DE1231392B - Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums Takamycin - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. CL:

C12d

Deutsche Kl.: 30h-6

Nummer: 1231392

Aktenzeichen: C 26900IV a/30 h

Anmeldetag: 4. Mai 1962

Auslegetag: 29. Dezember 1966

Die Erfindung bezieht sich auf ein neues Antibiotikum Takamycin und ein Verfahren zu dessen Herstellung durch Züchtung von Streptomyces takataensis (ATCC 15959).

F i g. 1 zeigt das Ultraviolettabsorptionsspektrum ' des Takamycins in Methanol;

F i g. 2 zeigt das Infrarotabsorptionsspektrum (in Kaliumbromid);

F i g. 3 zeigt die Verteilungskurve des Takamycins nach der Gegenstromverteilungsmethode.

Beim erfindungsgemäß verwendeten Stamm Streptomyces takataensis handelt es sich um einen neuen Stamm, welcher aus einer Bodenprobe von Takataminami-cho, Toshima-ku, Tokyo, isoliert wurde und die folgenden Eigenschaften aufweist. (Die in Klammern gesetzten Zahlen stellen Farben gemäß »Iro no Hyojun« [Farbstandard], veröffentlicht von Nihon Shiksai-Sha, dar.) :

1. Czapeks Rohrzuckeragar und Stärkeagar:

Wirbel bilden sich, sekundäre Wirbel brachen in Sporen. Die Sporen sind kugelförmig, oval oder elliptisch. Keine Spiralen.

2. Czapeks Rohrzuckeragar (27° C):

Dünnes, sich ausbreitendes, gräulichweißes, baumwollartiges Wachstum. Oberirdisches Pilzgeflecht: Gräulichweiß (0-19,5-0). Kein lösliches Pigment.

3. Czapeks Rohrzuckerlösung (27⁰C):

Schwach weiße, kugelförmige Masse an den Wänden und auf dem Boden des Versuchsgefäßes. Kein lösliches Pigment.

4. Asparagin-Glukose-Agar (27⁰C):

Etwas geringer, mäßig erhöht, gräulich, gelblich, braunes (7-16-2,5) Wachstum, tief in den Boden eindringend. Oberirdisches Pilzgeflecht ist pulverförmig, gelblichgrau (8-19-1). Kein lösliches Pigment.

5. Herkömmlicher Agar (27°C): Halbwegs gutes Wachstum. Erhöht im Zentrum, Oberfläche ist gelblichbraun (7-15,5-3); die Rückseite ist hellgelb (7-18-4). Oberirdisches Pilzgeflecht: Gräulichweiß (0-19-0). Es wird ein gelbliches graues, lösliches Pigment gebildet.

6. Kalziummalatagar (27⁰C):

Schwach erhöhte Kolonie. Die Oberfläche ist helleifarben bis rübensamenfarben (8-17-3,5). Die Rückseite ist hellgelblichbraun (7-18-3). Oberirdisches Pilzgeflecht: Pulverförmig, hellgelb (8-18,5-2). Kein lösliches Pigment.

Verfahren zur Herstellung des neuen
Antibiotikums Takamycin

Anmelder:

Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha, Tokio

Vertreter:

Dipl.-Ing. R. H. Bahr und Dipl.-Phys. E. Betzier,

Patentanwälte, Herne, Freiligrathstr. 19

Als Erfinder benannt:
Kikuko Takemoto,
Hiroshi Oya,
Kazuo Iwata, Tokio

Beanspruchte Priorität:

Japan vom 4. Mai 1961 (15 410)

7. Stärkeagar (27⁰C):

Gutes Wachstum, gräulichweiß bis gelblichgrau (7-19-1), baumwollene, mehr minder feuchte Kolonie, im Zentrum etwas erhöht, klar olivengrau (8-18-1). Oberirdisches Pilzgeflecht: Kompakter als in anderen Böden. Kein lösliches Pigment. Verflüssigung: Gut.

8. Tyrosinagar (27° C):

Geringe, hellbraune (7-19-3) Kolonie. Oberirdisches Pilzgeflecht: Pulverförmig, gelblichgrau (7-19-1). Kein lösliches Pigment.

9. Kartoffelboden (27⁰C):

Reichliches Wachstum, gerunzelt, klar olivenfarben (8-16-3). Oberirdisches Pilzgeflecht: Weiß bis gelblichgrau (8-19-1). Kein lösliches Pigment.

10. Eiernährboden (27⁰C):

Reichliches Wachstum; schwach erhöht, gräulicholivenfarben (8-16-2). Der Rand der Kultur ist an der Schräge dunkelrötlichpurpur (23-13-5) bis bräunlichpurpur (23-13-2). Oberirdisches Pilzgeflecht: Weiß, lang. Es bildet sich ein olivengraues Pigment.

11. Eieralbuminagar(27°C):

Schlechtes Wachstum, tief eindringend. Kein lösliches Pigment.

609 749/380

12. Loefflers koaguliertes Serum (27°C):

Erhöhte, gräulich, gelblichgrüne (9-17-2) Kolonie. Oberirdisches Pilzgeflecht: Spärlich vorhanden. Es bildet sich ein dunkelbräunlichgraues Pigment. Der Boden wird flüssig.

13. Gelatinenährboden (23° C):
Verflüssigung: Schnell. Kein lösliches Pigment.

14. Milchnährboden (27°C):

Reaktion unverändert. Nicht koaguliert, nicht peptonisiert. Es wird ein braunes lösliches Pigment gebildet.

15. Nitrite werden in Spuren aus Nitraten gebildet.

16. Zellulose wird nicht gelöst.

17. Blutagar(27°C):

Gutes Wachstum; Hämolyse.

20

18. Assimilation von Kohlenstoff enthaltenden Ausgangssubstanzen (27° C):

Es wird ein basischer, Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat und Ammoniumsulfat und 1% ^eme Kohlenstoff liefernde Substanz enthaltender Agar- _a5 nährboden verwendet. Inosit, Mannit, Lactose, Rohrzucker sind gut verwendbar, 1-Arabinose, 1-Rhamnose, d-Raffinose und d-Xylose ergeben jedoch kein oder nur ein geringes Wachstum.

19. Ein merkliches Wachstum ist bei 27 bis 30° C zu beobachten.

20. Antagonistische Eigenschaften:

Bringen ein Antibiotikum hervor, und zwar Takamycin.

21. Verwandtschaftliche Beziehungen zu anderen Arten:

Beim Vergleich der morphologischen und biologischen Eigenschaften dieses Stammes Streptomyces takataensis nach Bergeys Handbuch zur bakteriologischen Bestimmung, 7. Ausgabe, mit anderen bekannten Arten zeigt sich, daß dieser hinsichtlich der Bildung des Sekundärwirbels ohne Spiralen dem Streptomyzet hachijoensis, Streptomyzet, Stamm 5658 (Manual of Takeda Laboratory, 13, S. 69, 1953) dem Streptomyzet Stamm 3724 (Journal of Nihon Agricultural Chemikal Society, 29, S. 644,1955), dem Streptomyzet Nr. 963 (japanische Patentschrift 13 897/60) und dem Streptomyzet ehimensis (japanische Patentschrift 8148/55) ähnlich ist. Jedoch unterscheidet sich der Stamm Streptomyces takataensis ■ von diesen anderen Arten in folgenden Punkten: Streptomyzet hachijoensis bildet kein Pigment. Die Unterschiede zwischen Streptomyzet Stamm 5658, Streptomyzet Stamm 3724, Streptomyzet Nr. 963 und Streptomyzet ehimensis und dem Stamm Streptomyces takataensis ergeben sich aus der Tabelle I bis IV. Der erfindungsgemäße Stamm ist somit als neuer Stamm anzusehen.

Tabelle I

Boden .	Nährboden Wachstum Pigment	Streptomyzet Stamm 5658	Tabelle II	reduziert	Stamm Streptomyces takataensis
Kartoffelboden . Wachstum	farblos schwach orange bis zimtfarben	Streptomyzet 3724 Stamm	farblos	gräulich schwarz schwarz bräunlich, grau
Eieralbuminboden Wachstum O. Pilzgeflecht	farblos	weiß gut	klar olivenfarben
Assimilation Rhamnose auf Kohlenstoffbasis	gut weiß	langsam schwarz	arm Eindringen in den Boden
	verwendbar	nicht verwendbar
Boden
Nitratreduktion	Stamm Streptomyces takataensis
Glukose Asparaginboden. Wachstum	sehr schwach
Eieralbuminboden Wachstum O. Pilzgeflecht	gräulich gelblich braun
Gelatineboden Verflüssigung	arm Eindringen in den Boden
schnell nicht herstellen

Tabelle III

Boden	Milchboden Kartoffelboden Gelatineboden	Streptomyzet NoI 963 Stamm	Stamm Streptomyces takataensis
schwache Koagulation Peptonisation saurer pH-Wert bräunlichpurpur (24 — 13 — 1) Pigment braunes Pigment	Koagulation keine Peptonisation Reaktion unverändert unlösliches Pigment unlösliches Pigment

	Milchboden Gelatineboden Kartoffelboden	Tabelle IV	Stamm Streptomyces takataensis
Boden	Streptomyzet ehimensis	koaguliert braunes Pigment schnelle Verflüssigung, unlösliches Pigment unlösliches Pigment
koaguliert in 3 bis 4 Tagen, peptonisiert, dann schwach gelblich Pigment wird gebildet sehr langsame Verflüssigung, dunkelbraunes, unlösliches Pigment wird gebildet gräulich schwarzes Pigment

Bei dem oben beschriebenen erfindungsgemäßen Stamm Streptomyces takataensis handelt es sich um einen neuen, bisher in der Literatur noch nicht beschriebenen Stamm. Dieser Stamm wurde als Stamm Streptomyces takataensis und dessen antibiotisches Produkt als Takamycin-Substanz bezeichnet.

Das antibiotische Takamycin wird durch Überimpfen eines Stammes Streptomyces takataensis auf einen geeignete Nährstoffe enthaltenden und zur Züchtung unter aeroben Bedingungen geeigneten Nährboden erhalten. Als Nährstoffe finden die bekannten, gewöhnlich zur Züchtung von Streptomyzet angewendeten Substanzen Verwendung. Als kohlenstoffhaltiges Ausgangsmaterial dienen z. B. Glyzerin, Stärke, Glukose, Rohrzucker usw. und als stickstoffhaltiges Ausgangsmaterial Sojabohnenmehl, Fleischextrakt, Pepton, Natriumnitrat, Ammoniumnitrat usw. Erforderlichenfalls werden Natriumchlorid, Phosphat und geringe Mengen verschiedener Metallionen zugesetzt. Oberflächenaktive Stoffe wie Tween 85 und Sojabohnenmehl können ebenfalls Verwendung finden. Die Züchtung im flüssigen Nährboden ist vorzuziehen, und insbesondere ist eine Tauchzüchtung von Vorteil. Die Züchtung erfolgt unter aeroben Bedingungen durch Belüftung mit sterilisierter Luft. Die optimale Temperatur liegt bei 27 bis 32° C. Die Ausbeute an Takamycin erreicht ihr Maximum bei einer aeroben Tauchgärung nach 4 bis 6 Tagen und in der aeroben Tankgärung nach 3 bis 5 Tagen. Die Extraktion und Reinigung des Takamycins vom Pilzgeflecht und des vom Pilzgeflecht befreiten Takamycins enthaltenden Kulturlösung wird nach bekannten mechanischen und chemischen Verfahren, wie Auflösung, Ausfällung, Filtration, Adsorbtion, Eluieren, Verteilung zwischen zwei flüssigen Phasen, durchgeführt. Diese Verfahren, welche gewöhnlich zur Abscheidung und Gewinnung von Produkten aus den Nährböden angewendet werden, können einzeln oder in Kombination und eventuell mehrmals zur Anwendung kommen.

Das erfindungsgemäße Takamycin stellt ein gelblich kristallines Pulver dar, welches leicht löslich ist in Pyridin, Dimethylformamid, Eisessig, kaum löslich in Äther, Chloroform, Petroläther usw. und mäßig löslich in Methanol, Äthanol, Azeton. Insbesondere nimmt die Löslichkeit desselben unter alkalischen Bedingungen zu, die Substanz löst sich fast nicht in Wasser oder angesäuertem Wasser, jedoch mäßig in alkalisch gemachtem Wasser.

Das Infrarotabsorptionsspektrum des Takamycins in Kaliumbromid unter Verwendung eines Natriumchloridprismas ist in F i g. 2 wiedergegeben. Das Ultraviolettabsorptionsspektrum in Alkohol (1 mg/ 100 ml Methanol) zeigt die aus F i g. 1 ersichtlichen Maxima bei 341, 360, 380 und 405 m. Die Gegenstromverteilung (Craig-Verteilung) des Takamycins mit dem Lösungsmittelgemisch Methanol—Chloroform—in wäßriger Natriumazetatlösung (2:2:1) ergibt die in F i g. 3 gezeigte Verteilungskurve. Die Verteilungskoeffizienten der Hauptbestandteile betragen 0,44 und 1,22. Das Takamycin zeigt bei der Analyse folgende Werte: C 60,48 bis 59,51 °/₀, H 7,93 bis 7,70% und N 3,05 bis 2,64 °/₀- Die Substanz enthält kein Halogen. Der genaue Zersetzungspunkt der Substanz kann nicht beobachtet werden, er liegt jedoch bei etwa 150° C.

Das Takamycin gibt folgende Farbreaktionen: Sie entfärbt Kaliumpermanganat und Bromwasser. Nach Zusatz von konzentrierter Schwefelsäure färbt sie sich blau wie purpur. Das Takamycin gibt eine negative Ninhydrin- und Nitrobenzaldehydreaktion und eine positive Carr-Price-, Benedikt-(grün), ToI-lens-(in der Hitze), Diazo-, Legal- und Fichtenspanreaktion. Dagegen sind ungewiß die Fehlingsche, Ehrlichsche und 2,4-Dinitrophenylhydrazin-(FaI-lungs)-Reaktion.

Bei der Elektrophorese bei einem Abstand von 30 cm und 300 V in einem Zeitraum von 4 Stunden mit einem Lösungsmittel, welches aus Methanol, Pyridin, Wasser (8:1:1) besteht, bewegt sich das in

der Mitte aufgebrachte Takamycin nach der Anode, wodurch sich die besagte Substanz als eine saure Substanz ausweist.

Die pK-Werte der Lösung dieser Substanz in 60 %igem Dimethylformamid, welche durch Titration gemessen werden, betragen 9,1 und 6,2, so daß angenommen werden kann, daß es sich um eine amorphe Verbindung handelt.

Das Takamycin ist vergleichsweise stabil in neutralem und schwach alkalischem Medium.

Die antimikrobiologische Wirksamkeit des Takamycins ergibt sich wie folgt:

Tabelle V

Die Antipilz- und Antiprotozoenwirksamkeit des Takamycins

Organismen

Staphylococcus aureus (S-a-1)

Escherichia coli (Es-19) '

Pseudomonas aeruginosa (Ps-I) ...

Proteus vulgaris (Pr-2)

Salmonella typhi (S-I)

Bacillus subsilis (B-s-1)

Candida albicans (C-a-1)

Cryptococcus neoformans (Cr-I) ..

Microsporum canis (Mi-6)

Trichophyton mentagrophytes (T-I) Epidermophyton floccosum (Ep-6) . .Äspergillus nidulana (As-sp-2) :...

-Nocardia estersides (N-I-I)

.Trichomonas vaginalis (Tr-I)

Trichomonas vaginalis (Tr-2)

Trichomonas vaginalis (Tr-5) ......

N. I. C. meg/ml

200

200

200

200

200

200 0,2 0,02 0,2 0,8 0,4 20 20 1 1 0,2

Ultraviolettabsorption des Takamycins und anderer ähnlicher Antibiotika

Antibiotikum

Candimycin* .
Trichomycin**
Askosin*** ..
Takamycin ...

Maximale Absorptionsbanden (m)

362, 382, 406

286, 246, 364, 384, 405

234, 288, 340, 357, 376, 398

343, 360, 380, 405

CF: M.I.C. = Die minimale hemmende Konzentration.

Nach den Angaben der Tabelle V besitzt das Takamycin eine starke Antipilz- und Antiprotozoenwirksamkeit. Die nach der Cup-Methode durchgeführte antimikrobiologische Untersuchung der Substanz zeigt, daß die Wirksamkeit in schwach alkalischem Medium größer ist als in saurem oder neutralem Medium.

Das erfindungsgemäße Takamycin ähnelt im antibakteriellen Spektrum, den physikalischen und chemischen Eigenschaften dem Askosin, Trichomycin und Candimycin. Sie unterscheidet sich jedoch nach den Angaben der Tabelle VI von diesen in der Lage der Maxima des Ultraviolettabsorptionsspektrums; d. h., das Takamycin ist von diesen drei Antibiotika klar unterschieden.

Tabelle VI

* Japanese Patent Publication Nor. 8148/55. ** Japanese Journal of Experimental Medicine, 22, S. 505,1952. *** USAi-Patentschrift 2 723 216.

Ferner unterscheidet sich das Takamycin vom Candimycin dadurch, daß letzteres in seiner antibakteriellen Wirksamkeit in saurem (pH 5,7) und neutralem Medium keinen Unterschied zeigt und 600 mal wirksamer gegen Candida als gegen Trichophyton ist. Die Substanz unterscheidet sich auch vom Askosin in der Farbreaktion. Askosin gibt eine negative Benedikt- und Tollensreaktion (Antibiotics and Chemotherapy, 2, S. 472, 1952). Askosin besitzt

ίο keine Antiprotozoenwirksamkeit. Weiterhin unterscheidet sich das Takamycin von Trichomycin in der Farbreaktion (Trichomycin gibt eine negative Benedikt- und Tollensreaktion): Japanese Journal of Experimental Medicine, 22, S. 505, 1958, und ebenso bei der experimentellen Trichophytoninfektion von Meerschweinchen. Die Ergebnisse dieser Versuche werden in Tabelle VII gezeigt. Das Takamycin besitzt Heilwirkung gegenüber experimentellen Infektionen durch Trichophyton bei Meerschweinchen.

20

Tier Es werden bei jeder Gruppe zehn Meerschweinchen verwendet.

Organismen

Trichophyton-Mentagraphytes, Τ-1-Stamm.

Arzneimittel

(1) Trichomycinsalbe in handelsüblicher Form
(150000 u/g, i.e., etwa 45 mg/g).

(2) Takamycin (hydrophile Vaselinbase),
50, 10 und 2 mg/g.

Tabelle VII

Wirksamkeit des Takamycins bei experimenteller
Infektion von Meerschweinchen

Trichomycin-Salbe ..
Takamycin (50 mg/g)
Takamycin (10 mg/g)
Takamycin (2 mg/g)

Zahl der
geheilten Tiere

3/10

10/10

9/10

6/10

Aus allen oben gemachten Angaben ist zu ersehen, daß das Takamycin ein neues Antibiotikum darstellt, welches sich von den anderen Antibiotika unterscheidet.

Die Erfindung wird im einzelnen durch folgende Beispiele beschrieben:

Beispiel I

Von dem Stamm Streptomyces takataensis, welcher bei 27°C 3 Tage lang gewachsen ist, werden je 3 ml in eine Sakaguchiflasche, welche 80 ml eines Nährbodens (0,5% Fleischextrakt, 1% Pepton, 0,3% Natriumnitrat, 1,5% Stärke, einreguliert auf pH 7; Gesamtmenge des Bodens 5 1) enthält, übergeimpft und unter Schütteln bei 27 bis 29° C gezüchtet (Amplitude: 70 mm, Umdrehungen: 110 Umdr./Min.). Die Ausbeute an Takamycin erreicht ihr Maximum nach 4 bis 5 Tagen. Der Nährboden wird filtriert. Man erhält 450 g Pilzgeflecht, dieses wird mit Wasser gewaschen, das im Pilzgeflecht enthaltene Takamycin mit etwa 11 Azeton bei 30 bis 40⁰C und dann mit alkalisch gehaltenem Azeton behandelt. Diese Extrakte

Claims (1)

1. 9 10

   werden gesammelt und bei 3O⁰C unter vermindertem nitrat, 0,2% Natriumchlorid, 0,1% getrocknete Hefe

   Druck konzentriert. Man erhält 2 g der rohen, gelb- und Tween 85 (Atlas Powder Co.) und ist auf einen

   liehen Substanz. pH-Wert von 0,7 eingestellt und sterilisiert. Die

   Das in der Mischung aus Kultur- und Wasch- Züchtung wird bei 27⁰C ausgeführt (Belüftung: flüssigkeit des Pilzgeflechtes enthaltene Takamycin 5 70 l/Sekunde; Rühren: 120 Umdr./Min.). Die Auswird an japanischen Säureton adsorbiert und mit beute an Takamycin erreicht nach etwa 75 Stunden einem Lösungsmittelgemisch aus Butanol, Pyridin und ihr Maximum. Dann werden dieselben Verfahrens-Wasser (4:3:7) gewaschen. Die Extraktionsflüssigkeit schritte wie bei Beispiel I vorgenommen. Es werden wird konzentriert, und man erhält 0,5 g Substanz, 0,45 g an reinem Takamycin pro 11 Nährboden erweiche mit der aus dem Pikgeflecht erhaltenen ver- io halten.

   mischt wird. Das Takamycin wird mit Äther oder Patentansoruch·

   Äthylazetat gewaschen und aus wässerigem Äthanol ^p

   umkristallisiert. Es werden 1,8 g gereinigtes Taka- Verwendung von Streptomyces takataensis ATCC

   myein erhalten. 15959 zur Herstellung des Antibiotikums Taka-

   BeisDielll ¹⁵ Win auf üblichem biologischem Wege unter

   aeroben Bedingungen, vorzugsweise unter sub-

   6 1 eines pflanzlichen Pilzgeflechtes vom Stamm mersen Bedingungen, gegebenenfalls Isolierung des

   Streptomyces takataensis werden auf 120 1 in einem Antibiotikums aus dem Fermentationsmedium und

   200-1-Tank befindlichen Kulturboden übergeimpft. gegebenenfalls Umwandlung des Antibiotikums in

   Der Kulturboden enthält 1,5% Stärke, 1,5% Glyzerin, 20 seine Salze unter Verwendung von Basen oder

   2,5% entfettetes Sojabohnenmehl, 0,5% Natrium- Säuren.

   Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

   609 749/380 12.66 © Bundesdruckerei Berlin