DE1961764C3 - Verfahren zur Gewinnung von antibiotisch wirksamem Aabomycin-A mit der Summenformel C tief 39-40 H tief 65-67 O tief 11 N - Google Patents

Description

Kurze Seitenzweige, die entlang von geraden oder

gewellten Zellfäden angeordnet sind und in geschlossenen Spiralen mit zwei oder mehr Windungen 35 enden. Die Sporophoren sind einzeln oder paarweise

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung längs des axialen Myceliums angeordnet. Es sind keine von antibiotisch wirksamem Aabomycin-A mit starker Anzeichen einer Bildung von echten quirlständigen antifungaler und antiviraler Wirksamkeit gegen Pilze, Zweigen vorhanden. Diie Spiralen haben im Durchz. B. Piricuraria oryzae (Blattfleckenkrankheit des schnitt einen Durchmesser von 3,5 μπι.
Reises) und Gloeosporium kaki (Anthracnose der 40 _.. , , , . . . , _. ...

Kakipflaume), und Viren, z.B. den Tabakmosaik- Zuchtungs- und physiologische E.genschaften

virus, den Newcastlekrankheitsvirus, den Herpes sim- Die Zuchtungs- und physiologischen Prüfungen

plex-Virus und den Parainfluenzavirus. werden bei 28⁰C durchgeführt und die Ergebnisse

Die Subspezies aabomyceticus Seino (Waksman nach 21 Tagen festgestellt, sofern nichts anderes an-

et H e η r i c i) des Pilzes Streptomyces sp. 325-17, der 45 gegeben ist.

zu der Art Streptomyces der Gattung Actinomycetes _.. ^ „ .. . , . .
gehörtund alsStreptomycsshydroscopLs (Jensen) ^Platte ™ 5*5! ΧΐAgaT *
bezeichnet wird, erzeugt in ihrer Kultur ein neuartiges (Czapek-Sucrose-Agar-Agar)
Antibiotikum, das eine antifungale und antivirale Wachstum: Gut, sich ausbreitend, 2ea (helle Wirksamkeit hat. Es ist gelungen, aus einer Kultur 50 Weizenfarbe; s. »Color Hormoney Manual«, 4. Aufl., dieser Subspezies einen reinkristallinen Wirkstoff zu Container Covpovat of America, Chicago, 1948). Luftisolieren, mycelium: Dünn, pulverförmig, fast weiß, in der

Aabomycin ist bei Pflanzen von bemerkenswerter Mitte 1 ea (hellgelb, s. 0.). Lösliches Pigment: Nicht

antiviraler Wirksamkeit. vorhanden.

Zur Behandlung der Blattfleckenkrankheit des 55 „, _, . ., „ , ₄ .
Reises wird nach dem Stand der Technik IBP ^Platte aus Glycennnitrat und Agar-Agar
(= s-Benzyl-diisopropyl-phosphor-thiolat) und EDDP (Czapek-Glycenn-Agar-Agar)
(= o-Äthyl-diphenyl-phosphor-dithiolat) angewandt; Wachstum: Gut, sich ausbreitend, 2fb (hellgelbe beide Stoffe bewirken jedoch im Reis einen unan- Lederfarbe, 86, s.o.). Luftmycelium: Dünn, pulvergenehmen Geruch. Blasticidin-S wird auch wegen 60 förmig, weiß, in der Mitte gelb. Lösliches Pigment: seiner antiviralen Wirkung verwendet, obwohl es Blaßgelb.

toxisch ist und beim Menschen Augenkrankheiten .,„. , , „, . . . .

verursacht. Kasugamycin, eine antivirale Substanz, Nährboden aus Glucose, Asparagin und Agar-Agar

die in Japan entdeckt wurde und dort erzeugt wird, Wachstum: Gut, sich ausbreitend, 2ea (helle

gelangt häufig auf dem Bauernhof zur Anwendung; 65 Weizenfarbe, s. o.). Luftmycelium: Reichlich vorihm wirken resistente Mikroorganismen entgegen. handen, pulverförmig 3 fe (silbergrau, s. o.) mit

Der als Streptomyces sp. 325-17 bezeichnete Stamm feuchten Flecken. Lösliches Pigment: Nicht vorhat die ATCC-Nummer 21 449 erhalten und ist bei der handen. Bemerkung: Hygroskopisch.

förmig, fast 5 fe (aschfarben, rötlichgraues Hellbraun, platte aus Asparagin, Dextrose und Agar-Agar 45 s. o.). Lösliches Pigment: 1 ca (limonengelb, s. o.)-

tu α ν η e s u a., J. Appl. Microbiol., 3; 361, [1955])
W hstum: Wie auf der Platte aus Glucose, Asparagin 5 ^{Platte aus} Hefeextrakt, Stärke und Agar-Agar

d Agar-Agar. Luftmycelium: Reichlich vorhanden,

"dverfönriig, 5 fe (aschfarben, helles rötlichgraues Wachstum: Reichlich, aufwärtsgerichtet, sich aus-

Braun 45. ^s· °·) ^{mit feucnten} schwarzen Flecken. breitend, 1 ga (hellgelb, s. o.), in der Mitte dunkel. Lösliches Pigment: Nicht vorhanden. Bemerkungen:
Hygroskopisch.

Platte

aus

Glycerin, Asparagin und Agar-Agar

HSP Kulturmedium stimmt mit dem Standart des »International Streptomyces Projekt? überein). Wachs-" Q_Utj sich ausbreitend, 2 ca (helle Elfenbeinfarbe, Haßeelb 89, s.o.). Luftmycelium: Dünn, pulverförmig i ba (gelb getönt, blaßgelb, 89, s. o.) bis 3 dd (naturfarben, s. o.). Lösliches Pigment: ganz schwaches Rosa.

Luftmycelium: Reichlich vorhanden, pulverförmig, 3 ig (beigebraun, graugelbes Braun, 80, s. o.). Lösliches Pigment: Hellgelb. (Die Platte bestand aus 2 g Hefeextrakt, 10 g löslicher Stärke, 15 g Agar-Agar, gelöst in 1000 ml Wasser, pH 7.0).

Nähr-Agar-Agar (Difco — Name des Herstellers — Bacto-Nährboden-Agar-Agar)

Platte aus Glycerin, Calciummaleat und Agar-Agar

Wachstum: Beschränkt, aufwärtsgerichtet, gut, 2 ic (helle Goldfarbe, s. o.). Luftmycelium: Reichlich, Dulverförmig, 1 ic (zitronengelb) bis 3 ig (beigebraun, eraugelbes Braun, 80, s. o.). Lösliches Pigment: Nicht vorhanden. Bemerkungen: Das Cakiummaleat ist teilweise aufgeschlossen.

Platte aus organischen Salzen, Stärke und Agar-Agar (ISP)

Wachstum: Mäßig, I¹^Ca (cremefarben, s.o.). Luftmycelium: Gut, dünn, pulverförmig, weiß. Lösliches Pigment: Nicht vorhanden.

In den Tabellen 1 und 2 sind die Ergebnisse von verschiedenen physiologischen Prüfungen des Stammes 325-17 angegeben.

Tabelle 1

30

Wachstum: Reichlich, sich ausbreitend, 1 la (limonengelb, s.o.). Luftmycelium: Reichlich, pulverförmig, 4Ii (biberfarben, bräunlichgrau, 64, s.o.). Lösliches Pigment: Hellgelb. Bemerkungen: Positive hydrolytische Wirksamkeit.

Platte aus Tyrosin und Agar-Agar (ISP)

Wachstum: Gut, aufwärtsgerichtet, 3 Ie (zimtfarben s 0) bis 4nl (dunkelbraun, s. o.). Luftmycelium: Reichlich vorhanden, pulverförmig, 4 Ii (biberfarben, bräunlichgrau, 64, s. o.). Lösliches Pigment: 3 Ie (zimtfarben, +5 s.o.). Bemerkungen: Die Tyrosinasereaktion ist zweifelhaft.

Platte aus Hefeextrakt, Malzextrakt und Agar-Agar

(ISP)

Wachstum: Reichlich, 1 ia (limonengelb s.o.) bis zu dunkleren Farben. Luftmycelium: Reichlich vorhanden, pulverförmig, 4 Ii (biberfarben, bräunlichgrau 64, s. o.). Lösliches Pigment: Hellgelb.

SS

Platte aus Hafermehl und Agar-Agar (ISP)

Wachstum: Gut, beschränkt, nicht aufwärtsgerichtet, IVtca (cremefarben, s.o.). Luftmycelium: Gut, pulverförmig, 4 Ii (biberfarben, bräunlichgrau, 64, s. 0.). Lösliches Pigment: Nicht vorhanden.

Platte aus Bennett-Agar-Agar

Wachstum: Aufwärtsgerichtet, gut, 1 ga (hellgelb, s.o.). Luftmycelium: Reichlich vorhanden, pulver-

	Nährboden	Befund
Melanin	Pepton, Eisen und	negativ
bildung	Agar-Agar (Difco)
	Melaninbildungs-	zweifelhaft
	Agar-Agar	(3 Ie, s. 0.)
	Tyrosin und Agar-	zweifelhaft
	Agar (ISP)
Tyrosinase	Tyrosin und Agar-	zweifelhaft
reaktion	Agar (ISP)
Xanthogenin-	Xanthogenin und	negativ
zersetzung	Agar-Agar
Schwefel	Pepton, Eisen und	negativ
wasserstoff	Agar-Agar (Difco)
bildung
Nitratreduk	Glucosenitrat-	negativ
tion	bouillon
	Nitratbouillon	negativ
	(Difco)
Gelatinever	20%ige Difco-	positiv
flüssigung	Bacto-Gelatine
Milch	10%ige Difco-	peptonisiert
verdauung	Magermilch
Serum	Difco-Löffler-	positiv
verflüssigung	Scrum- N ährboden
«x.iulolytische	Filterpapier und	wahrschein
Wirksamkeit	Czapek-Bouillon	lich
	ohne Kohlenstoff
	quelle
Temperatur bereich	Bennett-Agar-Agar	kein Wachs tum bei 5
		und 500C
S Sauerstoff	Glycerin-Nähr-	aerob
bedarf	bouillon unter
	CO,-Atmosphäre

Tabelle 2

Verwertung von Kohlehydraten durch den Stamm 325-17 in dem synthetischen Nährboden von P r i d tiam und Gettleib.

Kohlehydrat	Befund(»)	Kohlehydrat I Befundi')	-4-_|_	(*) + + stark positive Verwertung.
L-Arabinose	±	Sucrose	+ +	+ positive Verwertung.
D-Glucose		Treharose	—	± Verwertung zweifelhaft
D-Galactose	+ +	D-XyI öse		— negative Verwertung.
Glycerin	+ +	Aesculin
Lactose		Salicin	J- +
D-Lävulose	+ +	Inulin
D(+)-Mannose	+ +	Adonitol	-fj-
Maltose		Duldtol
D(-f )-MeIezitose	—	i-Inositol
Melibiose	+ +■	n-Mannitol
Raffinose	-f +	D-Sorbitol
Sorbose	—

—

Zum Züchten des Streptomyces sp. 325-17 zwecks Erzeugung von Aabomycin-A können übliche Verfahren zum Züchten von Actinomycetes oder deren Modifikationen angewendet werden. Für die technische Erzeugung ist es jedoch vorteilhaft, die Züchtung durch Rühren und Belüften in einem Gärbehälter vorzunehmen. Während des Züchtens soll die Temperatur auf etwa 25 bis 32°C gehalten werden. Als Nährböden können die für das Züchten von Actinomycetes üblichen Substanzen in beliebigen Kombinationen verwendet werden. Diese Substanzen umfassen beispielsweise verschiedene Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff, anorganischen Salzen, wachstumsfördernden Stoffen und schaumunterdrückenden Mitteln. Die 4<> Menge des erzeugten und angesammelten Aabomycins-A erreicht gewöhnlich nach einer Züchtungszeit von 2 bis 5 Tagen ein Maximum.

Die Extraktion von Aabomycin-A aus der vorstehend angegebenen Kultur und seine ReindarsteUung erfolgen unter Ausnutzung seiner physisch-chemischen Eigenschaften. Aabomycin-A ist vor allem in dem Kulturfiltrat, je nach dem Züchtungsverfahren aber auch in den Pilzstellen, in einer mehr oder minder beträchtlichen Menge enthalten. Aabomycin-A ist in Butylacetat und anderen organischen Lösungsmitteln löslich. Nach dem Mischen der Kultur mit diesen Lösungsmitteln tritt das Antibiotikum in das Lösungsmittel ein und wird dadurch extrahiert. In manchen Fällen kann man aus dem Kulturfiltrat Pilzzellen abfiltrieren und das Filtrat mit den vorstehend angegebenen Lösungsmitteln vermischen, so daß Aabomycin extrahiert wird. Die Pilzzellen können dann mit hydrophilen Lösungsmitteln, z. B. Aceton, extrahiert werden. Nach der Extraktion der Pilzzellen mit einem <>o hydrophilen Lösungsmittel wird dieses im Vakuum eingeengt und die eingeengte Lösung ebenso wie das Kullurfiltrat mit einem organischen Lösungsmittel, wie Butylacetat, extrahiert. Die auf diese Weise erhaltenen Extraktlösungen werden kombiniert und im $5 Vakuum verdampft. Man erhält ein sirupartiges Konzentrat, aus dem mit einem kleinen Volumen Chloroform Aabomycin-A extrahiert wird. Der Extrakt wird durch eine mit Tonerde gefüllte Chromatographiekolonne geführt." Eine wirksame Entwicklung wird durch aufeinanderfolgende Elutionen mit Benzol, Chloroform und einem Gemisch von Butylacetat und Methanol (10:1) durchgeführt. Der Eluent wird fraktioniert und auf seine antifungale Wirksamkeit überprüft, wobei als Prüfungsorganismus Piricularia oryzae verwendet wird. Es werden nur die wirksamen Fraktionen gesammelt. Die gesammelten Fraktionen werden vereinigt und zur Trockne verdampft. Der so erhaltene Rückstand wird in einer möglichst kleinen Menge Chloroform aufgelöst. Bei tropfenweiser Zugabe von Benzol fallen grobe Kristalle aus Aabomycin-A aus. Diese Kristalle werden gesammelt und zu farblosen Nadeln umkristallisiert. Zum Umkristallisieren wird ein Lösungsmittelgemisch aus Benzol und Chloroform, Äthylacetat und Hexan oder Methanol und Wasser empfohlen.

Die Untersuchung der Kultur durch Papierchromatographie und Bioautographie ergibt den Nachweis von mindestens zwei oder mehr antifungalen Substanzen außer Aabomycin-A, doch ist der Gehalt an diesen Substanzen deutlich kleiner als der an Aabomycin-A und ihre Eigenschaften sind noch nicht bestimmt worden.

Aabomycin-A hat folgende Eigenschaften:

(1) Farbiose Kristallnadeln, Schmelzpunkt 144 bis 145° C.

(2) Elementaranalyse (%) für C3_e-4₀H,₅__e7O_nN:

Berechnet .... C 64,71, H 9,05, N 1,93 oder
C 65,10, H 9,15, N 1,89;

gefunden .... C 63,67, H 9,17, N 1,95.

(3) Molekulargewicht 723, 918 bis 737, 944

(Die Bestimmung nach dem Dampfdruckgleichgewichtsverfahren ergab einen Wert von 770).

(4) Spezifische optische Drehung: [x]f + 93,5° (c = 1, CHCl₃).

(5) Löslichkeit: Leicht löslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Äthylacetat, Butylacetat, Chloroform und Äther, etwas löslich in Ammoniakwasser, Benzol und Tetrachlorkohlenstoff, schwer löslich odsr unlöslich in Wasser, Hexan und Petroläther.

(6) Infrarotabsorptionsspektrum: Gemäß F i g. 1 (in Chloroformlösung).

(7) Ultraviolettäbsorptionsspektrum: Gemäß F i g. 2 ist in einer neutralen Methanollösung oder in einer Lösung von 0,1 η-Salzsäure und Methanol das Absorptionsmaximum bei 280 nm (££„ 1,67), und gemäß F i g. 3 ist das Absorptionsmaximum in einer Lösung von 0,1 n-Natriumhydroxyd bei 273 nm (Ei?. 65,0) vorhanden.

(8) Farbreaktionen: Positive Reaktion bei Kaliumpermanganat sowie positive Fehlingsche und Molischsche Reaktion. Bei der Behandlung mit Schwefelsäure auf einer dünnen Schicht aus Kieselgel erhält man die charakteristische Violettfärbung. Die Ninhydrin-Reaktion, die Biuretreaktion, die Sakaguchische Reaktion, die Reaktion von 2,4-Dinitrophenylhydrazin und die Reaktion von Eisen(III)-chlorid sind alle negativ.

(9) Temperaturbeständigkeit: Aabomycin-A wurde in Gemischen von Methanol und Wasser (1:1) aufgelöst, die auf verschiedene pH-Werte eingestellt und 24 Stunden stehen gelassen wurden. In keiner der Lösungen wurde die antifungale Wirksamkeit herabgesetzt. Dieselben Proben wurden 5 Minuten lang auf 100⁰C erhitzt. Bei einem pH-Wert der Lösung von 7

bis 9 wurde die antifungale Wirksamkeit fast nicht herabgesetzt, während sie bei einem pH-Wert von 2 bis 4 fast vollständig verschwand.

(10) Beständigkeit gegenüber Ultraviolettstrahlen: Bei einer Bestrahlung des Antibiotikums mit einer UV-Lampe aus einer Entfernung von 45 cm wurde die antifungale Wirksamkeit selbst bei einer Dauerbestrahlung von einer Woche nicht herabgesetzt.

(11) Chromatogramme: Nachstehend sind die Ri-Werte angegeben, die bei verschiedenen chromatographischen Verfahren erhalten wurden. Das zur Entwicklung verwendete Lösungsmittel ist in Klammern angegeben: Papierchromatographie: 0 (Benzol), 0 (Chloroform), 0,80 (Äthylacetat), 0,10 (Äthylacetat-Benzol 1: 1), 0 (Chloroform-Benzol 1:1), 0,23 (Benzol-Äthylacetat 1 : 2). Dünnschicht-Chromomatorgraphic über Kieselgel: 0 (Benzol), 0 (Chloroform), 0,82 (Äthylacetat), 0,35 (Äthylacetat-Benzol 1: 1), 0 (Chloroform-Benzol 1:1), 0,47 (Benzol-Äthylacetat 1: 2), 0,10 (Benzol-Äthylacetat 2:1).

(12) Elektrophorese: Unter Verwendung von Dextrangel als Träger wurde 30 Minuten lang eine Elektrophorese bei 10 mA durchgeführt. Bei Verwendung einer Phosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,0 wurde keine Beweglichkeit von Ionen festgestellt. Bei Verwendung einer Ammoniak-Ammoniumchlorid-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 10,5 wurde eine schwache Bewegung zu der Anode hin festgestellt.

(13) (A) Ein nach der Agar-Agar-Verdünnungs-Methode ermitteltes, antifungales Spektrum ist in der Tabelle 3 angegeben.

Tabelle 3

	Kleinste	Blasticidin- S
Prüforganismus	Hemmkonzentration ug/ml	5
	Aabomycin- Λ	>100
Piricularia oryzae	0.001	50
Cochliobolus miyabeanus	3.0	50
Gloesporium lacticolor	10,0	—
Gloesporium kaki	1.0	>100
Pellicularie filamentosa	10,0	100
Glommerella cingulata	>100	>100
Cladosporium fulvnm	100	—
Macrosporium batapicola	10,0	—
Trichophyton asteroides	1,5	—
Trichophyton rubrum	0,8	>100
Trichophyton mentagro- phytes Candida albicans 57	1.5	50
Staphylococcus aureus	12,0
FDA 209 P	>100	—
Pseudomonas aeruginosa		—
Mycobacterium smegmatis	>100
ATCC 607	>100	50
Escherichia coli NTHJ		—
Xanthomonas oryzae	>100	—
Snigella dysenteriae	>100
>100

von zwei Wochen alten Keimlingen von Phaseolus vulgaria L., Pinto, wurden für die Prüfung auf örtliche krankhafte Veränderungen verwendet. Für die Scheibenanalyse (disc-assay) wurden Blattscheiben von Nicotiana tabacum L. var. Blight yellow verwendet.

Blattscheiben wurden unmittelbar vor dem Impfen auf verschiedenen Konzentrationen des Antibiotikums in 40-mm-Petrischalen schwimmen gelassen und dabei ίο bei 25° mit Fluoreszenzlicht von 3000 Lux bestrahlt. Aus der Tabelle 4 geht hervor, daß die Vermehrung des TMV in den Scheiben merklich gehemmt wurde, wenn die Konzentration des Antibiotikums 1 g/ml übertraf.

Tabelle 4

35

Materialien	Konzen tration g/ml	Schutz- wert(*) %	Phyto- toxizität(**)
Aabomycin A BIasticidin S	100,0 10,0 1,0 0,01 0.005 0,001	99.8 87,0 82,0 86,0 87,0 82,0	I ++ I I I

(*) Schutzwert ---■

Virustiter (mit Antibiotikum behandeltes Blatt

Virustiter (nicht mit Antibiotikum behandeltes Blatt)/

(*·) — keine Phytotoxizität,
± 1-5%,
+ 5-10%.

(B) Antivirale Wirksamkeit:

B-I Antivirale Wirksamkeit gegen den TMV.

Vier Wochen alte Keimlinge von Nicotiana tabacum var. Xanthi wurden als Prüfpflanzen und die Koleoptile Die Ergebnisse in Tabelle 4 lassen erkennen, daß

*o Blasticidin-S bei niedrigerer Konzentration als Aabomycin wirksam ist. Die Tabelle zeigt aber auch, daß Blasticidin-S stark phytotoxisch wirkt und bei einer Konzentration über 0,005 μg/ml, die einem Schutzwert von 87% entspricht, nicht eingesetzt werden kann. Das bedeutet, daß der höchste Schutzwert 87% beträgt und über 87% bei einem Einsatz auf dem Acker nicht erhöht werden kann. Im Gegensatz hierzu kann Aabomycin, weit es nicht toxisch ist, bei einer Konzentration oberhalb von 100,0 μg/ml, die einem Schutzwert über 99,8%,, d. h. nahe oder genau 100% Schutzwert, entspricht, verwendet werden. Daher gewährleistet Aabomycin einen Schutzwert von 100% ohne Phytotoxizität, diese Eigenschaft muß aber in allen Pflanzenschutzmitteln gegeben sein. Anders ausgedrückt: Pflanzenschutzmittel sollen 100%ige Wirksamkeit auf dem Bauernhof beweisen; bringen die Mittel diese Wirksamkeit nicht, dann sind sie für die Praxis wertlos. So gesehen ist Aabomycin dem Blasticidin-S überlegen.

B-2 Antivirale Wirksamkeit gegen NDV und HSV.

1. Die antivirale Wirksamkeit von Aabomycin-A wurde mit Hilfe von Agar-Agar-DifTusionsplatten untersucht. Dabei wurden der Newcastle-Krankheitsvirus als Virus vom RNS-Typus und der Herpessimplex-Virus als Virus vom DNS-Typus verwendet. Das Ergebnis ist in der Tabelle 5 dargestellt. Bei

509 649/127

dieser Untersuchung wurde der Newcastle-Krankheitsvirus oder der Herpes-simplex-Virus zum Impfen der ineinanderwachsenden Einschichtkultur von Kükenembryofibroblast in Petrischalen verwendet. Die Kulturen wurden mit weichem Agar-Agar-Nä'nrboden bedeckt. Nach dem Erhärten des Agar-Agars wurde dieses mit Papierscheiben von 8 mm Durchmesser bedeckt, die mit 0,02 ml der Antibiotikumlösung getränkt waren. Es wurden die Durchmesser der cytotoxischen Zone (CTZ) und der antiviralen Zone (AVZ) gemessen.

Tabelle 5

Konzenttation	Newcastle-	AVZ	Herpes-simplex-	CTZ	AVZ
des Anti	krankheitsvirus	(mm)	Viius	(mm)	(mm)
biotikums		18,0		15,2	22,5
	CTZ	16,3	14,5	20,7
fcg/ml)	(mm)	16,8	13,7	17,5
50 000	14,7	16,3		17,0
25 000	13,4	16,8		17,1
12 500	10,1	15,5		16,4
6 250	—	16,5		16,0
3 125	—	15,9		16,5
1 562	—	15,2		15,4
781		16,3	—	15,8
390	—	15,1	—	15,7
195		13,7		12,9
98	—	12,8		13,6
49	—	—	—	±
24
12	—
6	—

2. Die antivirale Wirksamkeit von Aabomycin-A wurde an bebrüteten Eiern geprüft. Die Ergebnisse dieser Prüfung sind in der Tabelle 6 angegeben. 12 Tage alte embryonierte Eier wurden mit dem Newcastle-Krankheitsvirus in einer Menge von 10⁵PFU (Zahl der Viren oder Wachstumsgrad der Viren) pro Ei geimpft. Gleichzeitig wurde Aabomycin-A zugeführt. Die Eier wurden zwei Tage lang bei 39° C gehalten. Danach wurde die Chorioallantoisflüssigkeit gesammelt und ihre Hämagglutinationseinheit, worunter die maximale Verdünnung der Antigene, die noch eine vollständige Aggregation der Erythrocyten hervorrufen, zu verstehen ist, gemessen.

Tabelle 6

Konzen	Wachstum	Hämag-	Hemmungs
tration des	des Küken	glutinations-	zahl
Anti	embryos	Einheit
biotikums			(%)
(μβ/ΕΪ)	normal	10	100
40	normal	10	100
20	normal	10	100
10	normal	10	100
5	normal	20 bis 400	80 bis 99
1	normal	20 bis 1600	0 bis 99
0,8	normal	1800 bis 3200
Kontroll
versuch

Zur Untersuchung der Wirkung von Aabomycin-A auf das Wachsen des Embryos wurde das Wachsen der Kükenembryos mit dem Wachsen von nichtinfizierten und unbehandelten Kontrollembryos verglichen. Aus der Tabelle 6 geht hervor, daß das Antibiotikum in dieser Hinsicht wirkungslos war. In dieser Prüfung wurden für jede Konzentration des Antibiotikums 10 Eier verwendet.

Das Antibiotikum hat keine antibakterielle Wirkung ίο gegen grammpositive und grammnegative Bakterien.

(14) Toxizitätsprüfung

Zur Prüfung seiner akuten Toxizität wurde Aabomycin-A weiblichen Mäusen vom ddN-Stamm intraperitoneal injiziert. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 7 angegeben.

Tabelle 7

	Lösungsmittel	40	Konzentration des Antibiotikums	100	ioy0ige	500
			(mg/kg)	Äthanollösung	Olivenöl
25	3o Anzahl der toten	0/5
Mäuse am		2/4
10. Tag/
Anzahl der be
handelten
35 Mäuse
Autopsie	Bei der Autopsie
	der Mäuse am	Nebenniere-
	10. Tag wurden	Engorg-
	kein Verände	ment wurde
rungen fest	beobachtet
gestellt	(am 3. bis
5. Tag)

Eine 25prozentige Lösung von Aabomycin-A in

einem Lösungsmittelgemisch aus Methanol, Propylenglycol und Tween 20 wurde während einer Zeit von 2 Tagen zehnmal auf Mäuse desselben Stammes gestrichen. Es wurde keine Entzündung der Haut festgestellt. Die Toxizität in Fischen wurde an einem Reis-

fisch während der Eiablagerung geprüft. Dabei erwies sich das Antibiotikum selbst bei einer Konzentration von 1000 mg/1 als vollkommen harmlos.

Die LD₅₀ für die Maus wurde mit 500 mg/kg Aabomycin-A bei peroraler Anwendung bestimmt

gegenüber 2,82 mg/kg Blasticidin-S bei intravenöser Anwendung und 53,3 mg/kg Blasticidin-S-Benzylaminosulfonat bei oraler Anwendung. Das Ministerium für öffentliche Gesundheit in Japan stuft Blasticidin-S als Sub-Toxikant (starkes Gift, stark-

wirkendes Arzneimittel) ein.

Es sind keine Berichte vorhanden, wonach bekannte Antibiotika Eigenschaften haben, die mit den vorstehend angegebenen Eigenschaften vollständig übereinstimmen. Man nimmt an, daß die vorliegende

Substanz ein neues Antibiotikum ist.

Aabomycin kann von den bekannten Antibiotika als verschieden angesehen werden; dies zeigt die folgende Tabelle:

	11	Formel	Smpkt. °C	19 61	764	Löslichkeit	r	12	Literatur
		C11H67NO11 (schwach sauer)	144 bis 145 (farblose Nadeln)			unlöslich in Wasser
	C 63,06 bis 63,70% H 8,78 bis 8,39% N 1,21 bis 1,34% O Rest	75 (Zersetz.) hell gelb	Tabelle 7a	in Wasser kaum lös lich, lösl. in Äthylalko hol und Aceton		Antibiotische Wirkung gegen	DT-PS 12 49 456
	C40H65NO14 (basisch)	132 bis 134 (farblos)		in Wasser kaum lös lich	Maximale UV-Ab- sorplion	Pilze	Arzneimittel- Forschung 12, 1191-5,(1962)
Aabo- mycin-A	C40H69NO14	130 bis 133	-1-93,5" (c = 1, CHCl3)		275 ιημ (NaOH- MeOH)	G.ampositive Bakterien, Pilze, Hefe	DT-OS 14 92 035 Chem. Abstr. 66 54 258 W, (1967)
Gantok- mycin	C40H67NO15 (basisch)	207 bis 210	0- minus 13 (C=], Pyridin)			Grampositive Bakterien, Mycobacte- rium	J. Antibiotics 174-187, (1970)
Nidda- mycin	C36H53NO13	150;(Zers.) (farblos oder hellgelb)	-43" (C= 1, Methanol)	in Wasser kaum lös lich	279 ιτιμ (Methanol)	Grampositive und gram nega tive Bakterien	Chem. Abstr. C 73 51Oj. 1968
Josamycin	C47H81NO18 C46H79NO17.	120 bis 123	-70° (c=l, Äthylalk.)		232 ιτιμ (Methanol)	Grampositive und gramnegative Cakterien	Chem. Abstr. 68 22 205 b, 1968; J. Anti biotics Ser. A. 20, 234-5, 196'
Josa- mycin-S	C45H77NO16	135 bis 137	-58,5° (c = 1, (Methanol)		234 ιτιμ (365) (Methanol)	Pilze, Hefe, Amöben
N-Acetyl- do-deca lucenso- ' mycin	C 58,30% H 8,90% N 3.94%	144 (farblose Tafeln)	+49,8° (HCl, Methanol, +296° Pyridin)	unlöslich in Wasser	290, 305, 317, 220, 290, 305, 319		DT-OS 14 67 757
Leuko- mycin A3 Leuko- mycin A5	C40H50N3O1,	Cl 145 (farblose Nadeln)	-52°				The Journal ο Antibiotics XXlIl, 388-39 1970
Leuko- mycin A6	C27H45NO8 (basisch)	122 bis 124; 145 bis 148 (Solvat) (Farb loser Kristall)	-56°	in Wasser kaum lös lich		Pilze, Hefe	J. Antibiotics XXIl, 61-64, 1969 J. Antibiotics XVI, 59-66, 1963
Compia- mycin		+ 14,4° (c = 4,15, Methanol)		Grampositive Bakterien
Hodyda- mycin		237 263 249	Grampositive und gramnega tive Bakterien
Cirra- mycin A	-20" (c=l, CHCl3)	240 (268) (Äthyl alkohol)

ii ·φ5£Γ& Ii

Forlsetzung Tabelle 7a

0 ¹⁴

	Forme!	Smpkt. "C	-61	Löslichkeit	Maximale UV-Ah- sorption	Antibiotische Wirkung gegen	Lilciatur
Cirra-	C36H511NO12	228 bis 229	(c ---■ 1,	in Wasser	240	Gra in positive	US-PS
mycin B	(basisch)		CHCI3)	kaum lös	(Äthyl	und gramnega	31 59 540
				lich	alkohol)	tive Bakte
			-67			rien
Antibio	C41H67NO15	155 bis 156	(c - 1.	unlöslich	232	Grampositive	J. Antibiotics
tikum		(farblose	Äthanol)	in Wasser	(325)	Bakterien	XXIV, 476-482
SF 837		Nadeln)			(Äthyl		1971
				alkohol)

Aabomycin-A wird zum Gebrauch mit einem von verschiedenen Trägern vermischt, die aus Substanzen bestellen, durch die Aabomycin-A nicht zerstört wird. Der Träger kann fest oder flüssig sein. Seine Auswahl ist nicht auf bestimmte Stoffe eingeschränkt. Beispielsweise kann man Talkum, Ton, Kaolin. Kieselsäure, Bentonil und Kieselgur als feste Träger und organische Lösungsmittel, wie Alkohole, Ester und Benzol und ihre Gemische als flüssige Träger verwenden. Zur Steigerung der Wirkung kann man allgemein bekannte Hilfsstoffe. wie Emulgatoren, llyaluronidasen und Klebstoffe, wahlweise zusetzen.

Da Aabomycin-A in Wasser nur schwach löslich ist. wird es für die medizinische Verwendung in Olivenöl oder anderen pflanzlichen Ölen oder in einer winzigen Menge eines organischen Lösungsmittels aufgelöst, worauf diese Lösung auf die für lnjekiionsflüssigkeitcn gewünschte Konzentration verdünnt wird. Man kann das Antibiotikum auch mit Füllstoffen, wie Stärke und 1 actose, 7ii Pulvern oder Granulaten verarbeiten.

Beispiel 1

Ein flüssiger Nährboden aus 2% Glucose, 0.5% Rindfleischcxtrakt, 0,5% Pepton und 0.5% Natriumchlorid wurde in Kolben gegossen und mit Streptomyc"s sp. Nr. 325-17 geimpft. Die Kolben wurden dann 2 Tage lang unter Schütteln auf 26 bis 27° gehalten. Auf diese Weise erhielt man eine ungebrütete Pilzflüssigkeit. In einen aus nichtrostendem Stahl bestehenden Gärbehälter mit einem Fassungsvermögen von 200 1 wurden 100 1 eines Nährbodens eingebracht, der 4%, Glucose, 2,5% Sojabohnenkuchen. 0.4% getrocknete Bierhefe, 0,1 % Rindfleischextrakt und 0.2^% Natriumchlorid enthielt. Der Nährboden wurde mit 1 1 der vorstehend angegebenen Pilzflüssigkeit geimpft. Die Züchtung erfolgte bei 26 bis 27"C unter Belüftung. Nach einer Züchtung während eines Zeitraums von 96 Tagen erreichte die antifungale Wirksamkeit gegen Piricularia oryzae ihr Maximum. Nach der Beendigung der Züchtung wurden der Kulturflüssigkeit 4% Kieselgur beigemischt, worauf die Flüssigkeit filtriert und das Filtrat auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt wurde. Das Filtrat wurde mit 501 Äthylacetat extrahiert und die Lösungsmittelschicht abgetrennt. Der nasse Pilzkuchen wurde mit 301 Aceton extrahiert, das abfiltriert wurde. Der Fxtrakt wurde im Vakuum auf 7 1 eingeengt. Diese Lösung wurde auf einen pH-Wert von 7.0 eingestellt und mit demselben Volumen Äthylacetat extrahiert. Die Lösungsmittelschicht wurde mit der von dem Kulturfillrat erhaltenen Lösungsmittelschicht vereinigt. Das Lösungsmittelgemisch wurde im Vakuum zu einem Sirup verdampft. Dieser Sirup wurde in einem kleinen Volumen Chloroform aufgelöst. Eine Chromatographiekolonne wurde mit 500 g aktivierter Tonerde, die in Benzol suspendiert war. gefüllt. Auf diese Kolonne wurde die vorstehend angegebene Chloroformlösung aufgegeben. Die Kolonne wurde nacheinander mit Benzol und Chloroform und schließlich mit einem Lösungsmittelgemisch aus Äthylacetat und Methanol (10:1) eluiert. Der Eluent wurde fraktioniert. Jede Fraktion wurde auf antif'.mgalc Wirksamkeit geprüft, wobei Piricularia oryzae als Prüforganismus verwendet wurde. Die eine starke Wirksamkeit besitzenden Fraktionen wurden vereinigt. Das Fraktionsgemisch wurde im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde mit einem kleinen Volumen Chloroform extrahiert. Zu diesem Chloroformextrakt wurde tropfenweise Benzo! zugesetzt. Der gebildete Niederschlag wurde gesammelt und in Methanol gelöst. Zu dieser Methanollösung wurde tropfenweise destilliertes Wasser zugesetzt, bis sich eine Trübung zeigte. Dann wurde das ganze Gemisch über Nacht in einem kalten Raum stehengelassen. Kristallnadeln aus Aabomycin-A wurden abfiltriert, mit einem kleinen Volumen von kaltem destilliertem Wasser gewaschen und dann getiocknet. Man erhielt etwa 14 g Aabomycin-A-Kristalle.

Beispiel 2
(Hydratisiertes Antibiotikum, benetzbar, pulverförmig!

Aabomycin-A 2 Teile

Nonylphenol-poly(oxyäthylenglycol)-

äther 4 Teile

Kieselgur 94 Teile

Die vorstehend angegebenen Substanzen werder homogen gemischt. Das Gemisch wird pulverisiert und mit Wasser verdünnt. Gewöhnlich spritzt mar 100 bis 1801 pro a.

B e i s ρ i e 1 3

(Emulgiertes Antibiotikum)

Aabomycin-A 2 Teilt

Nonylphenolpoly(oxäthylenglycol)-

äther 4 Teil«

Methanol 94 Teil«

Die vorstehend angegebenen Substanzen werder gleichmäßig aufgelöst und mit Wasser verdünnt. Ge wohnlich spritzt man 100 bis 1801 pro TOa.

Beispiel 4 (Pulverförmiges Antibiotikum)

A.abomycin-A 0,2 Teile

Ton 99,8 Teile

Die vorstehend angegebenen Substanzen werden homogen gemischt und pulverisiert. Gewöhnlich werden 3 bis 4 kg pro 10 a verstäubt.

Beispiel 5

Reissamen (Oryza sativa. Stamm »Jukkoku«) werden direkt in Töpfe (10 Pflanzen pro Topf) gesät. Die Prüflösung wird gespritzt, wenn 4 bis 5 Blätter ausgetreten sind. Nach dem Trocknen der Prüflösung wird mit Pirivularia oryzae geimpft, indem eine Suspension der Sporen dieses Organismus gespritzt ⁰I

wird. Die Sporen wurden durch Züchtung während eines Zeitraums von 7 bis 10 Tagen bei 27 ⁰C in einem Reisschalen-Nährboden erhalten, der 3 g Reisschalen, 0,01 g Hefeextraktpulver, 0,2 g Zucker, 0,05 g Stärke und 5 ml Wasser enthielt.

Die Suspension wird in einer Impf kammer über die Pflanzen gespritzt. Danach läßt man die Pflanzen 24 Stunden lang in einem thermostatgeregelten Feuchtraum bei 25°C stehen. Anschließend werden die

ίο Töpfe in mit warmem Wasser gefüllte Bottiche eingebracht und mit einem Zelt aus Kunststoffolie abgedeckt. Nach 5 bis 7 Tagen breitet sich die Blattfleckenkrankheit aus. Man zählt jetzt die Anzahl der Blattflecken pro Topf. Mit Hilfe dieser Zahl wird der Schutzwert berechnet und die Potenz der Prüflösung bestimmt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 8 angegeben.

Schutzwert =

J Anzahl der Flecken in Ί J Anzahl der Flecken Ί

1 dem unbehandelten Feld ] \ in dem behandelten Feld J

Anzahl der Flecken in dem unbehandelten Feld

100

Tabelle 8	Verwendeter Wirkstoff	Wirkstoff- Konzen tration	Anzahl der Flecken	Schutz wert	Phytoxi- zität
	(ppm)		(%)
1. Aabomycin	2	143,5	66
2. Aabomycin	10	13,0	97
3. Aabomycin	20	4,5	99
4. Blasti-
cidin-S	2	105,0	30
5. Blasti-
cidin-S	10	21,0	95
6. Blasti-
cidin-S	20	8,5	98
7. Ohne		425,5

hemmte. Selbst bei einer Konzentration von 1000 ppm zeigte sich keine Phytotoxizität. Eine noch stärkere Hemmwirkung zeigte das Antibiotikum, wenn es zwei Tage vor dem Impfen auf die Prüfpflanzen gespritzt wurde. Daraus geht hervor, daß die Schutzwirkung stärker ist als die Heilwirkung. 30

Aus der Tabelle 8 ist ersichtlich, daß für einen Schutzwert über 97% und für eine Fleckenzahl unter 13,0 Aabomycin das Blasticidin-S übertrifft.

Beispiel 6

Unmittelbar nach dem Impfen der Keimlinge von Nicotiana tabacum var. Xanthi mit einer Suspension von TMV in biologischer Salzlösung wurden die Keimlinge mit dem Antibiotikum gespritzt. Die in der Tabelle 9 angegebenen Ergebnisse deuten an, daß das Antibiotikum die Vermehrung des TMV in der Tabakpflanze schon bei Konzentrationen unter 100 ppm

	Aabo-	40	Blasti	Tabelle	Konzen tration	9	24	48	72	96
	mycin-A..	cidin-S ..	(ppm)
35					52	74	75	61
1		89	92	88	80
10	Zeit nach der Impfung (Stunden)	95	98	97	89
100	O
		56	82	31	—
0,01	15	50	74	31	—
0,001	61
82
—
—

Tabelle 9 zeigt, daß die Konzentration von Blasticidin-S bis 0,001 % betragen soll, wenn eine sichere Anwendung gewünscht wird. Die Zeit nach der Impfung kann daher nicht über 74 Stunden hinaus verlängert werden; mit Aabomycin dagegen erreicht man mit Sicherheit 98 Stunden und mehr, wenn es in einer Konzentration von 100 ppm oder darüber angewandt wird.

In der Tabelle sind die erhaltenen Schutzwerte angegeben. Der Schutzwert ist gleich

Titer des TMV-Gehalts der mit Aabomycin behandelten Keimlinge Titer des TMV-Gehalts der unbehandelten Keimlinge

100

Beispiel 7

60

25 männliche weiße Leghornküken wurden nach dem Ausschlüpfen 3 Wochen lang unter vollständiger Verhinderung einer Krankheitsinfektion aufgezogen und in fünf Gruppen von je fünf Hühnern geteilt. Es wurde ein handelsübliches, vollkommen antibiotikumfrcics Vollfutlcr für Küken verwendet. In diese Küken wurden der Mivadera-Stamm des Ncwcastlc-Krankheitsvirus in einer Menge von 10⁴ PFU (Zahl der Viren bzw. Wachstumsgrad der Viren) pro Küken intramuskulär sowie 0,1, 0,2, 0,3 bzw. 0,4 ml einer auf 10 ml verdünnten Lösung von 3 g Aabomycin-A in Olivenöl 1. P. injiziert. Die Antibiotikumlösung wurde 2 Tage lang einmal täglich injiziert. Die Küken wurden nach der Injektion des Antibiotikums eine Woche lang täglich untersucht. Die Ergebnisse dieser Prüfung sind in der Tabelle 10 angegeben.

Gruppe

17

Tabelle 10

Injizierte Menge Aabomycin in

(mg/kg)

30

60

90

120

Anzahl der toten Küken/

Anzahl der behandelten Küken

1/5

0/5

0/5 0/5

5/5

Prozentsatz der

nach einer Woche

noch lebenden Küken

80

100

100

100

Pathologischer Befund

Grünliche, durchfallartige Extreme und nervöse Symptome, Küken kurz vor dem Tod

keine Veränderung

keine Veränderung

keine Veränderung

Grünliche, durchfallartige Extreme und nervöse Symptome kurz vor dem Tod

Claims (2)

ATCC ohne Einschränkung für die Öffentlichkeit zuPatentansprüche: gänglich. Dieser Stamm ist seit dem 20. November 1969 für die Abgabe an die Öffentlichkeit freigegeben.

1. Verfahren zur Gewinnung eines neuen, anti- Die Eigenschaften des im Rahmen der Erfindung biotischen, Aabcmycin-A genannten Wirkstoffes S verwendeten Pilzes Streptomyces sp. 325-17 sind nachin Form von farblosen Nadeln mit der Summen- stehend angegeben. Auf Grund dieser Eigenschaften formel C₃₉-WH₄₅-J₇O₁₁N, entsprechend folgenden wird der Pilz 325-17 als ein Pilzstamm der Art Strepto-Analysenwerten: C: 63,67%, H: 9,17% und myces der Gattung Actinomycetes angesehen.

,^{N: 11}I⁹⁵^uST ^S.^pezifis _c ^cli^en ?^rehu"^g *^: +J\⁵-° Mikromorphologie

(c = 1, CHCl₃), einem Schmelzpunkt von 144 bis io

145°C und folgenden Ultraviolettabsorptionen: In-flüssigen Medien, z. B. Glucose-Nährböden, zer

fällt das vegetative Mycelium nicht in kokken- oder

aWn-HO-Methanoi _{= 2}80 ππι (£!* 1,67) bazillenähnliche Teile. Einige Nährböden, z. B. aus

χο,ι n-NaOH-MeUunoi _ οτλ nm (F¹* 65 01 anorganischen Salzen, Stärke und Agar, Agar, oder

""« ^l '" ' ^h 15 aus Hefeextrakt, Malzextrakt und Agar-Agar oder

dadurch gekennzeichnet, daß man aus Bennet-Agar-Agar oder aus Hefeextrakt, Stärke einen üblichen Nährboden, der eine Kohlenstoff- und Agar-Agar eignen sich gut für die Beobachtung . quelle, eine S tickst off quelle und ein anorganisches der Mikromorphologie dieses Stammes.
Material enthält, mit einem Stamm von Strepto- _ fElektronenmikrojn-amm)

myces sp. 325-17 (ATCC 21449) beimpft und bei ao ^bP^oren imeMronenmuaogrammj

einer Temperatur von etwa 25 bis 32°C bebrütet, . Nichtsegmentiert, bedeckt mit einem kapselartigea anschließend das Antibiotikum entweder von dem Häutchen, ziemlich unregelmäßig ornamentierte Ober-Nährboden abtrennt, das Filtrat nach Einstellen fläche, warzenähnlich bis grobstachelig. Aus dem auf einen pH-Wert von etwa 7 oder das Mycel Kohlenrepligramm und dem durch Abtasten erhaltenen selbst mit einem organischen Lösungsmittel extra- 35 Elektronenmikrogramm geht hervor, daß die Oberhiert, den Extrakt einengt und anschließend auf fläche sehr runzelig ist und die Sporen eine ähnliche übliche Weise aufarbeitet. Morphologie haben wie die Sporen vom Typus I von

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- S. hygroscopicus (D i e t ζ u. a., J. Appl. Microbiol. zeichnet, daß die Züchtung durch eine Gärung 10, [1962] 258—263).

im Submersverfahren erfolgt. 30 Sporophoren