DE19806274A1 - Verfahren zum Nachweis von Aspergillus-Nukleinsäuren in einer Körperprobe, Nukleinsäure-Sonden und Diagnosekits zur Durchführung des Verfahrens - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Aspergillus-Nukleinsäuren in einer Körperprobe, wobei man Nukleinsäuren aus der Körperprobe isoliert und mit Hilfe der Zwei-Schritt-PCR diejenigen amplifiziert, deren Sequenzen im wesentlichen homolog zu Teilen des 3'-Endes der 18S-rRNA-Gene von Aspergillus sind. Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung bestimmte Nukleinsäure-Sonden und Diagnosekits zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Die Inzidenz lebensbedrohlicher durch Pilze hervorgerufener Infektionen ist im Vergleich zu bakteriellen Infektionen zwar niedriger, jedoch wird etwa seit Anfang der 70er Jahre eine ansteigende Tendenz schwerer systemischer Pilzinfektionen beobachtet. Diese Infektionen treten vorwiegend dann auf, wenn schwerwiegende Veränderungen der Infektionsabwehr vorliegen. Gerade bei hämatologisch-onkologischen Risikopatienten mit lang andauernder Einschränkung der zellulären Immunabwehr steigt die Inzidenz invasiver Mykosen mit konsekutiv hoher Sterblichkeit. Darüber hinaus sind auch zunehmend HIV-infizierte, organtransplantierte und intensiv therapierte Patienten sowie Frühgeborene betroffen.

Besonders hoch ist die Sterblichkeit bei systemischen, invasiven Infektionen mit Schimmelpilzen der Gattung Aspergillus. Sie kann bis zu 100% bei persistierender oder längerfristiger, hochgradiger Neutropenie (Reduktion der weißen Blutkörperchen) betragen. In der Tat sind invasive Aspergillosen für etwa 41% der Todesfälle bei Patienten mit akuter Leukämie verantwortlich. An einigen Knochenmarktransplantationszentren ist die systemische Aspergillose inzwischen die häufigste, tödlich verlaufende Infektion. Hämatologisch-onkologische Patienten mit invasiven Aspergillus-Infektionen haben zudem ein hohes Rezidivrisiko bei erneuten Neutropenien, trotz adäquater Therapie. Gerade bei diesen mit hoher Sterblichkeit einhergehenden schweren Infektionen stehen im Gegensatz zu bakteriellen Infektionen nur vergleichsweise schlechte therapeutische und prophylaktische Möglichkeiten zur Verfügung.

Pilze werden herkömmlicherweise mikrobiologisch-kulturell über ihre Morphologie und Nährstoffansprüche identifiziert. Problematisch ist, daß die dazu erforderliche Kultivierung bis zu ca. 2 Wochen in Anspruch nimmt und ein und derselbe Organismus je nach Wachstumsbedingungen unterschiedliche Formen annehmen kann. Selbst für ausgesprochene Experten ist die Identifizierung oft mit großen Schwierigkeiten verbunden.

Serologische Methoden bieten bis heute keine Alternative, da das Immunsystem betroffener Patienten stark beeinträchtigt ist und bisher Versuche eines Antigennachweises, beispielsweise über Radioimmunoassays, Immunoblotting-Assays, Enzym-Immuno­ assays oder Latex-Agglutinationstests, wegen schlechter Sensitivität nicht zu zufriedenstellenden Ergebnissen geführt haben.

So ist die Frühdiagnose und Verlaufsbeurteilung invasiver Mykosen sowohl auf klinischer, laborchemisch-serologischer als auch auf konventionell-radiologischer Seite bislang wenig spezifisch und in Frühstadien der Erkrankung wenig sensitiv. Die klinische Diagnose erfolgt häufig erst in Spätstadien der Mykose. Etwa 30 bis 40% der Pilzinfektionen werden erst bei der Autopsie diagnostiziert.

Erschwerend kommt hinzu, daß selbst bei frühzeitiger Einleitung einer systemischen Therapie die Quoten für ein Therapieversagen mit über 20% sehr hoch sind. Darüber hinaus existieren für die Dauer und Gesamtdosis einer antimykotischen Therapie keine einheitlich akzeptierten Richtlinien. Es gibt vor allem wegen der klinisch-problematischen Diagnostik der Erkrankung weder in der Initialdiagnostik noch zum Monitoring des Therapie- und Krankheitsverlaufs einen validierten, gut praktikablen, wenig mit Nebenwirkungen belasteten Parameter. Dies wäre jedoch besonders in Anbetracht der ausgeprägten systemischen Toxizität von Amphotericin B, dem "Goldstandard" der antimykotischen Therapie systemischer Aspergillosen, wünschenswert.

In Anbetracht der Notwendigkeit eines rasch durchzuführenden, hoch sensitiven und spezifischen Tests, der zudem mit möglichst wenig Belastung für den betroffenen Patienten verbunden sein muß, haben einige Forschungsteams fortschrittliche molekularbiologische Techniken benutzt, um Verfahren zu entwickeln, die auf dem Nachweis und der Identifizierung von DNA-Sequenzen ribosomaler Gene basieren. Es wird davon ausgegangen, daß die Ribosomen aller zellulärer Organismen artspezifische rRNA enthalten. In Eukaryoten findet man vier verschiedene rRNA's, die über ihre Größe bzw. den davon abhängenden Sedimentationskoeffizienten S als 5S-, 5,8S-, 18S- und 28S-rRNA bezeichnet werden. Da alle Ribosomen die gleiche für eine Zelle unerläßliche Funktion ausüben, sind die entsprechenden Gene hoch konserviert. Es gibt allerdings auch einige hypervariable Bereiche, in denen sich die Sequenzen von Art zu Art unterscheiden können.

So gelang es bereits, genomische ribosomale DNA (rDNA) mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion (im folgenden kurz als "PCR" bezeichnet) zu amplifizieren oder ribosoinale RNA (rRNA) zunächst durch reverse Transkription in cDNA umzuschreiben und diese anschließend mittels PCR zu amplifizieren.

Beispielsweise konnten geringe Mengen genomischer rDNA von Aspergillus fumigatus aus bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit bis in den Bereich von 1 pg nachgewiesen werden. Für die PCR wurden in diesem Ansatz spezifische Primer aus der Sequenz des 28S-rRNA-Gens benutzt, wodurch ein 401 Basenpaare umfassendes Fragment amplifiziert werden konnte (Spreadbury et al., J. Clin. Microbiol. (1993) 31(3) : 615-621).

Eine weitere Forschungsgruppe griff auf die Gene der 18S-rRNA zurück und erzielte PCR-Amplifikate aus bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit bei immunkompromittierten neutropenen, nicht aber bei immunkompetenten Patienten. Dieses Verfahren weist eine gewisse Genusspezifität auf, wogegen eine hinreichende Sensitivität erst durch die Kopplung der PCR mit einer anschließenden Southern-Blot-Analyse erreicht wird. Darüber hinaus ist eine zusätzliche Restriktionsanalyse der amplifizierten DNA erforderlich, um einer Infektion mit Paecilomyces variotii zugrundeliegende, falsch positive Antworten auszuschließen (Melchers et al., J. Clin. Microbiol. (1994) 32(7) : 1710-1717).

Ein ebenfalls auf der PCR-vermittelten Amplifizierung bestimmter Fragmente der 18S-rRNA-Gene basierendes Verfahren zum Nachweis von Candida- und Aspergillus-Arten wurde an Blutproben immunkompromittierter Patienten getestet. Auch hier gilt, daß eine Unterscheidung zwischen Aspergillus-Arten einerseits und Candida-Arten andererseits erst durch eine sich der PCR anschließende Southern-Blot-Analyse unter Verwendung einer spezifischen Hybridisierungssonde vorgenommen werden konnte (Einsele et al., J. Clin. Microbiol. (1997) 35 : 1353-1360).

Kürzlich wurde erstmals die Verwendung einer Zwei-Schritt-PCR zum Nachweis von Aspergillus-Arten aus Blut immunkompromittierter Patienten beschrieben. Dazu wurden zwei Primer-Paare gewählt, wobei sowohl die stromabwärts gelegenen Primer eines jeden Paares als auch die stromaufwärts gelegenen Primer eines jeden Paares gemeinsame Sequenzen aufweisen, d. h. miteinander überlappen und an eine gemeinsame hypervariable Region des 18S-rRNA-Gens binden. Mit Hilfe dieses Verfahrens konnten bis zu 50 fg DNA, die aus Aspergillus fumigatus extrahiert worden war, nachgewiesen werden. Wie allerdings selbst die Erfinder einräumen, ist dieses Verfahren zur klinischen Anwendung nicht geeignet (Yainakami et al., J. Clin. Microbiol. (1996) 34: 2464-2468).

Angesichts der vorstehend geschilderten Situation war es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein leistungsfähiges und zuverlässiges Verfahren zum klinischen Nachweis von Aspergillus bereitzustellen.

Diese Aufgabe wurde überraschenderweise durch ein Verfahren auf Grundlage der Zwei-Schritt-PCR gelöst, bei der die im ersten Schritt verwendeten Primer nicht mit den im zweiten Schritt verwendeten Primern überlappen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zum Nachweis von Aspergillus-Nukleinsäuren in einer Körperprobe, wobei man Nukleinsäuren aus der Körperprobe isoliert und mit Hilfe der Zwei-Schritt-PCR Nukleinsäuren amplifiziert, deren Sequenzen im wesentlichen homolog zu Teilen des 3'-Endes der 18S-rRNA-Gene von Aspergillus sind, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die im ersten Schritt zur Amplifizierung verwendeten Primer nicht mit den im zweiten Schritt verwendeten Primern überlappen.

Unter dem Begriff Aspergillus-Nukleinsäuren versteht man RNA, insbesondere rRNA, DNA, insbesondere genomische rDNA, der Schimmelpilz-Gattung Aspergillus. Diese Gattung umfaßt eine Vielzahl verschiedener Arten (Spezies), beispielsweise Aspergillus clavatus, Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus glaucus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus ochraceus, Aspergillus terreus, Aspergillus versicolor, Aspergillus unguis und Aspergillus ustus. Insbesondere die Arten Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger und Aspergillus terreus sind oft für die eingangs geschilderten menschlichen Erkrankungen verantwortlich. Nicht nur in Nordamerika scheinen die meisten Aspergillosen auf eine Infektion mit Aspergillus fumigatus zurückzugehen, so daß dieser Erreger im Rahmen der vorliegenden Erfindung besonders wichtig ist.

Bezüglich der Wahl der Körperprobe unterliegt das erfindungsgemäße Verfahren keinen prinzipiellen Einschränkungen. Es wird vorzugsweise an den Körperproben angewendet, bei denen in der Regel mit einem Pilzbefall zu rechnen ist oder die zumindest mit befallenen Stellen in Kontakt stehen und daher Hinweise auf einen Pilzbefall geben können. Im Hinblick auf Aspergillosen ist in erster Linie der respiratorische Trakt zu nennen, dessen direkte Untersuchung allerdings in der Regel eine Biopsie erforderlich macht. Weniger invasive aber dennoch etwas belastend ist die bronchoalveoläre Lavage. Insbesondere bei Patienten mit schwachem Gesundheitszustand greift man deshalb bevorzugt auf leicht entnehmbare Körperflüssigkeiten zurück, wie Blut oder Sputum, die bei der Untersuchung auf systemische Infektionen besondere Vorteile bieten können.

Erfindungsgemäß steht die Umschreibung "18S-rRNA-Gene von Aspergillus" für funktionell im wesentlichen gleichwirkende aber sequenzspezifisch gegebenenfalls voneinander abweichende Gene verschiedener Aspergillus-Arten, -Rassen, -Varianten, -Mutanten und dergleichen. Das 3'-Ende eines solchen Gens kodiert das 3'-Ende der resultierenden rRNA. Daraus folgt unmittelbar, daß erfindungsgemäß Nukleinsäuren amplifiziert werden, deren Sequenzen auch im wesentlichen homolog zu Teilen des 3'-Endes der 18S-rRNA's von Aspergillus sind.

Die vollständige Sequenz des 18S-rRNA-Gens von Aspergillus fumigatus wurde bei der DDBJ-EMBL-Gen-Bank hinterlegt; es trägt die Hinterlegungsnummer AB 008401 und ist dort publiziert. Die Sequenz der Basen +1 bis +1733 ist in Fig. 1 dargestellt. Teile verwandter Sequenzen von Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus flavus und Aspergillus terreus sind in Melchers et al., J. Clin. Microbiol. (1994) 32 (7): 1710-1717 beschrieben.

Die in Fig. 1 beschriebene Sequenz kann in konservierte und hypervariable Bereiche eingeteilt werden. Für die vorliegende Erfindung sind insbesondere die hypervariablen Bereiche am 3'-Ende von Interesse, die üblicherweise mit V7 (etwa +1306 bis etwa +1362), V8 (etwa +1436 bis etwa +1513) und V9 (etwa +1632 bis etwa +1700) bezeichnet werden.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Sequenz des im ersten PCR-Schritt amplifizierten Fragments (äußeres Fragment) im wesentlichen homolog zu einer in Fig. 1 gezeigten Sequenz, die den Bereich V7 zumindest teilweise, V8 vollständig und V9 zumindest teilweise überspannt, und das im zweiten Schritt amplifizierte Fragment (inneres Fragment) im wesentlichen homolog zu einer in Fig. 1 gezeigten Sequenz, die den Bereich V7 nicht, aber V8 und V9 zumindest teilweise überspannt. Besonders bevorzugt sind Amplifikate des äußeren Fragmentes, die V7 und V9 vollständig überspannen sowie Amplifikate des inneren Fragmentes, die V8 vollständig und V9 teilweise überspannen. Funktionelle Äquivalente dieser Fragmente sind ebenfalls Gegenstand der bevorzugten Ausführungsform.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform amplifiziert man im ersten Schritt eine Nukleinsäure mit der in Fig. 1 gezeigten Nukleotidsequenz von Nukleinsäurerest +1296 bis +1700, oder ein Fragment oder funktionelles Äquivalent davon, und im zweiten Schritt eine Nukleinsäure mit der in Fig. 1 gezeigten Nukleotidsequenz von Nu)cleinsäurerest +1436 bis +1671, oder ein Fragment oder funktionelles Äquivalent davon.

Mit funktionellen Äquivalenten seien erfindungsgemäß funktionell im wesentlichen gleichwirkende aber sequenzspezisch und/oder basentypisch voneinander abweichende Nukleinsäuren gemeint. Beispielsweise gehören derivatisierte, wie mit Markierungen oder Mitteln zur deren Befestigung und/oder Immobilisierungsmitteln versehene Nukleinsäuren dazu.

Die Sequenz der Amplifikate hängt wesentlich von der Wahl der Primer ab, die zu den beiden 3'-Einzelstrangenden des zu amplifizierenden Nukleinsäure-Fragmentes komplementär sind und somit dessen Enden bestimmen. Andererseits kann man die Amplifikation einer bestimmten Nukleinsäure, dessen Sequenz zumindest in Teilen bekannt sein sollte, durch die Wahl geeigneter Primer erreichen.

Da das erfindungsgemäße Verfahren auf der Zwei-Schritt-PCR basiert, wird in einem ersten Schritt eine durch ein erstes Primer-Paar (äußere Primer) definierte Nukleinsäure (äußeres Fragment) amplifiziert. Im zweiten Schritt wird dann durch ein zweites Primer-Paar (innere Primer) definiertes Fragment (inneres Fragment) der im ersten Schritt amplifizierten Nukleinsäure (äußeres Fragment) amplifiziert. Die inneren Primer müssen daher unter den gewählten Reaktionsbedingungen an das äußere Fragment binden, was voraussetzt, daß die Sequenzen dieser Primer zu Teilen der Sequenz des äußeren Fragmentes im wesentlichen komplementär sind. Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß die im ersten Schritt verwendeten Primer nicht mit den im zweiten Schritt verwendeten Primern überlappen. Mit anderen Worten unterscheiden sich inneres und äußeres Fragment sowohl am 3'- als auch am 5'-Ende um wenigstens die Länge der dem jeweiligen Ende zuzuordnenden äußeren Primer.

In der Regel handelt es sich bei den erfindungsgemäß verwendeten Primern um Nukleinsäure-Sonden mit einer Länge von 15 bis 25 Basen, die unter Verwendung konventioneller Synthetisiermaschinen hergestellt werden können.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Sequenz des ersten äußeren Primers im wesentlichen homolog zu wenigstens einem Teil der in Fig. 1 gezeigten Sequenz des Bereichs V7 und die Sequenz des anderen äußeren Primers im wesentlichen homolog zu wenigstens einem Teil der in Fig. 1 gezeigten Sequenz des Bereichs V9.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Sequenz des ersten inneren Primers im wesentlichen homolog zu wenigstens einem Teil der in Fig. 1 gezeigten Sequenz des Bereichs V8 und die Sequenz des zweiten inneren Primers im wesentlichen homolog zu wenigstens einem Teil der in Fig. 1 gezeigten Sequenz des Bereichs V9.

Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform verwendet man als Primer im ersten Schritt Nukleinsäure-Sonden mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID NO : 1 und SEQ ID NO : 2 und im zweiten Schritt Nukleinsäure-Sonden mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID NO : 3 und SEQ ID NO : 4, oder funktionelle Äquivalente oder Fragmente davon.

Erfindungsgemäß werden vor der eigentlichen PCR zumindest ein Teil der in der Körperprobe enthaltenen Nukleinsäuren isoliert. Unter Isolierung versteht man im vorliegenden Fall zumindest eine Anreicherung von Nukleinsäuren, eine vollständige Aufreinigung ist in der Regel nicht erforderlich, um die anschließende PCR durchführen zu können.

Je nach Art der zu isolierenden Nukleinsäuren sind dem Fachmann verschiedene allgemeine Vorgehensweisen bekannt. Soll beispielsweise intakte RNA aus Gewebe und Zellen isoliert werden, inaktiviert man in der Regel zunächst RNasen, beispielsweise durch Guanidinisothiocyanat, entfernt dann ggf. Proteine, Zelltrümmer, DNA und kleine RNAs und isoliert anschließend Poly(A)⁺RNA, beispielsweise über die bekannte Oligo(dT)-Zellulose-Chromatographie. Die so gewonnene Poly(A)⁺RNA wird dann mittels reverser Transkription in cDNA umgeschrieben. Dieser cDNA-Mix kann schließlich als Vorlage für die sich anschließende PCR verwendet werden. Die Kombination von reverser Transkription und PCR wird häufig auch kurz als RT-PCR bezeichnet.

Zur Isolierung von DNA aus Zellen, insbesondere genomischer DNA, werden die Zellen und Zellkerne in der Regel zunächst lysiert, die DNA protoniert und hochmolekulare DNA ggf. nach Entfernung löslicher Proteine ausgefällt. Nach der Lyse kann die DNA auch extrahiert werden. Die so gewonnene DNA kann dann direkt der PCR zugeführt werden.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist die Isolierung von DNA bevorzugt.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein in an sich bekannter Weise aus der Körperprobe isoliertes Leukozytenpellet zunächst mit einem Zellwand degradierenden Enzym inkubiert, dann ein Tensid und Proteinase K zugegeben und schließlich DNA in an sich bekannter Weise extrahiert. Bei dem zellwanddegradierenden Enzym handelt es sich vorzugsweise um Lyticase (Synonym: Yeast Lytic Enzyme), oder ein funktionelles Äquivalent davon, d. h. ein Enzym mit β-1,3-Glucanase-Aktivität. Lyticase ist im Handel erhältlich oder kann aus verschiedenen Mikroorganismen, wie Achromobacter, Arthrobacter oder Rhizoctonia, aufgereinigt werden oder über rekombinante Methoden hergestellt werden.

Bei dem zur Freisetzung der Zellkerne verwendeten Tensid handelt es sich vorzugsweise um SDS. Die Extraktion der DNA erfolgt bevorzugt durch eine Phenolextraktion.

Das Vorgehen zur Isolierung des Leukozytenpellets hängt im wesentlichen von der Art der Körperprobe ab. Aus bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit (BAL) kann das Leukozytenpellet nach Zentrifugation der Probe als sedimentiertes Zellmaterial erhalten werden. Verwendet man Blut, werden zunächst die Erythrozyten in an sich bekannter Weise lysiert, wonach das Leukozytenpellet durch Zentrifugation als sedimentiertes Zellmaterial gewonnen werden kann. Es sind die üblichen Vorsichtsmaßnahmen zur Vermeidung von Porphyrin- oder Heparinbestandteilen zu beachten, da diese zur Hemmung der PCR führen können.

Vorteile der erfindungsgemäß bevorzugten Ausführungsform zur Isolierung von Nukleinsäuren sind die rasche Durchführbarkeit und die Vermeidung von Kontaminationen mit Fremd-DNA, insbesondere durch ubiquitär vorhandene Pilzsporen. Zudem ist die Methode standardisierbar und auch automatisierbar.

Die isolierten Nukleinsäuren, d. h. die DNA oder der cDNA-Mix werden dann der eigentlichen PCR zugeführt, indem man sie mit einer geeigneten thermostabilen Polymerase, dNTP'S, Primer, Mg²⁺-haltigem Puffer und entsprechende Mengen an Wasser zusammengibt. Ein solcher Ansatz wird dann mehreren Temperaturzyklen unterworfen, was bevorzugt in einem der handelsüblichen Thermocycler vorgenommen werden kann. In der Regel wird mit einer anfänglichen Denaturierung der isolierten Nukleinsäure begonnen. Es schließen sich mehrere Zyklen an, die jeweils einen Denaturierungs-, Anlagerungs-, und Elongationsschritt beinhalten. In der Regel werden 20 bis 40 solcher Zyklen durchgeführt. Abschließend erfolgt eine letzte Elongation, an die sich Maßnahmen zur Erkennung der Amplifikate anschließen können. Jeder der vorstehend beschriebenen Schritte ist durch eine bestimmte Temperatur und die Zeit, während der diese Temperatur beibehalten wird, gekennzeichnet. Zur optimalen Ausgestaltung einer PCR können diese Parameter in einer dem Fachmann bekannten Art und Weise variiert werden. Die Wahl der thermostabilen Polymerase, beispielsweise Taq-DNA-Po­ lymerase, Tth-DNA-Polymerase oder Pwo-DNA-Polymerase, die Mg²⁺-Konzentration und pH-Wert des PCR-Ansatzes stellen weitere Parameter zur Beeinflussung des PCR-Ergebnisses dar.

Weiterhin besteht auch die Möglichkeit, die sogenannte "hot start"-Technik zu nutzen, um eine nichtspezifische Anlagerung des Primers und eine Primerelongation vor dem ersten Denaturierungsschritt zu vermeiden. Dazu wird wenigstens eine essentielle Reaktionskomponente von den übrigen Reaktionskomponenten durch ein Septum, in der Regel ein Wachs, getrennt. Mit dem ersten Erhitzungsschritt schmilzt dieses Septum, die Reaktionskomponenten mischen miteinander und die PCR beginnt.

Im Rahmen der erfindungsgemäßen Zwei-Schritt-PCR werden in einem ersten Schritt die isolierten Nukleinsäuren mit den erfindungsgemäßen äußeren Primern und allen weiteren Reaktionskomponenten zusammengemischt und die Reaktion wie oben beschrieben durchgeführt, was ein erstes PCR-Produkt ergibt. Dann wird ein Aliquot dieses ersten PCR-Produktes mit den erfindungsgemäßen inneren Primern und allen weiteren Reaktionskomponenten zusammengemischt und die Reaktion von neuem - wie oben beschrieben - durchgeführt, was das endgültige PCR-Produkt der erfindungsgemäßen Zwei-Schritt-PCR ergibt. Weitere Ausgestaltungen der PCR-Technik basieren auf fachmännischem Wissen.

Zum Nachweis PCR-amplifizierter Nukleinsäuren stehen dem Fachmann eine Reihe bekannter Techniken zur Verfügung.

Die einfachste Methode besteht in einer direkten Anfärbung des Amplifikats. Als übliches Reagenz wird beispielsweise Ethidiumbromid verwendet, das unter UV-Licht ein fluoreszierendes Signal abgibt. Diese Methode ist allerdings unspezisch, was in der Regel eine vorausgehende Auftrennung, beispielsweise eine Gelelektrophorese, der in der PCR-Re­ aktionslösung vorhandenen Nukleinsäuren erforderlich macht.

Ferner können Markierungen oder Mittel zur Befestigung einer Markierung sowie Immobilisierungsmittel in einen oder mehrere der verwendeten Primer und/oder auch während der Elongation durch eine der in der PCR herkömmlicherweise verwendeten thermostabilen Polymerasen eingeführt werden. Bei den Immobilisierungsmitteln und Markierungen kann es sich beispielsweise um Haptene, wie Biotin, Digoxigenin, Fluorescein oder Tetramethylrhodamin, handeln. Derartige Haptene können beispielsweise in kovalent an ein Nukleotid gebundener Form eingeführt werden. Vorzugsweise handelt es sich dabei um UTP-De­ rivate. Die Markierung durch Radionukleotide ist natürlich auch möglich. Bei den Mitteln zur Befestigung eines Signals oder einer Markierung greift man vorzugsweise auf 5'-nicht­ hybridisierende DNA-Sequenzen zurück, die Immobilisierungsmittel tragen, an einen festen Träger befestigt sind und/oder eine Markierung tragen.

Bei den festen Trägern für die Immobilisierung kann es sich beispielsweise um Microtiterkammern, Tauchstäbe, Fasern und Partikel handeln, die einen Bindungspartner für die Immobilisierungsmittel tragen, beispielsweise Streptavidin (für Biotin) oder einen Anti-Hapten-Antikörper (für andere Haptene).

Magnetische Partikel stellen eine weitere vorteilhafte Variante dar.

Derartige Markierungen können auf herkömmliche Weise erkannt werden. Radioaktive und fluoreszierende Markierungen können mit Hilfe entsprechender technischer Ausrüstung direkt nachgewiesen werden, während andere Haptene, wie Biotin oder Digoxigenin, unter Zuhilfenahme spezifischer Antikörper und einer daran gekoppelten Nachweisreaktion sichtbar gemacht werden können.

Im Vergleich zur einfachen Ethidiumbromid-Färbung eines zur Auftrennung des PCR-Produktes verwendeten Agarose-Gels kann die Sensitivität des erfindungsgemäßen Verfahrens durch die Verwendung der vorstehend geschilderten Immobilisierungs- und Markierungssystem erheblich, d. h. um 1 bis 2 Größenordnungen, gesteigert werden. Eine chromatographische Auftrennung ist in der Regel nicht erforderlich.

Das erfindungsgemäße Verfahren besitzt eine hohe diagnostische Wertigkeit für die Frühdiagnose und Verlaufskontrolle von Aspergillosen, insbesondere von invasiven Aspergillosen bei hämatologischen Risikopatienten.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch die Nukleinsäure-Sonden mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3 und SEQ ID NO : 4, oder funktionelle Äquivalente oder Fragmente davon. Werden derartige Nukleinsäure-Sonden als Primer verwendet, versteht man unter funktionellen Äquivalenten im wesentlichen gleichwirkende, d. h. zur korrekten Basenpaarung befähigte und als Primer wirkende Nukleinsäure-Sonden. Diese können in geeigneter Weise derivatisiert, z. B. mit Markierungen und/oder Mitteln zur Markierung oder Immobilisierung versehen sein. Eine derartige Derivatisierung kann sowohl den Basen- als auch den Zucker- und/oder Phosphatteil eines Nukleotids betreffen. Diesbezügliche Ausgestaltungen beruhen ebenfalls auf fachmännischem Wissen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Diagnosekits zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Bevorzugt werden Diagnosekits, die wenigstens einen der Primer mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3 und SEQ ID NO : 4, oder funktionelle Äquivalente oder Fragmente davon enthalten. Besonders bevorzugt sind Diagnose­ kits, die wenigstens ein Primer-Paar mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID NO : 1 und SEQ ID NO : 2 bzw. SEQ ID NO : 3 und SEQ ID NO : 4, oder funktionelle Äquivalente oder Fragmente davon enthalten. Ganz besonders bevorzugt werden Diagnosekits, die als äußere Primer Oligonukleotide mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID NO : 1 und SEQ ID NO : 2 und als innere Primer Oligonukleotide mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID NO : 3 und SEQ ID NO : 4, oder funktionelle Äquivalente oder Fragmente davon enthalten.

Die erfindungsgemäßen Diagnosekits bestehen aus mehreren Kompartimenten, die in der Regel die einzelnen Reaktionskomponenten getrennt voneinander enthalten. Essentieller Bestandteil erfindungsgemäßer Kits sind wenigstens zwei Kompartimente für die beiden Primer-Paare, vorzugsweise vier Kompartimente zur getrennten Aufbewahrung jedes einzelnen Primers, sowie weitere Kompartimente, die Polymerase, dNTP's und Mg²⁺-haltigen Puffer enthalten. Darüber hinaus kann der erfindungsgemäße Diagnosekit weitere Elemente zur Markierung und/oder Immobilisierung der PCR-Produkte, beispielsweise markierte Nukleotide, Mittel zur Isolierung der Nukleinsäuren aus der Körperprobe, beispielsweise bestimmte Lyse- und/oder Extraktionspuffer, sowie Mittel zur Erkennung markierter oder nichtmarkierter PCR-Produkte, wie spezifische Hybridisierungssonden oder Antikörper zur Durchführung bekannter Immunabsorptionsverfahren, wie ELISA's, enthalten.

Die nachfolgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung verdeutlichen, ohne sie zu beschränken.

Beispiel 1: Isolierung von DNA aus Blut

Circa 3-5 ml peripheres Blut werden mit dem 5-fachen Volumen an RCLB (Red Cell Lysis Buffer; 1,55 M NH₄Cl, 0,1 M NH₄HCO₃, 1 mM EDTA pH 7,4) gemischt und ca. 10 min bei 4°C inkubiert. Nach der Lyse der Erythrozyten wird die Probe 10 min bei 2000 rpm in einer Hettich-Zentrifuge (Ausschwingrotor) abzentrifugiert. Der Überstand wird verworfen, die sedimentierten Leukozyten werden einmal mit PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung; 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na₂HPO₄, 2,4 g KH₂PO₄, pH 7,2, auf 1 l) gewaschen und erneut abzentrifugiert.

Das Leukozytenpellet wird in 300 µl PBS resuspendiert und 30 min bei 37°C mit ca. 100-125 U Lyticase (Sigma) inkubiert. Anschließend erfolgt die Zugabe von SDS ad 0,5% (w/v) (15 ml einer 10%igen SDS-Lösung) und von 500-1000 µg Proteinase K (10 mg/ml, Boehringer Mannheim). Die Probe wird 1 Stunde bei 55°C inkubiert, anschließend 100 µl APEX (Aspergillus-Extraktions­ puffer; 400 mM Tris/Cl, 1 M NaCl, 20 mM EDTA, 2% SDS) zugegeben, verbliebene Zellklumpen mit Hilfe einer Pipetten­ spitze homogenisiert und der Ansatz 30 min bei 65°C erhitzt.

Die Extraktion der Pilz- und Patienten-DNA erfolgt durch eine Phenolextraktion. Hierbei wird der Probe ein Volumen an Tris­ gesättigtem Phenol zugegeben, kräftig gemischt, und 2-3 min in einer Tischzentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit zentrifugiert. Verbliebenes Phenol wird durch eine anschließende Chloroformextraktion entfernt. Zu der wäßrigen Phase der Probe werden 1/10 3 M Na-Acetat (pH 7,5) und 0,75% (v/v) 100%iges Isopropanol gegeben. Die Probe wird bei 20°C 30 min inkubiert, die ausgefallene DNA mittels Zentrifugation (13.000 rpm, 10 min) sedimentiert, einmal in 70%igem Ethanol gewaschen und getrocknet. Die anschließende Konzentrationsbestimmung der DNA erfolgt mittels Spektralphotometrie bei 260 nm und 280 nm.

Beispiel 2: Isolierung von DNA aus bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit

Eine Probe bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit (BAL) wird in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt und 5 min in einer Tischzentrifuge bei 13.000 rpm abzentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und das sedimentierte Zellmaterial gewonnen. Dieses Leukozytenpellet wird wie in Beispiel 1 beschrieben weiter verarbeitet.

Beispiel 3: Durchführung der Zwei-Schritt-PCR

• a) 1. Schritt
  Circa 50 ng der in Beispiel 1 oder Beispiel 2 gewonnenen DNA werden in ein Reaktionsgefäß gegeben. Dann werden 0,5-1 U Taq-DNA-Polymerase, 6,25 nmol dNTP's und 10 pmol des Primers mit der Nukleotidsequenz SEQ ID NO : 1 sowie 10 pmol des Primers mit der Nukleotidsequenz SEQ ID NO : 2 hinzugegeben. Das Gesamtvolumen der Probe wird mit Mg²⁺-haltigem Puffer auf 25 µl aufgefüllt. Diese Reaktionslösung wird gut durchmischt und sodann in einen Thermocycler gesetzt. Folgende Zyklusbedingungen kommen zur Anwendung:
  

Nach der abschließenden Elongation wird das Reaktionsgefäß bei 4°C gehalten.

• b) 2. Schritt
  1-2 µl des im 1. Schritt erhaltenen PCR-Produktes werden in ein weiteres Reaktionsgefäß gegeben. Dann werden die unter a) beschriebenen Reaktionskomponenten zugesetzt, gut durchmischt und das Reaktionsgefäß in den Thermocycler gesetzt. Folgende Zyklusbedingungen kommen zur Anwendung.
  

Nach der abschließenden Elongation wird die Reaktionsmischung auf 4°C abgekühlt.

Das PCR-Produkt wird durch Agarosegelelektrophorese aufgetrennt, mit Ethidiumbromid gefärbt und unter UV-Licht sichtbar gemacht.

Beispiel 4: Bestimmung der Nachweisgrenze

DNA aus Aspergillus fumigatus wird analog zu dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren isoliert. Aliquots von 1 pg, 100 fg, 10 fg und 1 fg dieser DNA werden in der in Beispiel 3 beschriebenen Zwei-Schritt-PCR eingesetzt. Das PCR-Produkt wird durch Agarosegelelektrophorese aufgetrennt, mit Ethidiumbromid gefärbt und unter UV-Licht sichtbar gemacht. Der 10 fg DNA enthaltende Ansatz ergibt ein noch gut erkennbares Signal, während dem 1 fg DNA enthaltenden Ansatz kein eindeutiges Signal zugeordnet werden kann. Die Nachweisgrenze für DNA von Aspergillus fumigatus durch die in Beispiel 3 beschriebene Zwei-Schritt-PCR liegt daher bei 10 fg.

Beispiel 5: Bestimmung der Spezifität

DNA aus verschiedenen Aspergillus-Stämmen sowie einer Reihe von ubiquitär vorkommenden humanpathogenen Pilzen und Bakterien wird analog zu dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren isoliert.

Jeweils 50 ng an isolierter DNA werden in der in Beispiel 3 beschriebenen Zwei-Schritt-PCR eingesetzt. Das PCR-Produkt wird durch Agarosegelelektrophorese aufgetrennt, mit Ethidiumbromid gefärbt und unter UV-Licht gehalten. Ein fluoreszierendes Signal zeigt das Vorliegen doppelsträngiger DNA (PCR-Am­ plifikat) an. Als Kontrolle dient das PCR-Amplifikat von Aspergillus fumigatus (Beispiel 4). Die resultierenden Agarosegele sind in Fig. 2 abgebildet und deren Auswertung in der folgenden Tabelle 1 zusammengefaßt:

Tabelle 1

Beispiel 6: Klinische Anwendung

Aus etwa 350 Blutproben von 100 Risikopatienten mit Fieber, Neutropenie sowie vorhandenen oder im Röntgenthorax nicht nachweisbaren Lungeninfiltrationen wurde DNA gemäß Beispiel 1 isoliert, die dann mit der in Beispiel 3 beschriebenen Zwei-Schritt-PCR untersucht wurde.

Ferner wurden 50 dieser Patienten bronchoskopiert und BAL gewonnen. Aus der BAL wurde gemäß Beispiel 2 DNA isoliert, die dann mit der in Beispiel 3 beschriebenen Zwei-Schritt-PCR untersucht wurde.

Blutproben von gesunden Probanden sowie BAL-Proben von immunkompetenten Patienten mit Lungeninfiltraten und mit bzw. ohne Fieber wurden ebenfalls getestet.

Alle Proben von Patienten mit einer gesicherten oder wahrscheinlichen Aspergillose testeten positiv; die Sensitivität betrug also 100%.

In 2% aller Blutproben und 6,2% aller BAL-Proben fanden sich Signale, die bei retrospektiver Betrachtung des klinischen Krankheitsverlaufs nicht mit einer Aspergillus-Infektion des Patienten in Verbindung gebracht werden konnten; die Spezifität betrug daher etwa 80%.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims (9)

1. Verfahren zum Nachweis von Aspergillus-Nukleinsäuren in einer Körperprobe, wobei man Nukleinsäuren aus der Körper­ probe isoliert und mit Hilfe der Zwei-Schritt-PCR diejeni­ gen Nukleinsäuren amplifiziert, deren Sequenzen im wesent­ lichen homolog zu Teilen des 3'-Endes der 18S-rRNA-Gene von Aspergillus sind, dadurch gekennzeichnet, daß die im ersten Schritt zur Amplifizierung verwendeten Primer nicht mit den im zweiten Schritt verwendeten Primern überlappen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man im ersten Schritt eine Nukleinsäure mit der in Fig. 1 gezeigten Nukleotidsequenz von Nukleinsäurerest +1296 bis +1700, oder ein Fragment oder funktionelles Äquivalent davon, und im zweiten Schritt eine Nukleinsäure mit der in Fig. 1 gezeigten Nukleotidsequenz von Nukleinsäurerest +1436 bis +1671, oder ein Fragment oder funktionelles Äquivalent davon, amplifiziert.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Primer im ersten Schritt Nukleinsäure-Sonden mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID NO : 1 und SEQ ID NO : 2 und im zweiten Schritt Nukleinsäure-Sonden mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID NO : 3 und SEQ ID NO : 4, oder funktionelle Äquivalente oder Fragmente davon, verwendet.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Körperprobe Blut oder bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit ist.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß ein in an sich bekannter Weise aus der Körperprobe isoliertes Leukozytenpellet zunächst mit einem zellwanddegradierenden Enzym, insbesondere der Lyticase, inkubiert wird, dann ein Tensid, vorzugsweise SDS, und Proteinase K zugegeben werden und schließlich DNA in an sich bekannter Weise durch Phenolextraktion isoliert wird.

6. Nukleinsäure-Sonden mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3 und SEQ ID NO : 4, oder funktionelle Äquivalente oder Fragmente davon.

7. Diagnosekit zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche.

8. Diagnosekit nach Anspruch 7, gekennzeichnet durch Nukleinsäue-Sonden nach Anspruch 6.

9. Diagnosekit nach Anspruch 7 oder 8 mit Kompartimenten, die Taq-DNA Polymerase, dNTP's, Primer und Mg²⁺-haltigen Puffer enthalten, wobei die Primer für den ersten PCR-Schritt in einem ersten Kompartiment und die Primer für den zweiten PCR-Schritt in einem zweiten Kompartiment enthalten sind.