DE19842609C2 - Salmonella antigen mixture and kit for the determination of antibodies against Salmonella - Google Patents
Salmonella antigen mixture and kit for the determination of antibodies against SalmonellaInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Salmonellenantigengemisch aus einem Salmonellen-LPS-Serumalbumin-Konjugat auf Basis eines Salmonellenantigens vom Typ Salmonella typhimurium (STM) und einem Salmonellenantigen vom Typ Salmonella cholerae sius (SCS) und einen Kit zur Bestimmung von Antikörpern gegen Salmonellen in Fleischsaft- oder Serumproben oder in Verbindung mit einer immunologischen Bestimmungsmethode, insbesondere einem heterogenen ELISA-Test. Dabei ist der Festphasenträger mit dem erfindungsgemäßen Salmonellenantigengemisch für eine immunologische Reaktion mit Antikörpern beladen.The invention relates to a Salmonella antigen mixture from a Salmonella LPS-serum albumin conjugate based on Salmonella antigen Salmonella typhimurium (STM) and a salmonella Salmonella cholerae sius type (SCS) and a kit for the determination of antibodies against Salmonella in meat juice or serum samples or in conjunction with an immunological method of determination, in particular a heterogeneous ELISA test. The solid phase carrier is loaded with the Salmonella antigen mixture according to the invention for an immunological reaction with antibodies.
Description
Die Erfindung betrifft ein Salmonellenantigengemisch und einen Kit zur Bestimmung von Antikörpern gegen Salmonellen in Fleischsaft- oder Serumproben oder anderen Flüssigkeiten in Verbindung mit einer immunologischen Bestimmungsmethode, insbesondere einem heterogenen ELISA-Test.The invention relates to a salmonella antigen mixture and a kit for the determination of Antibodies to Salmonella in meat juice or serum samples or other liquids in conjunction with an immunological method of determination, in particular a heterogeneous ELISA test.
Durch Salmonellen verursachte Krankheiten werden insbesondere über kontaminierte Lebensmittel hervorgerufen. Für den Bereich der Lebensmittelkontrolle und der Tierproduktion besteht auch aufgrund gestiegener Krankheitsfälle ein steigender Bedarf an schnellen und sicheren Verfahren zum Nachweis von Salmonellen. Zum Nachweis und zur Bestimmung von Salmonellen sind unterschiedliche Methoden bekannt. So können Bakterien auf verschiedenen Nährböden kultiviert werden. Über eine Selektivanreicherung auf festen Selektivnährböden ist eine serologische Typisierung möglich. Insgesamt dauert dieses Verfahren 4-5 Tage.Salmonella-induced diseases are over-contaminated in particular Caused food. For the field of food control and the Animal production is also increasing due to increased illness fast and safe method for the detection of Salmonella. For proof and for Determination of salmonella are known different methods. So can bacteria be cultured on different nutrient media. About a selective enrichment on solid Selective nutrient media serological typing is possible. Overall, this takes Procedure 4-5 days.
Unter Verwendung immunologischer Bestimmungsmethoden, insbesondere eines heterogenen ELISA-Tests ist auch der Nachweis von Salmonellenantikörpern bekannt (Enzyme-linked immunosorbent assay for Salmonella serology using lipopolysaccharide antigen, J. Vet. Diagn. Invest. 7: 481-487 (1995) Bradford P. Smith, George W. Dilling, John K. House, Hans Konrad, Nadia Moore). Dabei ist eine Mikrotiterplatte mit einem Salmonellenantigen beschichtet. Spezifische Antikörper gegen Salmonellen bilden während der Inkubation der Probe in der beschichteten Vertiefung einen Komplex mit dem Antigen. Nicht gebundenes Material wird durch Waschen entfernt. Ein zweiter, enzymmarkierter Antikörper, der gegen den antigengebundenen Antikörper gerichtet ist, bindet sich an die antigengebundenen Antikörper. Ungebundenes Konjugat wird herausgewaschen. Die Hinzugabe einer Farb reagenz (Substrat) führt dann zu einer Farbentwicklung (Substratumsetzung) durch antikörpergebundenes Enzym. Die Farbreaktion kann dann zur spektrophotometrischen Bestimmung der Menge von Salmonella-Antikörpern in der Probe genutzt werden und ist dieser proportional.Using immunological methods of determination, in particular a heterogeneous ELISA tests are also known to detect Salmonella antibodies (Enzyme-linked immunosorbent assay for Salmonella serology using lipopolysaccharide antigen, J. Vet. Diagn. Invest. 7: 481-487 (1995) Bradford P. Smith, George W. Dilling, John K. House, Hans Konrad, Nadia Moore). Here is a microtiter plate with a salmonella antigen coated. Specific antibodies against Salmonella form during incubation of the Sample in the coated well complex with the antigen. Unbound Material is removed by washing. A second, enzyme-labeled antibody against the antigen-bound antibody binds to the antigen-bound antibody Antibody. Unbound conjugate is washed out. The addition of a color Reagent (substrate) then performs a color development (substrate conversion) antibody-bound enzyme. The color reaction can then be used for spectrophotometric Determination of the amount of Salmonella antibodies used in the sample and is this proportionally.
Als Salmonellenantigene werden dabei Lipopolysaccharide (LPS) von Salmonellen vom Typ Salmonella typhimurium (STM) und Salmonella cholerae suis (SCS) verwandt. Die Bindung dieser Salmonellenantigene an die Mikrotiterplatte ist schwierig und insbesondere für die Automatisierung der Nachweisverfahren unzureichend. Die schlechte Bindung dieser Salmonellenantigene und deren Reaktivitätsverlust erfordert bislang eine frische Zubereitung vor Testdurchführung. Damit wird aber auch für diese Bestimmungsmethode ein Zeitraum von mindestens 2 Tagen benötigt. Als nachteilig hat sich auch herausgestellt, daß die STM- bzw. SCS-Antikörper positiven Kontrollen zu mehr als 30% mit SCS- bzw. STM-LPS- Antigen kreuzreaktiv reagieren.As Salmonellenantigene thereby Lipopolysaccharide (LPS) of Salmonellen of the type Salmonella typhimurium (STM) and Salmonella cholerae suis (SCS). The connection This Salmonella antigens to the microtiter plate is difficult and especially for the Automation of detection methods inadequate. The bad bond of this Salmonella antigens and their loss of reactivity so far requires a fresh preparation before test execution. But this will also be a period for this method of determination needed for at least 2 days. It has also proved disadvantageous that the STM or SCS antibody positive controls more than 30% with SCS or STM-LPS React antigen crossreactively.
Aus WO 97/08559 ist ein Verfahren zur Bestimmung von Antikörpern mittels Fluoreszenzpolarisation bekannt. Dieses Verfahren ist zur Durchführung von Immunoassays in Flüssigphasen und Messung in einem speziellen Fluoreszenz- Polarisationsgerät bestimmt. Aufgrund der Verfahrensspezifik und des gesonderten apparativen Aufwandes ist dieses Bestimmungsverfahren auf in der Praxis übliche ELISA-Techniken mittels Festphasenassays nicht anwendbar.From WO 97/08559 a method for the determination of antibodies by means Fluorescence polarization known. This procedure is to carry out Immunoassays in liquid phases and measurement in a special fluorescence Polarization device determined. Due to the process specification and the separate expenditure on equipment, this determination method is common in practice ELISA techniques using solid phase assays not applicable.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, verbesserte Mittel und Methoden für den immunologischen Nachweis von verschiedenen Salmonellen-Serovaren, insbesondere zur Bestimmung von Salmonella-Antikörpern bereitzustellen.The invention is based on the object, improved means and methods for the Immunological detection of various salmonella serovars, in particular for Provide determination of Salmonella antibodies.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch ein lyophilisiertes Salmonellenantigengemisch, bestehend aus einem Salmonellen-LPS-Serumalbumin-Konjugat auf Basis eines Salmonellen antigens vom Typ Salmonella typhimurium (STM) und einem Salmonellenantigen vom Typ Salmonella cholerae suis (SCS) und einen Kit zum Nachweis von Antikörpern gegen Salmonellen in Fleischsaft- oder Serumproben in Verbindung mit einer immunologischen Bestimmungsmethode, insbesondere einem heterogenen ELISA-Test gelöst, bei dem der Träger mit dem erfindungsgemäßen Salmonellenantigengemisch für eine immunologische Reaktion mit Antikörpern beladen ist.According to the invention, the object is achieved by a lyophilized salmonella antigen mixture, consisting of a salmonella-LPS-serum albumin conjugate based on Salmonella Salmonella typhimurium (STM) antigens and a salmonella type antigen Salmonella cholerae suis (SCS) and a kit for the detection of antibodies against Salmonella in meat juice or serum samples in combination with an immunological Determination method, in particular a heterogeneous ELISA test solved in which the Carrier with the Salmonella antigen mixture according to the invention for an immunological Reaction is loaded with antibodies.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung ist das Salmonellen-LPS-Serumalbumin- Konjugat ein Salmonellen-LPS-Rinder-Serumalbumin-Konjugat auf Basis eines Salmonellen antigens vom Typ Salmonella typhimurium (STM).In an advantageous embodiment of the invention, the Salmonella LPS serum albumin Conjugate a salmonella LPS-bovine serum albumin conjugate based on Salmonella antigens of the Salmonella typhimurium (STM) type.
Überraschend wurde festgestellt, daß das erfindungsgemäße Salmonellenantigengemisch sehr gute Bindungseigenschaften und eine hohe Langzeitstabilität aufweist. Das erfindungsgemäße Salmonellenantigengemisch ist nicht kreuzreaktiv und erlaubt den Nachweis von mindestens 95% der vorhandenen Serotypen. Das erfindungsgemäße Salmonellenantigengemisch bindet sehr gut an Träger, z. B. Mikrotiterplatten, wie sie für ELISA-Tests verwendet werden. Die Träger können damit vorgefertigt und für die Analyse bereitgestellt werden. Damit entfällt die bislang aufwendige Beschichtung und Probenvorbereitung durch den Anwender. Surprisingly, it was found that the Salmonella antigen mixture according to the invention very has good binding properties and high long-term stability. The invention Salmonella antigen mixture is not cross-reactive and allows the detection of at least 95% of the existing serotypes. The Salmonella antigen mixture according to the invention binds very good to carrier, z. B. Microtiter plates, as used for ELISA tests. The Carriers can be prefabricated and provided for analysis. This eliminates the previously complex coating and sample preparation by the user.
Die STM/SCS-Salmonellenantigene werden aus einer Salmonellenkultur nach der Methode von Appelmelk, B. J. et al., J. of Immunolog. Methods, 82 (1985): 199-207 "An Enzyme- Linked Immunosorbent Assay (ELISA) for the measurement of Antibodies to different Parts of the gram-negative Lipopolysaccharide Core Region" gewonnen. Anschließend werden die Salmonellen-LPS vom Typ STM mit einem Serumalbumin zum Salmonellen-LPS- Serumalbumin-Konjugat verbunden. Dies erfolgt nach der von Galanos, C., E. T. Rietschel, O. Lüderitz, O. Westphal, 1972, Eur. J. Biochem. 31, 230, beschriebenen Methode.The STM / SCS salmonella antigens are obtained from a Salmonella culture by the method by Appelmelk, B.J. et al., J. of Immunol. Methods, 82 (1985): 199-207 "An Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) for the measurement of Antibodies to different Parts of the gram-negative lipopolysaccharide core region " Salmonella LPS type STM with a serum albumin for Salmonella LPS Linked to serum albumin conjugate. This is done according to the method of Galanos, C., E. T. Rietschel, O. Luderitz, O. Westphal, 1972, Eur. J. Biochem. 31, 230, described method.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung ist der Träger mit einem Konjugat aus STM-LPS und Rinder-Serumalbumin (BSA) und einem Salmonellenantigen vom Typ Salmonella cholerae suis (SCS) versehen, wobei die besten Bindungseigenschaften in einem Bereich von 1 : 0,5 bis 1 : 3 einer Konjugation von STM-LPS mit BSA und einem Verhältnis SCS zu STM-LPS-BSA-Konjugat von 1 : 10 bis 1 : 200 nachgewiesen wurden.In an advantageous embodiment of the invention, the carrier is made with a conjugate STM-LPS and bovine serum albumin (BSA) and a salmonella antigen of the type Salmonella cholerae suis (SCS), with the best binding properties in one Range of 1: 0.5 to 1: 3 conjugation of STM-LPS with BSA and a ratio SCS to STM-LPS-BSA conjugate from 1:10 to 1: 200 were detected.
Die Beschichtung des Trägers, z. B. in Form einer Mikrotiterplatte erfolgt durch Inkubation mit dem erfindungsgemäßen Antigengemisch, Blockung der freien Bindungsstellen mit einer Serumalbuminlösung in Gegenwart einer Pufferlösung. Die so gefertigten Träger werden gewaschen und anschließend getrocknet.The coating of the carrier, z. B. in the form of a microtiter plate by incubation with the antigen mixture according to the invention, blocking the free binding sites with a Serum albumin solution in the presence of a buffer solution. The so produced carriers are washed and then dried.
Der erfindungsgemäße Kit besteht neben dem mit dem erfindungsgemäßen Salmonellen antigengemisch beschichteten Träger aus verschiedenen Kontrollseren, Waschpuffer konzentrat, Verdünnungspuffer und Anti-Antikörperenzymkonjugat sowie entsprechender Substrat- und Stoplösung. Als Anti-Antikörperenzymkonjugat wird für den Nachweis von Antikörpern gegen Salmonellen in Schweineseren vorteilhaft ein Anti-Schwein- Immunoglubolin-G-Peroxidasekonjugat und Tetramethylbenzidin (TMB) als Substratlösung sowie verdünnte HCl als Stoplösung verwandt.The kit according to the invention is in addition to the salmonella according to the invention antigen mixture coated carrier from different control sera, washing buffer concentrate, dilution buffer and anti-antibody enzyme conjugate, and the like Substrate and stop solution. As an anti-antibody enzyme conjugate is used for the detection of Antibodies to salmonella in pig sera favorably an anti-pig Immunoglubolin-G-peroxidase conjugate and tetramethylbenzidine (TMB) as substrate solution and diluted HCl used as a stop solution.
Als Kontrollseren werden salmonellapositive und salmonellanegative nichtkreuzreaktive Seren verwendet. Als besonders vorteilhaft haben sich für die Bestimmung von Salmonellen- Antikörpern in Schweineseren Kontrollseren von Salmonellen positiven Schweinen gezeigt, die durch Feldinfektionen infiziert wurden.As control sera salmonella-positive and salmonella-negative non-reactive Serums used. Particularly advantageous for the determination of Salmonella Antibodies in pig sera show control sera of salmonella positive pigs which were infected by field infections.
Die zu untersuchende Probe wird mit dem mit dem erfindungsgemäßen Salmonellen antigengemisch beschichteten Träger in Verbindung gebracht. Spezifische Antikörper gegen Salmonellen bilden während der Inkubation der Probe in der beschichteten Vertiefung einen Komplex mit dem Antigen. Nicht gebundenes Material wird durch Absaugen oder Ausschlagen und Waschen mit der Waschpufferlösung entfernt. Danach wird das Anti- Antikörperenzymkonjugat zugegeben. Nicht gebundenes Antikörperenzymkonjugat wird durch Absaugen oder Ausschlagen und Waschen mit der Waschpufferlösung entfernt. Die Hinzugabe von TMB als Substrat führt zu einer Farbentwicklung (Substratumsetzung) durch antikörpergebundenes Enzym. Die Farbreaktion kann dann zur spektrophotometrischen Bestimmung der Menge von Salmonella-Antikörpern in der Probe genutzt werden und ist dieser proportional.The sample to be examined is mixed with the salmonellae according to the invention antigen mixture coated carrier. Specific antibodies against Salmonella form one during the incubation of the sample in the coated well Complex with the antigen. Unbound material is removed by suction or Beat and wash with the wash buffer solution. After that, the anti-virus Antibody enzyme conjugate added. Unbound antibody-enzyme conjugate becomes removed by aspiration or rinsing and washing with the washing buffer solution. The Addition of TMB as a substrate leads to color development (substrate conversion) antibody-bound enzyme. The color reaction can then be used for spectrophotometric Determination of the amount of Salmonella antibodies used in the sample and is this proportionally.
Zum Vergleich werden Versuche mit Kontrollseren durchgeführt und die gemessenen Extinktionen der Kontrollseren zu ihren angegebenen Konzentrationen ins Verhältnis gesetzt. Daraus wird eine Regressionsgerade berechnet, mit deren Hilfe anhand der gemessenen Extinktion der Proben deren Konzentration an Salmonellenantikörpern berechnet werden kann.For comparison, experiments are carried out with control sera and the measured Absorbances of the control sera relative to their specified concentrations. From this, a regression line is calculated, with the help of which, based on the measured Extinction of the samples whose concentration of salmonella antibodies is calculated can.
Anhand nachfolgender Ausführungsbeispiele wird die Erfindung näher erläutert:Reference to subsequent embodiments, the invention is explained in more detail:
- 1. Von den benötigten Salmonella Serotypen S. thyphimurium und S. choleraee suis (erhältlich bei Robert Koch - Institut, Bundesinstitut für Infektionskrankheiten und nicht übertragbare Krankheiten, Nationales Referenzzentrum für Salmonellen und andere Enteritiserreger, Postfach, 38843 Wernigerode) wird jeweils eine Kultur im 50 l Fermenter angelegt und 8 Stunden bei 37°C inkubiert. In die Kultur gibt man anschließend 505 ml einer 36%igen Formaldehydlösung, um in der Kultur eine Endkonzentration von 1% Formalin zur Abtötung der Keime zu erhalten. Inkubation bei Raumtemperatur für mindestens 4 Stunden.1. Of the required Salmonella serotypes S. thyphimurium and S. choleraee suis (available from Robert Koch Institute, Federal Institute for Infectious Diseases and Noncommunicable Diseases, National Reference Center for Salmonella and Other Enteritiserreger, PO Box, 38843 Wernigerode) will each have a culture in the 50 l fermenter applied and incubated for 8 hours at 37 ° C. You enter culture then 505 ml of a 36% formaldehyde solution to culture in the To obtain final concentration of 1% formalin to kill the germs. incubation at room temperature for at least 4 hours.
- 2. Anlegen einer Sterilkontrolle für jede Kultur und 24 bis 48 Stunden Inkubation.2. Create a sterile control for each culture and incubate for 24 to 48 hours.
- 3. Die Kultur wird nun mittels Tangentialfiltration eingeengt.3. The culture is then concentrated by tangential filtration.
- 4. Die Zellsuspension wird 30 Minuten bei 8.000 U/min zentrifugiert.4. The cell suspension is centrifuged for 30 minutes at 8,000 rpm.
- 5. Das Zellsediment wird 3 mal mit Phosphatpuffer (PBS) gewaschen, 30 Minuten bei 8.000 U/min. 5. The cell pellet is washed 3 times with phosphate buffer (PBS) for 30 minutes 8,000 rpm.
- 6. Anschließend wird das Zellsediment 1 : 1 in sterilem Aqua dest. resuspendiert.6. Subsequently, the cell sediment is 1: 1 in sterile distilled water. resuspended.
- 7. Die Zellsuspension wird in 3 mal 2.000 ml Schraubflaschen gegeben (ca. 300 ml pro Flasche) und kommt über Nacht in den Kühlschrank.7. The cell suspension is placed in 3 times 2,000 ml screw bottles (about 300 ml per Bottle) and comes in the fridge overnight.
- 8. Aceton für den nächsten Arbeitsschritt am darauffolgenden Tag vorbereiten: 22 mal 500 ml Aceton kommt über Nacht in den Gefrierschrank bei -22°C.8. Prepare acetone for the next step the following day: 22 times 500 ml of acetone comes overnight in the freezer at -22 ° C.
- 9. In die Flaschen mit der Zellsuspension wird nun jeweils 1.500 ml kaltes Aceton gegeben.9. In the bottles with the cell suspension is now each 1,500 ml of cold acetone given.
- 10. Die Flaschen werden verschlossen, gut geschüttelt und kommen für 2-3 Stunden bei -22°C in den Gefrierschrank.10. The bottles are capped, shaken well and arrive for 2-3 hours -22 ° C in the freezer.
- 11. Der klare Überstand wird vorsichtig abgesaugt und verworfen. Dann werden pro Flasche 500 ml kaltes Aceton aufgefüllt. Die Flaschen kommen erneut für 2-3 Stunden in den Gefrierschrank.11. The clear supernatant is carefully aspirated and discarded. Then be pro Bottle 500 ml cold acetone filled. The bottles come again for 2-3 Hours in the freezer.
- 12. Nachdem der Schritt 11. noch zweimal wiederholt wurde, kommen die Flaschen diesmal über Nacht in den Gefrierschrank.12. After the step 11 has been repeated twice, the bottles come this time overnight in the freezer.
- 13. Vorsichtig wird erneut der Überstand abgesaugt und verworfen.13. Carefully suck off the supernatant and discard again.
- 14. Die Bodensätze werden abschließend in mehrere Petrischalen verteilt, die man nun über Nacht unter einem Abzug stehen läßt, damit das restliche Aceton verdunsten kann.14. The sediments are finally distributed in several Petri dishes, which you can now allowed to stand overnight under a hood to allow the residual acetone to evaporate can.
- 15. Das getrocknete Zellsediment wird im Mörser zu Pulver zerrieben und in einem offenen abgewogenen Erlenmeyerkolben im Abzug über Nacht stehen gelassen.15. The dried cell sediment is ground into a mortar and powdered in a mortar open weighed Erlenmeyer flask in the hood left overnight.
- 16. Die pulverisierten Zellen werden 1 : 1 mit sterilem Aqua dest. gelöst.16. The pulverized cells are distilled 1: 1 with sterile aqua. solved.
- 17. Die Zellsuspension wird in einem 65°C warmen Wasserbad 5 min inkubiert.17. The cell suspension is incubated in a 65 ° C water bath for 5 min.
- 18. Entsprechend der Gesamtmenge Zellsuspension benötigt man nun ebensoviel 90%iges Phenol. Dazu löst man das Phenol direkt in den Flaschen durch Zugabe von Aqua dest. Die 90%ige Phenollösung wird ebenfalls auf 65°C erwärmt und 5 min inkubiert.18. According to the total amount of cell suspension you need now as much 90% Phenol. To do this, dissolve the phenol directly in the bottles by adding distilled water. The 90% phenol solution is also heated to 65 ° C and incubated for 5 min.
- 19. Die Phenollösung und die Zellsuspension werden nun 1 : 1 in einem 2.000 ml Rundkolben gemischt, kräftig geschüttelt und für weitere 20 min bei 65°C im Schüttelwasserbad inkubiert.19. The phenol solution and the cell suspension are now 1: 1 in a 2,000 ml Mixed round bottomed flask, shaken vigorously and for a further 20 min at 65 ° C in Shaking water bath incubated.
- 20. Die Kolben werden in einem Eiswasserbad auf 4°C abgekühlt.20. The flasks are cooled to 4 ° C in an ice-water bath.
- 21. Zentrifugation des Zelle-/Phenolgemisches in 250 ml Bechern gefüllt mit 150 ml bei 13.000 U/min für 40 min.21. Centrifuge the cell / phenol mixture in 250 ml beakers filled with 150 ml 13,000 rpm for 40 min.
- 22. Die klaren Überstände werden gesammelt und dann in 3 bis 4 Dialyseschläuche (15 KD) gegeben und über Nacht gegen VE-Wasser dialysiert. 22. The clear supernatants are collected and then in 3 to 4 dialysis tubes (15 KD) and dialyzed overnight against deionized water.
- 23. Der Inhalt der Dialyseschläuche wird wieder gesammelt, auf Klarheit geprüft und falls noch Partikel zu erkennen sind, für 20 min. bei 5.000 g zentrifugiert.23. The contents of the dialysis hoses are collected again, checked for clarity and if particles are still visible for 20 min. centrifuged at 5,000 g.
- 24. Der Überstand bzw. das Dialysat wird gewonnen und mit 0,1% Natriumazid konserviert.24. The supernatant or dialysate is recovered with 0.1% sodium azide preserved.
- 25. Ermittlung der Antigen-Gebrauchsverdünnung.25. Determination of antigen usage dilution.
- 1. Die gewonnenen Salmonella-LPS-Antigene werden in Aqua dest. gelöst, welches 0,5% TEA (Triethanolamin) enthält.1. The obtained Salmonella LPS antigens are distilled in aqua. solved, which 0.5% TEA (triethanolamine).
- 2. Nach erfolgter Resuspendierung erfolgt eine Inkubation im Ultraschallbad für 30 sec.2. After resuspension, incubate in the ultrasonic bath for 30 sec.
- 3. Die Endkonzentration Salmonella-LPS-Antigen wird auf 1 mg/ml eingestellt.3. The final concentration of Salmonella LPS antigen is adjusted to 1 mg / ml.
- 4. Die zuvor hergestellte BSA-Suspension (Bovine Serum Albumin) (10 mg/ml) in 0,5% TEA wird zu gleichen Teilen mit der aus 3. hergestellten Salmonella- LPS- Antigen-Suspension gemischt.4. The previously prepared BSA suspension (bovine serum albumin) (10 mg / ml) in 0.5% TEA is divided equally with the Salmonella LPS produced from 3. Mixed antigen suspension.
- 5. Das erhaltene Gemisch wird zu Aliquoten von 1,0 ml abgefüllt und lyophilisiert.5. The resulting mixture is filled into aliquots of 1.0 ml and lyophilized.
- 6. Das lyophilisierte Salmonellen-LPS-BSA-Gemisch wird erneut resuspendiert in 1 ml 0,5%igem TEA.6. The lyophilized Salmonella LPS-BSA mixture is resuspended again in 1 ml of 0.5% TEA.
- 7. Der Schritt 5. wird 3 mal, der Schritt 6. 2 mal wiederholt.7. Step 5 is repeated 3 times, Step 6 twice.
- 8. Das so erhaltene Salmonellen-LPS-BSA-Konjugat wird bei 2-8°C gelagert.8. The salmonella LPS-BSA conjugate thus obtained is stored at 2-8 ° C.
Es wird ein Salmonellenantigengemisch aus einer wässrigen Lösung von 0,04 mg/l SCS-LPS und 4,0 mg/l STM-LPS-BSA-Konjugat hergestellt. Die Beschichtung einer Mikrotiterplatte der Fa.Nunc/Nunc Polysorb erfolgt durch Inkubation von 100 µl/Well mit dem Salmonellenantigengemisch über 12 Stunden bei 7°C. Nach erfolgter Inkubation wird nicht gebundenes Salmonellenantigengemisch abgesaugt und die Platte 3 × mit 250 µl/Well mit Aqua purif. gewaschen. Es folgt die Blockung der freien Bindungsstellen mit 200 µl einer 1%- igen Serumalbuminlösung in Karbonatpuffer (0,1 M, pH 9,6) 15 min bei Raumtemperatur. Daran schließt sich ein Waschschritt von 2 × 250 µl Waschpuffer (PBS-Tween)/Well an, bevor die beschichteten und geblockten Mikrotiterplatten 12-14 Stunden im Luftstrom getrocknet werden. A salmonella antigen mixture is obtained from an aqueous solution of 0.04 mg / l SCS-LPS and 4.0 mg / L STM-LPS-BSA conjugate. The coating of a microtiter plate The Nunc / Nunc Polysorb is made by incubating 100 μl / well with the Salmonella antigen mixture for 12 hours at 7 ° C. After the incubation will not sucked Salmonellenantigengemisch sucked and the plate 3 × with 250 ul / well with Aqua purif. washed. This is followed by blocking the free binding sites with 200 μl of a 1% Serum albumin solution in carbonate buffer (0.1 M, pH 9.6) for 15 min at room temperature. This is followed by a washing step of 2 × 250 μl washing buffer (PBS-Tween) / well before the coated and blocked microtiter plates are air-dried for 12-14 hours become.
Der Kit besteht aus folgenden Reagenzien:
The kit consists of the following reagents:
- - Fleischsaft - üblicherweise durch Einfrieren und Auftauen von Muskulatur des Zwerchfellpfeilers gewonnen - wird 1 : 30 mit Probenverdünnungspuffer verdünnt.- Meat juice - usually by freezing and thawing of muscles of the Diaphragm peg won - is diluted 1: 30 with sample dilution buffer.
- - Serumproben werden 1 : 400 mit Probenverdünnungspuffer verdünnt.- Serum samples are diluted 1: 400 with Sample Diluent.
Alle Reagenzien werden vor der Benutzung auf Raumtemperatur (18-23°C) gebracht und durch leichtes Schütteln gemischt.All reagents are brought to room temperature (18-23 ° C) before use and mixed by gentle shaking.
- 1. Registrieren der Kontrollen- und Probenlokalisationen in Doppelbestimmung entsprechend der Aufteilung der Testplatte auf einem Arbeitsblatt, z. B. K1 = A1/A2; K2 = B1/B2; K3 = C1/C2; K4 = D1/D2; K5 = E1/E2; übrige Positionen für Proben in Doppelbestimmung1. Register the control and sample localizations in duplicate according to the division of the test plate on a worksheet, for. B. K1 = A1 / A2; K2 = B1 / B2; K3 = C1 / C2; K4 = D1 / D2; K5 = E1 / E2; remaining positions for samples in duplicate
- 2. Jeweils 100 µl der gelösten Kontrollen sowie der vorverdünnten Proben in die Vertiefungen der Testplatte pipettieren und die Testplatte abdecken2. In each case 100 .mu.l of the dissolved controls and the prediluted samples in the Pipette wells of the test plate and cover the test plate
- 3. 60 min bei Raumtemperatur inkubieren und danach die Vertiefungen entleeren durch Absaugen oder Ausschlagen3. Incubate for 60 min at room temperature and then empty the wells Sucking or knocking out
- 4. 3 × Waschen mit je 200 µl vorbereitetem Waschpuffer, nach jedem Waschen den Puffer entleeren4. Wash 3 × with 200 μl of prepared wash buffer, after each wash Empty the buffer
- 5. In jede Vertiefung 100 µl vorbereitetes Kaninchen-Anti-Schwein-Meerettich peroxidase-Konjugat geben5. In each well 100 μl of prepared rabbit anti-pig horseradish give peroxidase conjugate
- 6. 60 min bei Raumtemperatur inkubieren und danach die Vertiefungen entleeren durch Absaugen oder Ausschlagen6. Incubate for 60 min at room temperature and then empty the wells Sucking or knocking out
- 7. 3 × Waschen mit je 200 µl vorbereitetem Waschpuffer, nach jedem Waschen den Puffer entleeren7. Wash 3 × with 200 μl of prepared wash buffer, after each wash Empty the buffer
- 8. In jede Vertiefung 100 µl TMB-Substratlösung geben8. Add 100 μl of TMB Substrate Solution to each well
- 9. Inkubation bei Raumtemperatur 7 min9. Incubation at room temperature 7 min
- 10. Stoppen der Reaktion durch Zugabe von 100 µl Stoplösung pro Vertiefung10. Stop the reaction by adding 100 μl stop solution per well
- 11. Kalibrierung des Photometers gegen Luft als Leerwert, Messung im Photometer bei 450 nm und einer Referenzwellenlänge von 630 nm.11. Calibration of the photometer against air as blank value, measurement in the photometer at 450 nm and a reference wavelength of 630 nm.
Die gemessenen Extinktionen der Kontrollseren werden zu ihren angegebenen Konzentrationen ins Verhältnis gesetzt und darauf eine Regressionsgerade berechnet, mit deren Hilfe anhand der gemessenen Extinktionen der Proben deren Konzentration an Salmonellen-Antikörper berechnet wird.The measured extinctions of the control sera become their indicated Concentrations and then calculates a regression line, with their help on the basis of the measured extinctions of the samples their concentration Salmonella antibody is calculated.
Mit beschichteten und geblockten Mikrotiterplatten wurden über einen Zeitraum von 6 Monaten Vergleichsversuche durchgeführt. Dabei wurden Variationskoeffizienten CV von 2,29-8,7% bei einem gemessenen Probenvolumen von 94/Platte/Monat ermittelt. Diese Ergebnisse belegen eine hohe Langzeitstabiltät der erfindungsgemäß beschichteten Platten. Kontrollversuche belegen eine hohe Genauigkeit der durchgeführten Bestimmungen. Untersucht wurden die verwendeten Kontrollen auf ihre Kreuzreaktivität und als nicht kreuzreagierend nachgewiesen.With coated and blocked microtiter plates were over a period of 6 Months of comparative experiments. The coefficients of variation were CV of 2.29-8.7% at a measured sample volume of 94 / plate / month. These Results prove a high long-term stability of the plates coated according to the invention. Control experiments prove a high accuracy of the determinations carried out. The controls used were tested for their cross-reactivity and not proved cross-reactive.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| OP8 | Request for examination as to paragraph 44 patent law | ||
| D2 | Grant after examination | ||
| 8364 | No opposition during term of opposition | ||
| 8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |