DE1961764A1 - Antibiotisch wirksames Aabomycin-A und Verfahren zu seiner Herstellung - Google Patents

Description

18.541

Kaken Kagaku Kabushiki Kaisha und Rikagaku Kenkyusho Tokio bzw. Kitaadachi (Japan)

Antibiotisch wirksames Aabomycin-A und Verfahren zu seiner Herstellung

Die Erfindung betrifft ein neues, antibiotisch wirksames Aabomycin-A mit starker antifungaler und antiviraler Wirksamkeit gegen Pilze, z.B. Piricuraria oryzae (BlattfIeckenkrankheit des Reises) und Gloeosporium kaki (Anthracnose der Kakipflaume), und Viren, z.B. den Tabakrnosaikvirus, den Hewcastlekrankheitsvirus, den Herpes simplex-Virus und den Parainfluenzavirus, sowie ein Ver fahren zur Erzeugung dieses Antibiotikums.

Die Erfinder haben gefunden, daß die Subspezies aabomyceticus Seino (Waksman et ilenrici) des Pilzes Streptomyce3 sp. 325-17» der zu¹ der Art Streptomyces der Gattung Actinornycetes gehört und als Streptomyces hygroscopicus (Jenaen) bezeichnet wird, in ihrer Kultur ein neuartiges Antibiotikum erzeugt und anreichert, da3 eine antifungale und antivirale Wirksamkeit hat. Es ist den Erfindern gelungen, aus einer Kultur dieser Subspezies einen reinkristallinen Wirkstoff zu isolieren. Die Erfindung beruht auf dieser Beobachtung und schafft ein Verfahren zum Erzeugen von Aabomycin-A unter Verwendung einer Kultur eines Streptomyces-

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BAD OBIGlNAU

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Pilzes, der imstande ist, Aabomycin-A zu erzeugen und aus dessen Kultur das Aabomycin-A gewonnen werden kann.

Der als Streptomyces sp. 525-17 bezeichnete Stamm hat in der amerikanischen Typenkultursammlung (ATGC) die ATCC-Nummer 21449 erhalten und ist bei der ATCC ohne Einschränkung für die Öffentlichkeit zugänglich. Dieser Stamm ist seit dem 20. November 1969 für die Abgabe an die Öffentlichkeit freigegeben.

Die Erfindung schafft ein neues, antibiotisch wirksames Aabomycin-A, das eine starke antifungale und antivirale Potenz besitzt und in reinkristalliner Form aus einer ψ Kultur eines Aabomycin-A erzeugenden Mikroorganismus, z.B. Streptomyces sp. 325-17 (ATCC 21449) gewonnen wird.

Die Eigenschaften des im Rahmen der Erfindung verwendeten Pilzes Streptomyces sp. 325-17 sind nachstehend angegeben. Aufgrund dieser Eigenschaften wird der Pilz 325-17 als ein Pilzstamm der Art Streptomyces der Gattung Aetinomycetes angesehen.
Hikromorphologie

In flüssigen Medien, z.B. Glueose-Nährböden, zerfällt das vegetative Mycelium nicht in kokken- oder baaillenähnliche Teile. Einige Nährböden, z.B. aus anorganisehen Salzen, Stärke und Agar, Agar, oder aus Hefeextrakt, Malzextrakt und Agar-Agar oder aus Bennet-Agar-Agar oder aus Hefeextrakt, Stärke und Agar-Agar eignen sich gut für die Beobachtung der Hikromorphologie dieses Stammes. Sporen (Elektronenmikrogramm)

Iiichtsegmontiert, bedeckt mit einem käpselartigen Häutchen, ziemlich unregelmäßig ornamentierte Überfläche, warzeriähnlich bis grobstachelig. Aus dem Kohlenrepligr-amm und dem durch Abtasten erhaltenen Elektronenmikrogramia geht hervor, daß die Oberfläche sehr runzelig ist und die Sporen eine ähnliche Morphologie haben wie die Sporen vom Typus I S₁. hygroscopicus (Dietz u.a., 1962).

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BAD ORfGf_NAL

Sporophoren

Kurze Seitenzweige, die entlang von geraden oder jev/ellten Zellfäden angeordnet sind und in geschlossenen Spiralen mit zwei oder mehr Windungen enden. Die Sporophoren sind einzeln, paarweise oder gelegentlich wirteiförmig längs d;3 axialen K; cGÜunn angeordnet. Es sind keine Anzeichen einer Bildung von echten quirlständigen Zweigen vorhanden. Hie Spiralen haben im Durchschnitt einen Durchmesser von 5,5 /Um.
liuolitungB- und physiο 1 ο g i s c he Ei genschaften

Die Zuchtungs- und physiologischen Prüfungen werden bei 28° C durchgeführt und die Ergebnisse nach 21 Tagen festgestellt, sofern nichts anderes angegeben ist. i-latte aus Sucrosenitrat und Agar-Agar (Czapek-Sucrose-Agar-Agar)

Wachstum: Gut, sich ausbreitend, 2 ea (helle Weizenfarbe) Luftinyceliumi Dünn, pulverförmig, fast weiß, in der Hit te 1 ea (hellgelb).

Lösliches Pigment: !licht vorhanden Platte aus Glycerinnitrat und Agar-Agar (Czapek-G-lyeerin- Agar-Agar)

Wachstum: Gut, sich ausbreitend, 2 fb (hellgelbe Lederfarbe, 86) Luftnycelium: Dünn, pulverförmig, weiß, in der llittel gelb. Lösliches Pigment: Blaßgelb

Nährboden aus Glucose, Asparagin und Agar-Agar V/ ac list um: Gut, sich ausbreitend, 2 ea (helle Weizenfarbe) Lr<f tnycelium: !leichlich vorhanden, pulverförmig 3 fe (3:'lborgrau), mit feuchten Flecken, j/:»:='- lohes Pigment; !licht vorhanden jicnorkjjig: Hygroskopisch

Viii., i- aus Asparagin, Dextrose und Agar-Agar

Oinv.-i.·. u.a., Appln. Kicrobiol. ,3:361, 1955) Mi. ----- .: Wie auf der Platte aus Glucose, Asparagin und A,··.-- -Agar

j.-·: !mycelium: keichlich vorhanden, pulverförmig, 5 fe (aschfarben, helles rötlichgraues Braun, 45), mit feuchten Flecken;

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BAD ORiGlNAL

Loslich.es Pigment: ificlit vorhanden Bemerkungen: Hygroskopisch.

Platte aus Glycerin, Asparagin und Agar-Agar__(ISP) Wachstum: Gut, sich ausbreitend, 2 ca (helle Elfenbeinfarbe, blaßgelb, 89)

Luftmycelium: Dünn, pulverförmig, 1 "ba (gel"b getönt, blaßgelb, 39) bis 3 dd (naturfarben) Lösliches Pigment: ganz schwaches Rosa Platte aus Glycerin, Calciummaleat und Agar-Agar Wachstum: Beschränkt, aufwärtsgerichtet, gut, 2 ic (helle Goldfarbe) Luftmycelium: Seichlich, pulverförmig, 1 ic (zitronengelb) bis 3 ig (beigebraun, graugelbes Braun, 80) Lösliches Pigment: liicht vorhanden Bemerkungen: Das Calciummaleat ist teilweise aufgeschlossen Platte aus anorganischen Salzen, Stärke und Agar-Agar (ISP) Wachstum: Reichlich, sich ausbreitend, 1 la (limonengelb) Luftrnyceliun: Reichlich, pulverförmig, 4 Ii (bib erf ar ben, bräunlichgrau, 64)· Lösliches Pigment: Hellgelb Bemerkungen: Positive hydrolytische Wirksamkeit Platte aus Tyrosin und Agar-Agar (ISP) Wachstum: Gut, aufwärtsgerichtet, 3 Ie (zimtfarben) bis 4 nl (dunkelbraun) Luftmycelium: Reichlich vorhanden, pulverfcrmig, 4 Ii (biberfarben, bräunlichgrau, 64) Lösliches Pigment: 3 Ie (zimtfarben) Bemerkungen: Die Tyrosinaserealrtion ist zweifelhaft. Platte aus Hefeextrakt, Ilalzextrakt und Agar-Agar (ISP) Wachstum: Reichlich, 1 ia (limonengelb) bis zu dunkleren Farben

Luftmycelium: Reichlich vorhanden, pulverförmig, 4 Ii (biberfarben, bräunlichgrau, 64) Lösliches Pigment: Hellgelb Platte aus Hafermehl und Agar-Agar (ISP) Wachstum: Gut, beschränkt, nicht aufwärtsgerichtet, 1 1/2 ca (cremefarben)

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Luftmycelium: Gut pulverförmig, 4 Ii (biberfarben, bräunlichgrau, 64)

Lösliches Pigment: Hicht vorhanden

Platte aus Bennett-Agar-Agar

Wachstum: Aufwärtsgerichtet, gut, 1 ga (hellgelb) Luftmycelium: Reichlich vorhanden, pulverförmig, fast 5 fe (aschfarben, rötlichgraues Hellbraun, 45) Lösliches Pigment: 1 ca (limonengelb)

Platte aus Hefeextrakt, Stärke und Agar-Agar

Wachstum: Reichlich, aufwärtsgerichtet, sich ausbreitend, 1 ga (hellgelb), in der Hitte dunkel Luftmycelium: Reichlich vorhanden, pulverförmig, 3 ig (beigebraun, graugelbes Braun,'8O)

Lösliches Pigment; Hellgelb

(Die Platte bestand aus 2 g Hefeextrakt, 10 g löslicher Stärke, 15 g Agar-Agar, gelöst in 1000 ml Wasser, pH 7>0.)

Ilähr-Agar-Agar (Difco Bacto-Fährböden-Agar-Agar)

Wachstum: Mäßig, 1 1/2 ca (cremefarben) Luftmycelium: Gut, dünn, pulverförmig, weiß Lösliches Pigment: Nicht vorhanden.

In den Tabellen 1 und 2 sind die Ergebnisse von verschiedenen physiologischen Prüfungen des Stammes 325-17 angegeben.

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Tabelle 1 Nährboden

Befund

Melaninbildung

Pepton, Eisen und Agar-Agar (Difc ο) negativ

Tyrosinasereaktion

Xanthogeninzersetzung

Schwefelwasserstoffbildung

Nitratreduktion

Gelatineverflüssigung

Kilchverdauung

Serumverflüssigung

cellulolytische

Wirksamkeit

Temperaturbereich

Sauerstoffbedarf

Melaninbildungs-Agar-Agar zweifelhaft (3 Ie)

Tyrosin und Agar-Agar (ISP) zweifelhaft

Tyrosin und Agar-Agar (ISP) zweifelhaft

Xanthogenin und Agar-Agar negativ

Pepton, Eisen und Agar-Agar (Difco)

Glucosenitratbouillon Ifitratbouillon (Difco)

SO-?«-ige Difc ο Bacto-Gelatine

1O-^-ige Difco-Magermilch

Difco-Löffler-Serum-Nährboden

Filterpapier und Czapek-Bouillon ohne Kohlenstoffquelle

Bennett-Agar-Agar

G-lycerin-Nährbouillon unter CO „-Atmo Sphäre negativ

negativ negativ positiv

peptonisiert positiv wahrs ehe inlich

kein Viachstum bei 5° C und 50° C

aerob

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Tabelle 2

Verwertung von Kohlehydraten durch den Stamm 325-17 in dem synthetischen Nährboden von Pridharn und Gettleib

Kohlehydrat

Befund

Kohlehydrat

Befund

U)

L-Arabinose D-Glucose !^-Galactose Glycerin Lactose D-Lävulose !)( + )-Mannose Maltose I)( + )-Melezitose Melibiose ILaffinose Sorbose

Sucrose

Treharose

D-XyIöse

Aesculin

Salicin

Inulin

Adonitol

DuIcitöl

i-Inositol

D-Mannitol

D-Sorbitol

^K ' ++ stark positive Verwertung + positive Verwertung + Verwertung zweifelhaft negative Verwertung

Zum Züchten des Streptoayces sp. 325-17 zwecks Urzeugung von Aabomycin-A kann das bekannte Verfahren zum «Juchten von Actinonycetes oder deren Modifikationen angewendet werden. Itir die technische Erzeugung ist es jedoch

;-;-teilhaft, die Züchtung durch Rühren und Belüften in einem i -j'i-chälter vorzunehmen. Während des Züchtens soll die Tem-.. . ■■'■- :r auf etwa 25-32° C gehalten werden. Als Nährboden i ... die für das iJüchten von Actinomycetes üblichen -zen in beliebigen Kombinationen verwendet werden, jubstanzen umfassen beispielsweise verschiedene

. .._<_n von Kohlenstoff, Stickstoff, anorganische Salze, τ :;i3tumsf ordernde Stoffe und schaumunterdrückende Mittel.

.-^e Menge des; erzeugten und angesammelten Aabomycins-A erreicht gewöhnlicn nacli einer Züchtungszeit von 2-5 Tagen ei η Maximum.

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BAD ORIGINAL.

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Die Extraktion von Aabomycin-A aus der vorstehend angegebenen Kultur und seine Reindarstellung erfolgen unter Ausnutzung seiner physisch-chemischen Eigenschaften. Aabomycin-A ist vor allem in dem Kulturfiltrat, je nach dem Züchtungsverfahren aber auch in den Pilzzellen in einer mehr oder minder beträchtlichen Henge enthalten. Aabomycin-A ist in Butylacetat und anderen organischen Lösungsmitteln löslich. IJach dem Kischen der Kultur mit diesen Lösungsmitteln tritt das Antibiotikum in das Lösungsmittel ein und wird dadurch extrahiert. In manchen Fällen kann man aus dem Kulturfiltrat Pilzsellen abfiltrieren und das Filtrat mit den vorstehend angegebenen Lösungsmitteln vermischen, so daß Aabomycin extrahiert wird. Die Pilzzellen können dann mit hydrophilen Lösungsmitteln, z.B. Aceton, extrahiert werden. Nach der Extraktion der Pilzzellen mit einem hydrophilen Lösungsmittel wird dieses im Vakuum eingeengt und die eingeengte Lösung ebenso wie das Kulturfiltrat mit einem organischen Lösungsmittel, wie Butylacetat, extrahiert. Die auf diese Weise erhaltenen Extraktlösungen werden kombiniert und im -Vakuum verdampft. Man erhält ein sirupartiges Konzentrat, aus dem mit einen kleinen Volumen Chloroforn Aabomycin-A extrahiert wird. Der Extrakt wird durch eine mit Tonerde gefüllte Chromatographiekolonne geführt. Eine wirksame Entwicklung wird durch aufeinanderfolgende Elutionen mit Benzol, Chloroform und einem Gemisch von Butylacetat und !!ethanol (10:1) durchgeführt. Der Effluent wird fraktioniert und auf seine antifungale Viirksamkeit überprüft, wobei als PrüfOrganismus Piricularia oryzae verwendet wird. Es werden nur die wirksamen Fraktionen gesammelt. Die gesammelten Fraktionen werden vereinigt und zur Trockne verdampft. Der so erhaltene Rückstand wird in einer möglichst kleinen Henge Chloroform aufgelöst. Bei tropfenweicer Zugabe ven Benzol fallen grobe Kristalle aus Aabomycin-A aus. Diese Kristalle werden gesauneIt und zu farblosen HadeIn umkristallisiert. Zum Umkristallisieren wird ein Lösungsmittelgemisch aus Benzol und Chloroform, Äthylacetat und Hexan oder Methanol und Wasser empfohlen»

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BAD

H	05	Έ	93	oder
9,	15	1,	89
9,	17	1,	95
9,	1,

Die Untersuchung der Kultur durch Papierchromatoimd Bioautographie ergibt den nachweis von mindestens zwei oder mehr antifungalen Substanzen außer Aabomycin-A, doch ist der Gehalt an diesen Substanzen deutlich kleiner als der an Aabomycin-A und sind ihre Eigenschaften noch nicht bestimmt worden.

Aabornycin-A hat folgende Eigenschaften:

(1) Farblose Kristallnadeln, Schmelzpunkt 144-I45⁰ C

(2) Elementaranalyse [fi)

Berechnet für C-Q_-40H_65-67O₁₁N 64,71

•65,10 Gefunden 63,67

(3) Holekulargewicht: 723,918-737,944

(Die Bestimmung nach de:;i Dampfdruckgleichgewichtsverfahren ergab einen V/ert von 770)

(4) Spezifische optische Drehung:[pcJ ? + 93,5° (c. = 1, CHOl₅)

(5) Löslichkeit: Leicht löslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Äthylacetat, Butylacetat, Chloroform und Äther, etwas löslich in Ammoniakwasser, Benzol und tetrachlorkohlenstoff, schwer löslich oder unlöslich in Wasser, Hexan und Petroläther.

(6) Infrarotabsorptionsspektrum: Gemäß Fig. 1 (in Chloroformlösung)

(7) Ultraviolettabsorptionsspektrum; Gemäß Fig. 2 ist in einer neutralen Methanollösung oder in einer Lösung von 0,1 η-Salzsäure und Methanol das Absorptionsniaximum bei 280 nm (e!, _ 1,67), und gemäß Fig. 3 ist das Absorptionsmaximum in einer Lösung von 0,1 n-Natriumhydroxyd bei

273 nm (e2?L 65,0) vorhanden.
~" 1 cm

(8) Farbreaktionen; Positive .Reaktion bei Kaliumpermanganat, sowie positive Pehlingsche und Molisch'-sehe Reaktion. Bei der Behandlung mit Schwefelsäure auf einer dünnen Schicht aus Kieselgel erhält man die charakteristische Violettfärbung. Die ITinhydrin-Heaktion, die Biuretreaktion, die Sakaguchische Reaktion, die Reaktion von 2,4-Dinitrophenylhydrazin und die Reaktion von Eisen(III)-Chlorid sind alle negativ.

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(9) Temperaturbeständigkeit: Aabomycin-A wurde in Gemischen von Methanol und Wasser (1:1) aufgelöst, die auf verschiedene pH-Werte eingestellt und 24 Stunden stehen gelassen wurden. In keiner der Lösungen wurde die antifungale Wirksamkeit herabgesetzt. Dieselben Proben wurden 5 Minuten lang auf 100° C erhitzt. Bei einem pH-Wert der Lösung von 7-9 wurde die antifungale Wirksamkeit fast nicht herabgesetzt, während sie bei einem pH-Wert von 2-4 fast vollständig verschwand.

(10) Beständigkeit gegenüber Ultraviolettstrahlen:

Bei einer Bestrahlung des Antibiotikums mit einer chemischen Lampe (bakterizide Lampe Toshiba [Warenzeichen], Type GL-15) aus einer Entfernung von 45 era wurde die antifungale Wirksamkeit selbst bei einer Dauerbestrahlung von einer Woche nicht herabgesetzt.

(11) Chromatogramme: nachstehend sind die Rf-Werte angegeben, die bei verschiedenen chromatographischen Verfahren erhalten wurden. Das zur Entwicklung verwendete Lösungsmittel ist in Klammern angegeben.

Papierchromatographie: 0 (Benzol), O (Chloroform), 0,80 (Äthylacetat), 0,10 (1:1 Äthylacetat-Benzol 1:1), 0 (Chlor of orm-Benzol 1:1), 0,23 (Benzol-Äthylacetat 1:2). Dünnschieht-Öhromatographie über Kieselgel; 0 (Benzol), 0 (Chloroform), 0,82 (Äthylacetat), 0,35 (Äthylacetat-Benzol 1:1), 0 (Chloroform-Benzol 1:1), 0,47 (Benzol-Äthylacetat 1:2), 0,10 (Benzol-Äthylacetat 2:1).

(12) Elektrophorese: Unter Verwendung von Sephalax (Warenzeichen) als Träger wurde 30 Minuten lang eine Elektrophorese bei 10 mA durchgeführt. Bei Verwendung einer Phosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,0 wurde keine Beweglichkeit von Ionen festgestellt. Bei Verwendung einer Ammoniak-Ammoniumchlorid-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 10,5 wurde eine schwache Bewegung zu der Anode hin festgestellt.

(13) (A) Ein nach der Agar-Agar-Verdünnungs-Methode ermitteltes, antifungales Spektrum ist in der Tabelle 5 angegeben.

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Tabelle 3

Kleinste

Prüf Organismus Ilermkonzentration

al g/ml

Piricularia oryzae 0,001

Gocliliobolus iniyabeanus 3,0

Gloeosporium lacticolor 1O₉O

Gloeosporium kaki 1 ,0

Pellioularia filamentosa 10,0

Glomerella cinffulata ^N> 100

Oladosporium fulvum 100

Ilacrosporium batapicola 10.0

[üricnophyton asteroides 1.5

Tricliopliyton rubrum 0,8

Triciiophyton mentagropnytes 1,5

Oandida albicans 57 12,0

Staphylococcus aureus PDA 209 P .-100

Pseudomonas aeru^inosa \100

Hycobacterium smegmatis ATOC 607 '»100

Eschericiiia coli ITIHJ \100

Zantiiomonas oryzae \100

dysonteriae M00

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(B) Antivirale Wirksamkeit

B-1 Antivirale Wirksamkeit gegen den TMV

Vier Yfochen alte Keimlinge von HTicotiana tabacum var. Xanthi wurden als Prüfpflanzen und die KoIeoptile von zwei Wochen alten Keimlingen von Phaseolus vulgaris L., Pinto, wurden für die Prüfung auf örtliche krankhafte Veränderungen verwendet. Für die Scheibenanalyse (dis>assay) wurden Blattscheiben von Uicotiana tabacum L. var. Blight yellow verwendet.

Blattscheiben wurden unmittelbar vor dem Impfen auf verschiedenen Konzentrationen des Antibiotikums in 40 mm-Petrischalen schwimmen gelassen und dabei bei 25 mit Pluoreszenzlicht von 3000 Lux bestrahlt. Aus der Tabelle 4 geht hervor, daß die Vermehrung des TMV in den Scheiben merklich gehemmt wurde, wenn die Konzentration des Antibiotikums übertraf.

Tabelle 4

(•χ) (iac)

Materialien Konzentration Schutzwert^v ' Phytotoxizität^v '

Aabomycin A 100,0 99,8

10,0 87,0

1,0 82,0

Blasticidin S 0,01 86,0 +

0,005 87,0 +

0,001 82,0

χ Schutzwert =

(1 Virustiter (mit Antibiotikum behandeltes Blatt K _10Q

Virustiter (nicht mit Antibiotikum behandeltes

Blatt)

keine Phytotoxizität
+ sehr schwache Phytotoxizität + schwache Phytotoxizität

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B-2 Antivirale Wirksamkeit gegen HDV und HSV

1) Die antivirale Yiirksamkeit von Aabomycin-A wurde mit Hilfe von Agar-Agar-Diffusionsplatten untersucht. Dabei wurden der Newcastlekrankheitsvirus als Virus vom RIiS-Typus und der Herpes simplex-Virus als Virus vom DNS-Typus verwendet. Das Ergebnis ist in der Tabelle 5 dargestellt. Bei dieser Untersuchung wurde der Newcastlekrankheitsvirus oder der Herpes simplex-Virus zum Impfen der ineinanderwachsenden Einscliichtkultur von Kükenembryof ibroblast in Petrischalen verwendet. Die Kulturen wurden mit weichem Agar-Agar-Nährboden bedeckt. Nach dem Erhärten des Agar-Agars wurde dieses mit Papierscheiben von 8 mm Durchmesser bedeckt, die mit 0,02 ml der Antibiotikumlösung getränkt waren. Es wurden die Durchmesser der cytotoxischen Zone (CTZ) und der antiviralen Zone (AVZ) gemessen.

Tabelle 5

Konzen tration des	Newcastle- krankheitsvirus	AVZ (mm)	Herpes simplex- Virus
Anti biotikums (yUg/ml)	CTZ	18,0	CTZ AVZ(mm)
50000	+	16,3	+ 22,5
25000	+	16,8	+ 20,7
I25OO	+	16,3	+ 17,5
6250	-	16,8	17,0
3125	-	15,5	17,1
1562	-	16,5	16,4
781	-	15,9	16,0
390	-	15,2	16,5
195	-	16,3	15,4
98	-	15,1	15,8
49	-	13,7	15,7
24	-	12,8	12,9
12	-	-	13,6
6	-	±

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2) Die antivirale Wirksamkeit von Aabomycin-A wurde an bebrüteten Eiern geprüft. Die Ergebnisse dieser Prüfung sind in der Tabelle 6 angegeben. 12 Tage alte embryonierte Eier wurden mit dem liewcastlekrankheitsvirus in einer Menge von 10 PW pro Ei geimpft. Gleichzeitig wurde Aabomycin-A zugeführt. Die Eier wurden zwei Tage lang bei 39° C gehalten. Danach wurde die Chorioallanoisflüssigkeit gesammelt und ihre Hämagglutinationseinheit gemessen.

	Wachstum der Küken embryos	Tabelle 6	Heinmungszahl
Kon zen tration des Anti biotikums		Hämag glut inations- Einheit
(//g/Ei)	normal		t=i 100
40	It	10	•*=i 100
20	It	10	t=i 100
10	Il	10
5	Il	10	80-99
1	It	20-400	0-99
0,8	tt	20-1600
Kontroll- versuch	I8OO-32OO

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Zur Untersuchung der Wirkung von Aabomycin-A auf das Wachsen des Embryos wurde das Wachsen der Kükenembryos mit dem Wachsen von nichtinfxzierten und unbehandelten Kontrollembryos verglichen. Aus der Tabelle 6 geht hervor, daß das Antibiotikum in dieser Hinsicht wirkungslos war. In dieser Prüfung wurden für jede Konzentration des Antibiotikums 10 Eier verwendet.

Dieses Antibiotikum hat keine antibakterielle Wirkung gegen grammpositive und grammnegative Bakterien.

(14) iEoxizitätsprüfung

Zur Prüfung seiner akuten Toxizität wurde

Aabomycin-A weiblichen Mäusen vom ddN-Stamm intraperitoneal injiziert. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 7 angegeben.

Tabelle 7

Konzentration des Antibiotikums (mg/kg) 100 500

Lösungsmittel 10-#-ige Olivenöl

Äthanollösung

Anzahl der toten

Mäuse am 10. Tag/ 0/5 2/4

Anzahl der behandelten Mäuse

Autopsie · Bei der Autopsie Die Nebenniere der

der Mäuse am toten Tiere war

10. Tag wurden überfüllt

keine (am 3· - 5. Tag). Veränder ungen
festgestellt

Eine 25-prozentige Lösung von Aabomycin-A in einem Lösungsmittelgemisch aus Methanol, Propylenglycol und Tween 20 wurde während einer Zeit von zwei Tagen zehnmal auf Mäuse desselben Stammes gestrichen. Es wurde keine Entzündung der Haut festgestellt. Die Toxizität in Fischen wurde an einem eierlegenden Zahnkarpfen geprüft. Dabei erwies sich das Antibiotikum selbst bei einer Konzentration von 1000 mg/l als vollkommen harmlos, nn&o^c/oa^L

Es sind keine Berichte vorhanden, wonach bekannte Antibiotika Eigenschaften haben, die mit den vorstehend angegebenen Eigenschaften vollständig übereinstimmen. Man nimmt an, daß die vorliegende Substanz ein neues Antibiotikum ist.

Das vorstehend beschriebene Aabomycin-A wird zum Gebrauch mit einem von verschiedenen Trägern vermischt, die aus Substanzen bestehen, durch die Aabomycin-A nicht zerstört wird. Der Träger kann fest oder flüssig sein. Seine Auswahl ist nicht auf bestimmte Stoffe eingeschränkt. Beispielsweise kann man Talkum, Ton, Kaolin, Kieselsäure, Bentonit und Kieselgur als feste Träger und organische lösungsmittel, wie Alkohole, Ester und Benzol und ihre Gemische als flüssige Träger verwenden. Zur Steigerung der Wirkung kann man allgemein bekannte Hilfsstoffe, wie Emulgatoren, Hyaluronidasen und Klebstoffe, wahlweise zusetzen.

Da Aabomycin-A in Wasser nur schwach löslich ist, wird es für die medizinische Verwendung in Olivenöl oder anderen pflanzlichen Ölen oder in einer winzigen Menge eines organischen Lösungsmittels aufgelöst, worauf diese lösung auf die für Insektionsfltissigkeiten gewünschte Konzentration verdünnt wird. Man kann das Antibiotikum auch mit Füllstoffen, wie Stärke und lactose, zu Pulvern oder Granulaten verarbeiten.

Beispiel 1

Ein flüssiger Nährboden aus 2 $> Glucose, 0,5 # Rindfleischextrakt, 0,5 i> Pepton und 0,5 ^ Natriumchlorid wurde in Kolben gegossen und mit Streptomyces sp. Nr. 325-17 geimpft. Die Kolben wurden dann zwei Tage lang unter Schütteln auf 26-27° gehalten. Auf diese Weise erhielt man eine ungebrütete Pilzflüssigkeit. In einen aus nichtrostendem Stahl bestehenden Gärbehälter mit einem Fassungsvermögen von 200 1 wurden 100 1 eines Nährbodens eingebracht, der 4 $> Glucose, 2,5 $> Sojabohnenkuchen, 0,4 $> getrocknete Bierhefe, 0,1 fe Rindfleischextrakt und 0,2 # Natriumchlorid enthielt« Der

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Nährboden wurde mit 1 1 der vorstehend angegebenen Pilzflüssigkeit geimpft. Die Züchtung erfolgte bei 26-27° C unter Belüftung, Nach einer Züchtung während eines Zeitraums von 96 'üagen erreichte die antifungale Wirksamkeit gegen Pirioularia oryzae ihr Maximum. Nach der Beendigung der Züchtung wurden der Kulturflüssigkeit 4 $ Kieselgur beigemischt, worauf die flüssigkeit filtriert und das Filtrat auf einen pH-Wert von 7»O eingestellt wurde. Das Filtrat wurde mit 50 1 Äthylacetat extrahiert und die Lösungsmittelschicht abgetrennt. Der nasse Pilzkuchen wurde mit 30 1 Aceton extrahiert, das abfiltriert wurde. Der Extrakt wurde im Vakuum auf 7 1 eingeengt. Diese lösung wurde auf einen pH-Wert von 7»0 eingestellt und mit demselben Volumen Äthylacetat extrahiert. Die Iiösungsmittelscliicht wurde mit der von dem Kulturfiltrat erhaltenen Lösungsmittelschicht vereinigt. Das Lösungsmittelgemisch v/urde im Vakuum zu einem Sirup verdampft. Dieser Sirup wurde in einem kleinen Volumen Chloroform aufgelöst. Eine Chromatographiekolonne wurde mit 500 g aktivierter Tonerde, die in Benzol suspendiert war, gefüllt. Auf diese Kolonne wurde die vorstehend angegebene Chloroformlösung aufgegeben. Die Kolonne wurde nacheinander mit Benzol und Chloroform und schließlich mit einem Lösungsraittelgemisch aue Äthylacetat und Methanol (10:1) eluiert. Der Effluent v/urde fraktioniert. Jede Fraktion wurde auf antifungale Wirksamkeit geprüft, wobei Piricularia oryzae als PrüfOrganismus verwendet wurde. Die eine starke Wirksamkeit besitzenden Fraktionen wurden vereinigt. Das Fraktionsgemiseh wurde im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde mit einem kleinen Volumen Chloroform extrahiert. Zu diesem Chloroformextrakt wurde tropfenweise Benzol zugesetzt. Der gebildete Niederschlag wurde gesammelt und in Methanol gelöst. Zu dieser Methanollösung wurde tropfenweise destilliertes Wasser zugesetzt, bis sich eine Trübung zeigte. Dann wurde das ganze Gemisch über Nacht in einem kalten Baum stehengelassen. Kristallnadeln aus Aabomycin-A wurden afcfiltriert, mit einem kleinen Volumen von kaltem destilliertem Wasser gewaschen und dann getrocknet. Man erhielt etwa 14 g Aabomycin-A-Kr!stalle.

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Beiapiel 2 (Hydratiertes Antibiotikum)

Aabomycin-Ä 2 Teile

Ionylphenol-poly(oxyäthylen- _{Λ ΦωΗ1ο} glycolether 10 M ⁴ leiie

Kieselgur 94 Teile

Die vorstehend angegebenen Substanzen werden homogen gemischt. Das Gemisch wird pulverisiert und mit Wasser verdünnt. Gewöhnlich spritzt man 100-180 1 prolG, a.

Beispiel 3 (Bmulgiertes Antibiotikum)

Aabomycin-A 2 Teile

NonylphenolpolyCoxyäthylen- . _φ ,, glycol)äther 10 M ⁴ ieiJ.e

Methanol 94 Teile

Die vorstehend angegebenen Substanzen werden gleichmäßig aufgelöst und mit Wasser verdünnt. Gewöhnlich spritzt man 100-180 1 pro 10 a.

Beispiel 4 (Pulverförmiges Antibiotikum)

Aabomycin-A 0,2 Teil

Ton 99,8 Teile

Die vorstehend angegebenen Substanzen werden homogen gemischt und pulverisiert. Gewöhnlich werden 3-4 kg pro 10 a verstäubt.

Beispiel 5

Reissamen (Oryza eativa, Stamm "Jukkoku") werden direkt in Töpfe (10 Pflanzen pro Topf) geaät« Die Prüflösung wird gespritzt, wenn 4-5 Blätter ausgetreten sind. NBch dem Trocknen der Prüflösung wird mit Piricularia oryzae geimpft, indem eine Suspension der Sporen dieses Organismus gespritzt wird. Die Sporen wurden durch Züchtung während eines Zeitraums von 7-10 Tagen bei 27° ß in einem Ε®1θεοη&1θη erhalten., der 3 g Eelsaohalen₉ 0,01 g Hef©@xtxⁱak1»pulve2?, 0,2 g Zucker, 0,05 g Stärke und 5 ml Wasser enthielt.

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Die Suspension wird in einer Impfkammer über die Pflanzen gespritzt. Danach läßt man die Pflanzen 24 Stunden lang in einem thermostatgeregelten Feuchtraum bei 25° C stehen. Anschließend werden die Töpfe in mit warmem Wasser gefüllte Bottiche eingebracht und mit einem Zelt aus Kunststoffolie abgedeckt. Nach 5-7 Tagen breitet sich die Blattfleckenkrankheit aus. Man zählt jetzt die Anzahl der Blattflecken pro Topf. Hit Hilfe dieser Zahl wird der Schutzwert berechnet und die Potenz der Prüflösung bestimmt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 8 angegeben.

^Anzahl der Flecken) (Anzahl der Flecken) \in dem J - (in dem )

Schut . _ yunbehandelten Feld) (behandelten Feld )

Anzahl der Flecken in dem unbehandelten Feld

Tabelle 8

Verwendeter Wirkstoff- Anzahl Schutz- Phyto-

Wirkstoff konzen- der wert toxizität

tration Flecken

(ppm)

1. Aabomycin-A 2 143,5 66

2. " 10 13,0 97

3. " 20 4,5 99

4. Blasticidin-S 10 21,0 95

5. " 20 8,5 98

6. Ohne 425,5

Beispiel 6

Unmittelbar nach dem Impfen der Keimlinge von Hicotiana tabaoum var. Xanthi mit dem groben TMV-Extrakt wurden die Keimlinge mit dem Antibiotikum gespritzt. Die in der Tabelle 9 angegebenen Ergebnisse deuten an, daß das Antibiotikum die Vermehrung des TMV in der Tabakpflanze schon bei Konzentrationen unter 100 ppm hemmte. Selbst bei einer Konzentration von 1000 ppm zeigte sich keine Phytotoxizität. Eine noch stärkere Hemmwirkung zeigte das Antibiotikum, wenn es zwei Tage vor dem Impfen auf die Prüfpflan zen gespritzt wurde. Daraus geht hervor, daß die Schutzwirkung stärker ist als die Heilwirkung. _ÄÄAAA(- j _{Λ Λ Λ} ι

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	Tabelle 9	24	der Impfung	72	1961764
	Zeit nach
Konzentration		52	48	75	(Stunden)
von	O	89		88
Aabomycin-A		95	74	97	96
(ppm)	15		92
1	öl		98	61
10	82			80
100			89

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196176 A

In der (Tabelle sind die erhaltenen Schutzwerte angegeben. Der Schutzwert ist gleich

(1 -

Titer des TMV-Gehalts der mit Aabomycin behandelten Keimlinge

Titer des TMV-Gehalts der unbehandelten Keimlinge

) 100

Beispiel 7

25 männliche weiße ieghornküken wurden nach dem Ausschlüpfen drei Wochen lang unter vollständiger Verhinderung einer Krankheitsinfektion aufgezogen und in. fünf Gruppen von je fünf Hühnern geteilt. Es wurde ein handelsübliches, vollkommen antibiotikumfreies Vollfutter für Küken verwendet. In diese Küken wurden der Miyadera-Stamm des Newcastlekrankheitsvirus in einer Menge von 10 EPU pro Küken intramuskulär sowie 0,1, 0,2, 0,3 bzw. 0,4 ml einer auf 10 ml verdünnten Lösung von 3 g Aabomycin-A in Olivenöl J.P. injiziert. Die Antibiotikumlösung wurde zwei Tage lang einmal täglich injiziert. Die Küken wurden nach der Injektion des Antibiotikums eine Woche lang täglich untersucht. Die Ergebnisse dieser Prüfung sind in der Tabelle 10 angegeben.

Tabelle 10

Gruppe	Injizierte Menge Aabomycin (mg/kg)	Anzahl der toten Küken/ Anzahl der behandelten Küken	Prozent satz der nach einer Woche noch lebenden Küken	Patho logischer Befund
1	30	1/5	80	Grünliche,durch fallartige Exkremente und nervöse Symptome bei den toten Küken
2	60	0/5	100	keine Veränderung
3	90	0/5	100	ai μ
4	120	0/5	100	it η
5	0	5/5	0	Grünliche, durohfallartige Exkremente und nervöse Symptome

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Claims (3)

Patentansprüche:

1. Heues, antibiotisch wirksames Aabomycin-A, gekennzeichnet durch

(a) die Molekularformel ^C39_4q^H65-67°11^N '

(b) eine spezifische Drehung fpcl ^ + 93,5°

(c) folgende Ultraviolettabsorptionsspektren: λ Jü »-H°l-Mett^°l . ₂₈₀ „, _(a1^ _1>67)

Sii n-

(d) eine positive Reaktion auf Kaliumpermanganat und positive lehlingsche und Molisch-sche Healction und

(e) eine negative Reaktion hinsichtlich der ITinhydrinreaktion, Biuretrealction,jSakaguchischen Reaktion, 2,4-Dinitropheny!hydrazin«Reaktion und Eisen(III)-Chlorid-Reaktion,

wobei das Aabomycin-A in Methanol, Äthanol, Aceton, A'thylacetat, Butylacetat, Chloroform und Äther löslich und in Wasser, Hexan und Petroläther nur schwer löslich oder unlöslich ist.

2. Verfahren zum Erzeugen eines neuen, antibiotisch wirksamen Aabomycins-A nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Nährboden, der eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und ein anorganisches Material enthält mit einem Stamm von Streptomyces sp. 325-17 (ATCC 21449) geimpft und bei einer Temperatur von etwa 25-32° C so lange gezüchtet wird, daß der Nährboden eine beträchtliche antibiotische Wirksamkeit besitzt, worauf dieses Antibiotikum von dem Nährboden abgetrennt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichneti daß die Züchtung durch eine aerobe Gärung im Submersverfahren erfolgt.

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