DE19653176A1

DE19653176A1 - Neue Nucleinsäuremoleküle aus Mais und ihre Verwendung zur Herstellung einer modifizierten Stärke

Info

Publication number: DE19653176A1
Application number: DE19653176A
Authority: DE
Inventors: Berlin Dr Herr; Golm Dr Herr
Original assignee: Planttec Biotechnologie GmbH Forschung and Entwicklung
Current assignee: Bayer Bioscience GmbH
Priority date: 1996-12-19
Filing date: 1996-12-19
Publication date: 1998-06-25
Also published as: US7186898B1; AU5857798A; AU740492B2; CA2272844C; ES2280086T3; AU740492C; JP2001522223A; DE69737507T2; ATE357522T1; DE69737507D1; EP0950107A1; WO1998027212A1; PT950107E; CA2272844A1; EP0950107B1; JP4098365B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Nucleinsäuremoleküle, die ein Stärkekorn-gebundenes Protein aus Mais codieren, sowie Verfahren und rekombinante DNA-Moleküle zur Herstellung transgener Pflanzenzellen und Pflanzen, die eine modifizier te Stärke synthetisieren. Die Erfindung betrifft ebenfalls die aus den Verfahren resultierenden transgenen Pflanzenzel len und Pflanzen und die aus den transgenen Pflanzenzellen und Pflanzen erhältliche Stärke.

Das Polysaccharid Stärke, das einen der wichtigsten Spei cherstoffe im Pflanzenreich darstellt, findet neben der Ver wendung im Nahrungsmittelbereich auch eine breite Verwendung als nachwachsender Rohstoff für die Herstellung industriel ler Produkte. Um die Anwendung dieses Rohstoffes in mög lichst vielen Einsatzgebieten zu ermöglichen, ist es notwen dig, eine große Stoffvielfalt und eine Anpassung an die je weiligen Anforderungen der zu verarbeitenden Industrie zu erreichen.

Obwohl Stärke aus einem chemisch einheitlichen Grundbau stein, der Glucose, aufgebaut ist, stellt Stärke keinen ein heitlichen Rohstoff dar. Es handelt sich dabei eher um ein komplexes Gemisch aus unterschiedlichen Molekül formen, die sich hinsichtlich ihres Verzweigungsgrades und des Auftre tens von Verzweigungen der Glucoseketten unterscheiden. Man unterscheidet insbesondere die Amylose-Stärke, ein im we sentlichen unverzweigtes Polymer aus α-1,4-verknüpften Glucosemolekülen, von der Amylopektin-Stärke, die ein Ge misch aus unterschiedlich stark verzweigten Glucoseketten darstellt, wobei die Verzweigungen durch das Auftreten von α-1,6-glycosidischen Verknüpfungen zustande kommen.

Die molekulare Struktur der Stärke, die zu einem großen Teil durch den Verzweigungsgrad, das Amylose/Amylopektin-Verhält nis, die durchschnittliche Kettenlänge sowie das Vorhanden sein von Phosphatgruppen bestimmt wird, ist ausschlaggebend für wichtige funktionelle Eigenschaften der Stärke bzw. ih rer wäßrigen Lösungen. Als wichtige funktionelle Eigenschaf ten sind hierbei beispielsweise zu nennen die Löslichkeit, das Retrogradierungsverhalten, die Filmbildungseigen schaften, die Viskosität, die Farbstabilität, die Verklei sterungseigenschaften, d. h. Binde- und Klebeigenschaften, sowie die Kältestabilität. Auch die Stärkekorngröße kann für verschiedene Anwendungen von Bedeutung sein. Von besonderem Interesse ist insbesondere die Erzeugung von hochamy losehaltigen Stärken. Ferner kann eine in Pflanzenzellen enthaltene modifizierte Stärke das Verhalten der Pflanzen zelle unter bestimmten Bedingungen vorteilhaft verändern. Denkbar ist beispielsweise eine Verringerung des Stärkeab baus während der Lagerung von Stärke-enthaltenden Organen, wie z. B. Samen oder Knollen, vor deren weiterer Verarbei tung, z. B. zur Extraktion der Stärke. Ferner ist es von In teresse, modifizierte Stärken herzustellen, die dazu führen, daß Pflanzenzellen oder pflanzliche Organe, die diese Stärke enthalten, besser zur Weiterverarbeitung geeignet sind, bei spielsweise bei der Herstellung von "Popcorn" oder "Corn flakes" aus Mais oder von Pommes frites, Chips oder Kartof felpulver aus Kartoffeln. Von besonderem Interesse ist hier bei die Verbesserung der Stärken in der Hinsicht, daß sie ein reduziertes "cold sweetening" aufweisen, d. h. eine ver ringerte Freisetzung von reduzierenden Zuckern (insbesondere Glucose) bei einer längeren Lagerung bei niedrigen Tempera turen.

Die Anpassung der aus Pflanzen isolierbaren Stärke an be stimmte industrielle Verwendungszwecke erfolgt häufig mit Hilfe chemischer Modifikationen, die in der Regelzeit- und kostenintensiv sind. Es erscheint daher wünschenswert, Mög lichkeiten zu finden, Pflanzen herzustellen, die eine Stärke synthetisieren, die in ihren Eigenschaften bereits den An forderungen der verarbeitenden Industrie entspricht.

Herkömmliche Wege zur Herstellung derartiger Pflanzen beste hen in klassischen Züchtungsverfahren und der Erzeugung von Mutanten. So wurde beispielsweise bei Mais eine Mutante er zeugt, die eine Stärke mit veränderten Viskositätseigen schaften synthetisiert (US Patentschrift 5,331,108), sowie eine Maissorte (waxy maize) durch Züchtung etabliert, deren Stärke zu nahezu 100% aus Amylopektin besteht (Akasuka und Nelson, J. Biol. Chem. 241 (1966), 2280-2285). Ferner sind bei Mais und Erbse Mutanten beschrieben worden, die Stärken mit hohem Amylosegehalt synthetisieren (70% in Mais bzw. bis zu 50% in Erbse). Diese Mutanten sind bisher nicht auf mole kularer Ebene charakterisiert worden und erlauben somit auch nicht die Erzeugung entsprechender Mutanten in anderen stär kespeichernden Pflanzen.

Alternativ können Pflanzen, die eine Stärke mit veränderten Eigenschaften synthetisieren, mit Hilfe gentechnischer Ver fahren erzeugt werden. Beschrieben wurde beispielsweise in mehreren Fällen die gentechnische Veränderung von Kartoffel pflanzen, mit dem Ziel der Veränderung der in den Pflanzen synthetisierten Stärke (z. B. WO 92/11376; WO 92/14827). Vor aussetzung für die Anwendung gentechnischer Verfahren ist jedoch die Verfügbarkeit von DNA-Sequenzen, deren Genproduk te einen Einfluß auf die Stärkesynthese, die Stärkemodifika tion oder den Stärkeabbau haben.

Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, Nucleinsäuremoleküle und Verfahren zur Verfügung zu stellen, die es ermöglichen, Pflanzen dahingehend zu verändern, daß sie eine Stärke synthetisieren, die sich hinsichtlich ihrer physikalischen und/oder chemischen Eigenschaften von natür licherweise in den Pflanzen synthetisierter Stärke unter scheidet, und die somit für allgemeine und/oder spezielle Verwendungszwecke besser geeignet ist.

Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung der in den Pa tentansprüchen bezeichneten Ausführungsformen gelöst.

Die vorliegende Erfindung betrifft somit Nucleinsäuremole küle, die ein Protein mit der unter Seq ID No. 6 angegebenen Aminosäuresequenz codieren. Derartige Proteine liegen in den Plastiden pflanzlicher Zellen sowohl an Stärkekörnern gebun den vor, als auch außerhalb von Stärkekörnern in freier, d. h. löslicher Form.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Nucleinsäuremole küle, die eine Sequenz mit der unter Seq ID No. 5 angegebe nen Nucleotidabfolge, insbesondere die in Seq ID No. 5 ange gebenen codierenden Region, umfassen.

Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls Nucleinsäuremole küle, die ein Protein an Mais codieren, das in den Plastiden der Zellen zum Teil an Stärkekörnern gebunden vorliegt, und die mit den oben genannten erfindungsgemäßen Nucleinsäuremo lekülen bzw. deren komplementären Strang hybridisieren. Der Begriff "Hybridisierung" bedeutet in diesem Zusammenhang ei ne Hybridisierung unter konventionellen Hybridisierungsbe dingungen, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, wie sie beispielsweise in Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) beschrieben sind.

Nucleinsäuremoleküle, die mit den erfindungsgemäßen Molekü len hybridisieren, können z. B. aus genomischen oder aus cDNA-Bibliotheken von Mais isoliert werden.

Die Identifizierung und Isolierung derartiger Nucleinsäure moleküle kann dabei unter Verwendung der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle oder Teile dieser Moleküle bzw. der re versen Komplemente dieser Moleküle erfolgen, z. B. mittels Hybridisierung nach Standardverfahren (siehe z. B. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Har bor, NY).

Als Hybridisierungsprobe können z. B. Nucleinsäuremoleküle verwendet werden, die exakt die oder im wesentlichen die un ter Seq ID No. 5 angegebene Sequenz oder Teile dieser Se quenz aufweisen. Bei den als Hybridisierungsprobe verwende ten DNA-Fragmenten kann es sich auch um synthetische DNA- Fragmente handeln, die mit Hilfe der gängigen DNA-Synthese techniken hergestellt wurden und deren Sequenz im wesentli chen mit der der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle übereinstimmt. Hat man Gene identifiziert und isoliert, die mit den erfindungsgemäßen Sequenzen hybridisieren, ist eine Bestimmung der Sequenz und eine Analyse der Eigenschaften der von dieser Sequenz codierten Proteine erforderlich.

Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung Nucleinsäuremo leküle, deren Sequenzen aufgrund des genetischen Codes dege neriert sind im Vergleich zu den Sequenzen der obengenannten Moleküle, und die ein Protein codieren, das in den Plastiden pflanzlicher Zellen teilweise an Stärkekörner gebunden vor liegt.

Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls Fragmente, Derivate und allelische Varianten der oben beschriebenen Nucleinsäu remoleküle, die das oben beschriebene Protein codieren. Un ter Fragmenten werden dabei Teile der Nucleinsäuremoleküle verstanden, die lang genug sind, um das beschriebene Protein zu codieren. Der Ausdruck Derivat bedeutet in diesem Zusam menhang, daß die Sequenzen dieser Moleküle sich von den Se quenzen der oben beschriebenen Nucleinsäuremoleküle an einer oder mehreren Positionen unterscheiden und einen hohen Grad an Homologie zu den Sequenzen dieser Moleküle aufweisen. Ho mologie bedeutet dabei eine Sequenzidentität von mindestens 40%, insbesondere eine Identität von mindestens 60%, vor zugsweise über 80% und besonders bevorzugt über 90%. Die Ab weichungen zu den oben beschriebenen Nucleinsäuremolekülen können dabei durch Deletion, Substitution, Insertion oder Rekombination entstanden sein.

Homologie bedeutet ferner, daß funktionelle und/oder struk turelle Äquivalenz zwischen den betreffenden Nucleinsäuremo lekülen oder den durch sie codierten Proteinen, besteht. Bei den Nucleinsäuremolekülen, die homolog zu den oben beschrie benen Nucleinsäuremolekülen sind und Derivate dieser Mole küle darstellen, handelt es sich in der Regel um Variationen dieser Nucleinsäuremoleküle, die Modifikationen darstellen, die dieselbe biologische Funktion ausüben. Es kann sich da bei sowohl um natürlicherweise auftretende Variationen han deln oder um Mutationen, wobei diese Mutationen auf natürli che Weise aufgetreten sein können oder durch gezielte Muta genese eingeführt wurden. Ferner kann es sich bei den Varia tionen um synthetisch hergestellte Sequenzen handeln.

Bei den allelischen Varianten kann es sich sowohl um natür lich auftretende Varianten handeln, als auch um synthetisch hergestellte oder durch rekombinante DNA-Techniken erzeugte Varianten.

Die von den verschiedenen Varianten der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle codierten Proteine weisen bestimmte ge meinsame Charakteristika auf. Dazu können z. B. Enzymaktivi tät, Molekulargewicht, immunologische Reaktivität, Konforma tion etc. gehören, sowie physikalische Eigenschaften wie z. B. das Laufverhalten in Gelelektrophoresen, chromatogra phisches Verhalten, Sedimentationskoeffizienten, Löslich keit, spektroskopische Eigenschaften, Stabilität, pH-Opti mum, Temperatur-Optimum etc.

Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle können auch durch dem Fachmann geläufige Synthesetechniken hergestellt werden.

Bei den erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen kann es sich sowohl um DNA-, beispielsweise um cDNA oder genomische DNA, als auch um RNA-Moleküle handeln.

Ferner betrifft die Erfindung Vektoren, insbesondere Plas mide, Cosmide, Viren, Bacteriophagen und andere in der Gen technik gängige Vektoren, die die oben beschriebenen erfin dungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle enthalten.

In einer bevorzugten Ausführungsform sind die in den Vekto ren enthaltenen Nucleinsäuremoleküle verknüpft mit regulato rischen Elementen, die die Transkription in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen gewährleisten.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung Wirtszellen, insbesondere prokaryontische oder eukaryonti sche Zellen, die mit einem oben beschriebenen erfindungsge mäßen Nucleinsäuremolekül oder Vektor transformiert und/oder genetisch manipuliert sind, sowie Zellen, die von solchen Zellen abstammen und ein erfindungsgemäßes Nucleinsäuremole kül oder einen Vektor enthalten. Dabei handelt es sich vor zugsweise um bakterielle Zellen oder um Pflanzenzellen.

Es wurde nun gefunden, daß das durch die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle codierte Protein einen Einfluß auf die Stärkesynthese bzw. -modifikation hat, und eine Veränderung der Menge des Proteins in pflanzlichen Zellen zu Veränderun gen im Stärkemetabolismus der Pflanzen führt, insbesondere zur Synthese von Stärken mit veränderten physikalischen und chemischen Eigenschaften.

Durch die Bereitstellung der erfindungsgemäßen Nucleinsäure moleküle ist es somit möglich, mit Hilfe gentechnischer Ver fahren Pflanzen herzustellen, die eine modifizierte Stärke synthetisieren, die sich in ihrer Struktur und ihren physi kalischen und chemischen Eigenschaften von in Wildtyp-Pflan zen synthetisierter Stärke unterscheidet. Hierzu werden die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle mit regulatorischen Elementen verknüpft, die die Transkription und Translation in Pflanzenzellen gewährleisten, und in pflanzliche Zellen eingebracht.

Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch transgene Pflanzenzellen, die ein erfindungsgemäßes Nucleinsäuremole kül enthalten, wobei dieses mit regulatorischen Elementen verknüpft ist, die die Transkription in pflanzlichen Zellen gewährleisten. Die regulatorischen Elemente sind vorzugswei se heterolog in Bezug auf das Nucleinsäuremolekül.

Derartige erfindungsgemäße Pflanzenzellen unterscheiden sich von natürlicherweise auftretenden Pflanzenzellen u. a. da durch, daß sie in ihr Genom integriert mindestens eine Kopie eines erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküls, gegebenenfalls zusätzlich zu den natürlicherweise vorkommenden Kopien ent halten. Ferner ist (sind) diese zusätzliche(n) Kopie(n) an einem Ort im Genom integriert, an dem sie natürlicherweise nicht vorkommen. Dies läßt sich beispielsweise durch eine Southern-Blot-Analyse nachweisen.

Die transgenen Pflanzenzellen können nach dem Fachmann be kannten Techniken zu ganzen Pflanzen regeneriert werden. Die durch Regeneration der erfindungsgemäßen transgenen Pflan zenzellen erhältlichen Pflanzen sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Ferner sind Gegenstand der Er findung Pflanzen, die die oben beschriebenen transgenen Pflanzenzellen enthalten. Bei den transgenen Pflanzen kann es sich prinzipiell um Pflanzen jeder beliebigen Pflanzen spezies handeln, d. h. sowohl monokotyle als auch dikotyle Pflanzen. Bevorzugt handelt es sich um Nutzpflanzen, insbe sondere stärkespeichernde Nutzpflanzen, wie z. B. Getreidear ten (Roggen, Gerste, Hafer, Weizen etc.), Reis, Mais, Erbse, Maniok und Kartoffel.

Die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzenzellen und Pflanzen synthetisieren aufgrund der Expression bzw. zusätzlichen Ex pression eines erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküls eine Stärke, die im Vergleich zu Stärke aus Wildtyp-Pflanzen, d. h. nicht-transformierten Pflanzen, modifiziert ist.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit auch die aus den erfindungsgemäßen transgenen Pflanzenzellen und Pflanzen erhältliche Stärke.

Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins, das in pflanzlichen Zellen so wohl an Stärkekörner gebunden als auch in löslicher Form vorliegt, bei dem erfindungsgemäße Wirtszellen unter Bedin gungen kultiviert werden, die die Expression des Proteins erlauben, und das Protein aus den Zellen und/oder dem Kul turmedium isoliert wird.

Ferner betrifft die Erfindung die durch die erfindungsgemä ßen Nucleinsäuremoleküle codierten Proteine sowie Proteine, die durch das oben beschriebene Verfahren erhältlich sind. Es handelt sich dabei vorzugsweise um kerncodierte Proteine aus Mais, die in den Plastiden lokalisiert sind. In den Pla stiden liegen diese Enzyme sowohl an den Stärkekörnern ge bunden vor als auch frei.

Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls Antikörper, die spe zifisch ein erfindungsgemäßes Protein erkennen. Es kann sich hierbei sowohl um monoclonale als auch um polyclonale Anti körper handeln. Verfahren zur Herstellung derartiger Anti körper sind dem Fachmann geläufig.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Nucleinsäuremole küle, die mit einem erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekül spezifisch hybridisieren und eine Länge von mindestens 15 Nucleotiden aufweisen. Spezifisch hybridisieren bedeutet da bei, daß unter konventionellen Hybridisierungsbedingungen, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, keine signifi kanten Kreuzhybridisierungen mit Sequenzen auftreten, die für andere Proteine codieren. Vorzugsweise haben derartige Nucleinsäuremoleküle eine Länge von mindestens 20, besonders bevorzugt von mindestens 50 und insbesondere von mindestens 100 Nucleotiden. Verwendet werden können solche Moleküle beispielsweise als PCR-Primer, als Hybridisierungsproben oder als DNA-Moleküle, die antisense-RNA codieren.

Es wurde ferner gefunden, daß es möglich ist, die Eigen schaften der in Pflanzenzellen synthetisierten Stärke da durch zu beeinflussen, daß die Menge an Proteinen, die durch die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle codiert werden, in den Zellen verringert wird. Diese Verringerung kann bei spielsweise durch antisense-Expression der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle, durch Expression geeigneter Ribozyme oder mittels Cosuppression erfolgen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind somit auch DNA-Moleküle, die eine antisense-RNA codieren, die komplementär ist zu Transkripten eines erfindungsgemäßen DNA-Moleküls, sowie diese antisense-Moleküle. Komplementär bedeutet dabei, daß die codierte RNA nicht 100% komplementär sein muß, son dern auch ein geringerer Grad an Komplementarität ausreicht, solange sie genügend hoch ist, um bei Expression in pflanz lichen Zellen die Expression eines erfindungsgemäßen Pro teins zu inhibieren. Die transkribierte RNA ist vorzugsweise zumindest 90% und besonders bevorzugt mindestens 95% kom plementär zu einem Transkript eines erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküls. Um bei Transkription in pflanzlichen Zellen einen antisense-Effekt zu bewirken, sind derartige DNA-Moleküle mindestens 15 bp lang, vorzugsweise länger als 100 bp und besonders bevorzugt länger als 500 bp, jedoch in der Regel kürzer als 5000 bp, vorzugsweise kürzer als 2500 bp.

Ferner betrifft die Erfindung auch DNA-Moleküle, die bei Ex pression in pflanzlichen Zellen zur Synthese einer RNA füh ren, die in den Pflanzenzellen aufgrund eines Cosuppres sions-Effektes eine Verringerung der Expression erfindungsge mäßer Nucleinsäuremoleküle hervorruft, die das beschriebene Protein codieren. Die Erfindung betrifft auch die durch diese codierten RNA-Moleküle. Das Prinzip der Cosuppression sowie die Herstellung entsprechender DNA-Sequenzen ist bei spielsweise ausführlich beschrieben in der WO 90/12084. Der artige DNA-Moleküle codieren vorzugsweise eine RNA, die ei nen hohen Grad an Homologie zu Transkripten der erfindungs gemäßen Nucleinsäuremoleküle hat. Es ist dabei allerdings nicht unbedingt erforderlich, daß die codierte RNA in ein Protein translatierbar ist.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung DNA-Moleküle, die ein RNA-Molekül mit Ribozymakti vität codieren, das spezifisch Transkripte eines erfindungs gemäßen DNA-Moleküls spaltet, sowie diese codierten RNA-Mo leküle.

Ribozyme sind katalytisch aktive RNA-Moleküle, die in der Lage sind, RNA-Moleküle und spezifische Zielsequenzen zu spalten. Mit Hilfe gentechnologischer Methoden ist es mög lich, die Spezifität von Ribozymen zu verändern. Es existie ren verschiedene Klassen von Ribozymen. Für die praktische Anwendung mit dem Ziel, das Transkript eines bestimmten Gens gezielt zu spalten, werden bevorzugt Vertreter zweier ver schiedener Gruppen von Ribozymen verwendet. Die eine Gruppe wird gebildet von Ribozymen, die dem Typ der GruppeI-Intron- Ribozymen zuzuordnen sind. Die zweite Gruppe wird von Ribo zymen gebildet, die als charakteristisches Strukturmerkmal ein sogenanntes "hammerhead"-Motiv aufweisen. Die spezifi sche Erkennung des Ziel-RNA-Moleküls kann modifiziert werden durch Änderung der Sequenzen, die dieses Motiv flankieren. Diese Sequenzen bestimmen über Basenpaarung mit Sequenzen im Zielmolekül die Stelle, an der die katalytische Reaktion und somit die Spaltung des Zielmoleküls erfolgt. Da die Sequenz anforderungen für eine effiziente Spaltung äußerst gering sind, ist es im Prinzip möglich, spezifische Ribozyme für praktisch jedes beliebige RNA-Molekül zu entwickeln.

Um DNA-Moleküle herzustellen, die ein Ribozym codieren, das spezifisch Transkripte eines erfindungsgemäßen DNA-Moleküls spaltet, wird beispielsweise eine DNA-Sequenz, die eine ka talytische Domäne eines Ribozyms codiert, beiderseits mit DNA-Sequenzen verknüpft, die homolog sind zu Sequenzen des Zielenzyms. Als Sequenzen, die die katalytische Domänen co dieren, kommen beispielsweise in Frage die katalytische Do mäne der Satelliten-DNA des SCMo-Virus (Davies et al., Viro logy 177 (1990), 216-224) oder die der Satelliten-DNA des TobR-Virus (Steinecke et al., EMBO J. 11 (1992), 1525-1530; Haseloff und Gerlach, Nature 334 (1988), 585-591). Die die katalytische Domäne flankierenden DNA-Sequenzen stammen vor zugsweise aus den oben beschriebenen erfindungsgemäßen DNA-Molekülen.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Vektoren, die die oben beschriebenen DNA-Moleküle enthalten, insbesondere solche, bei denen die beschriebenen DNA-Moleküle verknüpft sind mit regulatorischen Elementen, die die Transkription in pflanzlichen Zellen gewährleisten.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Wirtszellen, die die beschriebenen DNA-Moleküle oder Vektoren enthalten. Die Wirtszelle kann eine prokaryontische, beispielsweise bakte rielle, oder eukaryontische Zelle sein. Bei den eukaryonti schen Wirtszellen handelt es sich vorzugsweise um pflanzli che Zellen.

Ferner betrifft die Erfindung transgene Pflanzenzellen, die ein oben beschriebenes DNA-Molekül enthalten, das eine anti sense-RNA, ein Ribozym oder eine RNA, die zu einem Co suppressions-Effekt führt, codiert, wobei dieses DNA-Molekül verknüpft ist mit DNA-Elementen, die die Transkription in pflanzlichen Zellen gewährleisten. Diese transgenen Pflan zenzellen können nach gängigen Techniken zu ganzen Pflanzen regeneriert werden. Die Erfindung betrifft somit auch Pflan zen, die erhältlich sind durch Regeneration aus den be schriebenen transgenen Pflanzenzellen, sowie Pflanzen, die die beschriebenen transgenen Pflanzenzellen enthalten. Bei den transgenen Pflanzen kann es sich wiederum um Pflanzen jeder beliebigen Pflanzenspezies handeln, vorzugsweise um Nutzpflanzen, insbesondere stärkespeichernde, wie oben ange geben und besonders bevorzugt um Maispflanzenzellen.

Durch die Expression der beschriebenen DNA-Moleküle, die an tisense-RNA, ein Ribozym oder eine "Cosuppressions-RNA" co dieren, in den transgenen Pflanzenzellen kommt es zu einer Verringerung der Menge an Proteinen, die durch erfindungsge mäße DNA-Moleküle codiert werden, die endogen in den Zellen vorliegen. Diese Verringerung hat überraschenderweise eine drastische Veränderung der physikalischen und chemischen Ei genschaften der in den Pflanzenzellen synthetisierten Stärke zur Folge.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit auch die aus den beschriebenen transgenen Pflanzenzellen und Pflanzen er hältliche Stärke.

Ferner betrifft die Erfindung die durch die beschriebenen DNA-Moleküle codierten antisense-RNA-Moleküle, sowie RNA-Mo leküle mit Ribozymaktivität und RNA-Moleküle, die einen Co suppressions-Effekt hervorrufen, die beispielsweise durch Transkription erhältlich sind.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzenzellen, die im Vergleich zu nicht-transformierten Zellen eine modifizierte Stärke synthetisieren, bei dem in den Pflanzenzellen die Menge an Proteinen verringert wird, die durch erfindungsge mäße DNA-Moleküle codiert werden, die endogen in den Zellen vorliegen.

In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt diese Verringe rung mit Hilfe eines antisense-Effektes. Hierzu werden er findungsgemäße DNA-Moleküle oder Teile davon in antisense- Orientierung mit einem Promotor verknüpft, der die Trans kription in pflanzlichen Zellen gewährleistet, sowie gegebe nenfalls mit einem Terminationssignal, das die Termination der Transkription sowie die Polyadenylierung des Transkrip tes gewährleistet. Um einen effizienten antisense-Effekt in den pflanzlichen Zellen zu gewährleisten, sollte die synthe tisierte antisense-RNA eine Mindestlänge von 15 Nucleotiden, vorzugsweise von mindestens 100 Nucleotiden und besonders bevorzugt von über 500 Nucleotiden aufweisen. Ferner sollte die die antisense-RNA codierende DNA-Sequenz in bezug auf die zu transformierende Pflanzenspezies homolog sein. Es können jedoch auch DNA-Sequenzen verwendet werden, die einen hohen Grad an Homologie zu endogen in den Zellen vorhandenen DNA-Sequenzen aufweisen, vorzugsweise eine Homologie von mehr als 90%, besonders bevorzugt von mehr als 95%.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Verringerung der Menge an Proteinen, die durch die erfin dungsgemäßen DNA-Moleküle codiert werden, durch einen Ribo zym-Effekt. Die prinzipielle Wirkungsweise von Ribozymen, sowie die Konstruktion von DNA-Molekülen, die derartige RNA-Moleküle codieren, wurden bereits oben beschrieben. Um in transgenen Zellen eine RNA mit Ribozymaktivität zu expri mieren, werden die oben beschriebenen DNA-Moleküle, die für ein Ribozym codieren, mit DNA-Elementen verknüpft, die die Transkription in pflanzlichen Zellen gewährleisten, insbe sondere mit einem Promotor und einem Terminationssignal. Die in den Pflanzenzellen synthetisierten Ribozyme führen zur Spaltung von Transkripten von erfindungsgemäßen DNA-Molekü len, die endogen in den Zellen vorliegen.

Eine weitere Möglichkeit der Verringerung der Menge an Pro teinen, die durch die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle codiert werden, ist die Cosuppression. Gegenstand der Erfin dung sind dabei auch die durch das erfindungsgemäße Verfah ren erhältlichen Pflanzenzellen, die dadurch charakterisiert sind, daß bei ihnen die Menge an Proteinen verringert ist, die durch die erfindungsgemäßen DNA-Moleküle codiert werden, und die im Vergleich zu Wildtyp-Zellen eine modifizierte Stärke synthetisieren.

Ferner betrifft die Erfindung Pflanzen, die erhältlich sind durch Regeneration der beschriebenen Pflanzenzellen, sowie Pflanzen, die die beschriebenen erfindungsgemäßen Zellen enthalten.

Die aus den beschriebenen Pflanzenzellen und Pflanzen er hältliche Stärke ist ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Diese unterscheidet sich in ihren physikalischen und/oder chemischen Eigenschaften von Stärke aus nicht transformierten Zellen bzw. Pflanzen. Vorzugsweise weist diese Stärke im Vergleich zu Stärke aus nicht-transformier ten Zellen bzw. Pflanzen veränderte Verkleisterungseigen schaften, d. h. veränderte Viskositätseigenschaften der wäß rigen Lösungen der Stärke, und/oder einen veränderten Phos phatgehalt, insbesondere einen reduzierten Phosphatgehalt.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorlie genden Erfindung wird in den transformierten Pflanzenzellen nicht nur die Synthese eines erfindungsgemäßen Proteins re duziert, sondern darüber hinaus auch die Synthese mindestens eines weiteren, an der Stärkesynthese und/oder Modifikation beteiligten Enzyms. Bevorzugt sind dabei beispielsweise Stärkekorn-gebundene Stärkesynthasen oder Verzweigungsenzy me.

Die Expression der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle kann prinzipiell in allen Pflanzenspezies erfolgen. Von In teresse sind sowohl monokotyle als auch dikotyle Pflanzen, insbesondere Nutzpflanzen und hierbei bevorzugt stärkespei chernde Pflanzen, wie z. B. Getreidepflanzen (Roggen, Gerste, Hafer, Weizen, etc.), insbesondere Mais, Reis, Erbse, Maniok und Kartoffel.

Unter dem Begriff "regulatorische DNA-Elemente, die die Transkription in pflanzlichen Zellen gewährleisten" werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung DNA-Abschnitte verstan den, die die Initiation bzw. die Termination der Transkrip tion in pflanzlichen Zellen ermöglichen. Zu den DNA-Ab schnitten, die die Initiation der Transkription gewährlei sten zählen insbesondere Promotoren.

Für die Expression der verschiedenen oben beschriebenen er findungsgemäßen DNA-Moleküle in Pflanzen kommt im Prinzip jeder in pflanzlichen Zellen funktionale Promotor in Be tracht. Der Promotor kann homolog oder heterolog in bezug auf die verwendete Pflanzenspezies sein. Geeignet ist bei spielsweise der 35S-Promotor des Cauliflower-Mosaik-Virus (Odell et al., Nature 313 (1985), 810-812), der eine konsti tutive Expression in allen Geweben einer Pflanze gewährlei stet und das in der WO/9401571 beschriebene Promotorkon strukt. Es können jedoch auch Promotoren verwendet werden, die nur zu einem durch äußere Einflüsse determinierten Zeit punkt (siehe beispielsweise WO/9307279) oder in einem be stimmten Gewebe der Pflanze zu einer Expression nachfolgen der Sequenzen führen (siehe z. B. Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989), 2245-2251). Präferentiell werden Promotoren einge setzt, die in den stärkespeichernden Organen der zu trans formierenden Pflanzen aktiv sind. Dies sind beim Mais die Maiskörner, während es bei der Kartoffel die Knollen sind. Zur Transformation der Kartoffel kann insbesondere, aber nicht ausschließlich, der knollenspezifische B33-Promotor (Rocha-Sosa et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29) verwendet wer den.

Neben Promotoren können DNA-Abschnitte zur Initiation der Transkription auch DNA-Sequenzen enthalten, die eine weitere Steigerung der Transkription gewährleisten, beispielsweise sogenannte Enhancer-Elemente.

Ferner kann der Begriff "regulatorische DNA-Elemente" auch Terminationssignale umfassen, die der korrekten Beendigung der Transkription sowie der Addition eines Poly-A-Schwanzes an das Transkript dienen, dem eine Funktion bei der Stabili sierung der Transkripte beigemessen wird. Derartige Elemente sind in der Literatur beschrieben und sind beliebig aus tauschbar. Beispiele für derartige Terminationssequenzen sind die 3'-nichttranslatierten Regionen, die das Polyadeny lierungssignal des Nopalin-Synthase-Gens (NOS-Gen) oder des Octopinsynthase-Gens (Gielen et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29) aus Agrobakterien umfassen, oder die 3'-nichttransla tierten Regionen der Gene der Speicherproteine aus Soja bohne, sowie die der Gene der kleinen Untereinheit der Ribu lose-1,5-Bisphosphat-Carboxylase (ssRUBISCO).

Die Einführung erfindungsgemäßer DNA-Moleküle in pflanzliche Zellen erfolgt vorzugsweise unter Verwendung von Plasmiden. Vorzugsweise werden dafür Plasmide verwendet, die eine sta bile Integration der eingeführten DNA in das pflanzliche Ge nom gewährleisten.

Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen stehen eine große Anzahl von Clonierungsvektoren zur Verfügung, die ein Replikationssignal für E.coli und ein Markergen zur Selektion transformierter Bakterienzellen ent halten. Beispiele für derartige Vektoren sind pBR322, pUC-Serien, M13mp-Serien, pACYC184 usw. Die gewünschte Sequenz kann an einer passenden Restriktionsschnittstelle in den Vektor eingeführt werden. Das erhaltene Plasmid wird für die Transformation von E. coli-Zellen verwendet. Transformierte E.coli-Zellen werden in einem geeigneten Medium kultiviert, anschließend geerntet und lysiert. Das Plasmid wird nach Standardmethoden wiedergewonnen. Als Analysemethode zur Cha rakterisierung der gewonnenen Plasmid-DNA werden im allge meinen Restriktionsanalysen und Sequenzanalysen eingesetzt. Nach jeder Manipulation kann die Plasmid DNA gespalten wer den und resultierende DNA-Fragmente mit anderen DNA-Sequenzen verknüpft werden.

Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen eine Vielzahl von Techniken zur Verfügung. Diese Techniken umfassen die Transformation pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacteriuin rhizoqenes als Transformationsmittel, die Fusion von Protoplasten, die Injektion, die Elektroporation von DNA, die Einbringung von DNA mittels der biolistischen Methode sowie weitere Möglichkeiten.

Bei der Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzen zellen werden an sich keine speziellen Anforderungen an die verwendeten Plasmide gestellt. Es können einfache Plasmide wie z. B. pUC-Derivate verwendet werden. Sollen aber aus der artig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert wer den, ist die Anwesenheit eines selektierbaren Markergens notwendig.

Je nach Einführungsmethode gewünscht er Gene in die Pflanzen zelle können weitere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Werden z. B. für die Transformation der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri-Plasmid verwendet, so muß mindestens die rechte Begren zung, häufig jedoch die rechte und linke Begrenzung der Ti- und Ri-Plasmid T-DNA als Flankenbereich mit den einzuführen den Genen verbunden werden.

Werden für die Transformation Agrobakterien verwendet, muß die einzuführende DNA in spezielle Plasmide cloniert werden, und zwar entweder in einen intermediären Vektor oder in ei nen binären Vektor. Die intermediären Vektoren können auf grund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plas mid der Agrobakterien integriert werden. Dieses enthält au ßerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige vir-Region. Intermediäre Vektoren können nicht in Agrobakterien repli zieren. Mittels eines Helferplasmids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacteriuin tumefaciens übertragen werden (Konjugation). Binäre Vektoren können sowohl in E.coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selek tionsmarker-Gen und einen Linker oder Polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA Grenzregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agrobakterien transformiert werden (Holsters et al., Mol. Gen. Genet. 163 (1978), 181-187). Die zur Transformation der Agrobakterien verwendeten Plasmide enthalten weiterhin ein Selektionsmarkergen, beispielsweise das NPT II-Gen, das die Selektion transformierter Bakterien erlaubt. Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium soll ein Plasmid, das eine vir-Region trägt, enthalten. Die vir-Re gion ist für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig. Zusätzliche T-DNA kann vorhanden sein. Das derar tig transformierte Agrobakterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet.

Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflan zenzellen ist intensiv untersucht und ausreichend in EP 120516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System Offset drukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985), Chapter V; Fra ley et al., Crit. Rev. Plant. Sci., 4: 1-46 und An et al., EMBO J. 4 (1985), 277-287 beschrieben worden. Binäre Vekto ren sind bereits z. T. kommerziell erhältlich, z. B. pBIN19 (Clontech Laboratories, Inc., USA).

Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflan zen-Explantate zweckmäßigerweise mit Agrobacterium tume faciens oder Agrobacterium rhizogenes kokultiviert werden. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (z. B. Blattstücke, Stengelsegmente, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Sus pensions-kultivierte Pflanzenzellen) können dann in einem geeigneten Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Se lektion transformierter Zellen enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden. Die so erhaltenen Pflanzen kön nen dann auf Anwesenheit der eingeführten DNA untersucht werden. Andere Möglichkeiten der Einführung fremder DNA un ter Verwendung des biolistischen Verfahrens oder durch Pro toplastentransformation sind bekannt (vgl. z. B. Willmitzer, L., 1993 Transgenic plants. In: Biotechnology, A Multi- Volume Comprehensive Treatise (H.J. Rehm, G. Reed, A. Püh ler, P. Stadler, eds.), Vol. 2, 627-659, VCH Weinheim-New York-Basel-Cambridge).

Während die Transformation dikotyler Pflanzen über Ti-Plas mid-Vektorsysteme mit Hilfe von Agrobacterium tumefaciens wohl etabliert ist, weisen neuere Arbeiten darauf hin, daß auch monokotyle Pflanzen der Transformation mittels Agrobacterium basierender Vektoren sehr wohl zugänglich sind (Chan et al., Plant Mol. Biol. 22 (1993), 491-506; Hiei et al., Plant J. 6 (1994), 271-282).

Alternative Systeme zur Transformation von monokotylen Pflanzen sind die Transformation mittels des biolistischen Ansatzes, die Protoplastentransformation, die Elektropora tion von partiell permeabilisierten Zellen, die Einbringung von DNA mittels Glasfasern.

Spezifisch die Transformation von Mais wird in der Literatur verschiedentlich beschrieben (vgl. z. B. WO95/06128, EP 0 513 849; EP 0 465 875). In EP 292 435 wird ein Verfahren beschrieben, mit Hilfe dessen, ausgehend von einem schleim losen, weichen (friable) granulösen Mais-Kallus, fertile Pflanzen erhalten werden können. Shillito et al. (Bio/Technology 7 (1989), 581) haben in diesem Zusammenhang beobachtet, daß es ferner für die Regenerierbarkeit zu fer tilen Pflanzen notwendig ist, von Kallus-Suspensionskulturen auszugehen, aus denen eine sich teilende Protoplastenkultur, mit der Fähigkeit zu Pflanzen zu regenerieren, herstellbar ist. Nach einer in vitro Kultivierungszeit von 7 bis 8 Mona ten erhalten Shillito et al. Pflanzen mit lebensfähigen Nachkommen, die jedoch Abnormalitäten in der Morphologie und der Reproduktivität aufweisen.

Prioli und Söndahl (Bio/Technology 7 (1989), 589) beschrei ben die Regeneration und die Gewinnung fertiler Pflanzen aus Mais-Protoplasten der Cateto Mais-Inzuchtlinie Cat 100-1. Die Autoren vermuten, daß die Protoplasten-Regeneration zu fertilen Pflanzen abhängig ist von einer Anzahl verschiede ner Faktoren, wie z. B. von Genotyp, vom physiologischen Zu stand der Donor-Zellen und von den Kultivierungsbedingungen. Ist die eingeführte DNA einmal im Genom der Pflanzenzelle integriert, so ist sie dort in der Regel stabil und bleibt auch in den Nachkommen der ursprünglich transformierten Zel le erhalten. Sie enthält normalerweise einen Selektions marker, der den transformierten Pflanzenzellen Resistenz ge genüber einem Biozid oder einem Antibiotikum wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin oder Phosphinotricin u. a. ver mittelt. Der individuelle gewählte Marker sollte daher die Selektion transformierter Zellen gegenüber Zellen, denen die eingeführte DNA fehlt, gestatten.

Die transformierten Zellen wachsen innerhalb der Pflanze in der üblichen Weise (siehe auch McCormick et al., Plant Cell Reports 5 (1986), 81-84). Die resultierenden Pflanzen können normal angezogen werden und mit Pflanzen, die die gleiche transformierte Erbanlage oder andere Erbanlagen besitzen, gekreuzt werden. Die daraus entstehenden hybriden Individuen haben die entsprechenden phänotypischen Eigenschaften.

Es sollten zwei oder mehrere Generationen angezogen werden, um sicherzustellen, daß das phänotypische Merkmal stabil beibehalten und vererbt wird. Auch sollten Samen geerntet werden, um sicherzustellen, daß der entsprechende Phänotyp oder andere Eigenarten erhalten geblieben sind.

Die aus den erfindungsgemäßen Pflanzenzellen bzw. Pflanzen erhältliche Stärke eignet sich aufgrund ihrer Eigenschaften neben den bereits oben angesprochenen speziellen Verwen dungszwecken für verschiedene industrielle Verwendungen.

Grundsätzlich läßt sich Stärke in zwei große Kategorien un terteilen, die Hydrolyseprodukte der Stärke und die soge nannten nativen Stärken. Zu den Hydrolyseprodukten zählen im wesentliche die über enzymatische oder chemische Verfahren erhaltene Glucose sowie Glucosebausteine, die für weitere Prozesse, wie Fermentation, oder auch weitere chemische Mo difikationen eingesetzt werden können. In diesem Bereich kann die Einfachheit und kostengünstige Ausführung eines Hy drolyseverfahrens, wie es gegenwärtig im wesentlichen en zymatisch unter Verwendung von Amyloglucosidase verläuft, von Bedeutung sein. Darunter läßt sich vorstellen, daß ein geringerer Einsatz von für die Hydrolyse eingesetzten Enzy men durch Veränderung der Struktur der Stärke, z. B. größere Oberfläche des Korns, leichtere Verdaulichkeit durch gerin geren Verzweigungsgrad oder sterische, die Zugänglichkeit für die eingesetzten Enzyme limitierende Struktur, zu einer Kosteneinsparung führen kann.

Die Verwendungen der sogenannten nativen Stärken, die wegen ihrer polymeren Struktur eingesetzt werden, lassen sich in zwei große Bereiche unterteilen:

(a) Verwendung im Nahrungsmittelbereich

Stärke ist ein klassischer Zusatzstoff für viele Nah rungsmittel, bei denen sie im wesentlichen die Funktion des Bindens von wäßrigen Zusatzstoffen übernimmt bzw. eine Erhöhung der Viskosität oder aber eine erhöhte Gel bildung hervorruft. Wichtige Eigenschaftsmerkmale sind das Fließ- und Sorptionsverhalten, die Quell- und Ver kleisterungstemperatur, die Viskosität und Dickungslei stung, die Löslichkeit der Stärke, die Transparenz und Kleisterstruktur, die Hitze-, Scher- und Säurestabili tät, die Neigung zur Retrogradation, die Fähigkeit zur Filmbildung, die Gefrier/Taustabilität, die Verdaulich keit sowie die Fähigkeit zur Komplexbildung mit z. B. an organischen oder organischen Ionen.

(b) Einsatz im Nicht-Nahrungsmittelbereich

Der andere große Einsatzbereich liegt bei der Verwendung der Stärke als Hilfsstoff bei unterschiedlichen Herstel lungsprozessen bzw. als Zusatzstoff in technischen Pro dukten. Der wesentliche Einsatzbereich für die Verwen dung von Stärke als Hilfsstoff ist zum einen die Papier- und Pappeindustrie. Stärke wird dabei in erster Linie zur Retardation (Zurückhaltung von Feststoffen), der Ab bindung von Füllstoff- und Feinstoffteilchen, als Festi gungsstoff und zur Entwässerung eingesetzt. Darüber hin aus werden die günstigen Eigenschaften der Stärke in be zug auf die Steifigkeit, die Härte, den Klang, den Griff, den Glanz, die Glätte, die Spaltfestigkeit sowie die Oberflächen ausgenutzt.

Innerhalb des Papierherstellungsprozesses sind vier An wendungsbereiche, nämlich Oberfläche, Strich, Masse und Sprühen, zu unterscheiden.

Die Anforderungen an die Stärke in bezug auf die Ober flächenbehandlung sind im wesentlichen ein hoher Weiße grad, eine angepaßte Viskosität, eine hohe Viskositäts stabilität, eine gute Filmbildung sowie eine geringe Staubbildung. Bei der Verwendung im Strich ist der Fest stoffgehalt, eine angepaßte Viskosität, ein hohes Binde vermögen sowie eine hohe Pigmentaffinität wichtig. Als Zusatz zur Masse ist eine rasche, gleichmäßige, ver lustfreie Verteilung, eine hohe mechanische Stabilität und eine vollständige Zurückhaltung im Papierfließ von Bedeutung. Beim Einsatz der Stärke im Sprühbereich sind ebenfalls ein angepaßter Feststoffgehalt, hohe Viskosi tät sowie ein hohes Bindevermögen von Bedeutung.

Ein großer Einsatzbereich besteht beispielsweise in der Klebstoffindustrie, wo man die Einsatzmöglichkeiten in vier Teilbereiche gliedert: die Verwendung als reinem Stärkeleim, die Verwendung bei mit speziellen Chemika lien aufbereiteten Stärkeleimen, die Verwendung von Stärke als Zusatz zu synthetischen Harzen und Polymer dispersionen sowie die Verwendung von Stärken als Streckmittel für synthetische Klebstoffe. 90% der Kleb stoffe auf Stärkebasis werden in den Bereichen Wellpap penherstellung, Herstellung von Papiersäcken, Beuteln oder Tüten, Herstellung von Verbundmaterialien für Pa pier und Aluminium, Herstellung von Kartonagen und Wie derbefeuchtungsleim für Briefumschläge, Briefmarken usw. eingesetzt.

Eine weitere mögliche Verwendung als Hilfsmittel und Zu satzstoff besteht bei der Herstellung von Textilien und Textilpflegemitteln. Innerhalb der Textilindustrie sind die folgenden vier Einsatzbereiche zu unterscheiden: Der Einsatz der Stärke als Schlichtmittel, d. h. als Hilfs stoff zur Glättung und Stärkung des Klettverhaltens zum Schutz gegen die beim Weben angreifenden Zugkräfte sowie zur Erhöhung der Abriebfestigkeit beim Weben, als Mittel zur Textilaufrüstung vor allem nach qualitätsverschlech ternden Vorbehandlungen, wie Bleichen, Färben usw., als Verdickungsmittel bei der Herstellung von Farbpasten zur Verhinderung von Farbstoffdiffusionen sowie als Zusatz zu Kettungsmitteln für Nähgarne.

Ferner kann die Stärke als Zusatz bei Baustoffen verwen det werden. Ein Beispiel ist die Herstellung von Gipskartonplatten, bei der die im Gipsbrei vermischte Stärke mit dem Wasser verkleistert, an die Oberfläche der Gipsplatte diffundiert und dort den Karton an die Platte bindet. Weitere Einsatzbereiche sind die Beimi schung zu Putz- und Mineralfasern. Bei Transportbeton kann die Stärke zur Verzögerung der Abbindung eingesetzt werden.

Ferner bietet sich die Stärke zur Herstellung von Mit teln zur Bodenstabilisation an, die bei künstlichen Erd bewegungen zum temporären Schutz der Bodenpartikel ge genüber Wasser eingesetzt werden. Kombinationsprodukte aus Stärke und Polymeremulsionen sind nach heutiger Kenntnis in ihrer Erosions- und verkrustungsmindernden Wirkung den bisher eingesetzten Produkten gleichzuset zen, liegen preislich aber deutlich unter diesen.

Ferner kann die Stärke in Pflanzenschutzmitteln zur Ver änderung der spezifischen Eigenschaften der Präparate verwendet werden. So werden Stärken beispielsweise zur Verbesserung der Benetzung von Pflanzenschutz- und Dün gemitteln, zur dosierten Freigabe der Wirkstoffe, zur Umwandlung flüssiger, flüchtiger und/oder übelriechender Wirkstoffe in mikrokristalline, stabile, formbare Sub stanzen, zur Mischung inkompatibler Verbindungen und zur Verlängerung der Wirkdauer durch Verminderung der Zer setzung eingesetzt.

Ein wichtiges Einsatzgebiet besteht ferner im Bereich der Pharmaka, Medizin und Kosmetikindustrie. In der pharmazeutischen Industrie kann die Stärke als Bindemit tel für Tabletten oder zur Bindemittelverdünnung in Kap seln eingesetzt werden. Weiterhin eignet sich die Stärke als Tablettensprengmittel, da sie nach dem Schlucken Flüssigkeit absorbiert und nach kurzer Zeit so weit quillt, daß der Wirkstoff freigesetzt wird. Medizinische Gleit- und Wundpuder sind weitere Anwendungsmöglichkei ten. Im Bereich der Kosmetik kann die Stärke beispiels weise als Träger von Puderzusatzstoffen, wie Düften und Salicylsäure eingesetzt werden. Ein relativ großer An wendungsbereich für die Stärke liegt bei Zahnpasta.

Auch die Verwendung der Stärke als Zusatzstoff zu Kohle und Briketts ist denkbar. Kohle kann mit einem Stärkezu satz quantitativ hochwertig agglomeriert bzw. briket tiert werden, wodurch ein frühzeitiges Zerfallen der Briketts verhindert wird. Der Stärkezusatz liegt bei Grillkohle zwischen 4 und 6%, bei kalorierter Kohle zwi schen 0,1 und 0,5%. Desweiteren eignet sich die Stärke als Bindemittel, da durch ihren Zusatz zu Kohle und Bri kett der Ausstoß schädlicher Stoffe deutlich vermindert werden kann.

Die Stärke kann ferner bei der Erz- und Kohleschlammauf bereitung als Flockungsmittel eingesetzt werden.

Ein weiterer Einsatzbereich besteht als Zusatz zu Gieße reihilfsstoffen. Bei verschiedenen Gußverfahren werden Kerne benötigt, die aus Bindemittel-versetzten Sänden hergestellt werden. Als Bindemittel wird heute überwie gend Bentonit eingesetzt, das mit modifizierten Stärken, meist Quellstärken, versetzt ist.

Zweck des Stärkezusatzes ist die Erhöhung der Fließfe stigkeit sowie die Verbesserung der Bindefestigkeit. Darüber hinaus können die Quell stärken weitere produk tionstechnische Anforderungen, wie im kalten Wasser dis pergierbar, rehydratisierbar, gut in Sand mischbar und hohes Wasserbindungsvermögen, aufweisen.

In der Kautschukindustrie kann die Stärke zur Verbesse rung der technischen und optischen Qualität eingesetzt werden. Gründe sind dabei die Verbesserung des Oberflä chenglanzes, die Verbesserung des Griffs und des Ausse hens. Dafür wird Stärke vor der Kaltvulkanisation auf die klebrigen gummierten Flächen von Kautschukstoffen gestreut. Ebenso kann sie für die Verbesserung der Be druckbarkeit des Kautschuks eingesetzt werden.

Eine weitere Einsatzmöglichkeit der modifizierten Stärke besteht bei der Herstellung von Lederersatzstoffen.

Auf dem Kunststoffsektor zeichnen sich folgende Einsatz gebiete ab: die Einbindung von Stärkefolgeprodukten in den Verarbeitungsprozeß (Stärke ist nur Füllstoff, es besteht keine direkte Bindung zwischen synthetischem Po lymer und Stärke) oder alternativ die Einbindung von Stärkefolgeprodukten in die Herstellung von Polymeren (Stärke und Polymer gehen eine feste Bindung ein).

Die Verwendung der Stärke als reinem Füllstoff ist ver glichen mit den andere Stoffen wie Talkum nicht wettbe werbsfähig. Anders sieht es aus, wenn die spezifischen Stärkeeigenschaften zum Tragen kommen und hierdurch das Eigenschaftsprofil der Endprodukte deutlich verändert wird. Ein Beispiel hierfür ist die Anwendung von Stärke produkten bei der Verarbeitung von Thermoplasten, wie Polyethylen. Hierbei werden die Stärke und das syntheti sche Polymer durch Coexpression im Verhältnis von 1 : 1 zu einem "master batch" kombiniert, aus dem mit granu liertem Polyethylen unter Anwendung herkömmlicher Ver fahrenstechniken diverse Produkte hergestellt werden. Durch die Einbindung der Stärke in Polyethylenfolien kann eine erhöhte Stoffdurchlässigkeit bei Hohlkörpern, eine verbesserte Wasserdampfdurchlässigkeit, ein verbes sertes Antistatikverhalten, ein verbessertes Antiblock verhalten sowie eine verbesserte Bedruckbarkeit mit wäß rigen Farben erreicht werden.

Eine andere Möglichkeit ist die Anwendung der Stärke in Polyurethanschäumen. Mit der Adaption der Stärkederivate sowie durch die verfahrenstechnische Optimierung ist es möglich, die Reaktion zwischen synthetischen Polymeren und den Hydroxygruppen der Stärke gezielt zu steuern. Das Ergebnis sind Polyurethanfolien, die durch die An wendung von Stärke folgende Eigenschaftsprofile erhal ten: eine Verringerung des Wärmeausdehnungskoeffizien ten, Verringerung des Schrumpfverhaltens, Verbesserung des Druck/Spannungsverhaltens, Zunahme der Wasserdampf durchlässigkeit ohne Veränderung der Wasseraufnahme, Verringerung der Entflammbarkeit und der Aufrißdichte, kein Abtropfen brennbarer Teile, Halogenfreiheit und verminderte Alterung. Nachteile, die gegenwärtig noch vorhanden sind, sind verringerte Druckfestigkeit sowie eine verringerte Schlagfestigkeit.

Möglich ist nicht nur die Produktentwicklung von Folien. Auch feste Kunststoffprodukte, wie Töpfe, Platten und Schalen sind mit einem Stärkegehalt von über 50% herzu stellen. Ferner weisen die Stärke/Polymermischungen den Vorteil auf, daß sie eine sehr viel höhere biologische Abbaubarkeit aufweisen.

Außerordentliche Bedeutung haben weiterhin aufgrund ih res extremen Wasserbindungsvermögens Stärkepfropfpoly merisate gewonnen. Dies sind Produkte mit einem Rückgrat aus Stärke und einer nach dem Prinzip des Radikalketten mechanismus aufgepfropften Seitengitters eines syntheti schen Monomers. Die heute verfügbaren Stärkepfropfenpo lymerisate zeichnen sich durch ein besseres Binde- und Rückhaltevermögen von bis zu 1000 g Wasser pro g Stärke bei hoher Viskosität aus. Diese Superabsorber werden hauptsächlich im Hygienebereich verwendet, z. B. bei Pro dukten wie Windeln und Unterlagen sowie im landwirt schaftlichen Sektor, z. B. bei Saatgutpillierungen.

Entscheidend für den Einsatz der neuen gentechnischen verän derten Stärke sind zum einen die Struktur, Wassergehalt, Proteingehalt, Lipidgehalt, Fasergehalt, Asche/Phosphat gehalt, Amylose/Amylopektinverhältnis, Molmassenverteilung, Verzweigungsgrad, Korngröße und -form sowie Kristallisation, zum anderen auch die Eigenschaften, die in folgenden Merkma len münden: Fließ- und Sorptionsverhalten, Verkleiste rungstemperatur, Dickungsleistung, Löslichkeit, Kleister struktur, Transparenz, Hitze-, Scher- und Säurestabilität, Retrogradationsneigung, Gelbildung, Gefrier/Taustabilität, Komplexbildung, Jodbindung, Filmbildung, Klebekraft, Enzym stabilität, Verdaulichkeit und Reaktivität. Besonders her vorzuheben ist ferner die Viskosität.

Ferner kann die aus den erfindungsgemäßen Pflanzenzellen bzw. Pflanzen erhältliche modifizierte Stärke weiteren che mischen Modifikationen unterworfen werden, was zu weiteren Verbesserungen der Qualität für bestimmte der oben beschrie benen Einsatzgebiete führt oder zu neuen Einsatzgebieten. Diese chemischen Modifikationen sind dem Fachmann grundsätz lich bekannt. Insbesondere handelt es sich dabei um Modifi kationen durch

- Säurebehandlung
- Oxidation
- Veresterung (Entstehung von Phosphat-, Nitrat-, Sulfat-, Xanthat-, Acetat- und Citratstärken. Weitere organische Säuren können ebenfalls zur Veresterung eingesetzt wer den.)
- Erzeugung von Stärkeethern (Stärke-Alkylether, O-Allyl ether, Hydroxylalkylether, O-Carboxylmethylether, N-hal tige Stärkeether, S-haltige Stärkeether)
- Erzeugung von vernetzten Stärken
- Erzeugung von Stärke-Pfropf-Polymerisaten.

Gegenstand der Erfindung ist auch Vermehrungsmaterial der erfindungsgemäßen Pflanzen, wie z. B. Samen, Früchte, Steck linge, Knollen oder Wurzelstöcke, wobei dieses erfindungsge mäße Pflanzenzellen enthält.

Hinterlegungen

Folgende im Rahmen der vorliegenden Erfindung hergestellten und/oder verwendeten Plasmide wurden bei der als internatio nale Hinterlegungsstelle anerkannten Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) in Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland, entsprechend den Anforderungen des Budapester Vertrages für die internationale Anerkennung der Hinterle gung von Mikroorganismen zum Zwecke der Patentierung hinter legt.
(Hinterlegungsnummer; Hinterlegungsdatum):

Plasmid pBinAR Hyg:	(DSM 9505) (20.10.1994)
Plasmid p33-anti-BE:	(DSM 6146) (20.08.1990)
Plasmid pRL2:	(DSM 10225) (04.09.1995)

Beschreibung der Abbildungen

Fig. 1 zeigt das Plasmid p35S-anti-RL.
Aufbau des Plasmids:
A = Fragment A: CaMV 35S-Promotor, nt 6909-7437 (Franck et al., Cell 21 (1980), 285-294)
B = Fragment B: ca. 1949 bp-langes Asp718-Fragment aus pRL1
Orientierung zum Promotor: anti-sense
Der Pfeil gibt die Richtung des offenen Leserasters an.
C = Fragment C: nt 11748-11939 der T-DNA des Ti-Plas mids pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984), 835-846).

Fig. 2 zeigt das Plasmid pB33-anti-RL.
Aufbau des Plasmids:
A = Fragment A: B33-Promotor des Patatin-Gens B33 aus Solanum tuberosum (Rocha-Sosa et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29)
B = Fragment B: ca. 1949 bp-langes Asp718-Fragment aus pRL1
Orientierung zum Promotor: anti-sense
Der Pfeil gibt die Richtung des offenen Leserasters an.
C = Fragment C: nt 11748-11939 der T-DNA des Ti-Plas mids pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984), 835-846).

Fig. 3 zeigt eine mit einem Brabender-Viskograph vom Typ Viskograph E aufgezeichnete Brabender-Kurve einer wäßrigen Lösung von Stärke, die aus nicht-transformierten Kartoffel pflanzen der Varietät Désirée isoliert wurde (siehe Beispiel 8).

Dabei bedeuten:
Drehm. = Drehmoment
[BE] = Brabender-Einheiten
Temp. = Temperatur
A = Verkleisterungsbeginn
B = Maximale Viskosität
C = Start der Haltezeit
D = Start der Kühlzeit
E = Ende der Kühlzeit
F = Ende der End-Haltezeit.

Die blaue Linie gibt die Viskosität an; die rote den Tempe raturverlauf.

Fig. 4 zeigt eine mit einem Brabender-Viskograph vom Typ Viskograph E aufgezeichnete Brabender-Kurve einer wäßrigen Lösung von Stärke, die aus Kartoffelpflanzen isoliert wurde, die mit dem Plasmid p35S-anti-RL transformiert worden waren (siehe Beispiel 8). Für die Bedeutung der Abkürzungen siehe Fig. 3.

Fig. 5 zeigt eine mit einem Brabender-Viskograph vom Typ Viskograph E aufgezeichnete Brabender-Kurve einer wäßrigen Lösung von Stärke aus Kartoffeln, die mit dem Plasmid pB33-anti-RL transformiert worden waren (siehe Beispiel 8). Für die Bedeutung der Abkürzungen siehe Fig. 3.

Fig. 6 zeigt mit einem Rapid Visco Analyser aufgezeichnete Kurven wäßriger Stärkelösungen, die aus Kartoffelpflanzen isoliert wurden (siehe Beispiel 12). Die rote Linie gibt den Temperaturverlauf an, die blauen Linien 1, 2, 3 und 4 die Viskositäten folgender Stärkelösungen:
Linie 1: Stärke, die aus Wildtyppflanzen isoliert worden ist,
Linie 2: Stärke, die aus Pflanzen isoliert worden ist, bei denen das Verzweigungsenzym alleine inhibiert wur de (vgl. Beispiel 1 der Patentanmeldung WO92/14827),
Linie 3: Stärke, die aus Pflanzen isoliert worden ist, bei denen lediglich die erfindungsgemäßen Proteine in ihrer Konzentration verringert wurden (vgl. Bei spiel 6)
Linie 4: Stärke, die aus Pflanzen isoliert worden ist, die mit dem Plasmid p35S-anti-RL in Kombination mit dem Plasmid p35SH-anti-BE (vgl. Beispiel 12) transformiert worden sind.

Fig. 7 zeigt mit einem Rapid Visco Analyser aufgezeichnete Kurven wäßriger Stärkelösungen, die aus Kartoffelpflanzen isoliert wurden (siehe Beispiel 13). Die rote Linie gibt den Temperaturverlauf an, die blauen Linien 1, 2, 3 und 4 die Viskositäten folgender Stärkelösungen:
Linie 1: Stärke, die aus Wildtyppflanzen isoliert worden ist,
Linie 2: Stärke, die aus Pflanzen isoliert worden ist, die allein mit dem Plasmid pB33-anti-GBSSI isoliert wurde (sog. waxy-Kartoffel),
Linie 3: Stärke, die aus Pflanzen isoliert worden ist, die allein mit dem Plasmid p35S-anti-RL transformiert wurde (vgl. Beispiel 6),
Linie 4: Stärke, die aus Pflanzen isoliert worden ist, die mit dem Plasmid pB33-anti-RL in Kombination mit dem Plasmid pB33-anti-GBSSI (vgl. Beispiel 13) transformiert worden sind.

Fig. 8 zeigt das Plasmid pRL2, das eine Vollänge-cDNA aus Kartoffel enthält, die ein R1-Enzym codiert.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Verwendete Medien und Lösungen

Elutionspuffer
25 mM Tris pH 8,3
250 mM Glycin

Dialysepuffer
50 mM Tris-HCl pH 7,0
50 mM NaCl
2 mM EDTA
14,7 mM β-Mercaptoethanol
0,5 mM PMSF

Proteinpuffer
50 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,2
10 mM EDTA
0,5 mM PMSF
14,7 mM β-Mercaptoethanol

Lugolsche Lösung
12 g KI
6 g I₂
ad 1,8 l mit ddH₂O

20 × SSC
175.3 g NaCl
88.2 g Natrium-Citrat
ad 1000 ml mit ddH₂O
pH 7,0 mit 10 N NaOH

10×MEN
200 mM MOPS
50 mM Natriumacetat
10 mM EDTA
pH 7,0

NSEB-Puffer
  0,25 M Natriumphosphatpuffer pH 7,2
  7% SDS
  1 mM EDTA
  1% BSA (w/v)

YT
8 g Bacto-Yeast extract
5 g Bacto-Tryptone
5 g NaCl
ad 1000 ml mit ddH₂O

Protoplastenisolierungsmedium (100 ml)

Cellulase Onozuka R S (Meiji Seika, Japan)	800 mg
Pectolyase Y 23	40 mg
KNO₃	200 mg
KH₂PO₄	136 mg
K₂HPO₄	47 mg
CaCl₂ 2H₂O	147 mg
MgSO₄7H₂O	250 mg
Rinderserumalbumin (BSA)	20 mg
Glucose	4000 mg
Fructose	4000 mg
Saccharose	1000 mg
pH	5,8
Osmolarität	660 mosm.

Protoplastenwaschlösung 1: wie Protoplastenisolierlösung, aber ohne Cellulase, Pectolyase und BSA.

Transformationspuffer

a) Glucose 0,5 M

MES 0,1%

MgCl₂ 6H₂O 25 mM

pH 5,8

AL=L<auf 600 mosm. einstellen

b) PEG 6000-Lösung@ Glucose 0,5 M

MgCl₂ 6H₂O 100 mM

Hepes 20 mM

pH 6,5

Dem obigen Puffer unter b) wird PEG 6000 kurz vor Gebrauch der Lösung zugesetzt (40 Gew.-% PEG). Die Lösung wird durch ein 0,45 µm Sterilfilter filtriert.

W5 Lösung

CaCl₂	125 mM
NaCl	150 mM
KCl	5 mM
Glucose	50 mM

Protoplasten-Kulturmedium (Angaben in mg/l)

KNO₃	3000
(NH₄)₂SO₄	500
MgSO₄ 7H₂O	350
KH₂PO₄	400
CaCl₂ 2H₂O	300

Fe-EDTA und Spurenelemente wie im Murashige-Skoog-Medium (Physiol. Plant, 15 (1962), 473).

m-Inosit	100
Thiamin HCl	1,0
Nicotinsäureamid	0,5
Pyridoxin HCl	0,5
Glycin	2,0
Glucuronsäure	750
Galacturonsäure	750
Galactose	500
Maltose	500
Glucose	36 000
Fructose	36 000
Saccharose	30 000
Asparagin	500
Glutamin	100
Prolin	300
Caseinhydrolysat	500
2,4 Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D)	0,5
pH	5,8
Osmolarität	600 mosm.

Puffer A
2x SSC
10x Denhardts-Lösung
0,1% SDS
5 mM EDTA
50 mM Dinatrium-Phosphat
250 µg/ml Heringssperma-DNA.

In den Beispielen wurden folgende Standardtechniken angewen det:

1. Clonierungsverfahren

Zur Clonierung in E.coli wurde der Vektor pBluescriptSK verwendet.

Für die Pflanzentransformation wurden die Genkonstruk tionen in den binären Vektor pBinAR (Höfgen und Will mitzer, Plant Sci. 66 (1990), 221-230) und B33-Hyg clo niert.

2. Bakterienstämme

Für den pBluescript-Vektor und für die pBinAR- und B33- Hyg-Konstrukte wurde der E.coli-Stamm DH5α (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburgh, USA) verwendet.

Die Transformation der Plasmide in die Kartoffelpflanzen wurde mit Hilfe des Agrobacterium tumefaciens-Stammes C58C1 pGV2260 durchgeführt (Deblaere et al., Nucl. Acids Res. 13 (1985), 4777: 4788).

3. Transformation von Agrobacterium tumefaciens

Der Transfer der DNA erfolgte durch direkte Transforma tion nach der Methode von Höfgen & Willmitzer (Nucleic Acids Res. 16 (1988), 9877). Die Plasmid-DNA transfor mierter Agrobakterien wurde nach der Methode von Birn boim & Doly (Nucleic Acids Res. 7 (1979), 1513-1523) isoliert und nach geeigneter Restriktionsspaltung gel elektrophoretisch analysiert.

4. Transformation von Kartoffeln

Zehn kleine mit dem Skalpell verwundete Blätter einer Kartoffel-Sterilkultur (Solanum tuberosum L.cv. Désirée) wurden in 10 ml MS-Medium (Murashige & Skoog, Physiol. Plant. 15 (1962), 473-497) mit 2% Saccharose gelegt, welches 50 µl einer unter Selektion gewachsenen Agrobacterium tumefaciens-Übernachtkultur enthielt. Nach 3-5minütigem, leichtem Schütteln erfolgte eine weitere Inkubation für 2 Tage im Dunkeln. Daraufhin wurden die Blätter zur Kallusinduktion auf MS-Medium mit 1,6% Glucose, 5 mg/l Naphthylessigsäure, 0,2 mg/l Benzylami nopurin, 250 mg/l Claforan, 50 mg/l Kanamycin bzw. 1 mg/l Hygromycin B, und 0,80% Bacto Agar gelegt. Nach einwöchiger Inkubation bei 25°C und 3000 Lux wurden die Blätter zur Sproßinduktion auf MS-Medium mit 1,6% Gluco se, 1,4 mg/l Zeatinribose, 20 mg/l Naphthylessigsäure, 20 mg/l Giberellinsäure, 250 mg/l Claforan, 50 mg/l Ka namycin bzw. 3 mg/l Hygromycin B, und 0,80% Bacto Agar gelegt.

5. Transformation von Mais (a) Herstellung von Protoplasten der Zellinie DSM 6009 Protoplastenisolierung

2-4 Tage, vorzugsweise 3 Tage nach dem letzten Me diumswechsel einer Protoplastensuspensionskultur wird das Flüssigmedium abgesaugt und die zurückblei benden Zellen mit 50 ml Protoplastenwaschlösung 1 gespült und nochmals trockengesaugt. Zu jeweils 2 g der geernteten Zellmasse wird 10 ml Protoplasteniso lierungsmedium gegeben. Die resuspendierten Zellen und Zellaggregate werden bei 27 ± 2°C unter leich tem Schütteln (30 bis 40 rpm) 4 bis 6 h im Dunkeln inkubiert.

Protoplastenreinigung

Sobald die Freisetzung von mindestens 1 Mio. Proto plasten/ml erfolgt ist (mikroskopische Beobachtung), wird die Suspension durch ein Edelstahl- und Nylon sieb von 200 bzw. 45 µm Maschenwerte gesiebt. Die Kombination eines 100 µm und eines 60 µm Siebs er möglicht die Abtrennung der Zellaggregate genauso gut. Das protoplastenhaltige Filtrat wird mikrosko pisch beurteilt. Üblicherweise enthält es 98-99% Protoplasten. Der Rest sind unverdaute Einzelzellen. Protoplastenpräparationen mit diesem Reinheitsgrad werden ohne zusätzliche Gradientenzentrifugation für Transformationsexperimente verwendet. Durch Zentri fugation (100 UpM im Aufschwingrotor (100 × g, 3 min) werden die Protoplasten sedimentiert. Der Über stand wird verworfen und die Protoplasten in Waschlösung 1 resuspendiert. Die Zentrifugation wird wiederholt und die Protoplasten danach im Transfor mationspuffer resuspendiert.

(b) Protoplastentransformation

Die in Transformationspuffer resuspendierten Proto plasten werden bei einem Titer von 0,5-1 × 10⁶ Protoplasten/ml in 10 ml Portionen in 50 ml Poly allomer-Röhrchen eingefüllt. Die zur Transformation verwendete DNA wird in Tris-EDTA (TE) Puffer gelöst. Pro ml Protoplastensuspension werden 20 µg Plasmid- DNA zugegeben. Als Vektor wird dabei ein Phosphino tricinresistenz vermittelndes Plasmid verwendet (vgl. z. B. EP 0 513 849). Nach der DNA-Zugabe wird die Protoplastensuspension vorsichtig geschüttelt, um die DNA homogen in der Lösung zu verteilen. So fort danach wird tropfenweise 5 ml PEG-Lösung zuge tropft.

Durch vorsichtiges Schwenken der Röhrchen wird die PEG-Lösung homogen verteilt. Danach werden nochmals 5 ml PEG-Lösung zugegeben und das homogene Durchmi schen wiederholt. Die Protoplasten verbleiben 20 min der PEG-Lösung bei ± 2°C. Danach werden die Proto plasten durch 3-minütiges Zentrifugieren (100 g; 1000 Upm) sedimentiert. Der Überstand wird verwor fen. Die Protoplasten werden durch vorsichtiges Schütteln in 20 ml WS-Lösung gewaschen und danach erneut zentrifugiert. Danach werden sie in 20 ml Protoplastenkulturmedium resuspendiert, nochmals zentrifugiert und erneut in Kulturmedium resuspen diert. Der Titer wird auf 6-8 × 10⁵ Protopla sten/ml eingestellt und die Protoplasten in 3 ml Portionen in Petrischalen (∅ 60 mm, Höhe 15 mm) kul tiviert. Die mit Parafilm versiegelten Petrischalen werden bei 25 ± 2°C im Dunkeln aufgestellt.

(c) Protoplastenkultur

Während der ersten 2-3 Wochen nach der Protopla stenisolierung und -transformation werden die Proto plasten ohne Zugabe von frischem Medium kultiviert. Sobald sich die aus den Protoplasten regenerierten Zellen zu Zellaggregaten mit mehr als 20-50 Zellen entwickelt haben, wird 1 ml frisches Protoplasten kulturmedium zugegeben, das als Osmoticum Saccharose (90 g/l) enthält.

(d) Selektion transformierter Maiszellen und Pflanzenre generation

3-10 Tage nach der Zugabe von frischem Medium kön nen die aus Protoplasten entstandenen Zellaggregate auf Agar-Medien mit 100 mg/l L-Phosphinothricin plattiert werden. N6-Medium mit den Vitaminen des Protoplastenkulturmediums, 90 g/l Saccharose und 1,0 mg/l 2,4D ist ebenso geeignet wie ein analoges Medi um beispielsweise mit den Makro- und Mikronährsalzen des MS-Mediums (Murashige und Skoog (1962), siehe oben).

Auf dem Selektivmedium können die aus stabil trans formierten Protoplasten hervorgegangenen Kalli unge hindert weiterwachsen. Nach 3-5 Wochen, vorzugs weise 4 Wochen können die transgenen Kalli auf fri sches Selektionsmedium transferiert werden, welches ebenfalls 100 mg/l L-Phosphinothricin enthält, das aber kein Auxin mehr enthält. Innerhalb von 3-5 Wochen differenzieren ca. 50% der transgenen Mais kalli, die das L-Phosphinothricinacetyltransferase- Gen in ihr Genom integriert haben, auf diesem Medium in Gegenwart von L-Phosphinothricin erste Pflanzen.

(e) Aufzucht transgener Regeneratpflanzen

Das embryogene transformierte Maisgewebe wird auf hormonfreiem N6-Medium (Chu C.C. et al., Sci. Sin. 16 (1975), 659) in Gegenwart von 5×10^-4 M L-Phos phinothricin kultiviert. Auf diesem Medium ent wickeln sich Maisembryonen, die das Phosphinothri cinacetyltransferase-Gen (PAT-Gen) hinreichend stark exprimieren, zu Pflanzen. Nicht transformierte Em bryonen oder solche mit nur sehr schwacher PAT-Akti vität sterben ab. Sobald die Blätter der in vitro-Pflanzen eine Länge von 4-6 mm erreicht haben, können diese in Erde transferiert werden. Nach Abwa schen von Agarresten an den Wurzeln werden die Pflanzen in ein Gemisch von Lehm, Sand, Vermiculit und Einheitserde im Verhältnis 3 : 1 : 1 : 1 gepflanzt und während der ersten 3 Tage nach dem Verpflanzen bei 90-100% relativer Luft feuchte an die Erdkultur adaptiert. Die Anzucht erfolgt in einer Klimakammer mit 14 h Lichtperiode ca. 25000 Lux in Pflanzenhöhe bei einer Tag/Nachttemperatur von 23 ± 1/17 ± 1°C. Die adaptierten Pflanzen werden bei einer Luftfeuch te von 65 ± 5% kultiviert.

6. Radioaktive Markierung von DNA-Fragmenten

Die radioaktive Markierung von DNA-Fragmenten wurde mit Hilfe eines DNA-Random Primer Labelling Kits der Firma Boehringer (Deutschland) nach den Angaben des Herstel lers durchgeführt.

7. Northern Blot-Analyse

RNA wurde nach Standardprotokollen aus Blattgewebe von Pflanzen isoliert. 50 µg der RNA wurden auf einem Agaro segel aufgetrennt (1,5% Agarose, 1 × MEN-Puffer, 16,6% Formaldehyd). Das Gel wurde nach dem Gellauf kurz in Wasser gewaschen. Die RNA wurde mit 20 × SSC mittels Ka pillarblot auf eine Nylonmembran vom Typ Hybond N (Amersham, UK) transferiert. Die Membran wurde anschlie ßend bei 80°C unter Vakuum für zwei Stunden gebacken. Die Membran wurde in NSEB-Puffer für 2 h bei 68°C prähy bridisiert und anschließend in NSEB-Puffer über Nacht bei 68°C in Gegenwart der radioaktiv markierten Probe hybridisiert.

8. Pflanzenhaltung

Kartoffelpflanzen wurden im Gewächshaus unter folgenden Bedingungen gehalten:
Lichtperiode: 16 h bei 25000 Lux und 22°C
Dunkelperiode: 8 h bei 15°C
Luftfeuchte: 60%.

9. Bestimmung des Amylose/Amylopektinverhältnisses in Stär ke aus Kartoffelpflanzen

Stärke wurde nach Standardmethoden aus Kartoffelpflanzen isoliert und das Verhältnis Amylose zu Amylopektin nach der von Hovenkamp-Hermelink et al. beschriebenen Methode (Potato Research 31 (1988) 241-246) bestimmt.

10. Bestimmung von Glucose, Fructose und Saccharose

Zur Bestimmung des Glucose-, Fructose- bzw. Saccharose gehalts werden kleine Knollenstücke (Durchmesser ca. 10 mm) von Kartoffelknollen in flüssigem Stickstoff einge froren und anschließend für 30 min bei 80°C in 0,5 ml 10 mM HEPES, pH 7,5; 80% (Vol./Vol.) Ethanol extrahiert. Der Überstand, der die löslichen Bestandteile enthält, wird abgenommen und das Volumen bestimmt. Der Überstand wird zur Bestimmung der Menge an löslichen Zuckern ver wendet. Die quantitative Bestimmung von löslicher Gluco se, Fructose und Saccharose wird in einem Ansatz mit folgender Zusammensetzung durchgeführt:
100,0 mM Imidazol/HCl, pH 6,9
1,5 mM MgCl₂
0,5 mM NADP⁺
1,3 mM ATP
10-50 µl Probe
1,0 U Glucose-6-Phosphatdehydrogenase aus Hefe.

Der Ansatz wird für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Bestimmung der Zucker erfolgt anschließend mittels gängiger photometrischer Methoden durch Messung der Absorption bei 340 nm nach der aufeinanderfolgenden Zugabe von:
1,0 Einheiten Hexokinase aus Hefe (zur Bestimmung von Glucose)
1,0 Einheiten Phosphoglucoisomerase aus Hefe (zur Bestimmung von Fructose) und
1,0 Einheiten Invertase aus Hefe (zur Bestimmung von Saccharose).

Beispiel 1 Isolierung Stärkekorn-gebundener Proteine aus Kartoffelstärke

Die Isolierung von Stärkekorn-gebundenen Proteinen aus Kar toffelstärke erfolgte durch Elektroelution in einer Eluti onsvorrichtung, die analog zu dem "Model 422 Electro-Eluter" (BIORAD Laboratories Inc., USA) konstruiert war, aber ein wesentlich größeres Volumen aufwies (ca. 200 ml). Es wurden 25 g getrocknete Stärke in Elutionspuffer aufgenommen (Endvolumen 80 ml). Die Stärke stammte aus Kartoffeln, die aufgrund der anti-sense-Expression einer DNA-Sequenz, die für die Stärkekorn-gebundene Stärkesynthase I (GBSS I) aus Kartoffel codiert, eine nahezu amylosefreie Stärke produzie ren. Die Suspension wurde im Wasserbad auf 70-80°C erwärmt. Anschließend wurden 72,07 g Harnstoff zugegeben (Endkonzentration 8 M) und das Volumen mit Elutionspuffer auf 180 ml aufgefüllt. Die Stärke löste sich unter ständigem Rühren und bekam eine kleisterartige Konsistenz. Die Protei ne wurden aus der Lösung mit Hilfe der Elutionsvorrichtung über Nacht elektroeluiert (100 V; 50-60 mA). Die elu ierten Proteine wurden vorsichtig aus der Apparatur entnom men. Schwebstoffe wurden durch kurze Zentrifugation ent fernt. Der Überstand wurde 2-3 mal je eine Stunde bei 4°C gegen Dialysepuffer dialysiert. Anschließend wurde das Vo lumen der Proteinlösung bestimmt. Die Proteine wurden durch Zugabe von Ammoniumsulfat (90% Endkonzentration) gefällt. Die Zugabe erfolgte unter ständigem Rühren bei 0°C. Die ge fällten Proteine wurden durch Zentrifugation pelletiert und in Proteinpuffer aufgenommen.

Beispiel 2 Identifizierung und Isolierung von cDNA-Sequenzen die Stär kekorn-gebundene Proteine codieren

Die gemäß Beispiel 1 isolierten Proteine wurden zur Herstel lung von polyclonalen Antikörpern aus Kaninchen verwendet, die spezifisch Stärkekorn-gebundene Proteine erkennen. Mit Hilfe derartiger Antikörper wurde anschließend nach Standardmethoden eine cDNA-Expressionsbibliothek nach Se quenzen durchgemustert, die für Stärkekorn-gebundene Protei ne codieren.

Die Expressionsbibliothek wurde folgendermaßen hergestellt:
Aus Kartoffelknollen der Kartoffelvarietät "Berolina" wurde nach Standardmethoden poly(A⁺)-mRNA isoliert. Ausgehend von der poly(A⁺)-mRNA wurde nach der Methode von Gubler und Hoffmann (Gene 25 (1983), 263-269) unter Verwendung eines Xho I-Oligo d(t)₁₈-Primers cDNA hergestellt. Diese wurde nach EcoR I-Linkeraddition mit Xho I nachgeschnitten und orientiert in einen mit EcoR I und Xho I geschnittenen Lambda ZAP II-Vektor (Stratagene) ligiert. Ca. 500.000 Plaques einer derart konstruierten cDNA-Bibliothek wurden nach Sequenzen durchgemustert, die von polyclonalen Antikör pern, die gegen Stärkekorn-gebundene Proteine gerichtet sind, erkannt wurden.

Zur Analyse der Phagenplaques wurden diese auf Nitrozellulo sefilter übertragen, die vorher für 30-60 min in einer 10 mM IPTG-Lösung inkubiert und anschließend auf Filterpapier ge trocknet wurden. Der Transfer erfolgte für 3 h bei 37°C. An schließend werden die Filter für 30 min bei Raumtemperatur in Blockreagenz inkubiert und zweimal für 5-10 min in TBST-Puffer gewaschen. Die Filter wurden mit den gegen Stärke korn-gebundene Proteine gerichteten polyclonalen Antikörpern in geeigneter Verdünnung für 1 h bei Raumtemperatur oder für 16 h bei 4°C geschüttelt. Die Identifizierung von Plaques, die ein Protein exprimierten, das von den polyclonalen Anti körpern erkannt wurde, erfolgte mit Hilfe des "Blotting de tection kit for rabbit antibodies RPN 23" (Amersham UK) nach den Angaben des Herstellers.

Phagenclone der cDNA-Bibliothek, die ein Protein exprimier ten, das von den polyclonalen Antikörpern erkannt wurde, wurden unter Anwendung von Standardverfahren weiter gerei nigt.

Mit Hilfe der in-vivo-excision-Methode wurden von positiven Phagenclonen E. coli-Clone gewonnen, die ein doppelsträngi ges pBluescript-Plasmid mit der jeweiligen cDNA-Insertion enthalten. Nach Überprüfung der Größe und des Restriktions musters der Insertionen wurde ein geeigneter Clon, pRL1, weiter analysiert.

Beispiel 3 Sequenzanalyse der cDNA-Insertion des Plasmids pRL1

Aus einem entsprechend Beispiel 2 erhaltenen E. coli-Clon wurde das Plasmid pRL1 isoliert und ein Teil der Sequenz seiner cDNA-Insertion durch Standardverfahren mittels der Didesoxynucleotidmethode (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463-5467) bestimmt. Die Insertion ist ca. 2450 bp lang. Ein Teil der Nucleotidsequenz sowie die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz ist unter Seq ID No. 3 und Seq ID No. 4 angegeben.

Eine Sequenzanalyse und ein Sequenzvergleich mit bekannten DNA-Sequenzen zeigte, daß die unter Seq ID No. 3 darge stellte Sequenz neu ist und keine signifikante Homologie zu bisher bekannten DNA-Sequenzen aufweist. Die Sequenzanalyse zeigte weiterhin, daß es sich bei der cDNA-Insertion nur um eine partielle cDNA handelt, bei der ein Teil der codieren den Region am 5'-Ende fehlt.

Beispiel 4 Identifizierung und Isolierung einer vollständigen cDNA die ein Stärkekorn-gebundenes Protein aus Solanum tuberosum co diert

Zur Isolierung einer, der partiellen cDNA-Insertion des Plasmids pRL1 entsprechenden, vollständigen cDNA, wurde eine weitere cDNA-Bibliothek hergestellt. Dabei handelte es sich um eine Schließzellen-spezifische cDNA-Bibliothek aus Sola num tuberosum, die folgendermaßen konstruiert wurde:
Zunächst wurden Epidermisfragmente von Blättern von Kartof felpflanzen der Varietät Désirée im wesentlichen nach der Methode von Hedrich et al. (Plant Physiol. 89 (1989), 148) hergestellt, indem ca. 60 Blätter von sechs Wochen alten, im Gewächshaus gehaltenen Kartoffelpflanzen geerntet wurden. Aus den Blättern wurde die Mittelrippe entfernt. Anschlie ßend wurden die Blätter in einem großen "Waring blender" (Volumen 1 Liter) in gekühltem destilliertem H₂O viermal für je 15 Sekunden auf höchster Stufe zerkleinert. Die Suspen sion wurde durch ein Nylonsieb mit einer Porengröße von 220 µm (Nybolt, Zürich, Schweiz) filtriert und mehrmals mit kal tem destilliertem Wasser gewaschen. Die Suspension wurde wiederum durch ein 220 µm-Nylonsieb filtriert und ausgiebig mit kaltem destilliertem Wasser gewaschen. Der Rückstand (Epidermisfragmente) wurde in einen kleineren "Waring blen der" (Volumen 250 ml) gegeben und in destilliertem Wasser und Eis viermal für je 15 Sekunden bei auf kleiner Stufe zerkleinert. Die Suspension wurde durch ein 220 µm-Nylonsieb filtriert und ausgiebig mit kaltem destilliertem Wasser ge waschen. Die Epidermisfragmente (Rückstand) wurden mikrosko pisch hinsichtlich einer Kontamination durch Mesophyllzellen untersucht. Wenn dies der Fall war, wurde der Zerkleine rungsschritt im kleinen "Waring blender" wiederholt.

Der Aufschluß der Schließzellen der Epidermisfragmente er folgte durch Zermörsern in flüssigem Stickstoff in einem ge kühlten Mörser für ca. 2 h. Zur Überprüfung des Aufschlusses der Schließzellen wurden regelmäßig Proben genommen und mi kroskopisch überprüft. Nach 2 h oder wenn eine genügend gro ße Anzahl von Schließzellen aufgeschlossen wurde, wurde das entstandene Pulver in ein Reaktionsgefäß (Volumen 50 ml) überführt und in einem Volumen GTC-Puffer (Chirgwin et al., Biochem. 18 (1979), 5294-5299) aufgenommen. Die Suspension wurde zentrifugiert und der Überstand durch Miracloth (Calbiochem, La Jolla, Kalifornien) filtriert. Das Filtrat wurde wie in Glisin et al. (Biochemistry 13 (1974), 2633-2637) und Mornex et al. (J. Clin. Inves. 77 (1986), 1952-1961) für 16 h einer Ultrazentrifugation unterzogen. Nach der Zentrifugation wurde der RNA-Niederschlag in 250 µl TC-Puffer aufgenommen. Die RNA wurde durch Zugabe von 0,05 Vo lumen 1 M Essigsäure und 0,7 Volumen Ethanol gefällt. Die RNA wurde abzentrifugiert und der Niederschlag mit 3 M Na triumacetat (pH 4,8) und 70% Ethanol gewaschen. Die RNA wur de kurz getrocknet und in DEPC-behandeltem Wasser gelöst.

Aus der isolierten RNA wurde nach Standardverfahren poly A⁺-RNA isoliert. Ausgehend von der poly(A⁺)-mRNA wurde nach der Methode von Gubler und Hoffmann (Gene 25 (1983), 263-269) unter Verwendung eines Xho I-Oligo d(t)₁₈-Primers cDNA her gestellt. Diese wurde nach EcoR I-Linkeraddition mit Xho I nachgeschnitten und orientiert in einen mit EcoR I und Xho I geschnittenen Lambda ZAP II-Vektor (Stratagene, GmbH, Hei delberg, Deutschland) ligiert. Das Verpacken in Phagenköpfe erfolgte unter Verwendung des Gigapack II Gold kit's (Stratagene, GmbH, Heidelberg, Deutschland) nach den Angaben des Herstellers.

Aus einer derartigen cDNA-Bibliothek wurden nach Standard verfahren Phagenclone isoliert und gereinigt, die mit der cDNA-Insertion aus dem Plasmid pRL1 hybridisieren. Mit Hilfe der in-vivo-excision-Methode wurden von positiven Phagenclo nen E. coli-Clone gewonnen, die ein doppelsträngiges pBlu escript-Plasmid mit der jeweiligen cDNA-Insertion enthalten. Nach Überprüfung der Größe und des Restriktionsmusters der Insertionen wurden geeignete Clone einer Restrik tionskartierung und einer Sequenzanalyse unterzogen. Aus ei nem geeigneten Clon wurde das Plasmid pRL2 (DSM 10225) iso liert, das eine vollständige cDNA enthält, die ein Stär kekorn-gebundenes Protein aus Kartoffel codiert.

Beispiel 5 Sequenzanalyse der cDNA-Insertion des Plasmids pRL2

Die Nucleotidsequenz der cDNA-Insertion des Plasmids pRL2 wurde wie in Beispiel 3 beschrieben bestimmt. Die Insertion ist 4856 bp lang. Die Nucleotidsequenz sowie die daraus ab geleitete Aminosäuresequenz ist in Seq ID No. 1 bzw. Seq ID No. 2 angegeben. Das entsprechende Gen wird im folgenden RL-Gen genannt. Das durch die codierende Region codierte Prote in wird im folgenden als R1-Enzym bezeichnet.

Beispiel 6 Konstruktion des Plasmids p35S-anti-RL und Einführung des Plasmids in das Genom von Kartoffelpflanzen

Aus dem Plasmid pRL1 wurde mit Hilfe der Restriktionsendo nuclease Asp718 ein ca. 1800 bp langes DNA-Fragment iso liert. Dieses entspricht der unter Seq ID No. 3 dargestell ten DNA-Sequenz und enthält einen Teil des offenen Leserah mens. Das Fragment wurde in den mit Asp718 geschnittenen bi nären Vektor pBinAR (Höfgen und Willmitzer, Plant Sci. 66 (1990), 221-230) ligiert. Bei diesem handelt es sich um ein Derivat des binären Vektors pBin19 (Bevan, Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711-8721). pBinAR wurde folgendermaßen konstru iert:
Ein 529 bp langes Fragment, das die Nucleotide 6909-7437 des 35S-Promotor des Cauliflowermosaic-Virus umfaßt (Franck et al., Cell 21 (1980), 285-294), wurde als EcoR I/Kpn I-Frag ment aus dem Plasmid pDH51 (Pietrzak et al., Nucl. Acids Res. 14, 5857-5868) isoliert und zwischen die EcoR I- und die Kpn I-Schnittstellen des Polylinkers von pBin19 ligiert. Dabei entstand das Plasmid pBin19-A.

Aus dem Plasmid pAGV40 (Herrera-Estrella et al., Nature 303, 209-213) wurde mit Hilfe der Restriktionsendonucleasen Pvu II und Hind III ein 192 bp langes Fragment isoliert, das das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J. 3, 835-846) umfaßt (Nucleotide 11749-11939). Nach Addition von Sph I-Linkern an die Pvu I-Schnittstelle wurde das Fragment zwischen die Sph I- und Hind III-Schnittstellen pBin19-A ligiert. Dabei ent stand pBinAR.

Mit Hilfe von Restriktions- und Sequenzanalysen wurden re kombinante Vektoren identifiziert, bei denen das DNA-Frag ment derart in den Vektor inseriert ist, daß ein Teil der codierenden Region der cDNA-Insertion aus pRL1 in anti sense-Orientierung mit dem 35S-Promotor verknüpft ist. Das resultierende Plasmid, p35S-anti-RL, ist in Fig. 1 darge stellt.

Durch die Insertion des cDNA-Fragmentes entsteht eine Ex pressionskassette, die folgendermaßen aus den Fragmenten A, B und C aufgebaut ist:
Das Fragment A (529 bp) enthält den 35S-Promotor des Cauli flower-Mosaik-Virus (CaMV). Das Fragment umfaßt die Nucleo tide 6909 bis 7437 des CaMV (Franck et al., Cell 21 (1980), 285-294).

Das Fragment B enthält neben flankierenden Bereichen einen Teil der proteincodierenden Region der cDNA-Insertion aus dem Plasmid pRL1. Diese wurde wie oben beschrieben als Asp718-Fragment aus pRL1 isoliert und in anti-sense-Orien tierung an den 35S-Promotor in pBinAR fusioniert.

Fragment C (192 bp) enthält das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984), 835-846).

Die Größe des Plasmids p35S-anti-RL beträgt ca. 12,8 kb. Das Plasmid wurde mit Hilfe Agrobakterien-vermittelter Transformation in Kartoffelpflanzen transferiert wie oben beschrieben. Aus den transformierten Zellen wurden ganze Pflanzen regeneriert. Die transformierten Pflanzen wurden unter Gewächshausbedingungen kultiviert.

Die Überprüfung des Erfolges der genetischen Veränderung der Pflanzen erfolgte durch Analyse der Gesamt-RNA in einer Northern-Blot-Analyse bezüglich des Verschwindens der zu der cDNA komplementären Transkripte. Hierzu wurde Gesamt-BNA aus Blättern transformierter Pflanzen nach Standardmethoden iso liert, gelelektrophoretisch auf einem Agarosegel aufge trennt, auf eine Nylonmembran transferiert und mit einer ra dioaktiv markierten Probe hybridisiert, die die unter Seq ID No. 1 dargestellte Sequenz oder einen Teil dieser Sequenz aufweist. In ca. 5-10% der transformierten Pflanzen fehlte in der Northern-Blot-Analyse die Bande, die das spezifische Transkript der unter Seq ID No. 1 dargestellten Sequenz dar stellt. Diese Pflanzen wurden zur Analyse der Stärkequalität verwendet.

Beispiel 7 Konstruktion des Plasmids pB33-anti-RL und Einführung des Plasmids in das Genom von Kartoffelpflanzen

Aus dem Plasmid pRL1 wurde mit Hilfe der Restriktionsendo nuclease Asp718 ein ca. 1800 bp langes DNA-Fragment iso liert, das einen Teil des offenen Leserahmens der cDNA-In sertion umfaßt, und in den mit Asp718 geschnittenen Vektor B33-Hyg ligiert. Dieser Vektor wurde folgendermaßen herge stellt:
Aus dem Vektor pBinAR Hyg (DSM 9505) wurde mit Hilfe der Re striktionsendonucleasen EcoR I und Asp718 der 35S-Promotor entfernt. Aus dem Plasmid p33-anti-BE (DSM 6146) wurde mit Hilfe von EcoR I und Asp718 ein ca. 1526 bp langes Fragment, das den B33-Promotor umfaßt, isoliert und in den mit EcoR I und Asp718 geschnittenen Vektor pBinAR Hyg (DSM 9505) inse riert.

Durch die Insertion des cDNA-Fragmentes in die Asp718- Schnittstelle des Plasmids B33-Hyg entsteht eine Expres sionskassette, die folgendermaßen aus den Fragmenten A, B und C aufgebaut ist (Fig. 4):
Das Fragment A enthält den B33-Promotor aus Solanum tubero sum (EP 3775 092; Rocha-Sosa et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29).

Das Fragment B enthält neben flankierenden Bereichen einen Teil der proteincodierenden Region der cDNA-Insertion aus dem Plasmid pRL1. Diese wurde wie oben beschrieben als Asp718-Fragment aus pRL1 isoliert und in anti-sense-Orien tierung an den B33-Promotor in B33-Hyg fusioniert.

Die Größe des Plasmids pB33-anti-RL beträgt ca. 12,8 kb. Das Plasmid wurde mit Hilfe Agrobakterien-vermittelter Transformation in Kartoffelpflanzen transferiert wie oben beschrieben. Aus den transformierten Zellen wurden ganze Pflanzen regeneriert. Die transformierten Pflanzen wurden unter Gewächshausbedingungen kultiviert.

Die Überprüfung des Erfolges der genetischen Veränderung der Pflanzen erfolgte durch Analyse der Gesamt-BNA in einer Northern-Blot-Analyse bezüglich des Verschwindens der zu der cDNA komplementären Transkripte. Hierzu wurde Gesamt-BNA aus Knollen transformierter Pflanzen nach Standardmethoden iso liert, gelelektrophoretisch auf einem Agarosegel aufge trennt, auf eine Nylonmembran transferiert und mit einer ra dioaktiv markierten Probe hybridisiert, die die unter Seq ID No. 1 dargestellte Sequenz oder einen Teil dieser Sequenz aufweist. In ca. 5-10% der transformierten Pflanzen fehlte in der Northern-Blot-Analyse die Bande, die Transkripte dar stellt, die mit der erfindungsgemäßen cDNA hybridisieren. Aus diesen Pflanzen wurde aus Knollen die Stärke isoliert und wie in Beispiel 8 beschrieben analysiert.

Beispiel 8 Analyse der transformierten Kartoffelpflanzen

Die gemäß Beispiel 6 und Beispiel 7 transformierten Kartof felpflanzen wurden hinsichtlich der Eigenschaften der syn thetisierten Stärke untersucht. Die Analysen wurden an ver schiedenen Linien von Kartoffelpflanzen durchgeführt, die mit dem Plasmid p35S-anti-RL bzw. mit dem Plasmid pB33-anti- RL transformiert worden waren und die in der Northern-Blot- Analyse die Bande nicht mehr aufwiesen, die Transkripte dar stellt, die mit den erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen hybridi sieren.

a) Bestimmung der Viskosität wäßriger Lösungen der Stärke

Zur Bestimmung der Viskosität der wäßrigen Lösungen der in transformierten Kartoffelpflanzen synthetisierten Stärke wurde aus Knollen von Pflanzen, die mit dem Plas mid p35S-anti-RL bzw. mit dem Plasmid pB33-anti-RL trans formiert worden waren, Stärke nach Standardverfahren iso liert. Es wurden jeweils 30 g Stärke in 450 ml H₂O aufge nommen und für die Analyse in einem Viskograph E (Brabender OHG Duisburg (Deutschland)) verwendet. Der Be trieb des Gerätes erfolgte nach den Angaben des Herstel lers. Zur Bestimmung der Viskosität der wäßrigen Lösung der Stärke wurde die Stärkesuspension zunächst von 50°C auf 96°C erhitzt mit einer Geschwindigkeit von 3°C pro min. Anschließend wurde die Temperatur für 30 min bei 96°C gehalten. Danach wurde die Lösung von 96°C auf 50°C abgekühlt mit einer Geschwindigkeit von 3°C pro min. Wäh rend der gesamten Dauer wurde die Viskosität bestimmt. Repräsentative Ergebnisse derartiger Messungen sind in Form von Kurven, in denen die Viskosität in Abhängigkeit der Zeit dargestellt ist, in Fig. 3, Fig. 4 und Fig. 5 wiedergegeben. Fig. 3 zeigt eine typische Brabenderkurve für Stärke, die aus Wildtyp-Pflanzen der Kartoffelvarie tät Désirée isoliert wurde. Fig. 4 und 5 zeigen eine ty pische Brabenderkurve für Stärke, die aus Kartoffelpflan zen isoliert wurde, die mit dem Plasmid p35S-anti-RL bzw. pB33-anti-RL transformiert worden waren. Aus den Kurven lassen sich verschiedene charakteristische Werte ablei ten.

Für Wildtyppflanzen ergeben sich dabei folgende charakte ristische Werte:

Tabelle 1

Die Werte geben Mittelwerte aus zwei verschiedenen Mes sungen wieder.

In der Tabelle 1 und den folgenden Tabellen 2 un 26742 00070 552 001000280000000200012000285912663100040 0002019653176 00004 26623d 3 be deuten:
A: Verkleisterungsbeginn
B: Maximale Viskosität
C: Start der Haltezeit
D: Start der Kühlzeit
E: Ende der Kühlzeit
F: Ende der End-Haltezeit.

Für Pflanzen, die mit dem Plasmid p35S-anti-RL transfor miert worden waren (Linie P2), ergeben sich dabei fol gende charakteristische Werte:

Tabelle 2

Für Pflanzen, die mit dem Plasmid pB33-anti-RL transfor miert worden waren (Linie P3), ergeben sich dabei fol gende Werte:

Tabelle 3

Aus den Fig. 3, 4 und 5 geht deutlich hervor, daß die Stärke aus transformierten Pflanzen sich von der aus Wildtyp-Pflanzen insbesondere dadurch unterscheidet, daß beim Aufkochen nur eine sehr geringe Viskositätszunahme erfolgt. So liegt die maximale Viskosität bei der modi fizierten Stärke aus transformierten Pflanzen beim Auf kochen um mehr als 50% unter dem Wert der Wildtyp-Stärke.

Andererseits steigt die Viskosität der aus transformier ten Pflanzen isolierten Stärke nach dem Abkühlen stärker an als bei Wildtyp-Stärke.

b) Bestimmung des Phosphatgehaltes der Stärke

Der Phosphatgehalt der Stärke wurde bestimmt, indem die Menge an Phosphat, das an der C-6-Position von Glucosere sten gebunden war, gemessen wurde. Hierzu wurde Stärke zunächst durch Säurehydrolyse gespalten und anschließend der Gehalt an Glucose-6-Phosphat mittels eines Enzymtests bestimmt, wie im folgenden beschrieben.

100 mg Stärke wurden in 500 µl 0,7 N HCl 4 h bei 100°C inkubiert. Nach der Säurehydrolyse wurden 10 µl des An satzes in 600 µl Imidazolpuffer (100 mM Imidazol, 5 mM MgCl₂, pH 6,9, 0,4 mM NAD⁺) gegeben. Die Bestimmung der Menge an Glucose-6-Phosphat in dem Ansatz erfolgte durch Umsetzung mit dem Enzym Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase. Dazu wurde dem Ansatz 1 U Glucose-6-Phosphat-Dehydroge nase (aus Leuconostoc mesenteroides (Boehringer Mann heim)) zugesetzt und die Menge an gebildetem NADH durch Messung der Absorption bei 340 nm bestimmt.

Der Gehalt an Glucose-6-Phosphat/Milligramm Stärke ist in der folgenden Tabelle für nicht-transformierte Kartoffel pflanzen der Varietät Désirée sowie für zwei Linien (P1(35S-anti-RL; P2(35S-anti-RL)) transgener Kartoffel pflanzen, die mit dem Plasmid p35S-anti-RL transformiert worden waren, angegeben.

Tabelle 4

Die folgende Tabelle zeigt den Glucose-6-Phosphat-Gehalt pro Milligramm Stärke bei Kartoffelpflanzen, die mit dem Plasmid pB33-anti-RL transformiert worden waren, im Ver gleich zu Stärke aus nicht-transformierten Pflanzen (S. tuberosum c.v. Désirée).

Tabelle 5

Die Pflanzen 7, 37, 45 und 31 stellen unabhängige Trans formanten dar, die mit dem Plasmid pB33-anti-RL transfor miert worden waren. Die Pflanze 37 repräsentiert die Li nie P3, für die in Fig. 5 eine Brabenderkurve darge stellt ist.

Die Werte zeigen, daß der Phosphatgehalt der modifizier ten Stärke aus transgenen Kartoffelpflanzen um mindestens ca. 50% im Vergleich zu Stärke aus Wildtyp-Pflanzen ver ringert ist.

c) Bestimmung des Glucose-, Fructose- und Saccharosegehalts von Knollen nach Lagerung bei 4°C

Knollen von Pflanzen verschiedener transgener Linien, die mit dem antisense-Konstrukt p35S-anti-RL transformiert worden waren, und von Wildtyp-Pflanzen wurden für 2 Mona te bei 4°C bzw. bei 20°C im Dunkeln gelagert. An schließend wurden wie oben beschrieben die Mengen an Glucose, Fructose und Saccharose bestimmt. Dabei ergaben sich für zwei transgene Linien folgende repräsentative Werte:

Tabelle 6

Die Werte in der Tabelle sind in µmol Hexose bzw. Saccharose/g Frischgewicht angegeben.

Aus den Werten in Tabelle 6 wird deutlich, daß bei den transgenen Pflanzen bei einer Lagerung bei 4°C eine we sentlich geringere Akkumulation reduzierender Zucker in den Knollen stattfindet als bei Wildtyp-Pflanzen.

Insgesamt ähnelt die aus transgenen Kartoffelpflanzen isolierte modifizierte Stärke der Stärke aus Mais-Wild typ-Pflanzen. Im Vergleich zu dieser besitzt sie den Vor teil, daß sie geschmacksneutral ist und so für verschie dene Verwendungsmöglichkeiten im Nahrungsmittelbereich besser geeignet ist.

Beispiel 9 Expression der cDNA-Insertion des Plasmids pRL2 in E. coli (a) Transformation von Bakterienzellen

Zur Expression der cDNA-Insertion des Plasmids pRL2 wur den Zellen des E. coli-Stammes DH5α zunächst mit dem Plasmid pACAC transformiert. Dieses Plasmid enthält ein DNA-Fragment, das die ADP-Glucose-Pyrophosphorylase (AGPase) aus E. coli codiert, unter der Kontrolle des lac Z-Promotors. Das Fragment war als ca. 1,7 kb großes DraI/HaeII-Fragment aus dem Vektor pEcA-15 (siehe B. Müller-Röber (1992), Dissertation, FU Berlin) isoliert worden und nach Glättung der Enden in einen mit HindIII linearisierten pACAC184-Vektor cloniert worden. Die Ex pression der AGPase soll eine Steigerung der Glycogen synthese in transformierten E. coli Zellen bewirken. Die derart transformierten Zellen werden im folgenden als E. coli-K1-Zellen bezeichnet.

Zur Bestimmung der Enzymaktivität des durch die cDNA des Plasmids pRL2 codierten Proteins, wurden E. coli-K1-Zel len mit dem Plasmid pRL2 transformiert. Die transfor mierten E. coli-Zellen, die sowohl das Plasmid pACAC als auch das Plasmid pRL2 enthalten, werden im folgenden als E. coli-K2-Zellen bezeichnet.

Der Transfer der Plasmid-DNA in die Bakterienzellen er folgte jeweils nach der Methode von Hanahan (J. Mol. Biol. 166 (1983), 557-580). Die transformierten E. coli Zellen wurden auf Agarkulturschalen mit folgender Zusam mensetzung ausgestrichen:
YT-Medium mit
1,5% Bacto-Agar
50 mM Natriumphosphat-Puffer, pH 7,2
1% Glucose
10 µg/ml Chloramphenicol bei E. coli-K1-Zellen bzw.
10 µg/ml Chloramphenicol und
10 µg/ml Ampicillin bei E. coli-K2-Zellen.

Escherichia coli Zellen des Stammes DH5_, die mit dem Plasmid pRL2 + pACAC (E. coli-K2-Zellen) sowie als Kon trolle nur mit dem Plasmid pACAC (E. coli-K1-Zellen) transformiert worden sind, wurden auf Agarplatten ange zogen. Das gebildete Glycogen der verschiedenen Kulturen wurde bezüglich des Phosphorylierungsgrades (an C-6-Po sition des Glucosemoleküls) hin untersucht, wie im fol genden beschrieben wird.

(b) Isolierung von bakteriellem Glycogen

Zur Isolierung von bakteriellem Glycogen wurde der nach der Transformation gewachsene Bakterienrasen von jeweils 6 Agarplatten (∅ 135 mm) mit 5 ml YT-Medium/Platte abge schwemmt. Die Bakteriensuspension wurde bei 4500 xg für 5 Minuten zentrifugiert. Der Bakterienniederschlag wurde in 10 ml YT-Medium resuspendiert. Der Aufschluß der Bak terien erfolgte durch Zugabe von 2 Volumen Aufschlußme dium (0,2 N NaOH; 1% SDS) und Inkubation für 5 Minuten bei RT. Durch Zugabe von 3 Volumen EtOH abs., 30 minüti ger Inkubation bei 4°C und anschließender Zentrifugation von 15 Minuten bei 8000 gx wurde das Glycogen sedimen tiert. Anschließend wurde der Niederschlag mit 100 ml 70%igem EtOH gewaschen und erneut durch einen Zentrifu gationsschritt (10 Minuten bei 8000 xg) sedimentiert. Der Waschvorgang wurde 4 mal wiederholt.

(c) Bestimmung des Gesamtglycogengehaltes

Das isolierte und sedimentierte Glycogen wurde zunächst durch saure Hydrolyse (Lösen des Niederschlags in 2 ml 0,7 N HCl; Inkubation für 4 Stunden bei 100°C) in die einzelnen Glucosemoleküle aufgespalten. Der Glucosege halt der Lösung wurde mittels gekoppelter enzymatischer Reaktion eines Stärke-Tests nach Angaben des Herstellers (Boehringer Mannheim) an einem Photometer (Firma Kontron) bei einer Wellenlänge von 340 nm bestimmt.

Der Reaktionspuffer enthält:
100 mM MOPS, pH 7,5
10 mM MgCl₂
2 mM EDTA
0,25 mM NADP
1 mM ATP
1 U/ml Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase
2 U/ml Hexokinase.

Die Messung erfolgte bei 25°C mit 10 µl Glucoselösung.

(d) Bestimmung des Glucose-6-Phosphat Gehaltes

Zur Bestimmung des Gehaltes der an C-6-Position phospho rylierten Glucosemoleküle wurden gleiche Stoffmengen an Glucose, jeweils der verschiedenen Bakterienkulturen, eingesetzt. Durch Zugabe von gleichen Volumina an 0,7 N KOH zu dem mittels saurer Hydrolyse (siehe oben) in sei ne Glucosemoleküle aufgespaltenen Glycogens, wurde die Lösung neutralisiert.

Der Reaktionspuffer enthält:
100 mM MOPS, pH 7,5
10 mM MgCl₂
2 mM EDTA
0,25 mM NADP
2 U/ml Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase

Die Messung erfolgte bei 25°C mit 100-150 µl Glucoselö sung.

(e) Nachweis einer bakterielles Glycogen phosphorylierenden Enzymaktivität

Die Ergebnisse der Bestimmung des Phosphatgehaltes des in den Bakterienzellen synthetisierten Glycogens zeigen, daß das Glycogen der E. coli Zellen, die mit den Plasmi den pACAC + pRL2 transformiert worden waren, eine bis zu 290 ± 25% erhöhte Phosphorylierung an C-6-Position der Glucose aufweist, verglichen mit dem Kontrollansatz (E. coli Zellen transformiert mit dem Plasmid pACYC) (siehe folgende Tabelle).
E. coli-Zellen: Glucose-6-Phosphat : Glucose im Glycogen
E. coli-K1: 1:(4600 ± 1150)
E. coli-K2: 1:(1570 ± 390).

Die hier dargestellten Phosphorylierungsgrade sind der Mittelwert aus mindestens 6 Messungen ausgehend von 6 unabhängigen Transformationen und Glycogenisolierungen.

Beispiel 10 Einführung des Plasmids p35S-anti-RL in Kombination mit dem Plasmid p35SH-anti-BE in das Genom von Kartoffelpflanzen

Das Plasmid p35S-anti-RL wurde konstruiert wie im Beispiel 6 beschrieben. Das Plasmid p35SH-anti-BE wurde konstruiert wie in der Anmeldung WO95/07355, Beispiel 3, beschrieben. Beide Plasmide wurden mit Hilfe der Agrobakterium vermittelter Transformation wie oben beschrieben sequentiell in Kartof felpflanzen transferiert. Dazu wurde zunächst das Plasmid p35SH-anti-BE in Kartoffelpflanzen transformiert. Es wurden ganze Pflanzen regeneriert und auf eine verringerte Expres sion des branching-Enzymgens selektiert. Anschließend wurde das Plasmid p35S-anti-RL in die schon reduzierte Expression des branching-Enzyms aufweisenden transgenen Pflanzen trans formiert. Aus den transformierten Zellen wurden wiederum transgene Pflanzen regeneriert, und die transformierten Pflanzen wurden unter Gewächshausbedingungen kultiviert. Die Überprüfung des Erfolges der genetischen Veränderung der Pflanzen in Bezug auf eine stark reduzierte Expression so wohl des branching-Enzymgens als auch in Bezug auf eine stark reduzierte Expression des RL-Gens erfolgte durch Ana lyse der gesamten BNA in einer BNA-Blot-Analyse bezüglich des Verschwindens der zu Verzweigungsenzym-cDNA bzw. RL-cDNA komplementären Transkripte. Hierzu wurde die Gesamt-BNA aus Blätter transformierten Pflanzen nach beschriebenen Methoden isoliert, gelelektrophoretisch aufgetrennt, auf eine Membran transferiert und mit einer radioaktiv markierten Probe hy bridisiert, die die unter Seq ID No. 1 dargestellte Sequenz oder einen Teil dieser Sequenz aufweist und anschließend mit einer radioaktiv markierten Probe hybridisiert, die die Se quenz der Verzweigungsenzym-cDNA (vgl. WO92/14827, Beispiel 1) oder einen Teil derselben aufweist. In ca. 5%-10% der transformierten Pflanzen fehlte in der BNA-Blot-Analyse so wohl die Bande, die das spezifische Transkript der unter Seq. ID No. 1 dargestellten Sequenz darstellt als auch die Bande, die das spezifische Transkript der Verzweigungsenzym- cDNA (vgl. WO92/14827, Beispiel 1) darstellt. Diese Pflan zen, welche als R4-Pflanzen bezeichnet wurden, wurden zur Analyse der Qualität der in den Knollen enthaltenen Stärke eingesetzt.

Beispiel 11 Einführung des Plasmids pB33-anti-RL in Kombination mit dem Plasmid pB33-anti-GBSSI in das Genom von Kartoffelpflanzen

Das Plasmid pB33-anti-RL wurde konstruiert wie im Beispiel 7 beschrieben. Das Plasmid pB33-anti-GBSSI wurde wie folgt konstruiert:
Das DraI/DraI Fragment aus der Promotorregion des Patatin Klasse I Gens B33 von Solanuin tuberosum, umfassend die Nucleotide -1512 bis +14 (Rocha-Sosa et al., EMBO J 8 (1989), 23-29) wurde in die SmaI Schnittstelle des Plasmids pUC19 ligiert. Aus dem entstandenen Plasmid wurde das Promo torfragment als EcoRI/HindIII Fragment in die polylinker Re gion des Plasmids pBin19 (Bevan, Nucleic Acids Research 12 (1984), 8711-8721) ligiert. Anschließend wurde das 3' EcoRI Fragment 1181 bis 2511 des GBSSI-Gens von Solanum tuberosum (Hergersberg, Dissertation (1988) Universität zu Köln) in die EcoRI Schnittstelle des entstandenen Plasmids ligiert.

Beide Plasmide wurden mit Hilfe Agrobakterium vermittelter Transformation sequentiell in Kartoffelpflanzen transferiert wie unter Beispiel 10 beschrieben. Aus den transformierten Zellen wurden ganze Pflanzen regeneriert, und die transfor mierten Pflanzen wurden unter Gewächshausbedingungen kulti viert. Die Überprüfung des Erfolges der genetischen Verände rungen der Pflanzen erfolgte durch Analyse der Gesamt-BNA in einer BNA-Blot-Analyse bezüglich des Verschwindens der zu den beiden cDNAs komplementären Transkripte. Hierzu wurde die Gesamt-BNA aus Knollen transformierter Pflanzen nach Standardmethoden isoliert, gelelektrophoretisch auf einem Agarosegel aufgetrennt, auf eine Membran transferiert und mit einer radioaktiv markierten Probe hybridisiert, die die unter Seq ID No. 1 dargestellte Sequenz oder einen Teil der Sequenz aufweist. Danach wurde die gleiche Membran mit einer radioaktiv markierten Probe hybridisiert, die die Sequenz des GBSSI-Gens oder einen Teil dieser Sequenz aufweist (Hergersberg, Dissertation (1988) Universität zu Köln). In ca. 5% bis 10% der transformierten Pflanzen fehlte in der BNA-Blot-Analyse die Bande, die Transkripte darstellt, die mit der erfindungsgemäßen cDNA bzw. mit der GBSSI-cDNA hy bridisierten. Aus den Knollen dieser Pflanzen, welche als R3-Pflanzen bezeichnet wurden, wurde Stärke isoliert und analysiert.

Beispiel 12 Stärkeanalyse der R4-Pflanzen

Die gemäß Beispiel 10 transformierten Kartoffelpflanzen wur den hinsichtlich der Eigenschaften der synthetisierten Stär ke untersucht. Die Analysen wurden an verschiedenen Linien von Kartoffelpflanzen durchgeführt, die mit den beiden Plas miden p35S-anti-RL und p35SH-anti-BE transformiert worden waren und die in der BNA-Blot-Analyse die Banden nicht mehr oder stark reduziert aufwiesen, die Transkripte darstellen, die mit den erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen bzw. mit der Se quenz der Verzweigungs-cDNA hybridisieren.

a) Bestimmung der Viskosität wäßriger Lösungen der Stärke

Zur Bestimmung der Viskosität der wäßrigen Lösungen der in transformierten Kartoffelpflanzen synthetisierten Stärke wurde aus Knollen von Pflanzen, die mit dem Plas mid p35S-anti-RL und mit dem Plasmid p35SH-anti-BE transformiert worden waren, Stärke nach Standardverfah ren isoliert. Es wurden jeweils 2 g Stärke in 25 ml H₂O aufgenommen und für die Analyse in einem Rapid Visco Analyser (Newport Scientific Pty Ltd, Investment Support Group, Warriewood NSW 2102, Australien) verwendet. Der Betrieb des Gerätes erfolgte nach den Angaben des Her stellers. Zur Bestimmung der Viskosität der wäßrigen Lö sung der Stärke wurde die Stärkesuspension zunächst von 50°C auf 95°C erhitzt mit einer Geschwindigkeit von 12°C pro min. Anschließend wurde die Temperatur für 2,5 min bei 95°C gehalten. Danach wurde die Lösung von 95°C auf 50°C abgekühlt mit einer Geschwindigkeit von 12°C pro min. Während der gesamten Dauer wurde die Viskosität be stimmt. Repräsentative Ergebnisse derartiger Messungen sind in Form von Kurven, in denen die Viskosität in Ab hängigkeit von der Zeit dargestellt ist, wiedergegeben. Fig. 6 zeigt unter 1 eine typische RVA-Kurve für Stärke, die aus Wildtyp-Pflanzen der Kartoffelvarietät Désirée isoliert wurde. Linie 2 bzw. 3 zeigen typische RVA-Kur ven für Stärken, die aus Kartoffelpflanzen isoliert wur de, die mit dem Plasmid p35SH-anti-BE bzw. p35S-anti-RL transformiert worden waren. Linie 4 zeigt eine typische RVA-Kurve für Stärke, die aus den Knollen von Pflanzen isoliert worden ist, die mit dem Plasmid p35SH-anti-BE in Kombination mit dem Plasmid p35S-anti-RL transfor miert worden ist. Linie 4 zeichnet sich durch das Fehlen jedweder Viskositätszunahme in Abhängigkeit von der Tem peratur aus.

b) Bestimmung des Amylose/Amylopektinverhältnisses

Aus den Knollen von transformierten Kartoffelpflanzen isolierte Stärke wurde auf das Amylose zu Amylopektin verhältnis untersucht. Dabei ergab sich für die Pflan zenlinie R4-1 (dargestellt in Linie 4 der Fig. 6) ein Amylosegehalt von über 70%. Für die Pflanzenlinie R4-3 ergab sich ein Amylosewert von 27%, während der Amylose gehalt in Wildtypstärke aus der Sorte Désirée zwischen 19 und 22% liegt.

Beispiel 13 Stärkeanalyse der R3-Pflanzen

Die gemäß Beispiel 11 transformierten Kartoffelpflanzen wur den hinsichtlich der Eigenschaften der synthetisierten Stär ke untersucht. Die Analysen wurden an verschiedenen Linien von Kartoffelpflanzen durchgeführt, die mit den beiden Plas miden pB33-anti-RL und pB33-anti-GBSSI transformiert worden waren und die in der BNA-Blot-Analyse die Banden nicht mehr oder stark reduziert aufwiesen, die Transkripte darstellen, die mit den erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen bzw. mit der Se quenz der GBSSI-cDNA hybridisieren.

a) Bestimmung der Viskosität wäßriger Lösungen der Stärke

Zur Bestimmung der Viskosität der wäßrigen Lösungen der in transformierten Kartoffelpflanzen synthetisierten Stärke wurde aus Knollen von Pflanzen, die mit dem Plas mid pB33-anti-RL in Kombination mit dem Plasmid pB33-anti-GBSSI transformiert worden waren, Stärke nach Stan dardverfahren isoliert. Die Bestimmung der Viskosität mittels eines Rapid Visco Analysers erfolgte nach der in Beispiel 12, Teil a, beschriebenen Methode. Die Ergeb nisse sind in Fig. 7 dargestellt. Fig. 7 zeigt in Linie 1 eine typische RVA-Kurve für Stärke, die aus Wild typ-Pflanzen der Kartoffelvarietät Désirée isoliert wurde. Linie 2 bzw. 3 zeigen typische RVA-Kurven für Stärken, die aus Kartoffelpflanzen isoliert wurde, die mit dem Plasmid pB33-anti-GBSSI bzw. p35S-anti-RL transformiert worden waren. Linie 4 zeigt eine typische RVA-Kurve für Stärke, die aus den Kartoffelpflanzen isoliert wurde, die mit dem Plasmid pB33-anti-GBSSI in Kombination mit dem Plasmid pB33-anti-RL transformiert worden waren. Diese Kurve zeichnet sich durch das Fehlen des Viskosi tätsmaximums sowie dem Fehlen des Anstiegs der Viskosi tät bei 50°C aus. Des weiteren zeichnet sich diese Stär ke dadurch aus, daß der nach RVA-Behandlung erhaltene Kleister so gut wie keine Retrogradation nach mehrtägi ger Inkubation bei Raumtemperatur aufweist.

b) Bestimmung des Amylose/Amylopektinverhältnisses

Aus den Knollen von transformierten Kartoffelpflanzen isolierte Stärke wurde auf das Amylose zu Amylopektin verhältnis untersucht. Dabei ergab sich für die Pflan zenlinie R3-5 (dargestellt in Linie 4 der Fig. 7) ein Amylosegehalt von unter 4%, für die Pflanzenlinie R3-6 ein Amylosegehalt von unter 3%. Der Amylosegehalt in Wildtypstärke aus der Sorte Désirée liegt zwischen 19 und 22%.

c) Bestimmung des Phosphatgehaltes der Stärke

Der Phosphatgehalt der Stärke wurde bestimmt, indem die Menge an Phosphat, das an der C-6-Position von Glucose resten gebunden war, gemessen wurde. Hierzu wurde Stärke zunächst durch Säurehydrolyse gespalten und anschließend der Gehalt an Glucose-6-Phosphat mittels eines Enzym tests bestimmt, wie im folgenden beschrieben.

100 mg Stärke wurden in 500 µl 0,7 N HCl 4 h bei 100°C inkubiert. Nach der Säurehydrolyse wurden 10 µl des An satzes in 600 µl Imidazolpuffer (100 mM Imidazol, 5 mM MgCl₂, pH 6,9, 0,4 mM NAD⁺) gegeben. Die Bestimmung der Menge an Glucose-6-Phosphat in dem Ansatz erfolgte durch Umsetzung mit dem Enzym Glucose-6-Phosphat-Dehydroge nase. Dazu wurde dem Ansatz 1 U Glucose-6-Phosphat-Dehy drogenase (aus Leuconostoc mesenteroides (Boehringer Mannheim)) zugesetzt und die Menge an gebildetem NADH durch Messung der Absorption bei 340 nm bestimmt.

Der Gehalt an Glucose-6-Phosphat/Milligramm Stärke ist in der folgenden Tabelle für nicht-transformierte Kar toffelpflanzen der Varietät Désirée sowie für die Linien R3-5 und R3-6 transgener Kartoffelpflanzen, die mit dem Plasmid pB33-anti-RL in Kombination mit dem Plasmid pB33-anti-GBSSI transformiert worden waren, angegeben. Zum Vergleich ist der Wert für die Stärke aus der sog. waxy-Kartoffel (US2-10) mit angegeben, die mit dem Plas mid pB33-anti-GBSSI transformiert worden war.

Tabelle 7

Beispiel 14 Isolierung einer cDNA-Sequenz, die ein R1-Enzym aus Zea mays codiert

Bakterien des Stammes XL1-Blue wurden mit Lambdaphagen infi ziert, deren Phagenköpfe eine cDNA-Bibliothek aus Endosperm- Gewebe von Zea mays enthielten (Stratagene, Heidelberg). Die infizierten E. coli-Zellen wurden auf Medium in Petrischalen mit einer Dichte von ca. 25000 Plaques pro ca. 75 cm² plat tiert. Nach etwa 9-stündiger Inkubation wurden Nitrozellulo sefilter auf den lysierten Bakterienrasen aufgelegt, die nach 1 Minute abgenommen wurden. Die Filter wurden für 2 Mi nuten in 0.5 M NaOH, 1.5 M NaCl, dann für 2 Minuten in 0.5 M Tris HCl pH 7.0 inkubiert und anschließend für 2 Minuten in 2× SSC gewaschen. Nach Trocknung und Fixierung durch UV-Crosslinking wurden die Filter 3 Stunden in Puffer A inku biert, bevor die radioaktiv markierte DNA-Probe (random pri ming) zugesetzt wurde. Als Probe wurde ein ca. 2,7 großer Bereich der DNA-Insertion des Plasmids pRL2 (siehe Beispiel 4 und 5) verwendet. Dieses Fragment wurde mit den Restrik tionsenzymen XhoI und HindII herausgeschnitten und repräsen tiert die 3'-gelegene Hälfte der cDNA-Insertion in pRL2 (siehe Fig. 8).

Nach 12stündiger Hybridisierung bei 48°C wurden die Filter 1× 10 Minuten in 2× SSC/1% SDS bei Raumtemperatur und an schließend 2× 20 Minuten in 1× SSC/0.5% SDS bei 35°C gewa schen und autoradiographiert.

In drei Sondierungszyklen wurden Phagenclone, die eine cDNA- Insertion enthalten, vereinzelt. Auf diese Weise wurden bei der Durchmusterung von ca. 1.500.000 Phagenplaques ca. 6 Plaques identifiziert.

Diese positiven Phagenclone wurden für die in-vivo excision eines pBluescript-Plasmids nach Standardverfahren einge setzt. Die DNA-Sequenzen der entsprechenden Insertionen wur den nach dem Verfahren von Sanger et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463-5467) bestimmt. So konnten meh rere Clone identifiziert werden, die Insertionen enthalten, die ein Rl-Enzym aus Mais codieren. Die cDNA-Insertion eines geeigneten Clons, RIM, wurde vollständig bestimmt. Die Nucleinsäuresequenz ist dargestellt in Seq ID No. 5. Die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz ist dargestellt in Seq ID No. 6.

Eine geeignete cDNA-Insertion des Clons R1M wurde nach Stan dardverfahren (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Labora tory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbour Laboratory Press, (1989), NY, USA) aus dem pBluescript-Derivat mit NotI und XhoI isoliert, die Schnittstellen geglättet und in den Vek tor pUBIbar in die HpaI-Schnittstelle insertiert. Dieses Plasmid kann zur Transformation pflanzlicher Zellen, insbe sondere Mais, nach den oben angegebenen Methoden verwendet werden.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Nucleinsäuremolekül, das ein Protein aus Mais codiert, das in pflanzlichen Zellen sowohl an Stärkekörner gebun den vorliegt, als auch in löslicher Form, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

(a) Nucleinsäuremolekülen, die ein Protein mit der unter Seq ID No. 6 angegebenen Aminosäuresequenz codieren;
(b) Nucleinsäuremolekülen, die die codierende Region der unter Seq ID No. 5 angegebenen Nucleotidsequenz um fassen; und
(c) Nucleinsäuremolekülen, die mit dem komplementären Strang eines unter (a) oder (b) genannten Nuclein säuremoleküls hybridisieren;
sowie der jeweils komplementäre Strang eines solchen Nucleinsäuremoleküls.

2. Vektor enthaltend ein Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1.

3. Vektor nach Anspruch 2, wobei das Nucleinsäuremolekül verknüpft ist mit regulatorischen Elementen, die die Transkription in eukaryontischen oder prokaryontischen Zellen gewährleisten.

4. Wirtszelle, die genetisch modifiziert ist mit einem Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1 oder einem Vektor nach Anspruch 2 oder 3.

5. Wirtszelle nach Anspruch 4, die eine transgene Pflanzen zelle ist.

6. Pflanze enthaltend Pflanzenzellen nach Anspruch 5.

7. Stärke erhältlich aus Pflanzenzellen nach Anspruch 5 oder einer Pflanze nach Anspruch 6.

8. Verfahren zur Herstellung eines Proteins aus Mais, bei dem eine Wirtszelle nach Anspruch 4 unter Bedingungen kultiviert wird, die die Expression des Proteins erlau ben, und das Protein aus den Zellen und/oder dem Kultur medium isoliert wird.

9. Protein, das durch ein Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1 codiert wird oder das erhältlich ist durch ein Verfah ren nach Anspruch 8.

10. Antikörper, der spezifisch ein Protein nach Anspruch 9 erkennt.

11. Nucleinsäuremolekül von mindestens 15 Nucleotiden Länge, das spezifisch mit einem Nucleinsäuremolekül nach An spruch 1 hybridisiert.

12. DNA-Molekül codierend eine antisense-BNA, die komplemen tär ist zu Transkripten eines DNA-Moleküls nach Anspruch 1.

13. DNA-Molekül codierend eine BNA mit Ribozymaktivität, die spezifisch Transkripte eines DNA-Moleküls nach Anspruch 1 spaltet.

14. DNA-Molekül, codierend eine BNA, die bei Expression in einer pflanzlichen Zelle aufgrund eines Cosuppressions-Effektes zur Verringerung der Expression eines Nuclein säuremoleküls nach Anspruch 1 führt.

15. Vektor enthaltend ein DNA-Molekül nach einem der Ansprü che 12 bis 14.

16. Vektor nach Anspruch 15, wobei das DNA-Molekül kombi niert ist mit regulatorischen DNA-Elementen, die die Transkription in pflanzlichen Zellen gewährleisten.

17. Wirtszelle enthaltend ein DNA-Molekül nach einem der An sprüche 12 bis 14 oder einen Vektor nach Anspruch 15 oder 16.

18. Transgene Pflanzenzelle enthaltend ein DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 12 bis 14 in Kombination mit regula torischen DNA-Elementen, die die Transkription in pflanzlichen Zellen gewährleisten.

19. Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 18, bei der die Aktivität mindestens eines weiteren, an der Stärkebio synthese oder -modifikation beteiligten Enzyms verrin gert ist im Vergleich zu nicht-transformierten Pflanzen.

20. Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 19, bei der die Aktivität eines Verzweigungsenzyms verringert ist.

21. Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 20, bei der die Aktivität einer Stärkekorn-gebundenen Stärkesynthase der Isoform I (GBSSI) verringert ist.

22. Transgene Pflanze enthaltend Pflanzenzellen nach einem der Ansprüche 18 bis 21.

23. Stärke erhältlich aus Pflanzenzellen nach einem der An sprüche 18 bis 21 oder Pflanzen nach Anspruch 22.

24. BNA-Molekül erhältlich durch Transkription eines DNA Mo leküls nach einem der Ansprüche 12 bis 14.

25. Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzenzellen, die eine modifizierte Stärke synthetisieren, dadurch ge kennzeichnet, daß in den Zellen die Menge von Proteinen nach Anspruch 10 verringert wird, die endogen in der Zelle synthetisiert werden.

26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß die Verringerung der Menge der Proteine nach Anspruch 10 in den Zellen durch einen antisense-Effekt erzielt wird.

27. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß die Verringerung der Menge der Proteine nach Anspruch 10 in den Zellen durch einen Ribozymeffekt erzielt wird.

28. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß die Verringerung der Menge der Proteine nach Anspruch 10 in den Zellen durch einen Cosuppressions-Effekt erzielt wird.

29. Verfahren nach einem der Ansprüche 25 bis 28, wobei die Enzymaktivität mindestens eines weiteren an der Stärke biosynthese und/oder Modifikation beteiligten Enzyms re duziert wird.

30. Verfahren nach Anspruch 29, wobei das Enzym ein Verzwei gungsenzym ist.

31. Verfahren nach Anspruch 29, wobei das Enzym eine Stärke korn-gebundene Stärkesynthase der Isoform I (GBSSI) ist.

32. Pflanzenzelle erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 25 bis 31.

33. Transgene Pflanze enthaltend Pflanzenzellen nach An spruch 32.

34. Stärke erhältlich aus Pflanzenzellen nach Anspruch 32 oder einer Pflanze nach Anspruch 33.

35. Stärke nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Mais stammt.

36. Vermehrungsmaterial von Pflanzen nach Anspruch 6 enthal tend Pflanzenzellen nach Anspruch 5.

37. Vermehrungsmaterial von Pflanzen nach Anspruch 22 oder 32, enthaltend Pflanzenzellen nach einem der Ansprüche 18 bis 21 oder nach Anspruch 32.

38. Transgene Pflanze nach Anspruch 22 oder 33, die eine Maispflanze ist.

39. Samen einer Maispflanze nach Anspruch 38.