DE19530333C2

DE19530333C2 - Amplifikation von Pilzzellen-DNA sowie Verfahren zum Nachweisen von Pilzzellen in klinischem Material

Info

Publication number: DE19530333C2
Application number: DE19530333A
Authority: DE
Inventors: Hermann Dr Einsele
Original assignee: Eberhard Karls Universitaet Tuebingen
Current assignee: Myconostica Ltd
Priority date: 1995-08-17
Filing date: 1995-08-17
Publication date: 1997-08-28
Anticipated expiration: 2015-08-18
Also published as: US5722464A; DE19530333A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein ein Verfahren zum Nachweisen und Identifizieren von Pilzzellen in klinischem Material.

Derartige Verfahren sind z. B. in den Veröffentlichungen "De tection of various fungal pathogenes in blood samples" von Einsele et al. in: EBMT 1995, Vol. 15, Suppl. 2, März 1995, Abstract Book, Abstract 432, S. 103 und "Rapid, polymerase chain reaction-based identification assays for Candida species" von Niesters et al. (1993), Journal of Clinical Microbiology, Seiten 904-910, beschrieben.

Aus der Veröffentlichung von Einsele et al. ist es bekannt, ein DNA-Segment eines Pilz-Genes mittels des Polymerase-Ketten reaktion-Verfahrens zu amplifizieren, um eine Vielzahl von Pilz- Pathogenen im Blut zu identifizieren. Durch zusätzliche Hybri disierung mit speziesspezifischen Oligonukleotiden konnten ferner verschiedene Pilzspezies voneinander unterschieden werden.

In dieser Publikation wird allerdings nicht offenbart, wie das Verfahren genau durchgeführt werden soll, und es werden keine Sequenzen für spezifische Primer oder Hybridisierungssonden angegeben.

Weitere, aus der Praxis bekannte Verfahren beruhen standardmäßig auf einer Anzüchtung von Pilzspezies aus klinischem Material auf entsprechenden Nährmedien.

Durch diese Anzüchtung z. B. in Petrischalen und den Nachweis anhand der gewachsenen oder auch nicht gewachsenen Kolonien sind die Nachweisgeschwindigkeit sowie -empfindlichkeit insbe sondere wegen des langsamen Wachstumes der Pilzspezies stark beeinträchtigt. Die Diagnose der invasiven Pilzinfektion wird daher häufig erst durch eine äußerst komplikationsträchtige Biopsie eines Organes oder sogar erst nach dem Tod des Patienten gestellt.

Das Interesse an Verfahren zum Nachweisen von Pilzzellen ist vor dem Hintergrund zu sehen, daß insbesondere in den letzten Jahren Pilzspezies als bedeutende nosokomiale Pathogene eine erhebliche Bedeutung für immunsupprimierte Patienten erlangt haben. Vor allem nach Knochenmarkstransplantationen (KMT), aber auch nach Leber-, Nieren-, Pankreas-, Herz- und Herz-Lungen- Transplantationen haben invasive Pilzinfektionen erheblich zugenommen. So ist es z. B. im Jahr 1994 vor allem in französi schen KMT-Zentren zu einer solchen Häufung vor allem von Aspergillusinfektionen gekommen, daß diese Zentren mehrere Monate geschlossen werden mußten.

Neben den organtransplantierten Patienten sind aber auch Patienten mit Krebserkrankung, vor allem nach Chemotherapie oder chirurgischen Eingriffen, Verbrennungspatienten sowie Patienten auf chirurgischen und neonatalen Intensivstationen zunehmend von invasiven Pilzinfektionen betroffen. Sobald es bei diesen Patientenkollektiven zu einer Beteiligung eines Organsystemes oder gar mehrerer Organsysteme kommt, beträgt die Sterblichkeit an dieser infektiösen Komplikation zwischen 80 und 100%.

Nur durch eine frühzeitige Diagnose kann hier der Behandlungs erfolg verbessert werden. Wegen der mit den eingangs erwähnten Standardnachweisverfahren verbundenen Nachteile werden intensive Bemühungen unternommen, eine frühzeitige Sicherung der Diagnose einer systemischen Pilzinfektion zu ermöglichen.

Neue, auf molekularbiologischen Verfahren beruhende Techniken haben zwar bei einer Reihe von anderen Erregern bereits eine sensitivere Diagnostik und damit teilweise auch ein frühzeitigeres Erkennen und Behandeln der Infektionserkrankungen ermöglicht, bei Pilzinfektionen war dies bisher jedoch noch nicht möglich.

Die wesentlichen Probleme des Nachweises von Pilzinfektionen mit Hilfe molekularbiologischer Techniken sind dabei auf die sehr komplexe Zusammensetzung der Pilzzellenwand zurückzuführen, die bisher zeitaufwendige aber auch teure Extraktionsverfahren erforderlich machen.

Ein weiteres Problem besteht darin, daß eine zunehmende Zahl von Pilzspezies bei den immunsupprimierten Patienten bedrohliche Infektionen auslösen kann, woraus die Notwendigkeit resultiert, eine Fülle von verschiedenen Pilzgattungen und -stämmen bei diesen Patienten erfassen und bestimmen zu müssen. Da sich die Therapie der Infektionen bei verschiedenen Pilzspezies nämlich unterscheidet, ist es folglich erforderlich, nicht nur alle Pilzspezies erfassen, sondern diese auch differenzieren und identifizieren zu können.

Bei dem aus der eingangs genannten Veröffentlichung von Niesters et al. bekannten Verfahren wird zunächst das gesamte 18ssu rRNA- Gen von 1800 bp amplifiziert, danach werden spezifische kleinere Bereiche von 130-180 bp daraus reamplifiziert und durch verschie dene Techniken analysiert.

Dieses Verfahren hat den Nachteil, daß zwei Polymerase-Ketten reaktionen nacheinander durchgeführt werden müssen. Nach der ersten Polymerase-Kettenreaktion muß das Amplifikat, das gesamte 18ssu rRNA Gen, gereinigt werden, um danach die zweite Poly merase-Kettenreaktion durchführen zu können. Diese Schritte machen das Verfahren zeit- und kostenintensiv und erhöhen die Anzahl an möglichen Fehlerquellen.

Vor diesem Hintergrund ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, PCR-Primer für ein Verfahren von der in der Veröffentlichung von Einsele et al. beschriebenen Art bereitzustellen, um eine frühzeitige und zuverlässige Diagnose einer Pilzinfektion zu ermöglichen. Ferner soll das bekannte Verfahren entsprechend weitergebildet werden. Das Verfahren soll möglichst viele Pilzspezies erfassen und in einer Weiterbildung auch identi fizieren können.

Der Nachweis der Pilzspezies soll dabei insbesondere schnell und so einfach durchzuführen sein, daß sie auch im Klinikalltag und ggf. von angelerntem Personal durchgeführt werden kann.

Diese Aufgabe wird durch die Nucleotidsequenzen SEQ ID-No: 1 und SEQ ID-No: 2 aus dem beiliegenden Sequenzprotokoll gelöst.

Sie wird außerdem durch die Verwendung dieser beiden Nucleotid sequenzen als Primer zur Amplifikation eines Abschnitts aus dem Pilz-Gen für die 18ssu rRNA von einer Vielzahl von Pilz spezies in der Polymerase-Kettenreaktion gelöst.

Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird hierdurch vollkommen gelöst. Der Erfinder der vorliegenden Anmeldung hat nämlich überraschenderweise gefunden, daß diese beiden Nucleotid sequenzen als Primer für die verschiedensten Pilzspezies verwendbar sind, die im Klinikalltag relevant sind. Durch Verwendung dieser beiden Primer in der PCR-Reaktion werden Verstärkungsprodukte erzeugt, die eine Länge von ca. 500 Basenpaaren haben und somit auch leicht weiterzuverarbeiten sind, da sie z. B. leicht über Gelelektrophorese nachgewiesen werden können. Auf diese Weise ergibt sich also ein identisches Nachweisverfahren für alle pathogenen Pilzspezies, da gefunden wurde, daß die beiden Primersequenzen an die verschiedene Pilz- DNA binden.

Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird außerdem durch ein Verfahren der eingangs genannten Art mit den Schritten:

1. Extrahieren von Pilz-DNA aus Vollblut; und
2. Durchführung einer Polymerase-Kettenreaktion mit der extrahierten Pilz-DNA unter Verwendung von spezifischen Primern und ggf. Nachweis der Amplifikationsprodukte

gelöst, in dem im zweiten Schritt als Primer die Nucleotidsequen zen SEQ ID-No: 1 und SEQ ID-No: 2 aus dem beiliegenden Sequenzprotokoll verwendet werden.

Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird auch auf diese Weise vollkommen gelöst. Durch den Zugriff auf die Pilz-DNA selbst wird nämlich ein Verfahren geschaffen, das bei hoher Sensitivität über den Nachweis von pilzspezifischer DNA den sehr frühen Nachweis von Pilzinfektionen ermöglicht. Weil der Nachweis mit einer einzigen PCR-Reaktion durchgeführt werden kann, ist das Verfahren hoch empfindlich und schnell durchzu führen, so daß gegenüber dem bekannten Verfahren bezüglich der Geschwindigkeit große Vorteile erzielt werden. Dabei ist darauf zu achten, daß die Freisetzung und Reinigung der Pilz-DNA nicht nur rasch, sondern auch nahezu vollständig und relativ rein erfolgen muß, um eine hohe Sensitivität zu gewährleisten und eine schnelle Diagnose zu ermöglichen.

Bei diesem Verfahren ist von Vorteil, daß auf einfache und inzwischen etablierte Weise DNA in ausreichender Menge erzeugt werden kann, die dann leicht nachzuweisen, aber auch weiter verwendet werden kann, um die betreffenden Pilzspezies zu identifizieren.

Darüber hinaus ist es bevorzugt, wenn das neue Verfahren für eine Vielzahl von Pilzspezies sensitiv ist, wobei mit möglichst wenigen Verfahrensschritten die Pilzspezies auch identifiziert werden.

Dies wird bei dem obengenannten neuen Verfahren durch den folgenden Verfahrensschritt erreicht:

3. Bestimmen der Pilzspezies aus den Amplifikationsprodukten.

Der Erfinder der vorliegenden Anmeldung hat nämlich erkannt, daß das 18ssu rRNA-Gen bei den verschiedenen Pilz-Stämmen und -Gattungen ein derartiges Sequenzsegment aufweist, das einerseits von zwei Bindungsregionen für Primer flankiert wird, die für alle Pilz-Stämme und -Gattungen identisch sind, daß aber andererseits die Sequenz dieses Segmentes für die verschiedenen Pilz-Stämme und -Gattungen so verschieden ist, daß sie zum Nachweis der einzelnen Pilzspezies und -Gattungen verwenden werden kann.

Dieses Verfahren hat den Vorteil, daß die Diagnose der spezi fischen Pilzinfektion auf der DNA-Ebene sehr rasch durchzuführen ist und eine hohe Spezifität aufweist.

Die nachzuweisende Pilz-DNA wird dabei im Schritt 1) vorteil hafterweise so extrahiert bzw. isoliert, wie es in der zeitgleich eingereichten, parallelen deutschen Patentanmeldung DE 195 30 332.6 mit dem Titel "Extraktion von Pilzzellen-DNA" beschrieben ist. Es ist jedoch auch möglich, die Pilz-DNA z. B. durch geeignete Dichtegradienten-Zentrifugation, spezifische Fällungsschritte mit DNA-Sonden etc. zu gewinnen.

In all diesen Fällen ist der Nachweis wünschenswert, ob in der nun vorliegenden Ausgangslösung für die weitere Verwendung auch tatsächlich Pilz-DNA enthalten ist.

Die Pilz-DNA wird zwar vorteilhaft zum Zwecke der Diagnostik von Pilzinfektionen herangezogen, sie kann jedoch auch ander weitig weiterverarbeitet werden. Die Pilz-DNA kann dafür über Agarplatten oder aus dem Blut von Tieren gewonnen werden, die speziell mit den interessierenden Pilzspezies infiziert wurden. Aus der so gewonnenen Pilz-DNA können z. B. DNA-Sonden heraus geschnitten werden, die für Nachweisreaktionen verwendet oder in Plasmide eingebaut werden können. Es sind dabei Anwendungen im ganzen Bereich der Grundlagenforschung, Diagnostik, Therapeutik, industriellen Gentechnologie etc. denkbar.

Durch den neuen Nachweisschritt sollen dabei in einem einzigen Verfahren möglichst viele verschiedene Pilzspezies auch bei sehr geringer Konzentration in der Ausgangslösung erfaßt werden können, so daß z. B. im Rahmen der Diagnostik sehr schnell und sehr frühzeitig eine Aussage möglich ist, ob überhaupt eine Pilzinfektion vorliegt.

In der Polymerase-Kettenreaktion in Schritt 2) können auch geringe Mengen einer isolierten DNA zunächst hochverstärkt und dann nachgewiesen werden. Dieses Verfahren ist hochspezifisch und sehr sensitiv, so daß es die gewünschten Eigenschaften für Diagnostik, Therapeutik, industrielle Gentechnologie etc. mit sich bringt. Darüber hinaus ist dieses Verfahren auch ggf. von angelerntem Personal durchzuführen.

Dabei ist es bevorzugt, wenn die Reaktion mit folgendem Zyklus durchgeführt wird:

a1) Denaturieren für 0,3-1 min, vorzugsweise für 0,5 min bei 90-96°C, vorzugsweise bei 94°C;
a2) Hybridisieren für 0,5-1,5 min, vorzugsweise für 1,0 min bei 58-64°C, vorzugsweise bei 62°C, und
a3) Extension für 1,5-2,5 min, vorzugsweise für 2,0 min bei 68-75°C, vorzugsweise bei 72°C.

Dabei ist es besonders bevorzugt, wenn vor Beginn der Zyklus schritte ein Denaturierungsschritt von 5-9 min, vorzugsweise von 3 min bei 90-96°C, vorzugsweise bei 94°C erfolgt.

Es wurde gefunden, daß mit den obigen Bedingungen die PCR- Reaktion sehr reproduzierbar und vor allem hochspezifisch abläuft, so daß sichergestellt ist, daß die Amplifikations produkte auch tatsächlich Segmente der ursprünglichen Pilz-DNA sind.

Weiter ist es vorteilhaft, wenn im Schritt 2) die Amplifikations produkte gelelektrophoretisch, vorzugsweise auf einem Agarosegel, nachgewiesen werden und dazu vorzugsweise mit Ethidiumbromid angefärbt werden.

Hier wird ein bekanntes und gut etabliertes Nachweisverfahren verwendet, um aufzeigen zu können, daß bei der PCR-Reaktion tatsächlich Amplifikationsprodukte entstanden sind, die auf eine Pilzinfektion hinweisen.

Die Erfindung betrifft ferner einen Kit zum Nachweisen von Pilzzellen in klinischem Material durch Extraktion von Pilz-DNA aus Vollblut und Durchführung einer Polymerase-Kettenreaktion mit der extrahierten Pilz-DNA unter Verwendung von spezifischen Primern, wobei als Primer die Nucleotidsequenzen SEQ ID-No: 1 und SEQ ID-No: 2 aus dem Sequenzprotokoll enthalten sind.

Bei einem derartigen Kit ist von Vorteil, daß nicht nur die spezifischen Primer, sondern auch sämtliche erforderlichen Lösungen zusammengestellt werden können, so daß der Kit für Routineverfahren geeignet ist. So ist es zum Beispiel im Laboralltag möglich, auf diese neuen Kits zurückzugreifen, um in vorliegenden Untersuchungslösungen Pilzspezies überhaupt nachweisen zu können. Ferner kann dieser Kit dazu verwendet werden, bestimmte Segmente der nachgewiesenen Pilzspezies hochzuverstärken, die dann bspw. für weitere Identifizierungsver fahren verwendet werden können.

Die Ausgestaltung und Weiterbildung des ersten Verfahrens schrittes ist Gegenstand der oben erwähnten parallelen Anmeldung DE 195 30 332.6. Bei den einzelnen Schritten des dort beschrie benen neuen Verfahrens waren viele Probleme zu überwinden, die sich zum Teil aus der Zusammensetzung der Pilzzellenwand und aus der Tatsache ergaben, daß ein Großteil der Pilzzellen sich nicht im Vollblut frei in Lösung sondern nach Phagozytose in verschiedenen Blutzellpopulationen befindet, vor allem in Granulozyten und Makrophagen.

Gemäß dieser Anmeldung ist es bevorzugt, wenn der Schritt des Extrahierens von Pilz-DNA aus Vollblut die Schritte umfaßt:

- Isolation überwiegend intakter Pilzzellen aus dem Vollblut, vorzugsweise durch
- - Aufschließen der im Vollblut befindlichen Blutzellen; und
- - Trennung überwiegend intakter Pilzzellen vor allem von zellulärer DNA; und
- Extraktion von DNA aus den isolierten Pilzzellen, vorzugs weise durch
- - Aufschließen der isolierten Pilzzellen; und
- - Isolation der Pilz-DNA.

Dabei ist es insbesondere bevorzugt, wenn folgende Schritte durchgeführt werden:

- Lysis der roten Blutkörperchen durch osmotische Hämolyse;
- enzymatisches Aufschließen der weißen Blutkörperchen;
- Zentrifugation des so behandelten Vollblutes und Verwendung des Pellet in den nächsten Verfahrensschritten;
- alkalisches Lysieren der Pilzzellen, Neutralisation der Lösung und Zymolyase-Behandlung; und
- Präzipitation der Pilz-DNA.

Die Weiterbildung und Ausgestaltung des dritten Verfahrens schrittes, nämlich des Bestimmens der Pilzspezies, ist Gegenstand der zeitgleich eingereichten, parallelen deutschen Patentan meldung DE 195 30 336.9 mit dem Titel "Sequentielle Hybridi sierung von Pilzzellen-DNA".

Bezüglich der Bestimmung der spezifischen Pilzspezies aus der nachgewiesenen Pilz-DNA ist es gemäß dieser Anmeldung bevorzugt, wenn für die jeweilige Pilzspezies kennzeichnende Sequenz abschnitte bestimmt werden. Dies kann entweder durch zumindest teilweises Sequenzieren der Amplifikationsprodukte, durch Untersuchung des Schmelzverhaltens der erzeugten Doppelstränge oder auf andere Weise erfolgen.

Besonders bevorzugt ist es jedoch, wenn die Bestimmung der Sequenzabschnitte durch sequentielles Hybridisieren des Amplicons mit für die jeweiligen Pilzspezies spezifischen DNA-Sonden erfolgt, wobei der Nachweis der erfolgten Hybridisierung dann zur Identifizierung der Pilzspezies führt. Die DNA-Sonden sind für verschiedene Pilzstämme und -Spezies im Sequenzprotokoll als SEQ ID-No: 3 bis SEQ ID-No: 8 angegeben.

Weitere Vorteile ergeben sich aus der nachstehenden Beschreibung.

Es versteht sich, daß die vorstehend genannten und die nach stehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in den jeweils angegebenen Kombinationen, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.

Beispiele für die Durchführung der einzelnen Verfahrensschritte sowie die Anwendung des Verfahrens im Rahmen eines klinischen Untersuchungsprogrammes sind in der folgenden Beschreibung angegeben.

Ein besonderer Vorteil des neuen Verfahrens liegt darin, daß es mit Vollblut durchgeführt wird, daß also z. B. keine Biopsie erforderlich ist oder noch herzustellendes Serum verwendet wird. Mit dem Vollblut wird zunächst eine Trennung der Pilzzellen von zellulärer DNA vorgenommen. Dies ist erforderlich, damit die ggf. nur in geringer Menge vorliegende Pilz-DNA nicht vor dem Hintergrund der in sehr viel höherer Konzentration vorhan denen zellulären DNA nachgewiesen werden muß. Dadurch wird also die Spezifität des Nachweisverfahrens erhöht. Zu diesem Zweck werden als erstes die roten Blutkörperchen durch osmotische Hämolyse lysiert und dann die weisen Blutkörperchen enzymatisch aufgeschlossen. Diese beiden Verfahrensschritte sind so aus gewählt, daß durch sie die Pilzzellen selbst noch nicht beschädigt werden und daß ggf. phagozytierte Pilzzellen unbeschädigt wieder freigesetzt werden, so daß auch sie für den weiteren Nachweis zur Verfügung stehen.

Beispiel 1: Lysis roter Blutkörperchen durch osmotische Hämolyse

Die Lyse der roten Blutkörperchen erfolgt mit Hilfe einer hypotonen Lösung. Dazu wird folgender Puffer mit folgenden Endkonzentrationen verwendet:

Tris pH 7,6\|10 mM
MgCl₂	5 mM
NaCl	10 mM.

Die Lösung wird für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert, und danach zentrifugiert.

Für diesen ersten Schritt ist eine Menge von 3 ml Vollblut ausreichend.

Beispiel 2: Enzymatisches Aufschließen weißer Blutkörperchen

Die weißen Blutkörperchen, die ggf. Pilzzellen enthalten, werden vorsichtig aufgebrochen, indem die Zellen mit Proteinase K (200 µg/ml) der Firma Böhringer, Mannheim in folgendem Puffer mit den angegebenen Endkonzentrationen enzymatisch angedaut werden, in dem das Pellet aus Beispiel 1 aufgenommen wird:

Tris pH 7,6\|10 mM
EDTA pH 8,0	10 mM
NaCl	50 mM
SDS	0,2%
Proteinase K	200 µg/ml.

Dieser Puffer wird für zwei Stunden bei 65°C inkubiert.

Beispiel 3: Trennung überwiegend intakter Pilzzellen vor allem von zellulärer DNA

Nachdem wie in den Beispielen 1 und 2 angegeben die Blutzellen aufgeschlossen wurden, so daß die zelluläre DNA freigegeben wurde, erfolgt ein Zentrifugationsschritt bei 5000 Um drehungen/min, der zu einem erheblichen Verlust an zellulärer DNA führt, die bei dieser Zentrifugationsgeschwindigkeit nicht sedimentiert.

Im Sediment befinden sich jetzt vollständig die freien oder freigesetzten Pilzzellen, die für die weitere Verarbeitung in einem Puffer (Aqua bidest) aufgenommen werden.

Beispiel 4: Aufschließen der Pilzzellen

Als nächstes werden die Pilzzellen alkalisch lysiert und enzymatisch behandelt, um die Pilz-DNA freizusetzen.

Dazu erfolgt zunächst eine Alkalilyse mit 200 ml 50 mM NaOH für 10 min bei 95°C.

Daraufhin erfolgt ein Neutralisationsschritt mit 1 M Tris-HCl pH 7,0.

Als nächstes werden 500 µl Zymolyase von Sigma (300 µg/ml) zugegeben und die Lösung für 60 min bei 37°C inkubiert, um die Pilzzellen enzymatisch aufzuschließen.

Daraufhin werden 500 µl Tris/EDTA und 50 µl 10%iger SDS zugegeben und die Lösung bei 65°C für 20 min inkubiert, um das Protein zu denaturieren.

Beispiel 5: Isolation der Pilz-DNA

In der nunmehr vorliegenden Lösung befinden sich Trümmer der Pilzzellen sowie freie Pilz-DNA, die nun isoliert werden muß.

Hierzu erfolgt zunächst eine Proteinpräzipitation mit 5 M Kaliumazetat, woraufhin der Überstand abgenommen und die DNA dann durch Zugabe von eiskaltem Isopropanol ausgefällt wird. Dieses Fällungsprodukt wird dann für die weiteren Verfahrens schritte verwendet.

Durch die in den Beispielen 1-5 angegebenen Verfahrensschritte ist es also möglich, aus Vollblut hoch-selektiv Pilz-DNA zu extrahieren, die nun als Präzipitat vorliegt und nur gering mit zellulärer DNA verunreinigt ist, wodurch der jetzt erfolgende Nachweis sehr sensitiv und hochspezifisch erfolgen kann.

Beispiel 6: Amplifikation eines pilzspezifischen DNA- Segmentes

In diesem Verfahrensschritt soll zunächst nachgewiesen werden, ob in dem Präzipitat aus dem Verfahrensschritt in Beispiel 5 überhaupt Pilz-DNA vorhanden ist. Dabei wird ausgenutzt, daß die im Sequenzprotokoll unter SEQ ID-No: 1 und SEQ ID-No: 2 angegebenen DNA-Sequenzen spezifisch an Bindungsstellen auf dem Pilz-Gen für die 18ssu-rRNA vieler Pilzstämme und -spezies binden.

Der Erfinder der vorliegenden Anmeldung hat nämlich erkannt, daß dieses Pilz-Gen bei den verschiedenen Pilz-Stämmen und -Gattungen ein derartiges Sequenzsegment aufweist, das einerseits von zwei Bindungsregionen für Primer flankiert wird, die für alle Pilz-Stämme und -Gattungen identisch sind, daß aber andererseits die Sequenz dieses Segmentes für die verschiedenen Pilz-Stämme und -Gattungen so verschieden ist, daß sie zum Nachweis der einzelnen Pilzspezies und -Gattungen verwenden werden kann.

Die DNA-Sequenz SEQ ID-No: 1 bindet dabei an den sense-Strang, während die DNA-Sequenz SEQ ID-No: 2 an den anti-sense-Strang bindet, wobei der Abstand zwischen den beiden Bindungsstellen ca. 500 Basenpaare beträgt. Diese beiden DNA-Sequenzen SEQ ID-No: 1 und SEQ ID-No: 2 eignen sich damit als Primer für eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR), in der folglich Verstärkungs produkte (Amplicon) mit einer Länge von ca. 500 Basenpaaren erzeugt werden.

In der nachfolgenden Tabelle 1 ist die Lage der Primer und die Länge des jeweiligen Amplicons angegeben.

Tabelle 1

Von Pilz-Pathogenen erhaltene Amplicons

Durch diese beiden Primer SEQ ID-No: 1 und SEQ ID-No: 2 lassen sich also für alle relevanten Pilzspezies der Gattungen Candida und Aspergillus durch das PCR-Verfahren Amplicons von ca. 500 Basenpaaren in ausreichender Menge herstellen.

Die PCR-Bedingungen sind dabei die folgenden:

Puffer (50 µl):
10 mM Tris pH 9,6
50 mM NaCl
10 mM MgCl₂
0,2 mg/ml BSA
Polymerase
je 0,5 mM Nukleotide
je 100 pM Primer
Anfängliche Denaturierung: 3 min bei 94°C
Zyklus-Denaturierung: 0,5 min bei 94°C
Annealing: 1 min bei 62°C
Extension: 2 min bei 72°C
Terminale Extension: 5 min bei 72°C
Zykluszahl: 34.

Die hohe Magnesiumkonzentration im Puffer sorgt für eine hohe Spezifität der Polymerase, die mit 72°C im Extensions-Schritt bei ihrem Temperaturoptimum arbeiten kann.

Mit diesen Primern konnte insgesamt 40 Stämme von Candida albicans, 10 Stämme von Candida tropicalis, 6 Stämme von Candida parapsilosis, 11 Stämme von Candida glabrata, 8 Stämme von Candida krusei, 8 Stämme von Aspergillus fumigatus, 6 Stämme von Aspergillus flavus, 5 Stämme von Aspergillus terreus, 7 Stämme von Aspergillus niger, 5 Stämme von Aspergillus nidulans und 3 Stämme von Aspergillus versiculor erfolgreich amplifiziert werden.

Beispiel 7: Nachweis der Amplifikationsprodukte aus Beispiel 6

Im nächsten Schritt soll jetzt nachgewiesen werden, ob bei der PCR-Reaktion aus Beispiel 6 auch tatsächlich DNA-Segmente mit einer Länge von ca. 500 Basenpaaren hochverstärkt wurden. Diese Detektion der pilzspezifischen DNA-Segmente erfolgt durch Ethidiumbromid-Färbung der spezifischen Bande in einem 2%igen Agarose-Gel.

Ist hier die spezifische Bande zu erkennen, so kann von einer Pilzinfektion ausgegangen werden, da die Primer SEQ ID-No: 1 und SEQ ID-No: 2 an alle oben erwähnten Pilzstämme binden. Sollte also durch die Verfahrensschritte aus den Beispielen 1-5 Pilz- DNA extrahiert worden sein, so wird sie durch den PCR-Schritt des Beispiels 6 so weit hochverstärkt, daß sie hier durch Ethidiumbromid-Färbung nachgewiesen werden kann.

Beispiel 8: Zuordnung der Amplifikationsprodukte aus Beispiel 6 zu einzelnen Pilzspezies

Für eine spezifische Therapie ist es jetzt noch erforderlich, die im Schritt 7 bereits nachgewiesene Pilzinfektion genauer zu spezifizieren. Hier zeigt sich jetzt ein weiterer Vorteil des PCR-Schrittes aus Beispiel 6. Dort wurde nämlich so viel pilzspezifisches DNA-Segment erzeugt, daß jetzt weitere Nachweis verfahren zur Bestimmung der Pilzspezies möglich sind.

Hierzu werden die im Sequenzprotokoll angegebenen Nucleotid sequenzen SEQ ID-No: 3 bis SEQ ID-No: 8 herangezogen, die als Spezies-spezifische Sonden dienen, die mit einem Sequenzabschnitt des in Beispiel 6 erzeugten DNA-Segmentes spezifisch hybridi sieren.

Es wurde gefunden, daß die Sonde SEQ ID-No: 3 mit Candida albicans, SEQ ID-No: 4 mit Candida glabrata, SEQ ID-No: 5 mit Candida krusei, SEQ ID-No: 6 mit Candida tropicalis, SEQ ID-No: 7 mit Candida parapsilosis und SEQ ID-No: 8 mit Aspergillus fumigatus, A. flavus, A. versiculor, A. niger, A. nidulans und A. terreus hybridisieren. Die Nucleotidsequenz SEQ ID-No: 8 ist also eine allgemeine Aspergillus-Sonde, während die Nucleotidsequenzen SEQ ID-No: 3 - SEQ ID-No: 5 Pilzspezies der Gattung Candida voneinander unterscheiden können.

Um die erfolgte Hybridisierung nachweisen zu können, werden die Sonden mit dem Transferase-Kit der Firma Böhringer, Mannheim mit Digoxigenin markiert, wobei der Nachweis nach dem Southern Blot-Verfahren mit der üblichen Farbreaktion erfolgt.

Mit Hilfe dieser Sonden erfolgt eine sequentielle Hybridisierung, die nach der Häufigkeit der einzelnen Pilzspezies gestaffelt ist, so daß zunächst mit SEQ ID-No: 3 (C. albicans), dann mit SEQ ID-No: 8 (Aspergillus), SEQ ID-No: 6 (C. tropicalis), SEQ ID-No: 7 (C. parapsilosis), SEQ ID-No: 4 (C. glabrata) und schließlich mit SEQ ID-No: 5 (C. krusei) hybridisiert wird.

Auf diese Weise ist es also möglich, an Hand der im Schritt beispiel 6 erzeugten Amplifikationsprodukte durch sequentielles Hybridisieren die Pilzspezies zu identifizieren und anschließend eine gezielte Therapie einzuleiten.

Beispiel 9: Nachweis ausgesäter Pilzzellen in Blut

Mit Hilfe der spezifischen Amplifikation und sequentiellen Hybridisierung gelang es, Pilzspezies mit einer Sensitivität von 1-3 Pilzzellen reproduzierbar nachzuweisen. Durch Aussaat von Pilzspezies in Blutproben konnte nachgewiesen werden, daß das obige Verfahren eine Sensitivität von einer sog. CFU (colony forming unit)/ml-Blut erreicht. Diese Nachweisgrenze liegt weit unterhalb derjenigen, die bei einer klinisch relevanten Pilzaus saat in Blut erwartet werden kann.

Beispiel 10: Klinisches Untersuchungsprogramm

In einem groß angelegten klinischen Untersuchungsprogramm konnte eine hohe Spezifität des neuen Verfahrens bei der Analyse von 165 Blutproben von 65 gesunden Probanden gezeigt werden. Alle 165 Blutproben sind negativ geblieben.

94 immunsupprimierte Patenten mit unklarem Fieber wurden daraufhin auf die Präsenz einer Pilzinfektion untersucht. Von 69 Patienten, bei denen keine invasive Pilzinfektion vorlag, waren weit über 200 Blutproben (bis auf eine Ausnahme) ebenfalls negativ.

Dagegen konnten alle 25 Patienten mit invasiver Pilzinfektion bereits innerhalb der ersten Woche als positiv identifiziert werden. Bei allen Patienten gelang darüber hinaus die Zuordnung zu dem verursachenden Pilzerreger.

Sequenzprotokoll

Claims

1. Oligonucleotid mit folgender Nucleotidsequenz (SEQ ID-No: 1 aus dem Sequenz protokoll) ATTGGAGGGC AAGTCTGGTG.

2. Oligonucleotid mit folgender Nucleotidsequenz (SEQ ID-No: 2 aus dem Sequenz protokoll) CCGATCCCTA GTCGGCATAG.

3. Verwendung der Oligonucleotide gemäß den Ansprüchen 1 und 2 als Primer zur Amplifikation eines Abschnitts aus dem Pilz-Gen für die 18ssu-rRNA von einer Vielzahl von Pilzspezies in der Polymerase-Kettenreaktion.

4. Verfahren zum Nachweisen von Pilzzellen in klinischem Material, mit den Schritten:

1) Extrahieren von Pilz-DNA aus Vollblut; und
2) Durchführung einer Polymerase-Kettenreaktion mit der extrahierten Pilz-DNA unter Verwendung von spezifi schen Primern und ggf. Nachweis der Amplifikations produkte,

dadurch gekennzeichnet, daß im Schritt 2) als Primer die Oligonucleotide gemäß den Ansprüchen 1 und 2 verwendet werden.

5. Verfahren nach Anspruch 4, gekennzeichnet durch den zusätzlichen Schritt

3) Bestimmen der Pilzspezies aus den Amplifikations produkten.

6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß im Schritt 2) die Polymerase-Kettenreaktion mit folgendem Zyklus durchgeführt wird:

a1) Denaturieren für 0,3-1 min, vorzugsweise für 0,5 min bei 90-96°C, vorzugsweise bei 94°C;
a2) Hybridisieren für 0,5-1,5 min, vorzugsweise für 1,0 min bei 58-64°C, vorzugsweise bei 62°C; und
a3) Extension für 1,5-2,5 min, vorzugsweise für 2,0 min bei 68-75°C, vorzugsweise bei 72°C.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß vor Beginn der Zyklusschritte ein Denaturierungsschritt von 5-9 min, vorzugsweise von 3 min bei 90-96°C, vorzugs weise bei 94°C erfolgt.

8. Kit zum Nachweisen von Pilzzellen in klinischem Material durch Extrahieren von Pilz-DNA aus Vollblut und Durchführung einer Polymerase-Kettenreaktion mit der extrahierten Pilz- DNA unter Verwendung von spezifischen Primern, dadurch gekennzeichnet, daß er als Primer die Oligonucleotide gemäß Anspruch 1 und Anspruch 2 enthält.