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DE1792083A1 - Zweischichtenplatte und ihre Verwendung zur duennschichtchromatographischen Auftrennung von Aminosaeuren - Google Patents

Zweischichtenplatte und ihre Verwendung zur duennschichtchromatographischen Auftrennung von Aminosaeuren

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Publication number
DE1792083A1
DE1792083A1 DE19681792083 DE1792083A DE1792083A1 DE 1792083 A1 DE1792083 A1 DE 1792083A1 DE 19681792083 DE19681792083 DE 19681792083 DE 1792083 A DE1792083 A DE 1792083A DE 1792083 A1 DE1792083 A1 DE 1792083A1
Authority
DE
Germany
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layer
cellulose
amino acids
thin
board according
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
DE19681792083
Other languages
English (en)
Inventor
Herbert Dr Halpaap
Roland Dr Helger
Friedrich Dr Kraffczyk
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Merck Anlagen GmbH
Original Assignee
Merck Anlagen GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Merck Anlagen GmbH filed Critical Merck Anlagen GmbH
Priority to DE19681792083 priority Critical patent/DE1792083A1/de
Priority to CH825369A priority patent/CH524383A/de
Priority to GB29135/69A priority patent/GB1213445A/en
Priority to NL6908893A priority patent/NL6908893A/xx
Priority to IL32405A priority patent/IL32405A/xx
Priority to FR6921290A priority patent/FR2014652A1/fr
Priority to SE09814/69A priority patent/SE350337B/xx
Priority to US841712A priority patent/US3623841A/en
Priority to BE736203D priority patent/BE736203A/xx
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Pending legal-status Critical Current

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Description

Merck Patent Gesellschaft 1792083
mit beschränkter Haftung
Darmstadt
Zweischichtcnplatte und ihre Vorwendung zur dünnschiclitchroniatographischen Auftrennung von Aminosäuren
Bei der Dünnsehichtchromatographie von Aminosäuren, insbesondere von biologischen Flüssigkeiten wie z« B. Harn, oder auch von aminosäurehaltigen Hydrolysaten stören die darin in größeren ,Mengen vorhandenen Begloitstoffe, z. B. Salze, Säuren und/oder Neutralstoffe (z. B. Zucker oder andere Kohlenhydrate). Es war deshalb bisher erforderlich, diese störenden Begleitstoffe zunächst zu entfernen, z. B. durch Säulehchromatographio an Ionenaustauschern, und erst dann die Dünnsehichtchromatographie mit . den aminosäurehaltigen Eluaten durchzuführen.
Es wurde nun gefunden, daß man auf die bisher notwendigen und zeitraubenden Entsalzungs- bzw, Aufarbeitungsinethoden verzichten kann, wenn man die Chromatographie der aminosäurehaltigen Lösungen auf einer speziellen Zweischichtenplatte ausführt.
Gegenstand der Erfindung ist somit eine Zweischichtenplatto zur Dünnsehichtchromatographie, die aus einer Itoaktionszone (Schicht i) und einer daran anschließenden Sorptionsmittelschicht (Schicht II) auf einem üblichen Trägermaterial besteht, wobei die Roaktionszono ein Gemisch aus Cellulose und 50 - 80 5· eines Cellulose-Ioncnaustauschers oder 5 - 30 cJo eines stark basischen oder stark sauren Ionenaustauschers auf Polystyrolbasis enthält·
Gegenstand der Erfindung ist ferner die Vorwendung einer solchen Zwoischichtenplatte zur dünnschichtchromatographischon Auftrennunß von Araiuosäurolösungen ohne vorherige Abtrennung von üblicherweise störondon Bogloitstoffen.
Die Herstellung von Zwei- und Mehrschichtcnplatten und ihre Verwendung für verschiedene Trennprobleme ist im Prinzip.bereits bekannt. So ist schon eine Zwoischichtenplatte aus Aktivkohle und Kieselgol zur Bestimmung von Pestiziden in pflanzlichen Alatcrialion vorgeschlagen worden. Auch ist es bekannt, sogenannte Gradientschichten herzustellen, bei denen sich die Zusammensetzung des Sorptionsmittels in der Schicht kontinuierlich ändert. Dabei steigt der Gehalt an einem Sorptionsmittel A in der Schicht vom Start kontinuierlich an, während der Gehalt eines anderen Sorptionsmittels B kontinuierlich abnimmt· Mit dieser Methode kann z. D. schnell und einfach entschieden werden, welches Mischungs~ Verhältnis verschiedenartiger Sorptionsmittel die besten Trennungen ergibt.
Weiterhin ist schon übor die Dünnschichtchroraatographio von narkiorten Jodaminosäuren bzw. Jodfluaresceinon nach Abtrennung von nicht umgesetztem Jodid durch einen mit Silbornitrat imprägnierten Streifen an einer mit einen Ionenaustauscher beschichteten Platte borichtot worden. Auch zur zweidiiaensionalen Chromatographie von Fetten und Fettsäuren sind schon Dünnschichtchroinatographioplatten mit einem mit Silbernitrat imprägnierten Streifen vorwondet worden. In der ersten Dimension wird dabei das Gemisch auf dem imprägnierten Streifen nach Zahl (und Lage der Doppclbindungen getrennt, in der zweiten Dimension erfolgt der Ucborgang von dor imprägnierten in dio niohtimprägniorte Schicht, auf der die weitere Auftrennung des Substanzgemische durchgeführt
Schließlich ist auch schon, über die Verwendung von Schichten, die aus einem Gemisch von Ionenaustauschern auf Basis Polystyrol und Cellulose bestehen, berichtet worden· Biese Schichten bestanden jedoch stets zum überwiegenden Teil aus Ionenaustauschern (75 - 85 Ji)* denen lediglich 15 - 25 # Cellulose "zugesetzt worden war* Solche Schichten sind jedoch für die in der vorliegenden Anmeldung vorgeschlagenen Verwendungszwecke nicht geeignet. Es ist nicht möglich, auf solohon Sohichten Aminosäuren von Neutralstoffen und/oder Elektrolyten zu trennen und anschließend zu
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In der Literatur ist auch bereits angedeutet worden- daß Schichtstroifo:i aus basischem, saurem oder neutralem Material eine Differenzierung nach dcia pH-Wert ermöglichen. Daraus konnte jedoch nicht dme weiteres geschlossen worden, daß gerade eine Zweischichtenplattc der oben definierten Zusammensetzung speziell bei dor Auftrennung von Aminosäuren so große Vorteile bieten und die vorherige Abtrennung von Neutralstoffon und/oder Elektrolyten überflüssig dachen würde.
Der zur Herstellung der Ileaktionszoue (Schicht I) erfindungs^cnuiß zu verwendende Ionenaustauscher muß eine für dünnschichtchromatographische Zwecke ausreichende Reinheit besitzen. Seine Korngröße soll möglichst unter 60 μ liegen. Geeignet sind grundsätzlich ullo Ionenaustauscher mit stark sauren oder stark alkalischen Gruppen in der H+ bzw. 0II~ Form. Zweckmäßig werden solche Ionenaustauscher bevorzugt, die in den zu verwendenden Lösungsmitteln . nicht zu stark quellen, da sonst die Haftfestigkeit der Schicht auf der Unterlage beeinträchtigt wird.
Als Cellulose-Ionenaustauscher können alle bekannten stark sauren oder stark basischen Typen verwendet werden. In Betracht kommen z. B. Austauscher wie Cellulose-phosphorsäureester, Sulfomethyl- oder Sulfoäthylöellulose, Polyphosphat-imprägnierte Cellulose und ECTISOLA-Cellulose sowie insbesondere Triäthyluminoäthylccllulosc als stark basischer Ionenaustauscher. Die geeigneten Cellulose-Ionenaustauscher umfassen somit sowohl 'substituierte Celluloscn als auch solche Produkte, bei denen die austauschaktiven Gruppen durch Imprägnierung auf die native Cellulose aufgebracht «urden.
Bevorzugte Ionenaustauscher auf Basis Polystyrol mit stark saux-en Gruppen, die nach der Erfindung im Gemisch mit Cellulose zu verwenden sind, sind z. D. sulfonsäuregruppenhaltige Polystyrole. Solche sind z. U. unter den Handelsnamen "Dowex 5OX-8", "Merck Ionen-
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austauscher I", "Amberlite IIt-120" und "Zeocarb 225" bekannt. Auch Kunstharzionenaustauscher der Typen "Lewatite", "Permutitc" und "üuolite" können verwendet werden. Als stark basische Ionenaustauscher können bevorzugt solche vom Typ der quaternären Ammoniumsalze auf Polystyrolbasis, also insbesondere etwa "Dowox 1-X8", "Ionenaustauscher Merck III" oder Amberlite IR A-4001· verwendet werden.
Der Anteil der Ionenaustauscher auf ßasis Polystyrol om Gosaratsorptionsmittol in der Schicht I liegt nach der Erfindung zwischen 5 und 3° #, vorzugsweise bei etwa 10 $ί. DeiagegcnUbor worden die Celluiose-Ionenaustauscher in Mengen von 50 - 80 r t'§ bezogen auf das Gosamtsorptionsmittol der Schicht I, zugesetzt.
Als Cellulose, die mit den stark sauren odor stark basischen Ionenaustauschern zu vermischen ist, kann jede auch sonst für dUnnschichtchromatographischo Zwecke gdeigne^e Cellulose verwendet werden. Als besonders vorteilhaft hat sich mikrokristalline • Cellulose erwiesen·
Zweckmäßig wird die Cellulose-Austauschormischung noch mit einem Bindemittel versetzt, um auf der'Unterlage eine verbesserte Haftfestigkeit zu erzielen. Besonders geeignet für diesen Zweck ist Carboxyjaothylccllulose, jedoch können auch andere übliche Bindemittel wie Stärke, Gips, feinstteiligos Siliciumuioxyd, feinstteilige Aluminiumoxide und deren Hydrate sowie Polymerisate (Co- und Mischpolymerisate) von carboxylgrupponhaltigen Polyvitiylvor-
indungen und deren Salzen, insbesondere Salze von Polyacrylsiiuren uud/odor Polymethacrylsäuren, Polyacrylamide, polymethacrylamide sowie deren am Amidstickstoff durch niedere Alkylgruppen monoodcr disubstituierten Derivate zugesetzt wprdon« Dor Anteil dos Bindemittels am Gemisch beträgt etwa 0,01 bis 12 Je, bei Vorwendung •von Carboxymethylcellulose vorzugsweise 0,04 bis 0,1.$.
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Die übrige, normale Sorptionsmittclschieht kann alle beliebigen, zur Chromatographie von Aminosäuren geeigneten Sorptionsmittel enthalten. Besonders gute Resultate lassen sich bekanntlich mit Cellulose, Kieselgel und/oder Kieselgur erziolen. Darüberhinaus kann sie selbstverständlich auch weitere übliche Zusätze wie Binder, Haftmittel odor Fluoreszenzindikatoren enthalten.
Zur Herstellung der Zweischichtenplatte nach der Erfindung werden zunächst getrennt die Suspensionen für die beiden Schichten zubereitet. Das Cellulose-Austauschergemiseh wird zunächst, gegebenenfalls unter Zusatz des'Bindemittels, in bis zur zehnfachen, vorzugsweise in der droi- bis vierfachen Menge Wasser suspendiert. Bei Vorwendung von Carboxymethylcellulose als Bindemittel wird z. B. dio Mischung in der drei- bis vierfachen Gewichtsmengo einer etwa 0,05 $iigen Lösung von Carboxymethylcellulose suspendiert. Anschließend wird homogenisiert. Die eigentliche Sorptionsmittelschicht und dio dafür benötigte Suspension wird nach Standardverfahren hergestellt. Das Verhältnis Sorptionsmittol-Flüssigkeit ist dabei gegebenenfalls geringfügig zu variieren, um zu erreichen, daß diese Suspension für die Schicht II etwa die gleiche Konsistenz wie die ioncnaustauscherhaltige Suspension für die Schicht I hat.
Die Suspensionen werden dann in oinem der Schichtbreitc entsprechendem Verhältnis in ein zur llorstollung von Zwei- oder Mohrschichtenplatten geeignetes Gerät in die entsprechenden Segmente gefüllt und dio Platten werden in der üblichen Weise beschichtet. Die Schichtdicke wird dabei auf 200 bis 500 u eingestellt. Die bevorzugte Schichtdicke beträgt beim Aufziehen der Schicht 0,25 mm. Bevorzugte Formate der Unterlagen sind 20 χ 20 cm, 20 χ 10 bzw. χ 10 cm. Die bevorzugte Breite des Austauscherstroifens beträgt 1,5-2 cm, die Länge 20 bzw. 10 cm.
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Als Trägermaterial für die Schichten können alle gebräuchlichen Stoffe eingesetzt werden, z. D. Glas, Metall- (insbesondcro Aluminium-)folien, Kunststoffolien, Papier und ähnliche Materialien.
Die Verwendung der neuen Zweischichtenplatte gestaltet sich etwa folgendermaßen:
Die Durchführung des Verfahrens nach der Erfindung mit der neuen Zweischichtcnplatte wird etwa folgendermaßen vorgenommen: Die aminosäurehaltigen Lösungen, die gegebenenfalls Neutralstoffe und/oder Salze enthalten können, werden in an sich üblicher V/eise nebeneinander punkt- oder strichförmig in etwa 1 bis 1,5 cm Entfernung vom unteren Plattenrand auf die Heaktionszone (Schicht l) aufgetragen. Anschließend wird die Schicht I mit Wasser abgespült,. z.B. mit Hilfe einer Pipette oder Spri-tzflasche. Das Abspülen mit Wasser kann auch dadurch ersetzt werden, daß man mit Wasser als Elutionsmittel so weit entwickelt, daß die störenden Begleitstoffe über die spätere Frontlinie des Chromatogramms hinaus in einen unbenutzten Teil der Schicht transportiert werden. Nach dem Trocknen werden die Platten mit der Schicht I nach unten etwa 0,5 cm tief in ein Fließmittel gestellt, das die Aminosäuren aus der Heaktionszone in die zur eigentlichen Chromatographie vorgesehene Sorptionsmittolschicht II transportiert.
Enthält die Heaktionszone einen stark sauren Austauscher, so muß das Flioßmittel eine flüchtige Dase enthalten, während für einen stark basischen Austauschor eine flüchtige Säuro im Flioßraittel zugegen soin muß. Als flüchtige Düsen kommen in diesem Zusammenhang neben dem bevorzugten Ammoniak z. D. auch Diüthylamin, Triethylamin und Piperidin in Frage. Flüchtige Säuren sind bevorzugt Essigsäure oder Ameisensäure. Als Elutionsmittel haben sich im übrigen Gemische aus Methanol und V/asser bestens bewährt. Es können jedoch auch alle anderen für Aminosäuretrennungen verwendbaren Lösungsmittel eingesetzt werden, z. D. Acthanol/Y/asser odor Pyridin/frasser odor einfach Ammoniak/Wasser* Auch ternäre odor quatornäre Gemische z. D.
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Mothanol/Ammonialc/V/asscr oder Pyridin/Dioxan/Animoniak/Vasscr, lassen sich mit Erfolg verwenden. Wenn die Front der aminosäuren etwa - 2 cm hoch in die Sorptionsmittelsclxiclit transportiert worden ist, wird die Ueaktionszone (Schicht i) zweckmäßigerweise abgetrennt, anschließend erfolgt nach Trocknung eine normale Chromatographie zur Auftrennung der Aminosäuren. Diese kann in an sich üblicher Weise ein- oder zweidimensional durchgo'führt werden.
Dieses Verfahren bietet ganz erhebliche Vorteile. So können z. B. auf einer Platte des Formats 10 χ 20 odor 20 χ 20 cm mit einem 20 cm langen Streifen der Reaktionszono, je nach Auftragsart, G ~ 18 Aminosäurclösungen in einfachster Art und Weise entsalzt bzw, aufgearbeitet v/erden. Dei den bisher üblichen Verfahren müssen dagegen entsprechend viele Säulen gefüllt oder regeneriert werden. Anschließend müssen bei jeder Säule einzeln die Säuren und Neutralstoffc eluiert werden. Als nächster Schritt folgt die Elution der Aminosäuren, dann müssen die einzelnen Eluate eingeengt werden. Der Arbeitsaufwand für diese Aufarbeitung ist somit so groß, daß praktisch eine Reihenuntersuchung nach den bekannten Verfahren kaum möglich ist. Gerade auf diesem Gebiet bestellt jedoch ein großer Dedarf an solchen Trennverfahren, da Störungen des Aminosäurcstoffwechsels schon nach kurzer Zeit irreversible oercbrale Störungen verursachen, die Schwachsinn oder Tod der Kranken zur Folge haben können. Oft können bei rechtzeitigem Thorapiebeginn die Folgen einer solchen Erkrankung abgewendet worden. Klinische Symptome treten ja häufig erst auf, wenn bereits irreversible Schädigungen vorliegen* Ein Teil solcuc störung η
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ist jedoch mit einem Anstieg der Konzentration einer oder mehrerer spezifischer Aminosäuren im Harn verbunden, den man dünnschichtchromatographisch nachweisen kann. Gerade die Harnaminosäuren ließen sich jedoch bisher erst nach Entsalzung in genügendem Maße dünnschichtchromatographisch auftrennen. Die neue Zweischichtenplatte bietet somit sehr große Vorteile auf diesem Gebiet der Reihenuntersuchungen. Wegen der Einfachheit in der Durchführung ist das Verfahren insbesondere für Screening-Teste sehr gut geeignet.
Ei .^..,terer besonderer Vorteil der neuen Platte ist der gering? Substanzbedarf. Bei der Verwendung der neuen Zweischichtanplatte braucht nur so viel von der rohen Uhtersuchungslösung eingesetzt zu werden, wie bei der anschließenden DünnschichtChromatographie tatsächlich benötigt wird. Auf diese Art und Weise kommt der,eigentliche Vorteil der Dünnschichtchromatographie, nämlich der geringe Substanzbedarf, voll zur Geltung. Dagegen ist es gar nicht oder nur unter sehr großem Arbeitsaufwand möglich, die zur Entsalzung zunächst auf eine Säule gegebene Lösung der Aminosäuren quantitativ auf eine Dünnschichtplatte zu überführen.
Darüberhinaus ist die neue Zweischichtenplatte insbesondere überall dort von Vorteil, wo Aminosäuren im Gemisch mit vielen anderen Begleitstoffen, insbesondere Elektrolyten, anfallen. Wichtig sind in diesem Zusammenhang z. B. Hydrolysate, wie sie etwa bei Untersuchungen von Proteinen, Peptiden
er sonstigen aminosäurehaltigen Verbindungen anfallen, solche Lösungen enthalten z. B. in der Regel größere Mengen des Hydrolysierungsmittels, z. B. Salzsäure oder Perchlorsäure. Bisher ist stets eine vorherige Abtrennung dieser Elektrolyte erforderlich gewesen, um ein brauchbares Aminoeäurechromatogramm zu erhalten.
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A: Herstellung der Zweischichtenplatte
1. a) Streichmasse für die Austauscherschicht Ionenaustauscher I, stark sauer (Merck, Darmstadt), ein Polystyrolderivat rait kernsubstituierten Sulfonsäuregruppen, wird nacheinander mit Wasser, Methanol und Aether gewaschen. Der Austauscher wird im Mörser zerrieben und anschließend mit einem GO ,η-Sieb klassiert. Verwendet wird das Siebfeine. Der zerkleinerte Austauscher wird nacheinander mit 1 η Salzsäure, V/asser, Methanol und Aether gewaschen und an der Luft getrocknet. 45 g mikrokristalline Cellulose und δ g Austauscher werden in 180 ml einer 0,05 ^igen Lösung von Carboxymethylcellulose in Wasser suspendiert und 15 Sek. im Mixgerät homogenisiert. Anstelle des Ionenaustauschers I MEItCIC kann mit gleichem Erfolg einer der folgenden Austauscher eingesetzt werden: Amberlite IR 120; Dowex 50; Permutit RS; Lewatit S i00.
b) Streichmasse für die Celluloseschicht
50 g Cellulose werden in 200 ml destilliertem Wasser homogenisiert. Beide Streichmassen sind, im geschlossenen Gefäß aufbewahrt, wochenlang haltbar. Vor Gebrauch müssen sie kräftig geschüttelt werden.
c) Ausziehen der Schicht
Für die Herstellung von fünf Platten des Formats 20 cm χ 20 cm, die einen 2 cm breiten Austauscherstreifen tragen, werden etwa 10 ml der Austauscherstreichmasse und 80 ml Cellulosestreichmasse in die entsprechenden Kammern eines Mehrschichtenstreichgerates gefüllt und bei einer Schichtdicke von 0,25 mm ausgezogen.
Die Platten werden erst kurz an der Luft, dann etwa 10 bis 15 Minuten bei 80 bis 900C im Trockenschrank getrocknet. Die fertigen Platten werden am besten mit der Schicht aufeinanderliegend in einem Exsikkator aufbewahrt, um eine Verunreinigung aus der Atmosphäre zu verhindern. Es empfiehlt sich ferner, die Platten unmittelbar vor Gebrauch leer in oiner Kammer mit Wasser zu entwickeln, um Verunreinigungen in den nicht benutzten Toll der Platte zu schieben. 10 9 818/1720 BAD 0Fi/GfNAL
2. Analog Beispiel A 1 wird eine Platte hergestellt, bei der als Austauscher ein makroporöser, stark saurer Ionenaustauscher des Typs LEWATIT verwendet wird (Polystyrolbasis, SuIfonsäure—Gruppen). Es werden die nach dem Mahlen erhaltenen Siebanteile unter 60 μ eingesetzt.
Die Streichmasse für die Celluloseschicht bleibt unverändert und das Ausziehen der Schicht wird in Uebereinstimmung mit Beispiel A ic durchgeführt.
3. a) Streichmasse für die Austauscherschicht
12,5 g phosphorylierte Cellulose in der U —Form (Hersteller; Maeherey & Nagel, Deutschland), Faserlänge 5 bis 25 micron, Teilchengröße < 6O1U, und 12,5 g mikrokristalline Cellulose .(Avieel SF) werden mit 85 ml einer 0,05 ^igen Lösung von Carboxymethylcellulose in Wasser suspendiert und 15 Sekunden im elektrischen Mixgerät homogenisiert·
b) Streichmasse für die Celluloseschicht
100 g mikrokristalline Cellulose (Avieel SF) werden in 350 ml demineraliäiertem Wasser suspendiert und 15 Sekunden im elektrischen Mixgerät homogenisiert.
c) Ausziehen der Schicht
üas Ausziehen der Schicht erfolgt wie im Beispiel A Ic beschrieben.
Für weitere Beschichtungen kann die phosphorylierte Cellulose auch ersetzt werden durch die handelsüblichen Triäthylaminoäthylcellulosen, Sulfoäthylcellulosen, Sulfomethylcellulosen oder ECTEOLA-Cellulosen.
B: Chromatographie
1· Auf die gereinigte und getrocknete Platte werden in 1,5 cm Abstand vom unteren Rand 6 Harn prob ο η von je 2 jil in einem 2 cm langen Strich auf die Austauscherschicht aufgetragen, wobei zwischen den einzelnen Proben ein Abstand von je 1 cm
' bleibt. Die Platte wird vorsichtig längs des Austauschorstreifens mit Wasser abgespült. Nach Trocknung wird die Platte mit der mob*:...^ Phase Ammoniak/tfethanol/Wasser (15/50/35) zweifach 1,5 cm über den Austauscherstreifen entwickelt. Der Austauscherstreifen wird abgeschnitten und die Platte mit der mobilen Phase Butanol/Aceton/Eisessig/Wasser (35/35/i0/20) zweiaal über 7,5 cm chromatographiert.
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Die Aminosäuren werden durch Besprühen mit einer Ninhydrinlbsung in der üblichen Weise naehg-i viesen.
Ist eine Aminosäurebande im Verhälntnis zu ύύ>. . leren sciurebanden der gleichen Harnprobe wesentlich stärker als gewöhnlich und im Vergleich zu den übrigen Ilarnproboa des Chromatogramms, so liegt der Verdacht einer Hyperaminacidurie vor. Auf Grund der Lage der Bande(n) wird entschieden, um welche Aminosäuren es sich handelt. Ist am Chromotogramm einer Ilarnprobe nichts Auffälliges zu bemerken, kann, eine Hyperaminacidurie ausgeschlossen werden.
2. Auf eine Platte des Formats 10 χ 10 cm mit einer 1(5 cm breiten Schicht I (hergestellt nach Beispiel A) werden etwa 51*1 eines Hydrolysate, erhalten aus einem Peptidgemisch und Perchlorsäure, auf eine möglichst kleine Fläche in je 1 cm Abstand vom unteren und von einem seitlichen P ax,tenrand auf den Ionenaustauscherstreifen (Schicht i) aufgetragen.
Von jeder Aminosäure müssen etwa 0,02 bis 0,2 ^g aufgetragen Averden. Nachdem das Lösungsmittel des Hydrolysate verdunstet ist, wird der Austauscherstreifen mit 5 — iO ml Wasser aus einer Pipette vorsichtig abgespült. Es wird wiederum getrocknet. Dann werden die Aminosäuren durch zweimaliges Entwickeln mit dem Elutionsmittel Methanol/Ammoniak/Wasser (50/15/35) 1 cm weit in die Celluloseschicht geschoben. Der Ionenaustauscherstreifen wird abgeschnitten. Anschließend wird eine zweidimensional Chromatografie der Ami ^^äuran in der üblichen Weise angeschlossen. Es wird ei. a·...-::. Trennung der Aminosäuren erreicht (Ninhydrin-Anrft- ;
3. Auf eine Zweischichtenfolie oder Glasplatte vom Format
IO cm χ 20 cm mit einem 3 cm breiten Ionenaustauscherstreifen entsprechend Beispiel A 2 worden auf den Austauec':arstreifen in eine Ecke, 1,5 cm vom Rand entfernt, 2 ul V^r- punktförmig aufgetragen. Man entwickelt die Pol! :·""" PT Ae in der
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üblichen V/eise über 20 cm mit Wasser als Elutionsmittel, und zwar so, daß die Ionenaustauscherschicht in das Elutionsmittel taucht. Dann trocknet man die Platte und entwickelt mit dem Elutionsmittel Methanol/Ainmoniak/AVassor (0O/20/30) zweimal bis 1,5 cm über den Austauscherstreifen hinaus.
Nun werden der Ionenaustauscherstreifen und' der obere Teil der Folie abgeschnitten, so daß eine Folie bzw. Platte vom Format 10 χ 10 cm entsteht. Diese Folie wird nun in der ül'lichen Art zweidimensional entorickelt. Bevorzugt wird das System Pyridin/Dioxan/Amnoniak/Vasser (35/3S/l5/i5) als 1. Elutionsmittel und Butanol/Aceton/Eisessig/AVasser (35/35/10/20) als 2. Elutionsmittel. Es wird jeweils zweimal im gleichen Elutionsmittel bis zum Plattenrand in verschiedenen Richtungen entwickelt. Der Nachweis der Aminosäuren auf dem Chromatogramm geschieht in üblicher Weise mit Ninhydrin, Prolin, Ehrlichs Reagenz oder anderen Detektionsmitteln.
Die Methode erlaubt eine ausgezeichnete Auftrennung der Harnaminosiiuren und dient zur Erkennung von Anomalien des Aminosäurestoffwechsels. Entsprechende Ergebnisse werden auch bei Verwendung einer der nach Beispiel A 3 herstellbaren Folien erzielt.
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Claims (4)

  1. Patentansprüche,
    1» Zwoischichtcnplatto zur Dünnschichtchromafcographie, bestehend aus einer 'Ilcaktionszonc (Schicht i) und einer daran anschließenden Sorptionsmittelschicht (Schicht II) auf einem üblichen Trägermaterial, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktiouszone neben Cellulose entweder 50 - 90 '/β eines stark sauren oder stark basischen Celluloseioncnoustauschers oder 5 - 30 c/o eines stark sauren oder stark basischen Ionenaustauschers auf Polystyrolbasis enthalt.
  2. 2. Zweischichtenplatte nach Anspruch I1 dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionszone aus einem Gemisch aus etwa 90 '/t mikrokristalliner Cellulose und etwa 10 £» eines stark sauren Austauschers vom Typ der Polystyrol-Sulfonsäuren besteht.
  3. 3* Zweischichtenplatte nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß dio Reaktionszone zusätzlich ein an sich übliches Bindemittel, vorzugsweise Carboxymethylcellulose, enthält.
  4. 4. Zweischichtenplatte nach den Ansprüchen 1 bis 3,' dadurch gekennzeichnet, daß der verwendete Ionenaustauscher eine Kornr größe von unter 60 η besitzt.
    5« Zwoischichtenplatte nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Breite der Ileaktionszono etwa 10 bis 30 $# der Breite der Sorptionsmittelschicht beträgt.
    6· Verwendung der Zweischichtenplatte nach den Ansprüchen 1 bis zur dünnscliichtchromatographischon Auftrennung von salz- und/oder noutralstoffhaltigen Aniinosäurolüsungen.
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