, permitiendo su expresión en células, semillas, tejidos de plantas o plantas enteras.

3.- La molécula de ADN de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, que comprende además por lo menos un gen marcador seleccionable o ADNc enlazado operativamente a una secuencia de promotor constitutivo, inducible o específico para tejidos, permitiendo su expresión en células, semillas, tejidos de plantas o plantas enteras.

4.- La molécula de ADN de acuerdo con una cualquiera de las a llil JM i lili lili - - reivindicaciones 1 a 3, en que la secuencia de nucleótidos que codifica una sintasa de fitoeno se origina a partir de plantas, expresada preferiblemente bajo el control de un promotor específico para tejidos.

5.- La molécula de ADN de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, en que la secuencia de nucleótidos que codifica una desaturasa de fitoeno se origina a partir de bacterias.

6.- La molécula de ADN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en que la secuencia de nucleótidos que codifica una desaturasa de fitoeno está fusionada con una secuencia que codifica un apropiado péptido de tránsito en plástidos, ambas de los cuales se expresan preferiblemente bajo el control de un promotor específico para tejidos o constitutivo.

7.- La molécula de ADN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en la que el gen o ADNc marcador seleccionable es una fosfotransferasa de higromicina bajo el control de un promotor constitutivo.

8.- La molécula de ADN de acuerdo con la reivindicación 6 ó 7, en la que dicha secuencia de péptido de tránsito en plástidos se deriva de la subunidad pequeña del guisante Rubisco (tp).

9.- Un sistema de plásmido o vector que comprende las moléculas de ADN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

10.- Un sistema de plásmido o vector de acuerdo con la reivindicación 9, que se deriva de Agrobacterium tumefaciens.

11.- Una célula, una semilla, un tejido de planta o una planta entera *£» . , r - - J ?í J 1 , transgénica que contiene una molécula de ADN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

12.- Una célula, una semilla, un tejido de planta o una planta entera transgénica de acuerdo con la reivindicación 11 , seleccionada entre el grupo que 5 consiste en algas eucarióticas, embriofitos que comprenden Bryophyta, Pteridophyta y Spermatophyta tales como Gymnospermae y Angiospermae, incluyendo estas últimas Magnoliopsida, Rosopsida y Liliopsida ("monocotiledóneas").

13.- Una célula, una semilla, un tejido de planta o una planta entera 10 transgénica de acuerdo con la reivindicación 12, seleccionada entre el grupo que consta de semillas de cereales y otros granos, prefiriéndose las de arroz, trigo, cebada, avena, amaranto, lino, triticale, centeno y maíz; semillas oleaginosas, prefiriéndose las semillas de Brassica, semillas de algodón, soja, alazor, girasol, nuez de coco y palma; otras semillas comestibles o semillas con partes 15 comestibles seleccionadas entre el grupo que consta de calabaza común, calabaza oleaginosa, sésamo, adormidera, uva, habas de garbanzo Mung, cacahuete, guisantes, judías, rábano, alfalfa, cacao, café, cáñamo; nueces de árboles prefiriéndose las de nogales, almendros, pecanas y garbanzos, etc.; patatas, zanahorias, boniatos, tomates, pimentones, mandiocas, sauces, robles, 20 olmos, arces, manzanos, bananos; y flores ornamentales, siendo preferidas las de lirios, orquídeas, juncias, rosas, ranúnculos, petunias, flox, violetas, y girasoles. _,* £ - - X

14.- Un método de transformar células, semillas, tejidos de plantas o plantas enteras con el fin de proporcionar transformantes capaces de expresar todas las enzimas de la ruta de biosíntesis de los carotenoides, que son necesarias para producir carotenos y xantófilas que presentan interés, que 5 comprende la transformación de dichas células, dichas semillas, dichos tejidos de plantas o dichas plantas enteras con una molécula de ADN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o con un sistema de plásmido o vector de acuerdo con la reivindicación 9 ó 10, o con sistemas de plásmidos o vectores que llevan genes o ADNc's que codifican una sintasa de fitoeno de lo plantas u hongos y una desaturasa de fitoeno de hongos o bacterias, o con sistemas de plásmidos o vectores que llevan genes o ADNc's que codifican una sintasa de fitoeno de plantas u hongos, una desaturasa de fitoeno de plantas y una desaturasa de ?-caroteno de plantas, en que dichas células, dichas semillas o dichos tejidos de plantas seleccionados para transformación están 15 normalmente exentos de carotenoides.

15.- Un método de acuerdo con la reivindicación 14, en el que dichas células, dichas semillas o dichos tejidos de plantas seleccionados para transformación tienen normalmente un contenido en carotenoides de 0,001 % p/p o menor. 20

16.- Una planta entera transformada regenerada a partir de transformantes producidos de acuerdo con la reivindicación 14 ó 15, o partes de ella, seleccionadas entre el grupo que consta de algas eucarióticas, embriofitos - - que comprenden Bryophyta, Pteridophyta y Spermatophyta tales como Gymnospermae y Angiospermae, incluyendo estas últimas Magnoliopsída, Rosopsida y Liliopsida ("monocotiledóneas").

17.- Una planta entera transformada o una parte de ella, de acuerdo con la reivindicación 16, seleccionada entre el grupo que consta de semillas de cereales y otros granos, prefiriéndose las de arroz, trigo, cebada, avena, amaranto, lino, triticale, centeno y maíz; semillas oleaginosas, prefiriéndose las semillas de Brassica, semillas de algodón, soja, alazor, girasol, nuez de coco y palma; otras semillas comestibles o semillas con partes comestibles seleccionadas entre el grupo que consta de calabaza común, calabaza oleaginosa, sésamo, adormidera, uva, habas de garbanzo Mung, cacahuete, guisantes, judías, rábano, alfalfa, cacao, café, cáñamo; nueces de árboles prefiriéndose las de nogales, almendros, pecanas y garbanzos, etc.; patatas, zanahorias, boniatos, tomates, pimentones, mandiocas, sauces, robles, olmos, arces, manzanos, bananos; y flores ornamentales, siendo preferidas las de lirios, orquídeas, juncias, rosas, ranúnculos, petunias, flox, violetas, y girasoles.

18.- Una planta entera transformada o una parte de ella de acuerdo con la reivindicación 17, que es arroz. La presente invención proporciona medios y métodos de transformar células, semillas, tejidos de plantas o plantas enteras con el fin de 5 producir transformantes capaces de expresar todas las enzimas de la ruta de biosíntesis de los carotenoides, que son esenciales para que la planta hospedante establecida como diana acumule carotenos y/o xantófilas que presentan interés. La presente invención proporciona también moléculas de ADN diseñadas para ser adecuadas para llevar a cabo el método del invento, y 10 sistemas de plásmidos o vectores que comprenden dichas moléculas. Además, la presente invención proporciona células, semillas, tejidos de plantas transgénicas y plantas enteras que presentan una calidad nutritiva mejorada y contienen dichas moléculas de ADN y/o que han sido generadas por uso de los métodos de la presente invención. *®. m0? LEHMANN/osu P01/1417F