DE19509695A1

DE19509695A1 - Verfahren zur Herstellung einer modifizieren Stärke in Pflanzen, sowie die aus den Pflanzen isolierbare modifizierte Stärke

Info

Publication number: DE19509695A1
Application number: DE19509695A
Authority: DE
Inventors: Jens Kosmann; Franziska Springer
Original assignee: Institut fuer Genbiologische Forschung Berlin GmbH
Current assignee: Bayer CropScience AG
Priority date: 1995-03-08
Filing date: 1995-03-08
Publication date: 1996-09-12
Also published as: CA2214736A1; US6610843B1; EP0813605A1; HUP9801855A3; HUP9801855A2; JPH11501213A; AU5104196A; WO1996027674A1; US6162966A; AU713917B2; PL322142A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung einer modifizierten Stärke in transgenen Pflanzen, insbesondere einer Stärke, die im Vergleich zu in Wildtyppflanzen synthetisierter Stärke veränderte Verkleisterungseigenschaften und einen erhöhten Phosphatgehalt besitzt. Ferner betrifft die Erfindung die aus Pflanzen isolierbare modifizierte Stärke, sowie die Verwendung von DNA- Sequenzen, die für Disproportionierende Enzyme (EC 2.4.1.25) kodieren, für die Herstellung von Pflanzen, die eine verringerte Aktivität dieser Enzyme aufweisen und die eine modifizierte Stärke synthetisieren.

Das Polysaccharid Stärke, das einen der wichtigsten Speicherstoffe im Pflanzenreich darstellt, findet neben der Verwendung im Nahrungsmittelbereich auch eine breite Verwendung als nachwachsender Rohstoff für die Herstellung industrieller Produkte. Um die Anwendung dieses Rohstoffes in möglichst vielen Einsatzgebieten zu ermöglichen, ist es notwendig, eine große Stoffvielfalt und eine Anpassung an die jeweiligen Anforderungen der zu verarbeitenden Industrie zu erreichen.

Obwohl Stärke aus einem chemisch einheitlichen Grundbaustein, der Glukose, aufgebaut ist, stellt Stärke keinen einheitlichen Rohstoff dar. Es handelt sich dabei eher um ein komplexes Gemisch aus unterschiedlichen Molekülformen, die sich hinsichtlich ihres Verzweigungsgrades und des Auftretens von Verzweigungen der Glukoseketten unterscheiden. Man unterscheidet insbesondere die Amylose-Stärke, ein im wesentlichen unverzweigtes Polymer aus α-1,4-verknüpften Gluosemolekülen, von der Amylopektin-Stärke, die ein Gemisch aus unterschiedlich stark verzweigten Glukoseketten darstellt, wobei die Verzweigungen durch das Auftreten von α-1,6-glykosidischen Verknüpfungen zustande kommen.

Die molekulare Struktur der Stärke, die zu einem großen Teil durch den Verzweigungsgrad, das Amylose/Amylopektin-Verhältnis, die durchschnittliche Kettenlänge sowie das Vorhandensein von Phosphatgruppen bestimmt wird, ist ausschlaggebend für wichtige funktionelle Eigenschaften der Stärke bzw. ihrer wäßrigen Lösungen. Als wichtige funktionelle Eigenschaften sind hierbei beispielsweise zu nennen die Löslichkeit, das Retrogradierungsverhalten, die Filmbildungseigenschaften, die Viskosität, die Farbstabilität, die Verkleisterungseigenschaften, d. h. Binde- und Klebeigenschaften, sowie die Kältestabilität. Auch die Stärkekorngröße kann für verschiedene Anwendungen von Bedeutung sein.

Die Anpassung der aus Pflanzen isolierbaren Stärke an bestimmte industrielle Verwendungszwecke erfolgt häufig mit Hilfe chemischer Modifikationen, die in der Regel zeit- und kostenintensiv sind. Es erscheint daher wünschenswert, Möglichkeiten zu finden, modifizierte Stärke, die in ihren Eigenschaften bereits den Anforderungen der verarbeitenden Industrie entspricht, direkt in Pflanzen zu synthetisieren und die modifizierte Stärke aus diesen Pflanzen zu isolieren.

Herkömmliche Wege zur Herstellung von Pflanzen, die eine im Vergleich zu Wildtyppflanzen modifizierte Stärke synthetisieren, bestehen in klassischen Züchtungsverfahren und der Erzeugung von Mutanten. So wurde beispielsweise bei Mais eine Mutante erzeugt, die eine Stärke mit veränderten Viskositätseigenschaften synthetisiert (US Patentschrift 5,331,108), sowie eine Maissorte (waxy maize) durch Züchtung etabliert, deren Stärke zu nahezu 100% aus Amylopektin besteht (Akasuka und Nelson, 1966, J. Biol. Chem. 241: 2280-2285).

Alternativ können Pflanzen, die eine Stärke mit veränderten Eigenschaften synthetisieren, mit Hilfe gentechnischer Verfahren erzeugt werden. Beschrieben wurde beispielsweise in mehreren Fällen die gentechnische Veränderung von Kartoffelpflanzen, mit dem Ziel der Veränderung der in den Pflanzen synthetisierten Stärke (z. B. WO 92/11376; WO 92/14827). Obwohl bereits in einigen Fällen die Herstellung einer veränderten Stärke in Pflanzen gelang, besteht nach wie vor Bedarf an Verfahren zur Herstellung einer im Vergleich zu in Wildtyppflanzen synthetisierter Stärke modifizierten Stärke, die sich in speziellen industriellen Verarbeitungsprozessen bevorzugt einsetzen läßt.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, Verfahren zur Herstellung einer modifizierten Stärke, die sich hinsichtlich ihrer physikalischen und chemischen Eigenschaften von natürlicherweise in den Pflanzen synthetisierter Stärke unterscheidet und somit für spezielle Verwendungszwecke besser geeignet ist, zur Verfügung zu stellen.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß Kartoffelpflanzen, die im Vergleich zu Wildtyppflanzen eine verringerte Aktivität des "Disproportionierenden Enzyms" (auch 4-α-Glucanotransferase; EC 2.4.1.25; im folgenden D-Enzym genannt) aufweisen, eine modifizierte Stärke synthetisieren, die sich hinsichtlich ihrer physikalischen und chemischen Eigenschaften stark von natürlicherweise in Pflanzen synthetisierter Stärke unterscheidet. Wäßrige Lösungen der in diesen Pflanzen synthetisierten Stärke weisen beispielsweise im Vergleich zu in Wildtyppflanzen synthetisierter Stärke ein deutlich verändertes Viskositätsverhalten auf. Eine verringerte Aktivität des D-Enzyms im Vergleich zu Wildtyppflanzen bedeutet dabei, daß diese Pflanzen nur 50%, vorzugsweise weniger als 25% und besonders bevorzugt weniger als 10% der D-Enzymaktivität von Wildtyppflanzen aufweisen.

D-Enzyme sind dabei definiert als Enzyme, die den Transfer von Glukanen von einem 1,4-α-D-Glukan auf ein anderes 1,4-α-D-Glukan oder auf Glukose katalysieren. Effektive Glukan-Donatoren sind dabei Maltooligosaccharide, lösliche Stärke, sowie Amylopektin (Takaha et al., 1993, J. Biol. Chem. 268: 1391-1396). In der Regel wird eine Maltose-Gruppe übertragen, außer wenn Maltotetraose als Donor dient. In diesem Fall wird Maltotriose übertragen.

Gegenstand der Erfindung sind daher Verfahren zur Herstellung einer modifizierten Stärke, dadurch gekennzeichnet, daß zunächst Pflanzen, vorzugsweise stärkeproduzierende Pflanzen, hergestellt werden, deren intrazelluläre Aktivität des D-Enzyms (EC 2.4.1.25) im Vergleich zu Wildtyppflanzen verringert ist, und aus diesen Pflanzen Stärke isoliert wird. Derartige Pflanzen können sowohl durch herkömmliche Mutagenese-Verfahren erzeugt werden, als auch durch gezielte gentechnische Manipulation. Die Verringerung der Aktivität des D-Enzyms erfolgt dabei bevorzugt dadurch, daß in den Zellen der Pflanzen die Synthese eines D-Enzyms inhibiert wird, z. B. durch Inhibierung der Expression von DNA-Sequenzen, die für ein D-Enzym kodieren. Dies kann durch die Konstruktion eines geeigneten Ribozyms, durch einen Cosuppressions-Effekt oder vorzugsweise durch einen anti-sense-Effekt erfolgen. Für die Inhibierung der Expression endogener Gene durch einen anti sense-Effekt wird eine DNA-Sequenz, die zu einer endogenen, ein D-Enzym kodierenden DNA-Sequenz homolog ist, in anti-sense-Orientierung an einen Promotor fusioniert und in Zellen zur Expression gebracht. Dadurch wird eine anti-sense-RNA synthetisiert, die die Synthese des endogenen D-Enzyms inhibiert.

Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahren besteht aus folgenden Schritten:

i) Herstellung einer Expressionskassette, die folgende DNA-Sequenzen umfaßt:
- a) einen in pflanzlichen Zellen aktiven Promotor,
- b) eine DNA-Sequenz, die für ein D-Enzym (EC 2.4.1.25) kodiert und in anti sense-Orientierung an den Promotor fusioniert ist, und gegebenenfalls
- c) eine DNA-Sequenz, die die Termination der Transkription und die Polyadenylierung des Transkriptes gewährleistet,
ii) Transfer der besagten Expressionskassette in pflanzliche Zellen,
iii) Regeneration ganzer Pflanzen aus den transformierten Zellen und
iv) Isolierung der in den Pflanzen synthetisierten Stärke.

Für den unter a) genannten Promotor kommt im Prinzip jeder in pflanzlichen Zellen aktive Promotor in Frage. Es können sowohl virale als auch pflanzliche Promotoren verwendet werden. Der Promotor kann homolog oder heterolog in bezug auf die verwendete Pflanzenspezies sein. Geeignet sind sowohl Promotoren, die eine konstitutive Expression gewährleisten, wie beispielsweise der 35S-Promotor des Cauliflower-Mosaik-Virus (Odell et al., 1985, Nature 313: 810-812) und das in der WO/9401571 beschriebene Promotorkonstrukt, als auch Promotoren, die nur zu einem durch äußere Einflüsse determinierten Zeitpunkt (siehe beispielsweise WO/9307279) oder in einem bestimmten Gewebe der Pflanze zu einer Expression nachgeschalteter Sequenzen führen (siehe z. B. Stockhaus et al., 1989, EMBO J. 8: 2245-2251). Präferentiell werden Promotoren eingesetzt, die in typischen "sink"-Organen von Pflanzen aktiv sind. "Sink"- Gewebe sind definiert als Nettoimporteure des in photosynthetisch aktiven Geweben fixierten Kohlenstoffs. Typische sink-Organe sind z. B. Wurzeln, Blüten und Speicherorgane. In dem erfindungsgemäßen Verfahren werden ferner bevorzugt Promotoren verwendet, die in den stärkespeichernden Organen der zu transformierenden Pflanzen aktiv sind. Als stärkespeichernde Organe kommen z. B. die Samen von verschiedenen Getreidearten, Mais, Reis, und Erbse in Frage, sowie die Knollen von Kartoffeln. Bekannt ist zum Beispiel der USP-Promotor aus Vicia faba, der eine samenspezifische Expression in Vicia faba sowie in anderen Pflanzenarten gewährleistet (Fiedler et al., 1993, Plant Mol. Biol. 22: 669-679; Bäumlein et al., 1991, Mol. Gen. Genet. 225: 459-467), sowie der Promotor des Acyl Carrier Protein-Gens (Baerson et al., 1993, Plant Mol. Biol. 22: 255-267). Promotoren, von denen bekannt ist, daß sie im Endosperm von Maiskörnern aktiv sind, sind beispielsweise die Promotoren der Zein-Gene (Pedersen et al., 1982, Cell 29: 1015-1026; Quattrocchio et al., 1990, Plant Mol. Biol. 15: 81-93). Zur Transformation der Kartoffel können insbesondere, aber nicht ausschließlich, Promotoren der Patatingene der Klasse I aus Kartoffel verwendet werden, die eine knollenspezifische Expression gewährleisten, wie beispielsweise der B33- Promotor (Rocha-Sosa et al., 1989, EMBO J. 8: 23-29).

Neben dem Promotor kann das gemäß Verfahrensschritt a) konstruierte DNA- Molekül auch DNA-Sequenzen enthalten, die eine weitere Steigerung der Transkription gewährleisten, beispielsweise sogenannte Enhancer-Elemente, oder DNA-Sequenzen, die im transkribierten Bereich liegen und die eine effizientere Translation der synthetisierten RNA in das entsprechende Protein gewährleisten. Derartige 5′-nichttranslatierte Regionen können von viralen Genen oder geeigneten eukaryontischen Genen gewonnen werden oder synthetisch hergestellt werden. Sie können homolog oder heterolog in bezug auf den verwendeten Promotor sein.

Bei der unter b) genannten DNA-Sequenz kann es sich prinzipiell um jede beliebige DNA-Sequenz handeln, die für ein D-Enzym kodiert. Bevorzugt werden DNA-Sequenzen aus Pflanzen verwendet. Es handelt sich dabei vorzugsweise um eine DNA-Sequenz homologen Ursprungs in bezug auf die zu transformierende Pflanzenspezies. Es können jedoch auch DNA-Sequenzen aus anderen Spezies verwendet werden, solange gewährleistet ist, daß die Homologie zu den endogenen DNA-Sequenzen der zu transformierenden Spezies hoch genug ist, um einen anti-sense-Effekt zu gewährleisten. Dabei sollte die Homologie höher als 80%, vorzugsweise höher als 90% und insbesondere höher als 95% sein.

Es können Sequenzen bis zu einer Mindestlänge von 15 bp verwendet werden. Eine inhibierende Wirkung ist aber auch bei der Verwendung kürzerer Sequenzen nicht ausgeschlossen. Bevorzugt werden längere Sequenzen zwischen 100 und 500 Basenpaaren verwendet, für eine effiziente anti-sense-Inhibition werden insbesondere Sequenzen mit einer Länge über 500 Basenpaaren verwendet. In der Regel werden Sequenzen verwendet, die kürzer als 5000 Basenpaare sind, bevorzugt Sequenzen, die kürzer als 2500 Basenpaare sind.

Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sieht die Verwendung einer DNA-Sequenz aus Kartoffel vor, die für das D-Enzym kodiert, oder von Teilen einer derartigen Sequenz, insbesonder der DNA-Sequenz, die von Takaha et al. (1993, J. Biol. Chem. 268: 1391-1396) beschrieben wird (zugänglich in der GenEMBL-Datenbank unter der Zugriffsnummer X68664).

Es ist jedoch auch möglich andere DNA-Sequenzen zu verwenden, die für D- Enzyme kodieren und die sich aus anderen Organismen, insbesondere aus anderen Pflanzenspezies, isolieren lassen, z. B. mit Hilfe der bereits bekannten Sequenzen.

Die unter c) genannte DNA-Sequenz dient der korrekten Beendigung der Transkription sowie der Addition eines Poly-A-Schwanzes an das Transkript, dem eine Funktion bei der Stabilisierung der Transkripte beigemessen wird. Derartige Elemente sind in der Literatur beschrieben und sind beliebig austauschbar. Beispiele für derartige Terminationssequenzen sind die 3′- nichttranslatierten Regionen, die das Polyadenylierungssignal des Nopalin- Synthase-Gens (NOS-Gen) oder des Octopinsynthase-Gens (Gielen et al., 1989, EMBO J. 8: 23-29) aus Agrobakterien umfassen, oder die 3′-nichttranslatierten Regionen der Gene der Speicherproteine aus Sojabohne, sowie die der Gene der kleinen Untereinheit der Ribulose-1,5-Bisphosphat-Carboxylase (ssRUBISCO).

Die Bestandteile der oben beschriebenen Expressionskassette werden in einer dem Fachmann geläufigen Weise miteinander verknüpft, die die Synthese von Transkripten nach Einführung in pflanzliche Zellen ermöglicht.

Zur Herstellung derartiger Expressionkassetten stehen eine große Anzahl von Klonierungsvektoren zur Verfügung, die ein Replikationssignal für E.coli und ein Markergen zur Selektion transformierter Bakterienzellen enthalten. Beispiele für derartige Vektoren sind pBR322, pUC-Serien, M13mp-Serien, pACYC184 usw. Die gewünschte Sequenz kann an einer passenden Restriktionsschnittstelle in den Vektor eingeführt werden. Das erhaltene Plasmid wird für die Transformation von E. coli-Zellen verwendet. Transformierte E. coli-Zellen werden in einem geeigneten Medium gezüchtet, anschließend geerntet und lysiert. Das Plasmid wird wiedergewonnen. Als Analysemethode zur Charakterisierung der gewonnenen Plasmid-DNA werden im allgemeinen Restriktionsanalysen, Gelelektrophoresen und weitere biochemisch-molekularbiologische Methoden eingesetzt. Nach jeder Manipulation kann die Plasmid DNA gespalten und gewonnene DNA-Fragmente mit anderen DNA-Sequenzen verknüpft werden. Methoden zur Herstellung rekombinanter DNA-Moleküle sind in der Literatur vielfach beschrieben (siehe z. B. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbour, NY, Cold Spring Harbour Laboratory Press).

Für die Einführung der Expressionskassette in eine pflanzliche Wirtszelle stehen eine Vielzahl von Techniken zur Verfügung. Diese Techniken umfassen die Transformation pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmittel, die Fusion von Protoplasten, die Injektion, die Elektroporation von DNA, die Einbringung von DNA mittels der biolistischen Methode sowie weitere Möglichkeiten.

Die Einführung der beschriebenen Expressionskassette in pflanzliche Zellen erfolgt vorzugsweise unter Verwendung von Plasmiden, insbesondere von Plasmiden, die für die Transformation von Pflanzenzellen geeignet sind und die Integration der Expressionskassette in das pflanzliche Genom gewährleisten.

Bei der Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen werden an sich keine speziellen Anforderungen an die verwendeten Plasmide gestellt. Es können einfache Plasmide wie z. B. pUC-Derivate verwendet werden. Sollen aber aus derartig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, ist die Anwesenheit eines selektierbaren Markergens notwendig.

Je nach Einführungsmethode in die Pflanzenzelle können weitere DNA- Sequenzen erforderlich sein. Werden z. B. für die Transformation der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri-Plasmid verwendet, so muß mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch die rechte und linke Begrenzung der Ti- und Ri- Plasmid T-DNA als Flankenbereich mit den einzuführenden Genen verbunden werden.

Werden für die Transformation Agrobakterien verwendet, muß die einzuführende DNA in spezielle Plasmide kloniert werden, und zwar entweder in einen intermediären Vektor oder in einen binären Vektor. Die intermediären Vektoren können aufgrund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plasmid der Agrobakterien integriert werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige vir-Region. Intermediäre Vektoren können nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helferplasmids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden (Konjugation). Binäre Vektoren können sowohl in E.coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selektionsmarker-Gen und einen Linker oder Polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA Grenzregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agrobakterien transformiert werden (Holsters et al. (1978) Mol. Gen. Genet. 163: 181-187). Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium soll ein Plasmid, das eine vir-Region trägt, enthalten. Die vir-Region ist für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig. Zusätzliche T-DNA kann vorhanden sein. Das derartig transformierte Agrobakterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet. Bekannte binäre Vektoren sind beispielsweise der Vektor pBinAR (Höfgen und Willmitzer, 1990, Plant Sci. 66: 221-230) oder der Vektor pBin19 (Bevan, 1984, Nucl. Acids Res. 12: 8711-8721), der kommerziell erhältlich ist (Clontech Laboratories, Inc., USA).

Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist intensiv untersucht und ausreichend in EP 120516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerÿ Kanters B.V., Alblasserdam (1985), Chapter V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant. Sci., 4: 1-46 und An et al. (1985) EMBO J. 4: 277-287 beschrieben worden.

Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflanzen-Explantate zweckmäßigerweise mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kokultiviert werden. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (z. B. Blattstücke, Stengelsegmente, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Suspensions-kultivierte Pflanzenzellen) können dann in einem geeigneten Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion transformierter Zellen enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden. Die so erhaltenen Pflanzen können dann auf Anwesenheit der eingeführten DNA untersucht werden.

Ist die eingeführte DNA einmal im Genom der Pflanzenzelle integriert, so ist sie dort in der Regel stabil und bleibt auch in den Nachkommen der ursprünglich transformierten Zelle erhalten. Sie enthält normalerweise einen Selektionsmarker, der den transformierten Pflanzenzellen Resistenz gegenüber einem Biozid oder einem Antibiotikum wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin oder Phosphinotricin u. a. vermittelt. Der individuelle gewählte Marker sollte daher die Selektion transformierter Zellen gegenüber Zellen, denen die eingeführte DNA fehlt, gestatten.

Die transformierten Zellen wachsen innerhalb der Pflanze in der üblichen Weise (siehe auch McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5: 81-84). Die resultierenden Pflanzen können normal angezogen werden und mit Pflanzen, die die gleiche transformierte Erbanlage oder andere Erbanlagen besitzen, gekreuzt werden. Die daraus entstehenden hybriden Individuen haben die entsprechenden phänotypischen Eigenschaften.

Es sollten zwei oder mehrere Generationen angezogen werden, um sicherzustellen, daß das phänotypische Merkmal stabil beibehalten und vererbt wird. Auch sollten Samen geerntet werden, um sicherzustellen, daß der entsprechende Phänotyp oder andere Eigenarten erhalten geblieben sind.

Die in dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Transformation verwendeten Pflanzenzellen können prinzipiell von jeder beliebigen Pflanzenspezies stammen, insbesondere aus Pflanzen, die ein Protein mit D-Enzymaktivität exprimieren. Von Interesse sind sowohl monokotyle als auch dikotyle Pflanzen. Für verschiedene monokotyle und dikotyle Pflanzenspezies sind bereits Transformationstechniken beschrieben worden. Bevorzugt wird das Verfahren auf Nutzpflanzen, insbesondere auf Pflanzen, die Stärke als Speichersubstanz synthetisieren und Stärke-speichernde Organe bilden, wie zum Beispiel Getreidearten (z. B. Gerste, Weizen, Roggen, Hafer), Mais, Reis, Kartoffeln oder Erbse angewendet.

Die Isolierung der Stärke erfolgt nach herkömmlichen Methoden, wie z. B. beschrieben in "Handbuch der Stärke" (Band I, Max Ullmann (Hrsg.), 1974, Paul Parey Verlag, Berlin, Deutschland) oder in Morrison und Karkalas (1990, Methods in Plant Biochemistry, Vol. 2: 323-352; Academic Press Ltd., London).

Alternativ zu dem beschriebenen Verfahren können Pflanzen, die eine verringerte Aktivität des D-Enzyms aufweisen, auch mittels verschiedener anderer Verfahren hergestellt werden.

Bei verschiedenen Pflanzenarten ist es z. B. möglich, derartige Pflanzen mittels gängiger Mutagenese-Techniken herzustellen. Hierbei werden Mutanten erzeugt und anschließend hinsichtlich der Aktivität des D-Enzyms analysiert. Die Aktivität des D-Enzyms kann dabei z. B. bestimmt werden wie in Takaha et al. (1993, J. Biol. Chem. 268: 1391-1396) beschrieben. Alternativ kann die Expression von D-Enzym-Genen in den Mutanten mit Hilfe einer Northern-Blot-Analyse untersucht werden.

Eine weitere Möglichkeit besteht darin, die Synthese von D-Enzym in Zellen transgener Pflanzen mit Hilfe eines geeigneten Ribozyms zu inhibieren, das spezifisch Transkripte von endogenen D-Enzym-Genen endonukleolytisch spaltet.

Ribozyme sind katalytisch aktive RNA-Moleküle, die in der Lage sind, RNA- Moleküle an spezifischen Zielsequenzen zu spalten. Mit Hilfe gentechnologischer Methoden ist es möglich, die Spezifität von Ribozymen zu verändern. Es existieren verschiedene Klassen von Ribozymen. Für die praktische Anwendung mit dem Ziel, das Transkript eines bestimmten Gens gezielt zu spalten, werden bevorzugt Vertreter zweier verschiedener Gruppen von Ribozymen verwendet. Die eine Gruppe wird gebildet von Ribozymen die dem Typ der Gruppe I-Intron-Ribozymen zuzuordnen sind. Die zweite Gruppe wird von Ribozymen gebildet, die als charakteristisches Strukturmerkmal ein sogenanntes "hammerhead"-Motiv aufweisen. Die spezifische Erkennung des Ziel-RNA-Moleküls kann modifiziert werden durch Änderung der Sequenzen, die dieses Motiv flankieren. Diese Sequenzen bestimmen über Basenpaarung mit Sequenzen im Zielmolekül die Stelle, an der die katalytische Reaktion und somit die Spaltung des Zielmoleküls erfolgt. Da die Sequenzanforderungen für eine effiziente Spaltung äußerst gering sind, erscheint es daher im Prinzip möglich, spezifische Ribozyme für praktisch jedes beliebige RNA-Molekül zu entwickeln.

Die Herstellung genetisch veränderter Pflanzen, deren Aktivität des D-Enzyms drastisch reduziert ist, kann daher auch erfolgen durch Einführung und Expression eines rekombinanten doppelsträngigen DNA-Moleküls in Pflanzen, das sich zusammensetzt aus:

a) einem in Pflanzen funktionalen Promotor
b) einer DNA-Sequenz, die für eine katalytische Domäne eines Ribozyms kodiert und die flankiert ist von DNA-Sequenzen, die homolog sind zu Sequenzen des Zielmoleküls, und
c) , falls erforderlich, einem in Pflanzen funktionalen Signal für die Transkriptionstermination und Polyadenylierung eines RNA-Moleküls.

Für die unter Punkt b) genannte Sequenz kommt z. B. die katalytische Domäne der Satelliten-DNA des SCMo-Virus (Davies et al., 1990, Virology, 177: 216-224) oder die der Satelliten-DNA des TobR-Virus (Steinecke et al., 1992, EMBO J., 11: 1525-1530; Haseloff and Gerlach, 1988, Nature 334: 585-591) in Betracht. Die DNA-Sequenzen, die die katalytische Domäne flankieren, werden gebildet von DNA-Sequenzen, die homolog sind zu den Sequenzen endogener D- Enzym-Gene.

Für die unter a) und c) genannten Sequenzen gilt dasselbe, das schon oben für die Konstruktion von anti-sense-Konstrukten angeführt wurde.

Aufgrund der Verringerung der Aktivität des D-Enzyms wird in den Pflanzen eine modifizierte Stärke synthetisiert, die sich hinsichtlich ihrer physikalischen und chemischen Eigenschaften, insbesondere ihrer Verkleisterungseigenschaften sowie ihres Phosphatgehaltes, von in Wildtyppflanzen synthetisierter Stärke unterscheidet.

Gegenstand der Erfindung ist daher auch eine Stärke, die aus Pflanzen isolierbar ist, die im Vergleich zu Wildtyppflanzen eine verringerte D-Enzym-Aktivität aufweisen, insbesondere eine Stärke, die durch ein Verfahren herstellbar ist, das darauf beruht, daß zunächst Pflanzen hergestellt werden, deren intrazelluläre Aktivität des D-Enzyms (EC 2.4.1.25) im Vergleich zu Wildtyppflanzen verringert ist, und aus diesen Pflanzen die Stärke isoliert wird. Die Verringerung der Aktivität des D-Enzyms erfolgt dabei bevorzugt dadurch, daß in den Zellen der Pflanzen die Synthese eines D-Enzyms inhibiert wird, z. B. durch Inhibierung der Expression von DNA-Sequenzen, die für ein D-Enzym kodieren. Dies kann durch die Konstruktion eines geeigneten Ribozyms, durch einen Cosuppressions- Effekt oder vorzugsweise durch einen anti-sense-Effekt erfolgen. Für die Inhibierung der Expression endogener Gene durch einen anti-sense-Effekt wird eine DNA-Sequenz, die zu einer endogenen, ein D-Enzym kodierenden DNA- Sequenz homolog ist, in anti-sense-Orientierung an einen Promotor fusioniert und in Zellen zur Expression gebracht. Dadurch wird eine anti-sense-RNA synthetisiert, die die Synthese des endogenen D-Enzyms inhibiert. Insbesondere Gegenstand der Erfindung ist eine Stärke, die durch ein Verfahren herstellbar ist, das folgende Schritte umfaßt:

Für die Bestandteile der Expressionskassette, sowie für die Pflanzenzellen, Pflanzen, den Transfer der Expressionskassette in die Pflanzenzellen und die Isolierung der Stärke gilt dasselbe, was oben bereits im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gesagt wurde.

Die Stärke, die aus Pflanzen isoliert wird, bei denen die Synthese des D-Enzyms stark inhibiert ist, zeigt Charakteristika, die stark von denen abweichen, die Stärke zeigt, die aus Wildtyppflanzen isolierbar ist, z. B. veränderte Verkleisterungseigenschaften. Dies zeigt sich in einer veränderten Viskosität wäßriger Lösungen dieser Stärke im Vergleich zu wäßrigen Lösungen von Wildtyp-Stärke (siehe Fig. 3, 4, 5 und 6).

Ein gängiger Test, der verwendet wird, um die Viskositätseigenschaften zu bestimmen, ist der sogenannte Brabender-Test. Dieser Test wird durchgeführt unter der Verwendung eines Apparates, der beispielsweise als Viskograph E bekannt ist. Hergestellt und vertrieben wird dieses Instrument unter anderem von der Firma Brabender OHG Duisburg (Deutschland).

Der Test besteht im wesentlichen darin, daß Stärke in Gegenwart von Wasser zunächst erhitzt wird, um zu bestimmen, wann die Hydratisierung und das Schwellen der Stärkekörner einsetzt. Dieser Vorgang, der auch als Gelatinisierung bzw. Verkleisterung bezeichnet wird, beruht auf der Auflösung von Wasserstoffbrückenbindungen und geht einher mit einer meßbaren Viskositätszunahme der Stärkesuspension. Während eine weitere Erhitzung nach der Gelatinisierung zur vollständigen Auflösung der Stärkepartikel und einer Abnahme der Viskosität führt, kommt es bei einer Abkühlung unmittelbar nach der Gelatinisierung typischerweise zu einer Viskositätszunahme (siehe Fig. 6). Das Resultat eines Brabendertests ist eine Kurve, die die Viskosität in Abhängigkeit von der Zeit angibt, wobei zunächst eine Temperaturzunahme bis über die Gelatinisierungstemperatur und anschließend eine Abkühlung erfolgt. Die Analyse einer Brabender-Kurve zielt in der Regel ab auf die Bestimmung der Verkleisterungsstemperatur, der maximalen Viskosität bei Erhitzen der Viskosität nach längerem Kochen, der Viskositätszunahme bei Abkühlung sowie der Viskosität nach dem Erkalten. Diese Parameter sind wichtige Charakteristika, die die Qualität einer Stärke sowie ihre Verwendbarkeit für verschiedene Anwendungen bestimmen.

Ferner zeigt die Stärke, die aus Pflanzen mit einer verringerten D-Enzymaktivität isolierbar ist, im Vergleich zu Stärke aus Wildtyppflanzen einen erhöhten Phosphatgehalt, insbesondere einen Phosphatgehalt, der um mindestens 10% höher, vorzugsweise um 20% höher ist, als der Phosphatgehalt von Stärke aus Wildtyppflanzen.

Unter dem Begriff "modifizierte Stärke" wird daher im Rahmen dieser Erfindung eine Stärke verstanden, die sich hinsichtlich ihrer physikalischen und chemischen Eigenschaften von Wildtyp-Stärke unterscheidet, insbesondere eine Stärke, die im Vergleich zu Wildtypstärke veränderte Verkleisterungseigenschaften aufweist und deren wäßrige Lösungen im Vergleich zu wäßrigen Lösungen von Wildtyp-Stärke eine veränderte Viskosität zeigen. Dabei wird die Viskosität vorzugsweise mittels eines Brabender- Viskographen bestimmt. Ferner kann eine derartige modifizierte Stärke im Vergleich zu Wildtypstärke einen erhöhten Phosphatgehalt aufweisen. Dabei ist der Phosphatgehalt dieser Stärke mindestens um 10%, vorzugsweise um 20% und besonders bevorzugt um 30% höher als der Phosphatgehalt von Wildtypstärke.

Eine derartige modifizierte Stärke, die Gegenstand der Erfindung ist, weist vorzugsweise die in Fig. 3, 4 und 5 dargestellten charakteristischen Brabenderkurven auf. Die modifizierte Stärke weist insbesondere unter den in Beispiel 4 genannten Bedingungen zur Bestimmung der Viskosität mit Hilfe eines Brabender-Viskographen mindestens einen der folgende charakteristische Werte auf oder eine Kombination der folgenden Werte:
eine Verkleisterungstemperatur von 67,3 ± 0,0°C,
eine maximale Viskosität von 2823,7 ± 82,0 BE
eine Viskosität zu Beginn der Haltezeit von 1517,3 ± 62,3 BE
eine Viskosität zu Beginn der Kühlzeit von 641,3 ± 19,7 BE
eine Viskosität nach dem Erkalten von 998,0 ± 18,3 BE.

Im Rahmen der Meßgenauigkeit, können diese Durchschnittswerte um bis zu 10% nach oben oder unten von den genannten Werten abweichen, so daß die genannten charakteristischen Werte für die modifizierte Stärke folgende Werte annehmen können:
eine Verkleisterungstemperatur von 67,3 ± 6,7°C,
eine maximale Viskosität von 2823,7 ± 282,4 BE
eine Viskosität zu Beginn der Haltezeit von 1517,3 ± 151,7 BE
eine Viskosität zu Beginn der Kühlzeit von 641,3 ± 64,1 BE
eine Viskosität nach dem Erkalten von 998,0 ± 99,8 BE.

Die modifizierte Stärke weist in der Regel mindestens einen der oben genannten charakteristischen Werte auf, vorzugsweise eine Kombination mehrerer Werte. Besonders bevorzugt liegen alle Werte in den angegebenen Bereichen.

Durch Anwendung der anti-sense-Technologie ist es ferner möglich, Pflanzen herzustellen, bei denen die Expression von DNA-Sequenzen, die für D-Enzyme kodieren, in unterschiedlich starkem Maße inhibiert ist, und die daher eine unterschiedlich starke Reduktion der Aktivität des D-Enzyms aufweisen. Je nach dem Grad der Reduktion der D-Enzym-Aktivität synthetisieren derartige transgene Pflanzen Stärke, die sich hinsichtlich ihrer Verkleisterungseigenschaften und ihres Phosphatgehaltes mehr oder weniger stark von Wildtyppflanzen unterscheidet.

Generell weisen derartige modifizierte Stärken folgenden Eigenschaften im Vergleich zu Wildtyppflanzen auf:

1. eine höhere maximale Viskosität bei Erhitzen
2. eine höhere Viskosität nach Abkühlung.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von DNA-Sequenzen, die für Enzyme mit der enzymatischen Aktivität eines D-Enzyms kodieren, für die Herstellung einer modifizierten Stärke in Pflanzen.

Hinterlegungen

Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung hergestellten und verwendeten Plasmide wurden bei der als internationale Hinterlegungsstelle anerkannten Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) in Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland, entsprechend den Anforderungen des Budapester Vertrages für die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zwecke der Patentierung hinterlegt.

Am 26.08.1993 wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) in Braunschweig, Deutschland, folgendes Plasmid hinterlegt (Hinterlegungsnummer):

Plasmid p35SH-anti-D (DSM 8479)

Am 10.08.1994 wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) in Braunschweig, Deutschland, folgendes Plasmid hinterlegt (Hinterlegungsnummer):

Plasmid p35S-anti-D (DSM 9365)

Ferner wurde am 20.10.1994 bei der oben genannten Hinterlegungsstelle folgendes Plasmid hinterlegt (Hinterlegungsnummer):

Plasmid pBinAR-Hyg (DSM 9505)

Verwendete Medien und Lösungen
20 × SSC
175.3 g NaCl
	88.2 g Natrium-Citrat
	ad 1000 ml mit ddH₂O
	pH 7,0 mit 10 N NaOH
10 × MEN	200 mM MOPS
	50 mM Natriumacetat
	10 mM EDTA
	pH 7,0
NSEB-Puffer	0,25 M Natriumphosphatpuffer pH 7,2
	7% SDS
	1 mM EDTA
	1% BSA (w/v)

Beschreibung der Abbildungen

Fig. 1 zeigt das Plasmid p35SH-anti-D (DSM 8479). Das Plasmid enthält folgende Fragmente:
A=Fragment A (529 bp) umfaßt den 35S Promotor des Blumenkohl-Mosaik-Virus (CaMV), Nukleotide 6906-7437 des CaMV.
B=Fragment B (2909 bp) umfaßt ein DNA-Fragment, das die kodierende Region für das Disproportionierende Enzym aus Kartoffel beinhaltet (Takaha et al., 1993, J. Biol. Chem. 268: 1391-1396; Nukleotide 303 bis 1777), und in anti-sense- Orientierung an den Promotor gekoppelt ist.

C=Fragment C (192 bp) umfaßt das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T- DNA des Ti-Plasmids pTiACH5, Nukleotide 11749-11939.

Das Plasmid ist ca. 12,7 kb groß und erlaubt Selektion auf Hygromycinresistenz in transformierten Pflanzenzellen.

Fig. 2 zeigt das Plasmid p35S-anti-D (DSM 9365)
Das Plasmid enthält folgende Fragmente:
A=Fragment A (529 bp) umfaßt den 35S Promotor des Blumenkohl-Mosaik-Virus (CaMV), Nukleotide 6906-7437 des CaMV.
B=Fragment B (2909 bp) umfaßt ein DNA-Fragment, das die kodierende Region für das Disproportionierende Enzym aus Kartoffel beinhaltet (Takaha et al., 1993, J. Biol. Chem. 268: 1391-1396; Nukleotide 303 bis 1777), und in anti-sense- Orientierung an den Promotor gekoppelt ist.
C=Fragment C (192 bp) umfaßt das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T- DNA des Ti-Plasmids pTiACH5, Nukleotide 11749-11939.
Das Plasmid ist ca. 12,2 kb groß und erlaubt Selektion auf Kanamycinresistenz in transformierten Pflanzenzellen.

Fig. 3 zeigt eine Brabenderkurve für eine wäßrige Lösung von Stärke aus der transgenen Kartoffellinie JD1-32. Die Kurve wurde wie in Beispiel 3 erläutert aufgenommen.

Dabei bedeuten:

Drehm.
Drehmoment
[BE]	Brabender-Einheit
Temp.	Temperatur
A	Verkleisterungsbeginn
B	Maximale Viskosität
C	Start der Haltezeit
D	Start der Kühlzeit
E	Ende der Kühlzeit
F	Ende der End-Haltezeit

Die blaue Linie gibt die Viskosität (gemessen in Brabender-Einheiten) an. Die rote Linie gibt den Temperaturverlauf an.

Meßbedingungen:
Apparat: Brabender Viskograph E (Brabender OHG Duisburg, Deutschland) Verwendete Menge Stärke: 30 g
Verwendetes Volumen Lösungsmittel: 450 ml destilliertes Wasser Rührgeschwindigkeit: 75 Umdrehungen pro min
Erhitzen: von 50°C auf 96°C mit einer Geschwindigkeit von 3°C pro min Halten der Temperatur: 30 min bei 96°C
Kühlen: von 96°C auf 50°C mit einer Geschwindigkeit von 3°C pro min.

Fig. 4 zeigt eine Brabenderkurve für eine wäßrige Lösung von Stärke aus der transgenen Kartoffellinie JD1-33. Die Kurve wurde wie in Beispiel 3 erläutert aufgenommen.

Die Abkürzungen sind definiert wie für Fig. 3 beschrieben. Die Meßbedingungen entsprechen den unter Fig. 3 beschriebenen.

Fig. 5 zeigt eine Brabenderkurve für eine wäßrige Lösung von Stärke aus der transgenen Kartoffellinie JD1-71. Die Kurve wurde wie in Beispiel 3 erläutert aufgenommen.

Fig. 6 zeigt eine Brabenderkurve für eine wäßrige Lösung von Stärke aus Wildtyppflanzen Solanum tuberosum in cv. D´sir´e. Die Kurve wurde wie in Beispiel 3 erläutert aufgenommen.

Die nachfolgenden Ausführungsbeispiele erläutern den Gegenstand der Erfindung ohne ihn einzuschränken. Beschrieben wird die Herstellung von Kartoffelpflanzen mit verringerter D-Enzym-Aktivität mit Hilfe der anti-sense- Technologie, sowie die Isolierung und Charakterisierung der aus Knollen dieser Pflanzen isolierbaren Stärke.

Analog zu den dargestellten Beispielen können auch andere Pflanzen, insbesondere landwirtschaftliche Nutzpflanzen, vorzugsweise Stärke produzierende Pflanzen wie, Getreidearten (z. B. Gerste, Weizen, Roggen, Hafer), Mais, Erbse, Reis etc. verändert werden und Stärke aus diesen Pflanzen gewonnen werden. Ferner kann die Herstellung von Pflanzen mit einer reduzierten D- Enzym-Aktivität mit Hilfe anderer Techniken als der anti-sense-Technologie wie oben beschrieben erfolgen.

In den folgenden Ausführungsbeispielen wurden folgende Standardtechniken angewendet:

1. Klonierungsverfahren

Für die Pflanzentransformation wurden die Genkonstruktionen in die binären Vektoren BIN19 (Bevan, 1984, Nucl. Acids Res. 12: 8711-8720) und pBinAR-Hyg (DSM 9505) kloniert.

2. Bakterienstämme

Für die binären Vektoren wurde der E.coli-Stamm DH5α (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburgh, USA) verwendet.

Die Transformation der Plasmide in die Kartoffelpflanzen wurde mit Hilfe des Agrobacterium tumefaciens-Stammes C58C1 pGV2260 durchgeführt (Deblaere et al., 1985, Nucl. Acids Res. 13: 4777-4788).

3. Transformation von Agrobacterium tumefaciens

Der Transfer der DNA erfolgte durch direkte Transformation nach der Methode von Höfgen (1988, Nucleic Acids Res. 16: 9877). Die Plasmid-DNA transformierter Agrobakterien wurde nach der Methode von Birnboim & Doly (1979, Nucleic Acids Res. 7 : 1513-1523) isoliert und nach geeigneter Restriktionsspaltung gelelektrophoretisch analysiert.

4. Transformation von Kartoffeln

Zehn kleine mit dem Skalpell verwundete Blätter einer Kartoffel-Sterilkultur (Solanum tuberosum L.cv. D´sir´e) wurden in 10 ml MS-Medium (Murashige & Skoog (1962) Physiol. Plant. 15: 473) mit 2% Saccharose gelegt, welches 50 ml einer unter Selektion gewachsenen Agrobacterium tumefaciens- Übernachtkultur enthielt. Nach 3-5 minütigem, leichtem Schütteln erfolgte eine weitere Inkubation für 2 Tage im Dunkeln. Daraufhin wurden die Blätter zur Kallusinduktion auf MS-Medium mit 1,6% Glukose, 5 mg/l Naphthylessigsäure, 0,2 mg/l Benzylaminopurin, 250 mg/l Claforan, 50 mg/l Kanamycin bzw. 1 mg/l Hygromycin B, und 0,80% Bacto Agar gelegt. Nach einwöchiger Inkubation bei 25°C und 3000 Lux wurden die Blätter zur Sproßinduktion auf MS-Medium mit 1,6% Glukose, 1,4 mg/l Zeatinribose, 20 mg/l Naphthylessigsäure, 20 mg/l Giberellinsäure, 250 mg/l Claforan, 50 mg/l Kanamycin bzw. 3 mg/l Hygromycin B, und 0,80% Bacto Agar gelegt.

5. Radioaktive Markierung von DNA-Fragmenten

Die radiokative Markierung von DNA-Fragmenten wurde mit Hilfe eines DNA- Random Primer Labelling Kits der Firma Boehringer (Deutschland) nach den Angaben des Herstellers durchgeführt.

6. Northern Blot-Analyse

RNA wurde nach Standardprotokollen aus Blattgewebe von Pflanzen isoliert. 50 µg der RNA wurden auf einem Agarosegel aufgetrennt (1,5% Agarose, 1 × MEN- Puffer, 16,6% Formaldehyd). Das Gel wurde nach dem Gellauf kurz in Wasser gewaschen. Die RNA wurde mit 20 × SSC mittels Kapillarblot auf eine Nylonmembran vom Typ Hybond N (Amersham, UK) transferiert. Die Membran wurde anschließend bei 80°C unter Vakuum für zwei Stunden gebacken. Die Membran wurde in NSEB-Puffer für 2 h bei 68°C prähybridisiert und anschließend in NSEB-Puffer über Nacht bei 68°C in Gegenwart der radioaktiv markierten Probe hybridisiert.

7. Pflanzenhaltung

Kartoffelpflanzen wurden im Gewächshaus unter folgenden Bedingungen gehalten:

Lichtperiode
16 h bei 25000 Lux und 22°C
Dunkelperiode	8 h bei 15°C
Luftfeuchte	60%

8. Isolierung der Stärke aus Kartoffelpflanzen

Zur Isolierung von Stärke aus Kartoffelknollen wurden die Knollen zunächst in einer Saftpresse zerkleinert. Der resultierende Saft wurde mit geringen Mengen an Natriumsulfit und Natriumbisulfit versetzt und stehengelassen, damit sich die Stärke absetzen konnte. Nach dem Absetzen der Stärke wurde der Überstand abgenommen und die Stärke mindestens 3 mal in destilliertem Wasser gewaschen. Anschließend wurde die Stärke bei 37°C unter mehrmaligem Wenden getrocknet.

9. Bestimmung des Phosphatgehaltes von Stärke

Der Phosphatgehalt der Stärke wurde bestimmt, indem die Menge an Phosphat, das an der C-6-Position von Glukoseresten gebunden war, gemessen wurde. Hierzu wurde Stärke zunächst durch Säurehydrolyse gespalten und anschließend der Gehalt an Glukose-6-Phosphat mittels eines Enzymtests bestimmt, wie im folgenden beschrieben:
100 mg Stärke wurden in 500 µl 0,7 N HCl 4 h bei 100°C inkubiert. Nach der Säurehydrolyse wurden 10 µl des Ansatzes in 600 µl Imidazolpuffer (100 mM Imidazol, 5 mM MgCl₂, pH 6,9; 2 mM NADP⁺) gegeben. Die Bestimmung der Menge an Glukose-6-Phosphat in dem Ansatz erfolgte durch Umsetzung mit dem Enzym Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase. Dazu wurde dem Ansatz 1 U Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase (aus Hefe) zugesetzt und die Menge an gebildetem NADPH durch Messung der Absorption bei 340 nm bestimmt.

Beispiele Beispiel 1

Konstruktion des binären Plasmids p35SH-anti-D
Unter Verwendung zweier synthetisch hergestellter Oligonukleotide mit den Sequenzen:

5′- GCCCCCGGGC TTTTAAGTTC CTTG -3′ (Seq ID No. 1)

und

5′- CAGGGTACCT AACATCTTAA TCATC -3′ (Seq ID No. 2)

als Primer für eine Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung von cDNA aus Knollengewebe von Solanum tuberosum wurde eine Kopie der kodierenden Region des Gens, das für das D-Enzym kodiert, hergestellt. Das resultierende Fragment umfaßt die Nukleotide 303 bis 1777 der in Takaha et al. (1993, J. Biol. Chem. 268: 1391-1396) dargestellten Nukleotidsequenz. Durch die spezifische Sequenz der für die Amplifikation gewählten Oligonukleotide wird am 5′-Ende des kodogenen Stranges eine Sma I-Schnittstelle und am 3′-Ende eine Kpn I- Schnittstelle eingeführt. Das PCR-Fragment wurde mit den Restriktionsendonukleasen Sma I und Kpn I geschnitten und in den mit Sma I und Kpn I geschnittenen Vektor pBinAR-Hyg (DSM 9505) ligiert. Das resultierende Plasmid wurde p35SH-anti-D (DSM 8479) genannt und ist in Fig. 1 dargestellt.

Durch die Insertion der kodierenden Region für das D-Enzym entsteht eine Expressionskassette, die aus folgenden Sequenzen A, B und C aufgebaut ist:
A=Fragment A (529 bp) umfaßt den 35S Promotor des Blumenkohl-Mosaik-Virus (CaMV), Nukleotide 6906-7437 des CaMV.
B=Fragment B (2909 bp) umfaßt ein DNA-Fragment, das die kodierende Region für das Disproportionierende Enzym aus Kartoffel (Takaha et al., 1993, J. Biol. Chem. 268: 1391-1396; Nukleotide 303 bis 1777) beinhaltet, und in anti-sense- Orientierung an den Promotor fusioniert ist.
C=Fragment C (192 bp) umfaßt das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T- DNA des Ti-Plasmids pTiACH5, Nukleotide 11749-11939.

Beispiel 2 Konstruktion des binären Plasmids p35S-anti-D

Für die Herstellung des Plasmids p35S-anti-D wurde zunächst das Plasmid pBIN19-AC hergestellt. Zu diesem Zweck wurde ein 529 bp Fragment, das den 35S-Promotor des CaMV umfaßt (Nukleotide 6909-7437, Franck et al., Cell 21: 285-294), aus dem Plasmid pDH51 (Pietrzak et al., Nucl. Acids Res. 14: 5857-5868) mit Hilfe der Restriktionsendonukleasen EcoR I und Kpn I isoliert. Dieses Fragment wurde in den mit EcoR I und Kpn I geschnittenen Vektor pBIN19 (Bevan, 1984, Nucl. Acids Res. 12: 8711-8721) ligiert. Dabei entstand das Plasmid pBIN19-A. Anschließend wurde ein 192 bp-Fragment, das das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J. 3: 835-846; Nukleotide 11749-11939) umfaßt, als Pvu II/Hind III-Fragment aus dem Plasmid pAGV40 (Herrera-Estrella et al., Nature 303: 209-213) isoliert. Nach Addition eines Sph I-Linkers an die Pvu II-Schnittstelle wurde das Fragment in den mit Sph I und Hind III geschnittenen Vektor pBIN19-A ligiert. Das resultierende Plasmid wurde pBIN19-AC genannt.

Für die Konstruktion des Plasmids p35S-anti-D wurde das wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellte PCR-Fragment in den mit Kpn I und Sma I geschnittenen Vektor pBIN19-AC ligiert.

Das resultierende Plasmid ist in Fig. 2 dargestellt.

Beispiel 3 Herstellung transgener Kartoffelpflanzen mit einer reduzierten Aktivität des D- Enzyms und Isolierung der in den Pflanzen synthetisierten Stärke

Zur Herstellung transgener Kartoffelpflanzen, bei denen die Aktivität des D- Enzyms verringert ist im Vergleich zu Wildtyppflanzen, wurden Agrobakterien der Spezies Agobacterium tumefaciens mit dem Plasmid p35S-anti-D transformiert. Das Plasmid wurde mit Hilfe Agrobakterien-vermittelter Transformation in Zellen von Kartoffelpflanzen der Varietät D´sir´e transferiert wie oben beschrieben. Aus den transformierten Zellen wurden ganze Pflanzen regeneriert. Die transformierten Pflanzen wurden unter Gewächshausbedingungen kultiviert.

Die Überprüfung des Erfolges der genetischen Veränderung der Pflanzen erfolgte durch Analyse der Gesamt-RNA in einer Northern-Blot-Analyse bezüglich des Verschwindens der Transkripte, die für das D-Enzym kodieren. Hierzu wurde Gesamt-RNA aus Blättern transformierter Pflanzen nach Standardmethoden isoliert, gelelektrophoretisch auf einem Agarosegel aufgetrennt, auf eine Nylonmembran transferiert und mit einer radioaktiv markierten Probe hybridisiert, die die für das D-Enzym aus Kartoffel kodierende Region oder einen Teil dieser Region umfaßt. Bei erfolgreich transformierten Pflanzen fehlt in der Northern-Blot-Analyse die Bande, die das spezifische Transkript des D-Enzym- Gens darstellt.

Drei unabhängige Linien transgener Kartoffelpflanzen, die Linien JD1-32, JD1-33 und JD1-71, bei denen in der Northern-Blot-Analyse nur noch sehr geringe bis gar keine Mengen des D-Enzym-spezifischen Transkriptes nachgewiesen werden konnten, wurden näher hinsichtlich der synthetisierten Stärke untersucht.

Dazu wurde aus Knollen der transgenen Pflanzen Stärke nach Standardverfahren isoliert.

Beispiel 4 Analyse der Stärke aus Kartoffelpflanzen, die mit dem Plasmid p35S-anti-D transformiert worden waren a) Bestimmung der Viskosität

Die aus den transgenen Kartoffelpflanzen isolierte Stärke wurde hinsichtlich der Viskosität wäßriger Lösungen dieser Stärke untersucht.

Zur Bestimmung der Viskosität der wäßrigen Lösungen der in transformierten Kartoffelpflanzen synthetisierten Stärke wurden jeweils 30 g Stärke in 450 ml H₂O aufgenommen und für die Analyse in einem Viskograph E (Brabender OHG Duisburg (Deutschland)) verwendet. Der Betrieb des Gerätes erfolgte nach den Angaben des Herstellers. Zur Bestimmung der Viskosität der wäßrigen Lösung der Stärke wurde die Stärkesuspension zunächst von 50°C auf 96°C erhitzt mit einer Geschwindigkeit von 3°C pro min. Anschließend wurde die Temperatur für 30 min bei 96°C gehalten. Danach wurde die Lösung von 96°C auf 50°C abgekühlt mit einer Geschwindigkeit von 3°C pro min. Während der gesamten Dauer wurde die Suspension gerührt (75 Umdrehungen pro Minute) und die Viskosität (in Brabender-Einheiten) bestimmt. Die Ergebnisse derartiger Messungen sind in Form von Kurven, in denen die Viskosität in Abhängigkeit von der Zeit dargestellt ist, in den Fig. 3, 4, 5 und 6 wiedergegeben. Fig. 3 zeigt eine typische Brabenderkurve für Stärke, die aus transgenen Kartoffelpflanzen der Linie JD1-32 isoliert wurde. Fig. 4 zeigt eine typische Brabenderkurve für Stärke, die aus transgenen Kartoffelpflanzen der Linie JD1-33. Fig. 5 zeigt eine typische Brabenderkurve für Stärke, die aus transgenen Kartoffelpflanzen der Linie JD1-71 isoliert wurde. In Fig. 6 ist dagegen eine typische Brabenderkurve für Stärke, die aus nicht-transformierten Kartoffelpflanzen der Varietät D´sir´e isoliert wurde, gezeigt. Aus den Kurven geht zum einen hervor, daß in allen drei transgenen Linien eine Stärke mit fast identischen Viskositätseigenschaften isoliert werden kann. Ferner ist erkennbar, daß die Stärke aus transgenen Kartoffeln Eigenschaften aufweist, die deutlich von denen der Wildtypstärke abweichen. Aus den dargestellten Kurven lassen sich verschiedene charakteristische Werte ableiten.

Für Wildtyppflanzen ergeben sich dabei folgende charakteristische Werte:

Tabelle 1

Angegeben sind die Durchschnittswerte der Viskosität bei verschiedenen Temperaturen und zu verschiedenen Zeitpunkten in Brabender-Einheiten zusammen mit den Standardabweichungen, sowie die Verkleisterungstemperatur und die Temperatur, bei der die maximale Viskosität erreicht wird.

Für Pflanzen, die mit dem Plasmid p35S-anti-D transformiert worden waren, ergeben sich dabei folgende charakteristische Werte:

TAbelle 2

Transgene Linie JD1-32

Tabelle 3

Transgene Linie JD1-33

Tabelle 4

Transgene Linie JD1-71

Für die Stärke aus transgenen Kartoffelpflanzen, bei denen die Aktivität des D- Enzyms stark verringert ist, lassen sich unter den genannten Versuchsbedingungen somit folgende charakteristische Werte ermitteln:
eine Verkleisterungstemperatur von 67,3 ± 0,0°C,
eine maximale Viskosität von 2823,7 ± 82,0 BE
eine Viskosität zu Beginn der Haltezeit von 1517,3 ± 62,3 BE
eine Viskosität zu Beginn der Kühlzeit von 641,3 ± 19,7 BE
eine Viskosität nach dem Erkalten von 998,0 ± 18,3 BE.

Unter Berücksichtigung von Meßungenauigkeiten und Schwankungen zwischen verschiedenen transgenen Linien mit unterschiedlichen D-Enzym-Aktivitäten können die ermittelten Durchschnittswerte um bis zu 10% nach oben oder unten abweichen, so daß die modifizierte Stärke folgende charakteristischen Werte aufweisen kann:
eine Verkleisterungstemperatur von 67,3 ± 6,7°C,
eine maximale Viskosität von 2823,7 ± 282,4 BE
eine Viskosität zu Beginn der Haltezeit von 1517,3 ± 151,7 BE
eine Viskosität zu Beginn der Kühlzeit von 641,3 ± 64,1 BE
eine Viskosität nach dem Erkalten von 998,0 ± 99,8 BE.

Da es mit Hilfe der anti-sense-Technologie möglich ist, Pflanzen herzustellen, bei denen die Expression von DNA-Sequenzen, die für D-Enzyme kodieren, in unterschiedlich starkem Maße inhibiert ist, können mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens transgene Pflanzen hergestellt werden, die eine mehr oder weniger starke Reduktion der Aktivität des D-Enzyms aufweisen und die daher eine Stärke synthetisieren, die sich hinsichtlich ihrer Verkleisterungseigenschaften mehr oder weniger stark von Wildtyppflanzen unterscheidet.

b) Bestimmung des Phosphatgehaltes

Die Bestimmung des Phosphatgehaltes von Stärke aus transgenen und aus Wildtyppflanzen erfolgte wie oben beschrieben.

Der Gehalt an Glukose-6-Phosphat (angegeben in nmol/mg Stärke) ist in der folgenden Tabelle für nicht-transformierte Kartoffelpflanzen der Varietät D´sir´e sowie als Durchschnittswert für drei Linien (JD1-32; JD1-65; JD1-71) transgener Kartoffelpflanzen, die mit dem Plasmid p35S-anti-D transformiert worden waren, angegeben.

Die Werte zeigen, daß der Phosphatgehalt der modifizierten Stärke aus transgenen Kartoffelpflanzen im Vergleich zu Stärke aus Wildtyppflanzen um ca. 34% erhöht ist.

Sequenzprotokolle

Seq ID No.:
1
Art der Sequenz	Nukleotidsequenz
Sequenzlänge	24 Basenpaare
Strangform	Einzelstrang
Topologie	linear
Art des Moleküls	Oligonukleotid

Sequenzinformation zu Seq ID No. 1:

Seq ID No.:
2
Art der Sequenz	Nukleotidsequenz
Sequenzlänge	25 Basenpaare
Strangform	Einzelstrang
Topologie	linear
Art des Moleküls	Oligonukleotid

Sequenzinformation zu Seq ID No. 2:

Claims

1. Verfahren zur Herstellung einer modifizierten Stärke, dadurch gekennzeichnet, daß zunächst Pflanzen hergestellt werden, deren intrazelluläre Aktivität des D-Enzyms (EC 2.4.1.25) im Vergleich zu Wildtyppflanzen verringert ist, und aus diesen Pflanzen Stärke isoliert wird.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Verringerung der Aktivität des D-Enzyms dadurch erfolgt, daß in den Zellen der Pflanzen die Synthese eines D-Enzyms inhibiert wird.

3. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß in den Zellen der Pflanzen die Synthese des D-Enzyms mit Hilfe einer anti-sense-RNA inhibiert wird.

4. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es folgende Schritte umfaßt:

i) Herstellung einer Expressionskassette, die folgende DNA-Sequenzen umfaßt:
- a) einen in pflanzlichen Zellen aktiven Promotor,
- b) eine DNA-Sequenz, die für ein D-Enzym (EC 2.4.1.25) kodiert und in anti- sense-Orientierung an den Promotor fusioniert ist, und gegebenenfalls
- c) eine DNA-Sequenz, die die Termination der Transkription und die Polyadenylierung des Transkriptes gewährleistet,
ii) Transfer der besagten Expressionskassette in pflanzliche Zellen,
iii) Regeneration ganzer Pflanzen aus den transformierten Zellen und
iv) Isolierung der in den Pflanzen synthetisierten Stärke.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei DNA- Sequenz, die für ein D-Enzym kodiert, um eine DNA-Sequenz aus Solanum tuberosum handelt.

6. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den hergestellten Pflanzen um Nutzpflanzen handelt.

7. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den hergestellten Pflanzen um Pflanzen handelt, die Stärke als Speichersubstanz synthetisieren.

8. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den hergestellten Pflanzen um Getreidepflanzen, Mais-, Reis- oder Erbsenpflanzen handelt.

9. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den hergestellten Pflanzen um Kartoffelpflanzen handelt.

10. Stärke, herstellbar durch ein Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8.

11. Stärke, die mindestens einen oder eine Kombination der folgenden charakteristische Werte bei der Untersuchung der Verkleisterungseigenschaften mit Hilfe eines Brabender-Viskographen aufweist:
eine Verkleisterungstemperatur von 67,3 ± 6,7°C,
eine maximale Viskosität von 2823,7 ± 282,4 BE
eine Viskosität zu Beginn der Haltezeit von 1517,3 ± 151,7 BE
eine Viskosität zu Beginn der Kühlzeit von 641,3 ± 64,1 BE
eine Viskosität nach dem Erkalten von 998,0 ± 99,8 BE

12. Stärke gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Kartoffeln stammt.