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Diese
Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung
von Pilzen in z. B. Kultur, Pflanzenmaterial, Boden, Propagationsmedien
oder Wasser unter Verwendung von Oligonukleotidprimern, um (unter
Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion)
zu Pilznukleinsäure
und zu Polynukleotiden wie etwa Primern zur Verwendung in diesem
Verfahren zu amplifizieren oder zu hybridisieren.
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Die
Oomycetes-Klasse enthält
einige der wichtigsten und schädlichsten
Pilzkrankheitserreger von Pflanzen, insbesondere innerhalb der Gattungen
Phytophthora, Pythium und Peronospora, die der Ordnung Peronosporales
angehören.
Phytophthora beinhaltet ungefähr
sechzig Arten, wobei alle davon auf Pflanzen krankheitserregend
sind; einige sind auf einen oder ein paar Wirte hoch spezialisiert,
andere weisen einen sehr breiten Wirtsbereich von mehreren tausend
Pflanzen auf. Eine Liste der zehn für den Handel bedeutendsten Krankheiten
in der Welt könnten
Krautfäule
und Knollenfäule
der Kartoffel umfassen, die durch Phytophthora infestans verursacht
wird, und Schwarzfäule
der Kakaobohne, die durch mehrere Phytophthora spp. verursacht werden,
und verschiedene Formen von Krankheiten auf Eukalyptus, die durch
P. cinnamomi verursacht werden. Pythium ist ebenfalls wichtig; es
ist eine viel diversere Gruppe von im Allgemeinen nicht spezialisierten Pilzen,
die hauptsächlich
Umfallkrankheiten von Keimpflanzen und von Gewebe von Sukkulenten
verursachen. Peronospora ist typisch für die biotrophen und obligaten
falschen Mehltaue, welche hoch spezialisierte Krankheitserreger
der Blätter
und Stiele von Pflanzen sind. Es gibt etliche Gattungen und viele
Arten von falschem Mehltau, wobei jede im Allgemeinen einen beschränkten Wirtsbereich
aufweist.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Identifizierung von
Pilzen auf der Ebene der Gattungen und auf der Ebene der Arten unter
Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) bereit. Kurz gesagt wird
durch PCR eine Ziel-DNA-Sequenz exponentiell auf Niveaus amplifiziert,
die durch nicht radioaktive Techniken nachweisbar sind. Zwei kurze
Stücke
DNA (Primer), die normalerweise zwischen 10 und 30 Nukleotide lang
sind, werden durch chemische Standard-Verfahren synthetisiert. Die
DNA-Sequenz des 'Vorwärts'-Primers ist komplementär zu den
Sequenzen an dem Anfang der Ziel-DNA in dem absteigenden DNA-Strang
in der DNA-Doppel-Helix, während
die 'Rückwärts'-Primer-Sequenz zu dem Ende
der Ziel-Sequenz in dem komplementären DNA-Strang komplementär ist.
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Die
Primer werden zu der Test-DNA zusammen mit der Enzym Taq-Polymerase, einer
Mischung aus den vier in der DNA vorkommenden Desoxyribonukleotiden
und Puffern usw. hinzugefügt.
Die Mischung wird dann auf eine Temperatur (1)
erhitzt, bei der sich die beiden Stränge der Ziel-DNA trennen. Beim
Abkühlen heften
sich die Primer, die in dem Reaktionsgemisch im Überschuss vorkommen, an komplementäre Sequenzen
auf den getrennten Einzelsträngen
(Annealing), und die Taq-Polymerase
synthetisiert dann neue DNA-Doppelstränge, die an den Enden der kurzen
Helices, welche durch das Annealing der Primer an die Doppelstränge geformt
wurden, beginnen. Ein neuer Strang wird in der Vorwärtsrichtung
von dem Vorwärts-Primer
und in der Rückwärtsrichtung
von dem Rückwärts-Primer
geformt. Die Taq-Polymerase wird bei hohen Temperaturen nicht zerstört und wird
durch wiederholte Zyklen der Reaktion arbeiten. Dadurch kann die gesamte
Reaktion aufgehalten werden, indem die Temperatur wiederum erhöht wird,
bis sich die Stränge
trennen, und dann wiederholt werden, indem die Temperatur gesenkt
wird, um das Annealing und die DNA-Synthese zu erlauben.
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Nach
dem ersten Temperaturzyklus funktionieren vier Stränge als
Schablonen, jedoch werden zwei sehr kurze Stränge, welche nur die Sequenz
zwischen den Primern darstellen, synthetisiert. Die Anzahl dieser kurzen
Stränge
wird mit jedem Zyklus verdoppelt, während die ursprünglichen
langen Stränge
nicht verdoppelt werden. Innerhalb von 35 Reaktionszyklen können ein
paar Kopien der Ziel-Sequenz in Millionen von Kopien amplifiziert
werden. Da diese von einheitlicher Länge sind, können sie durch Elektrophorese
in einem einzelnen Band konzentriert werden und ihre Anwesenheit
kann durch das Färben
mit Ethidiumbromid oder anderen Reagenzien hervorgebracht werden.
Eine DNA-Sequenz, die für
einen bestimmten Organismus einzigartig ist, kann daher vor einem
Hintergrund anderer DNA auf nachweisbare Niveaus amplifiziert werden,
wenn angemessene Primer für
diese einzigartige DNA-Sequenz hergestellt werden können.
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Die
verschachtelte PCR (eine Variante der PCR-Technik) erfordert zwei
Sätze an
Primern. Der erste Satz erzeugt ein wie oben beschriebenes Amplifikationsprodukt.
Der zweite Satz an Primern muss zu den Sequenzen innerhalb dieses
Produktes komplementär
sein. Durch das Hinzufügen
einer kleinen Menge des Reaktionsprodukts aus dem ersten Reaktionszyklus
zu einer anderen Reaktion kann eine kurze DNA-Sequenz, die sich im Innern des ursprünglichen
Produkts befindet, amplifiziert werden. Die verschachtelte PCR weist zwei
Vorteile auf: der erste Satz an Primern kann weniger spezifisch
sein und dadurch die Amplifikation von DNA aus mehreren möglichen
Ziel-Organismen ermöglichen – Spezifität kann dann
erreicht werden, indem spezifischere Primer in der zweiten Reaktion
verwendet werden, und sie erhöht
die Empfindlichkeit mit zwei Runden Amplifikation.
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Die
Erfindung bezieht sich insbesondere auf Primer, die zu rDNA komplementär sind.
Die ribsosomale RNA-Gen-Wiederholung (rDNA) kodiert RNA, das nach
der Verarbeitung die RNA-Untereinheiten innerhalb der Ribosomen
ausmacht. Die Untereinheiten sind über alle Organismen hinweg
hoch konserviert. Kodierungsregionen der großen und kleinen Untereinheit-rDNA
zeigen hohe Niveaus an Sequenzhomologie. Die internen transkribierten
Spacer-Regionen (ITS1 und ITS2), die sich zwischen den 18S- und
28S-Genen befinden, werden transkribiert, aber anschließend vor
dem Zusammensetzen des Ribosoms entfernt (Nues et al. 1994).
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird ein Polynukleotid mit einer Sequenz, die mindestens
einem Teil einer der SEQ ID NO: 1–11 oder einem komplementären Strang
davon entspricht, bereitgestellt.
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Ferner
wird gemäß der Erfindung
die Verwendung eines beliebigen von derartigen Polynukleotiden zum
Nachweis einer Pilzart, insbesondere einer Peronospora- und noch
genauer einer Phytophthora-Art bereitgestellt.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird ferner ein Polynukleotid mit einer Sequenz, die mindestens einem
Teil einer der SEQ ID NO: 12–39
oder einem komplementären
Strang davon entspricht, bereitgestellt.
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Des
Weiteren wird gemäß der Erfindung
die Verwendung eines wie oben beschriebenen Polynukleotids mit einer
Sequenz, die zu mindestens einem Teil der artspezifischen Sequenz
der Nukleinsäure
der ITS-Region oder der Nukleinsäure
der ITS flankierenden Region komplementär ist, um jene Art nachzuweisen, bereitgestellt.
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Die
Erfindung umfasst beide komplementären Stränge einer doppelsträngigen Polynukleotidsequenz.
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Vorzugsweise
weist das Polynukleotid eine Sequenz auf, die mindestens einem Teil
einer der Sequenzen SEQ ID NO: 1–39 entspricht.
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Vorzugsweise
können
die Primer und Polynukleotide der Erfindung eine bestimmte Art der
Peronosporales, vorzugsweise eine bestimmte Phytophthora-Art in
einer Mischung aus unterschiedlichen Arten nachweisen.
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Vorzugsweise
werden die Primer und Polynukleotide der Erfindung in einem Nukleotidhybridisierungsassay,
wie etwa einem Polymerase-Kettenreaktionsassay
verwendet, um die Arten von Phytophthora zu identifizieren.
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Kombinationen
aus mehr als einem Primer und/oder Polynukleotid können in
demselben Assay verwendet werden. Zum Beispiel kann der Assay ein
Paar von Primern (einen Vorwärtsprimer
und einen Rückwärtsprimer),
die aus den oben aufgelisteten Polynukleotiden ausgewählt sind,
verwenden. Es reicht aus, wenn nur eines der Polynukleotide (z.
B. der Vorwärtsprimer)
zu einer einzigartigen Sequenz in der zu amplifizierenden und nachzuweisenden
Ziel-DNA komplementär
ist, jedoch wird bevorzugt, dass sowohl der Vorwärts- als auch der Rüchwärtsprimer
zu einzigartigen Sequenzen in der Ziel-DNA komplementär ist.
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Ferner
wird gemäß der vorliegenden
Erfindung ein Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit der Nukleinsäure, die
für eine
Pilzart charakteristisch ist, bereitgestellt, wobei das Verfahren
das Bereitstellen einer Probe eines zu untersuchenden Materials,
von dem vermutet wird, dass es Nukleinsäure aus der Pilzart enthält oder
aus dieser besteht, das Bereitstellen eines Polynukleotids mit einer
Sequenz, die zu mindestens einem Teil der artspezifischen Sequenz
der DNA der ITS-Region oder der DNA der ITS flankierenden Region
der Pilzart oder einem Äquivalent
oder einem funktionellen Analogon davon komplementär ist, das
In-Kontakt-Bringen des
Polynukleotids mit dem Material und das Bestimmen, ob zwischen dem
Polynukleotid und der Probe des Materials eine Reaktion stattgefunden
hat, beinhaltet.
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Die
Materialprobe kann Pflanzengewebe, Tiergewebe oder lebloses Nahrungsgewebe
wie etwa Erde beinhalten.
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Vorzugsweise
beinhaltet die Reaktion das Binden des Polynukleotids und des Materials
und bringt optional die Amplifikation von DNA mit sich.
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Das
in dem Verfahren verwendete Polynukleotid besteht vorzugsweise aus,
umfasst oder ist abgeleitet von einer beliebigen der Sequenzen SEQ
ID NO: 1–39
und am besten einer beliebigen der SEQ ID NO: 1–11.
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Die
Vorteile eines Tests auf der Basis einer PCR basierten spezifischen
Amplifikation gegenüber
früher aufgezeichneten
Verfahren sind Geschwindigkeit, Einfachheit und Empfindlichkeit.
Unbearbeitete Präparationen
von Pilzmaterial stellen ausreichende DNA bereit, um die Identifizierung
zu ermöglichen.
Myzel, Zoosporen oder Oosporen können
durch Ultraschalldesintegration oder Gefrier-Auftau-Zyklus behandelt
werden, um ausreichende DNA, die eine Reinheit aufweist, welche
für den
PCR-Vorgang geeignet ist, freizusetzen. Dies beseitigt die Erfordernis,
unter Verwendung von herkömmlichen,
zeitaufwendigen Verfahren Pilzmyzel zu kultivieren und DNA zu extrahieren.
Der PCR-Amplifikationsvorgang
ist erheblich einfacher als das Übertragen von
DNA auf Nylonmembranen und die Hybridisierung mit einer radioaktiv
markierten Sonde. Eine PCR-Reaktion kann innerhalb von 3 Stunden
aufgestellt und laufen gelassen werden. Bis heute aufgezeichnete
Empfindlichkeit lag in dem Bereich von 100 fg bis 10 pg von reiner
DNA, was mehr ist als die durch Hybridisierung, weil die PCR die
DNA amplifiziert.
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Während weitere
Abwandlungen und Verbesserungen angebracht werden können, ohne
den Bereich dieser Erfindung zu verlassen, ist Folgendes eine Beschreibung
eines oder mehrere Beispiele der Erfindung mit Bezug auf die beigelegten
Zeichnungen.
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Kurze Beschreibung der
Zeichnungen
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1a ist
eine schematische Darstellung der Schritte der Polymerase-Kettenreaktion (PCR);
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1b ist
eine schematische Darstellung der Schritte der verschachtelten PCR;
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2 ist
ein Negativbild eines mit Ethidiumbromid gefärbten Gels von PCR-Produkten,
die mit P. cambivora spezifischen Primern (Primer 2 und Primer 3)
mit DNA eines Bereichs der Phytophthora-Arten amplifiziert wurden.
Bahn 1–9
P. fragariae var. fragariae Rassen A1, A2, A3, A4, A6, A7, A8, A9
und A10, Bahn 10 P. cambivora, Bahn 11 P. cinnamomi, Bahn 12 P.
fragariae var. rubi, Bahn 13 P. cactorum, Bahn 14, P. cryptogea, Bahn
15 P. drechsleri, Bahn 16 P. megasperma, Bahn 17 Kontrolle. Bahn-DNA-Leiter;
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3 zeigt
den Nachweis von Phytophthora cryptogea in infizierten Tomatenpflanzen.
1 – Markerbahn;
2 – reine
DNA von P. cryptogea; 3 – negative
Kontrolle ohne DNA; 4–9
infizierte Tomatenstängel;
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4A zeigt
ein Agarosegel, das Amplifikationsprodukte trennt, welche mit (A)
der universalen Primerkombination ITS6 und ITS4 und (B) dem Peronosporales
Primer 8 und dem universalen Primer ITS4 erhalten wurden. In A:
Bahnen 1 – Marker;
Bahn 2 – Phaeodactylum
tricornata; Bahn 3 – Saprolegnia
ferax; Bahn 4 – Thraustotheca
clavata; Bahn 5 – Achyla
radiosa; Bahn 6 – Saprolegnia
turfosa; Bahn 7 – Brevilegnia
gracilis; Bahn 8 – Pythium
sylvaticum*; Bahn 9 – Phytophthora
infestans*; Bahn 10 – Peronospora
viciae*; Bahnen 11 – bis
14 – vier
Isolate von Peronospora sparsa*; Bahn 15 – Albugo candida*; Bahn 16 – Kontrolle,
keine DNA.
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4B.
Amplifikationsprodukte, die mit der Primerkombination DC6 und ITS4
erhalten wurden: Bahnen 1- Marker; Bahn 2 – Phaeodactylum tricornata;
Bahn 3 – Saprolegnia
ferax; Bahn 4 – Thraustotheca
clavata; Bahn 5 – Achyla
radiosa; Bahn 6 – Saprolegnia
turfosa; Bahn 7 – Brevilegnia
gracilis; Bahn 8 – Pythium sylvaticum*;
Bahn 9 – Phytophthora
infestans*; Bahn 10 – Peronospora
viciae*; Bahnen 11 und 12 – Peronospora
sparsa*; Bahn 13 – Albugo
candida*; Bahn 14 – Kontrolle,
keine DNA; (* – Art,
die zu den Peronosporales gehört);
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5 zeigt
die Amplifikation von DNA aus 18 Arten von Phytophthora und Pythium
durch den Peronosporales-Primer DC6 und ITS4: Bahn 1 – Marker;
Bahn 2 – Kontrolle,
keine DNA; Bahn 3 Phytophthora fragariae; Bahn 4 – Phytophthora
capsici; Bahn 5 – Phytophthora
palmivora; Bahn 6 – Phytophthora
drechsleri; Bahn 7 – Phytophthora
megasperma; Bahn 8 – Phytophthora
cryptogea; Bahn 9 – Phytophthora
cinnamomi; Bahn 10 – Phytophthora
syringae; Bahn 11 – Phytophthora
citricola; Bahn 12 – Phytophthora
cambivora; Bahn 13 – Phytophthora
nicotianae; Bahn 14 – Phytophthora
idaei; Bahn 15 – Phytophthora
erythroseptica; Bahn 16 – Phytophthora
citrophthora; Bahn 17 – Phytophthora
infestans; Bahn 18 – Phytophthora
cactorum; Bahn 19 – Pythium
sylvaticum; Bahn 20 – Pythium
ultimum;
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6 zeigt
eine graphische Darstellung, welche den Nachweis der Infektion von
Erdbeerwurzeln durch Phytophthora fragariae var. fragariae mittels
direkter PCR (Weiß)
mit spezifischen Primern für
P. fragariae, und verschachtelter PCR (Schwarz), zunächst mit
dem Peronosporales Primer und den ITS4 Primern, dann denselben spezifischen
Primern, anzeigt; und
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7 zeigt gleich ausgerichtete DNA-Sequenzen
der ITS1-Regionen verschiedener Phytophthora-Arten.
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Materialien und Verfahren
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- 1. Kultivierung der Pilze: Die Pilze wurden
auf schrägen
Hafermehl-Agar-Kulturen
bei 4°C
gehalten. Das auf Gartenbohnen-Agarmedium bei 20°C im Dunkeln gezüchtete Myzel
wurde abgestreift und verwendet, um 20 ml eines definierten Saccharose/Asparagin/Mineralsalz-Mediums
bei 20°C
im Dunkeln anzuimpfen. Nach 1 Woche wurde das Myzel durch das Filtern
durch Filterpapier geerntet, mit destilliertem Wasser gewaschen
und gelagert (–20°C). Die Zoosporen
wurden hergestellt, indem Myzel-Agar-Pfropfen in ein Wasserextrakt aus erdfreiem
Kompost 3 Tage lang bei 14 °C
im Dunkeln gegeben wurden, wobei das Extrakt jeden Tag gewechselt
wurde. Am letzten Tag wurde das Extrakt durch destilliertes Wasser
ersetzt, und nach der Inkubation über Nacht bei 4°C und vier
Stunden bei Raumtemperatur wurden die Zoosporen eingesammelt.
- 2. Pflanzen: Erdbeerpflanzen, Sorte Alexandria, wurden aus Samen
6 Wochen lang in Töpfen
gezüchtet. Kurz
vor der Animpfung wurde Wasser in den Topf gegossen, um die Erde
zu durchtränken.
Die Pflanzen wurden dann mit einer Suspension von 25000 Zoosporen
in 50 ml Wasser und zu verschiedenen Zeitabständen angeimpft; danach wurden
die Pflanzen aus den Töpfen
entfernt, ihre Wurzeln wurden in Leitungswasser gewaschen und zwei
cm lange Wurzelfragmente wurden abgeschnitten und unter einem Fluoreszenzmikroskop
untersucht oder direkt für
die DNA-Extraktion
verwendet.
- 3. DNA-Extraktion: Pilz-DNA wurde extrahiert, indem gemäß den Herstellerempfehlungen
ein Nucleon II Extraktionskit (Scotlab Ltd., Glasgow, Vereinigtes
Königreich)
verwendet wurde. Es wurden zwischen 150 und 250 mg komprimierter
Feuchtgutmasse von Myzel in einem zur Verwendung in 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen verkleinerten
Protokoll extrahiert; dies ergab 30 bis 50 μg DNA. Die Pflanzen-DNA wurde
aus zwei oder drei 2 cm langen Wurzelfragmenten extrahiert.
- 4. PCR-Bedinpungen: Die Reaktionsgemische waren je nach Primer
unterschiedlich, und so auch die Zykluszeiten und -temperaturen.
Im Allgemeinen wurden die Primer bei 1 mM mit 0,2 mM der vier dNTPs,
1 mg ml-1, 0,05 Einheiten von Taq-Polymerase pro μl Reaktion
und dem PCR-Puffer,
der mit dem Enzym (20 mM Tris-HCI pH-Wert 8,4, 50 mM KCl, 1,5 mM
MgCl2) bereitgestellt wurde, verwendet.
Test-DNA (0,5 μl) wurde
am Ende in das Reaktionsgemisch zugegeben. Im Falle der verschachtelten
PCR wurde das Amplifikationsprodukt, das nach der ersten Runde PCR
erhalten wurde, einhundert mal in sterilem Wasser verdünnt, und
der zweiten Runde PCR wurden 0,5 μl
zugegeben. Je nach Erfordernissen könnte das endgültige Volumen
der PCR-Reaktion 25, 50 oder 100 μl
betragen.
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Die
Thermocyclerparameter für
die direkte und verschachtelte PCR waren wie folgt: Die DNA wurde bei
94°C 3 Min.
lang denaturiert. Für
die direkte PCR mit Primern 1 und 2 wurden die Röhrchen 25 Zyklen Denaturierung
bei 94°C,
30 Sek., Annealing 65°C,
15 Sek. und Synthese, 72°C
unterzogen. Für
die verschachtelte PCR in der ersten Runde mit Primern Primer 8
und ITS4 wurde die DNA bei 94°C
3 Min. lang denaturiert, gefolgt von 30 Zyklen Denaturierung bei
94°C, 30
Sek., Annealing 55°C,
15 Sek. und Synthese 72°C
für 1 Min. 30
Sek. Die Reaktion wurde abgeschlossen, indem die Röhrchen 10
Min. lang bei 72°C
stehen gelassen wurden. In der zweiten Runde mit Primern 1 und 2
wurde die DNA bei 94°C
3 Min. lang denaturiert, gefolgt von 23 Zyklen Denaturierung bei
94°C, 30
Sek., Annealing 65°C,
15 Sek. und Synthese 72°C,
1 Min. 30 Sek. Die Reaktion wurde abgeschlossen, indem die Röhrchen 10
Min. lang bei 72°C
stehen gelassen wurden.
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Die
Ergebnisse der PCR-Reaktion wurden durch Elektrophorese der PCR-Produkte auf einem
TAE 1X (40 mM Tris-Acetat, 1 mM EDTA)-Agarosegel untersucht, wobei
mit Ethidiumbromid (0,5 μg/ml)
gefärbt
und mit UV-Licht
beleuchtet wurde.
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Beispiele
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Die
ribosomalen ITS-Regionen und flankierenden Sequenzen, die in SEQ
ID NO: 12–39
gezeigt sind, wurden sequenziert, und die Oligonukleotide wurden
mittels chemischer Standard-Verfahren synthetisiert, um spezifische
Amplifikation der ITS- (oder flankierenden) Regionen ausgewählter Phytophthora
und anderer Pilz-Arten zu ermöglichen.
Derartige Primer ermöglichen
ein Identifikations- und Nachweissystem in einem einzelnen Schritt,
in dem die Anwesenheit eines PCR amplifizierten DNA-Produkts die
Anwesenheit und Identität
des Krankheitserregers bestätigt.
Einzelheiten der Primer sind unten in Tabelle 1 gezeigt:
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Beispiel 1
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Der
Vorwärts-Primer
DC1, der einer einzigartigen Sequenz in der ITS1-Region von Phytophthora fragariae var.
fragariae rDNA entspricht, wurde synthetisiert und weist die Sequenz
auf, die in SEQ ID NO: 1 gezeigt ist. Der Rückwärts-Primer DC5 weist eine Sequenz
auf, die in SEQ ID NO: 2 gezeigt ist, und wurde von der ITS2-Region
von Phytophthora fragariae var. fragariae rDNA abgeleitet. Wenn
diese Primer bei einer geeigneten Annealingtemperatur (z. B. 62°C) zusammen
verwendet wurden, amplifizierten sie ein Band (550 bp) aus zehn
Isolaten von P. fragariae var. fragariae und vier P. fragariae var.
rubi von unterschiedlichen physiologischen Rassen und/oder geographischen
Ursprüngen.
Im Gegensatz dazu wurde aus 16 anderen Arten keine DNA amplifiziert:
P. cactorum, P. cambivora, P. capsici, P. cinnamomi, P. citricola,
P. citrophthora, P. cryptogea, P. drechsleri, P. erythoseptica,
P. gonapodyides, P. idaei, P. ilicis, P. megasperma, P. nicotianae,
P. palmivora und P. syringae. Anfänglich trat ein schwaches Band
mit P. syringae auf, jedoch beseitigte eine geringfügige Modifikation
der Bedingungen dieses Artefakt.
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Die
Primer wurden um so wenige wie drei Basenpaarunterschiede an ihren
3'-Enden gestaltet,
was für die
spezifische DNA-Amplifikation ausreichte. DC1 und DC5 wurden entweder
in direkter PCR für
P. fiagariae oder in der zweiten Runde einer verschachtelten PCR
nach den Primern DC6 und ITS4 verwendet.
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Beispiel 2
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Der
Vorwärts-Primer
DC4 weist die Sequenz, die in SEQ ID NO: 3 gezeigt ist, auf und
ist komplementär zu
einer einzigartigen Sequenz in Phytophfhora cambivora ITS1 rDNA.
Wenn diese Primer mit dem Rückwärts-Primer
ITS2 (siehe Referenz 5) oder DC5 über einer geeigneten Annealingtemperatur
(z. B. 60–62°C) verwendet
werden, amplifizieren sie ein 530 by Band aus der DNA, die nur aus
der oben genannten Art gewonnen wurde. Die DNA von anderen Arten
zeigte keine Amplifikationsprodukte (siehe 2).
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Beispiel 3
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Der
Primer DC3 ist von einer Sequenz abgeleitet, die für die ITS1-Region
von Phytophthora nicotianae und P. infestans einzigartig ist (wobei
die Spezifität
nicht auf eine einzelne Art herabgeht), und weist die Sequenz auf,
die in SEQ ID NO: 4 gezeigt ist. Wenn diese Primer zusammen mit
dem Primer ITS2 oder ITS4 (siehe Referenz 5) bei einer geeigneten
Annealingtemperatur (z. B. 58°C)
verwendet werden, sind sie für
die oben genannten Arten spezifisch. DC3 amplifiziert auch ein Band,
das spezifische von P. nicotianae-DNA ist, wenn er zusammen mit
DC8 verwendet wird.
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Beispiel 4
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Der
Primer DC8 (Rückwärts) ist
von der ITS2-Region von P. nicotianae abgeleitet und weist die Sequenz
auf, die in SEQ ID NO: 5 gezeigt ist. Wenn die Primer zusammen mit
DC3 verwendet werden, amplifizieren sie ein Band, das nur von jener
Art stammt.
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Beispiel 5
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Der
Primer ADF1 (Vorwärts)
ist von der ITS1-Region von P. cactorum abgeleitet und hatte die
Sequenz, die in SEQ ID NO: 6 gezeigt ist. Der Primer ADR1 (Rückwärts) weist
eine Sequenz, die in SEQ ID NO: 7 gezeigt ist, auf und ist von einer
Sequenz ITS2-rDNA aus Phytophthora cactorum abgeleitet. Werden diese Primer
zusammen verwendet, amplifizieren sie ein Band von P. cactorum-DNA.
Die Primer ADF1 und ADR1 differenzieren nicht zwischen P. cactorum
und dem sehr eng verwandten P. idaei, das üblicherweise auf der Himbeere
vorkommt. Zwischen den Produkten von diesen zwei Arten besteht jedoch
ein Einzel-Basenpaar-Sequenzunterschied,
der mit Bst Ell, einem DNA-Restriktionsenzym, eine einzigartige
Restriktionsstelle erzeugt: das Produkt von P. idaei wird in zwei
Stücke
geschnitten, wohingegen das Produkt von P. cactorum nicht betroffen
ist, und die beiden PCR-Produkte können dadurch differenziert
werden. Die Primer ADF1 und ADF2 amplifizieren DNA von keiner der
anderen, oben aufgelisteten Arten.
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Wenn
ADR1 mit einem Primer ITS1 (8) verwendet wird, ist er für die Arten
von Phytophthora (d. h. P. cactorum, P. idaei und P. pseudotsugae)
der Gruppe 1 spezifisch.
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Beispiel 6
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Der
Primer DC9 ist ein Vorwärts-Primer,
der von der ITS1-Region von P. cinammomi abgeleitet ist, und weist
die Sequenz auf, die in SEQ ID NO: 8 gezeigt ist. DC9 amplifiziert
ein Band von DNA von P. cinammomi spezifisch, wenn er zusammen mit
DC5 verwendet wird.
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Beispiel 7
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Der
Primer CRYF (Vorwärts)
weist eine Sequenz auf, die in SEQ ID NO: 9 gezeigt ist, und ist
von einer einzigartigen Stelle in der ITS1-rDNA von P. cryptogea
abgeleitet. Der Primer CRYR ist ein Rückwärts-Primer von der ITS2-Region
desselben Organismus, der die Sequenz, die in SEQ ID NO: 10 gezeigt
ist, aufweist. Wenn diese beiden Primer zusammen verwendet wurden,
wiesen sie P. cryptogea in mit P. cryptogea infizierten Tomatenstängelbasen
und in der Steinwolle, in der die Pflanzen gewachsen waren, nach
(siehe 3). Außerdem
haben sie aus keiner anderen, oben erwähnten Phytophthora-Art DNA
amplifiziert.
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Beispiel 8
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Der
Primer DC6, der die Sequenz aufweist, die in SEQ ID NO: 11 gezeigt
ist, wurde erhalten, indem Sequenzen des 18S-Gens von rDNA von Angehörigen der
Oomycota, einschließlich
Pilzen, die den Peronosporales angehören, anderer Ordnungen, Pflanzen
und andere Pilze verglichen wurden. Ein Vorwärts-Primer wurde dann gestaltet,
der nur mit Angehörigen
der Peronosporales reagiert, wenn er zusammen mit dem veröffentlichten
universalen Primer ITS4, 5'-CAGGGACTTTGGGTAATCA
(White et al., 1990) verwendet wird, dessen Sequenz von dem Anfang
des 28S-rDNA-Gens abgeleitet ist, und der ein 1500 bp Produkt, das
sowohl ITS1- als auch ITS2-rDNA Sequenzen aller getesteter Pilze,
die der Ordnung Peronosporales (Pythium ultimum und Pythium sylvaticum)
und Gewebe von einer Auswahl von Pflanzenarten, die mit den falschen
Mehltauen (Peronospora viciae, Peronospora sparsa, Peronospora parasitica
oder Albugo candida) infiziert wurden, außer Bremia lactucae, einem
falschen Mehltau, angehören,
enthält.
Mit den Isolaten von Achlya spp., Saprolegnia spp. und Thraustotheca
spp., die anderen Ordnungen der Oomycetes angehören, oder mit gesunden Pflanzen
wurde keine Amplifikation erhalten.
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DC6
amplifizierte ein Produkt mit einer Anzahl von anderen falschen
Mehltauen, einschließlich
mehreren Peronospora spp. und Albugo candida. DC6 amplifiziert kein
Produkt mit anderen Pilzen, selbst nicht mit jenen, die der Oomycota
angehören,
wenn sie nicht Angehörige
der Ordnung Peronosporales sind (4A, B). Falsche Mehltaue sind obligate Krankheitserreger
und treten stets in enger Verbindung mit ihren Wirten auf; dennoch
wurde nur ein einziges PCR-Produkt erhalten, als DNA von Pflanzen,
die mit falschen Mehltauen infiziert wurden, amplifiziert wurde,
und dieses Produkt kam von den falschen Mehltauen, nicht den Pflanzen. Bei
universalen Primern wurden immer zwei Produkte erhalten, eines von
der Pflanze und das andere von dem Pilz.
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Die
Universalität
der Anwendung dieses Primers auf die Phytophthora-Arten und Pythium
ist aus 5 ersichtlich. Der Teilausfall
mit P. palmivora, der in Bahn 5 beobachtet wurde, trat in späteren Experimenten
nicht auf.
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6 zeigt
klar die Verbesserung der verschachtelten PCR bei dem Nachweis in
infiziertem Pflanzenmaterial (in diesem Fall Erdbeerwurzeln) auf,
indem der Peronosporales DC6 Primer gegenüber direkter PCR mit dem spezifischen
Primer alleine verwendet wurde; es wurde bei beiden Verfahren mit
DNA von den Wurzeln der Kontrollen keine Amplifikation erhalten.
Nach zwei Tagen ergaben nur 30% der Proben von angeimpften Pflanzen
ein Produkt mit direkter PCR, aber nach vier Tagen war dies auf
100% angestiegen, und obgleich es an Tagen 5 und 6 sank (60–70%), stieg
es bis zum Ende des Experiments wieder auf 100% an. Demgegenüber waren
alle Proben mit der verschachtelten PCR ab dem 2. Tag positiv.
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Die
verschachtelte PCR wurde auch mit DNA-Proben verwendet, die zwei
Stunden, 16 Stunden und ein Tag nach der Animpfung extrahiert wurden.
P. fragariae wurde in allen Proben, die einen Tag nach der Animpfung
entnommen wurden, nachgewiesen, jedoch nur in einigen Wurzeln nach
16 Stunden und in keiner nach zwei Stunden.
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7 zeigt eine Auflistung von DNA-Sequenzen
der ITS1-Regionen verschiedener Phytophtora-Arten, die gleich ausgerichtet
sind, um die Konservierungsregionen (in Schwarz) und die Variationsregionen
(in Weiß)
zu zeigen. Wenn Primer konstruiert werden, um eine oder eine Gruppe
von Arten von den restlichen Arten zu differenzieren, kann ein Fachmann
eine Oligonukleotidsequenz auswählen,
die zwischen den Arten von Interesse variiert oder konstant ist.
Zum Beispiel differenziert ein Oligonukleotid, das die Sequenz 5'-TCTCGGG umfasst,
die Gruppe P. fragariae, P. cambivora und P. cinammomi von den anderen.
Unter Verwendung von verschachtelten PCR-Techniken oder eines geeigneten
Rückwärts-Primers,
der für
eine dieser ausgewählten
Arten spezifisch ist, kann die ausgewählte Gruppe auf eine einzelne
Art reduziert werden.
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Abwandlungen
und Verbesserungen können
angebracht werden, ohne den Bereich der Erfindung zu verlassen.
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Literaturnachweis
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Folgende
Dokumente sind hier unter Bezugnahme aufgenommen:
- 1
Goodwin P. H., Kirkpatrick B. C. und Duniway J. M. (1989). Phytopathology
79, 716–721.
- 2 Lee S. B. und Taylor J. W. (1992) Journal of Molecular Biology
and Evolution 9, 636–653.
- 3 White T. J. et al. (1990) In PCR Protocols (Hrsg. M. A. Innis,
D. H. Gelfand, J. J. Sninsky und T. J. White) 315–322, Academic
Press: San Diego.
- 4 Berbee, M. L. u. Taylor, J. W. (1992). Canadian Journal of
Botany 71, 1114–1127.
- 5 Gray, M. W. et al. (1984). Nucleic Acids Research 12, 5834–5852
- 6 Nues, R. W. et al. (1994). Nucleic Acids Research 22, 912–919.
- 7 Sherriff C. et al. (1994). Experimental Mycology 18, 121–138.
- 8 Zambino, P. J. u. Szabo, L. J. (1993). Mycologia 85, 401–414.
- 9 Gunderson, J. H. et al. (1987). PNAS USA. 84, 5823–5827.
- 10 Britische Patentanmeldung Nr. 9509112.0.
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