-
GEBIET DER ERFINDUNG
-
Die
Erfindung betrifft das Gebiet der Chromatographieverfahren und genauer
die Trennung von geladenen Soluten bzw. gelösten Stoffen
durch hydrophile Interaktionschromatographie.
-
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
-
Gelöste
Stoffe in einer Mischung können sich in ihren Eigenschaften
stark unterscheiden. Bei der Umkehrphasen-Chromatographie (RPC)
betrifft dies Unterschiede der Polarität. Bei der Ionenaustausch-Chromatographie
betrifft dies Unterschiede der Ladung. Im Allgemeinen wird eine
Art von Elutionsgradient verwendet, um sicherzustellen, dass alle
gelösten Stoffe in einer Mischung im gleichen Zeitrahmen
eluiert werden.
-
Der
Ausdruck hydrophile Interaktionschromatographie (HILIC) wurde im
Jahr 1990 [1] geprägt, um Normalphasen-Chromatographie
mit mobilen Phasen zu beschreiben, die in der Regel zu 10–40%
wässrig sind. Ein Material mit ausreichend polarer stationärer
Phase ist stärker polar als diese mobile Phase und behält polare
gelöste Stoffe zurück. Ein Modell für
den Rückhaltemechanismus postuliert eine Trennung zwischen
der dynamischen mobilen Phase und einer sich langsam bewegenden
Wasserschicht, mit der die polare stationäre Phase hydriert
wird. Je polarer ein gelöster Stoff ist, desto stärker
ist er mit dieser stagnierenden Wasserphase assoziiert und desto
später eluiert er, eine normale Phasenrichtung. HILIC wurde
für die Kohlenwasserstoffanalyse bereits 1975 [2,3] eingesetzt.
Der Trennungsmechanismus wurde bereits 1967 erkannt, im Fall von
Sephadex, das mit einer vorherrschend organischen mobilen Phase
eluiert wurde [4]. HILIC ist allgemein geeignet für die
Analyse von polaren gelösten Stoffen wie es die Umkehrphasen-Chromatographie
(RPC) für nicht-polare gelöste Stoffe ist. Seit
1990 wird HILIC auf eine große Vielfalt von Peptiden [5–10],
komplexen Kohlenwasserstoffen [11] und einigen Proteinen [12–15]
angewendet und wird in wachsendem Umfang auf wenig polare gelöste
Stoffe, wie Pharmazeu tika [16–17], Saponine [18], Harnstoff
[19], Aminoglycosidantibiotika [20], Glucosinate [21], Zucker und
Glycane [22–24], Folsäure und deren Metaboliten
[25], Nicotin und dessen Metaboliten [26] und Glycoalkaloide [27],
angewendet. Yoshida hat eine Reihe von Schriften verfasst, in denen die
Variablen untersucht werden, die an der HILIC von Peptiden beteiligt
sind [28–30]. Hemström und Irgum haben eine anspruchsvolle
Schrift verfasst, welche das gesamte Feld behandelt und auch versucht,
den Umfang zu bestimmen, bis zu dem eine Partitionierung oder Adsorption
für den Trennungsmechanismus verantwortlich ist [31]. Gradienten
der Elution beinhalten eine Erhöhung der Polarität
der mobilen Phase, wie bei der regulären Normalphasen-Chromatographie.
In der Regel beinhaltet dies die Senkung der Konzentrationen an organischem
Lösungsmittel, obwohl auch zunehmende Salzkonzentrationen
verwendet werden können. Hydrophile Interaktion kann als
Mischmodus über eine Ionentauschersäule gelegt
werden, indem man einen zunehmenden Salzgradienten in einer mobilen
Phase, die 60–70% organisches Lösungsmittel enthält,
ausführt. Diese Bedingungen wirken gut, um Histonvarianten
auf einer schwachen Kationentauschersäule aufzulösen [32–37],
und werden auch für die Chromatographie von Peptiden in
einer starken Ionentauschersäule in einer ausführlichen
Reihe von Schriften der Robert Hodges Group verwendet [38–40].
-
Hydrophile
Interaktionen bestimmen in der Regel das Elutionsprofil unter Verwendung
von HILIC. Unter bestimmten Bedingungen können jedoch auch
elektrostatische Wirkungen die Elution von geladenen Lösungen
beeinflussen und manchmal komplizierter machen. Beispielsweise eluieren
saure Aminosäuren vor dem Hohlraumvolumen einer Kationentauschersäule,
da elektrostatische Abstoßung sie aus fast dem ganzen Volumen
innerhalb der Poren der stationären Phase ausschließt.
Wenn die mobile Phase jedoch zu mehr als 60% organisches Lösungsmittel
enthält, dann werden die sauren Aminosäuren von
einer Kationentauschersäule fast ebenso gut zurückgehalten
wie von einer neutralen Säule (1). Mit ausreichend organischem
Lösungsmittel in der mobilen Phase überwindet
die hydrophile Interaktion die elektrostatischen Wirkungen und dominiert
die Chromatographie.
-
Ein
weiteres Beispiel für elektrostatische Wirkungen in HILIC
ist die Trennung von Phosphoproteinen. Histonproteine sind basisch
und werden auf einer Kationentauschersäule gut zurückgehalten.
Jegliche Phosphatgruppen, die an das Histonprotein gebunden sind, stoßen
die Säule elektrostatisch ab, was zu einer früheren
Lösung des Proteins führt. Jedoch induziert ein
hoher Anteil an organischem Lösungsmittel in der mobilen
Phase eine hydrophile Interaktion der Phosphatgruppen mit der Säule.
Dies führt zu einer späteren Elution von phosphorylierten
Histonen trotz der elektrostatischen Abstoßung [32].
-
Elektrostatische
Wirkungen haben wichtige Implikationen für die Trennung
von geladenen gelösten Stoffen anhand von HILIC. Normalerweise
werden basische gelöste Stoffe am besten anhand von HILIC
zurückgehalten, danach kommen die phosphorylierten (1).
Daher ist ein Gradient nötig, um Proben zu eluieren, die
sehr basische Peptide oder Nukleotide, wie ATP, aufweisen. In extremen
Fällen ist ein Gradient mit sowohl abnehmenden als auch
zunehmenden Salzkonzentrationen erforderlich [8]. Die Verwendung
von Gradienten ist komplizierter als eine isokratische Elution und
beinhaltet zusätzliche Ausrüstung. Wenn eine isokratische Elution
verwendet wird, können viel längere Elutionsprofile
erforderlich sein. Ferner kann eine ineffiziente Trennung die Folge
sein, wenn keine geeigneten Elutionsgradientenbedingungen gewählt
werden. Es besteht ein Bedarf in der Technik an Verfahren, welche
die isokratische und schnelle Auflösung von bestimmten
geladenen gelösten Stoffen erlauben.
-
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
-
In
einem Aspekt umfasst ein Verfahren zur Durchführung von
elektrostatischer Abstoßungs-/hydrophiler Interaktion-Chromatographie
(ERLIC) an einem Protein, einem Peptid oder einer Aminosäure
die Bereitstellung einer Säule mit einem Anionentauschermaterial
mit einem pH von unter etwa 4 und das Eluieren der Verbindung anhand
einer mobilen Phase, die eine Menge an organischem Lösungsmittel
aufweist, die ausreicht, um eine hydrophile Interaktion zu ermöglichen,
welche die elektrostatische Abstoßung durch die stationäre
Phase im Wesentlichen ausgleicht. Das Verfahren ist beispielsweise
wirksam für die selektive Isolierung von Phosphopeptiden,
entweder isokratisch oder anhand eines Salzgradienten. In einem
anderen Aspekt umfasst ein Verfahren zur Durchführung einer
ERLIC an einer Nukleinsäure oder einem Nukleotid die Bereitstellung
einer Säule mit einem Kationentauschermaterial mit einem
pH von unter etwa 3,4 und das Eluieren der Verbindung an hand einer
mobilen Phase, die ausreichend organisches Lösungsmittel
aufweist, um eine hydrophile Interaktion zu ermöglichen,
welche die elektrostatische Abstoßung durch die stationäre
Phase im Wesentlichen ausgleicht.
-
BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
-
Die
Ziele, Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden
ausführlicheren Beschreibung bestimmter Ausführungsformen
der Erfindung deutlich und wie in der begleitenden Zeichnung dargestellt,
in der:
-
1 eine
typische Trennung von Peptidstandards im Anionentauschermodus darstellt.
Gly-Tyr ist ein neutrales Peptide, das im Hohlraumvolumen eluiert.
Die mäßig sauren Peptide Asp-Val und Ala-Gly-Ser-Glu werden
in gewissem Umfang durch elektrostatische Anziehung zurückgehalten.
In Abwesenheit einer hydrophilen Interaktion wird jedoch das basische
Peptid [Arg8]-Vasopressin durch elektrostatische
Abstoßung aus dem Porenvolumen ausgeschlossen und eluiert
vor dem Porenvolumen.
-
2 zeigt
die Rückhaltezeit mehrerer Standardpeptide als Funktion
einer Acetonitril-Konzentration anhand des HILIC-Verfahrens.
-
3 zeigt
die Rückhaltezeit mehrerer Standardpeptide gegen die Acetonitril-Konzentration
anhand des ERLIC-Verfahrens.
-
4 zeigt
die Trennung einer Mischung von Peptidstandards anhand der HILIC-
und ERLIC-Verfahren. Die oberen Hälfte der Figur zeigt
das Elutionsprofil unter Verwendung des HILIC-Modus und die untere Hälfte
der Figur zeigt das Elutionsprofil unter Verwendung des ERLIC-Modus.
-
5 zeigt
die Wirkung des pH der mobilen Phase auf die Peptidrückhaltezeit
unter Verwendung von ERLIC.
-
6 zeigt
die Wirkung der Salzkonzentration der mobilen Phase auf die Peptidrückhaltezeit
unter Verwendung von ERLIC.
-
7 zeigt
die Chromatographie des tryptischen Verdaus von beta-Casein. Die
Verdauung des Proteins beta-Casein mit Trypsin ergibt etwa 14 Fragmente.
Eines dieser Peptide weist eine Phosphatgruppe auf und das andere
vier. Das obere Chromatogramm zeigt den Verdau, der unter ERLIC-Bedingungen
auf einer PolyWAX LPTM-Säule (einem
Anionentauschermaterial) bei pH 2,0 durchgeführt wird.
Unter diesen Bedingungen haben Carboxylgruppen in den Peptiden ihre
negative Ladung verloren. Die zweiten und dritten Chromatogramme
zeigen die Elution von authentischen Standards der Phosphopeptide
in dem Verdau.
-
8 stellt
die Migration von Phosphopeptiden auf einer Anionentauschersäule
(wie in 7) im ERLIC-Modus der Migration
auf der gleichen Säule, die im üblichen Anionentausch(AEX)-Modus
verwendet wird, gegenüber. Die Bedingungen waren identisch,
abgesehen davon, dass im AEX-Modus beide mobile Phasen nur 10% Acetonitril
enthielten, nicht annähernd genug, um eine hydrophile Interaktion
in der Chromatographie zu ermöglichen, so dass das Peptid
mit einer Phosphatgruppe nur schlecht von Peptiden ohne Phosphatgruppe
getrennt wird.
-
9 zeigt
einen Satz synthetischer Peptide mit der gleichen Aminosäuresequenz.
Sie unterscheiden sich darin, dass sie 0, 1, 2, 3 oder 4 Phosphatgruppen
auf den Serinresten aufweisen. Das Insert zeigt auch die Trennung
von Positionsvarianten: von zwei Peptiden mit der gleichen Zahl
von Phosphaten (2), aber auf unterschiedlichen Serinresten. Wiederum
wird das Peptid mit einem Phosphat im ERLIC-Modus gut zurückgehalten,
aber nicht im AEX-Modus.
-
10 zeigt
die Rückhaltung als Funktion der Triethylaminmethylphosphonat-Konzentration
bei der ERLIC von Aminosäuren.
-
11 zeigt
die Wirkung der Triethylaminphosphonat-Konzentration der mobilen
Phase auf die Rückhaltung von Aminosäuren bei
der ERLIC.
-
12 zeigt
die isokratische Elution von sauren Aminosäuren im gleichen
Zeitrahmen wie von basischen Aminosäuren im ERLIC-Modus.
-
13 zeigt
die Wirkung der Erhöhung der Acetonitril-Konzentration
in der mobilen Phase von 65 bis 70% auf die Rückhaltezeiten
von Aminosäuren. Mit einer zunehmenden hydrophilen Interaktion
stiegen die Rückhaltezeiten von basischen Aminosäuren
bis zu dem Punkt, dass die elektrostatische Abstoßung nicht mehr
ausreichte, um ihre isokratische Elution im gleichen Zeitrahmen
wie die der anderen Aminosäuren zu bewirken.
-
14 zeigt
die Wirkung der Salzkonzentration, der Acetonitril-Konzentration
und des pH auf die Rückhaltung von Aminosäuren
bei der HILIC. Isokratische Bedingungen, die zu einer angemessenen
Trennung der nicht-basischen Aminosäuren führen,
bewirken, dass die basischen Aminosäuren in einem späteren Zeitrahmen
eluieren.
-
15 vergleicht
ERLIC von Nukleotiden auf einer Kationentauschersäule,
Poly-SULFOETHYL AspartamideTM, mit einer
HILIC dieser Verbindungen auf einer Säule aus neutralem
Material, PolyHYDROXYETHYL A. Bei niedrigen ACN-Konzentrationen,
wo hydrophile Interaktionen zu vernachlässigen sind, eluiert ADP
aufgrund seiner stärkeren elektrostatischen Abstoßung
früher als AMP aus der Kationentauschersäule. Bei
höheren ACN-Niveaus, wo hydrophile Interaktionen mit den
Phosphatgruppen Bedeutung gewinnen, ist die Elutionsreihenfolge
umgekehrt.
-
16 zeigt,
dass bei einem pH von 6, wo Phosphatgruppen beginnen, ihre zweite
negative Ladung zu erwerben, die elektrostatische Abstoßung
so stark ist, dass kein Nukleotid oder Oligonukleotid bei der ERLIC
zurückgehalten wird. Die Rückhaltung nimmt mit
abnehmendem pH zu, insbesondere unter 3,4, wo die Phosphatgruppen
beginnen, ihre einzelne negative Ladung zu verlieren.
-
17 zeigt
die Wirkung der Base auf die Rückhaltung in der ERLIC,
genauer U T < A < G < C. Bei den hier
verwendeten ACN-Niveaus fördert die Phosphorylierung die
Rückhaltung in jedem Fall.
-
18 zeigt
die Ergebnisse, die mit TEA-MePO4, das statt
TEAP genommen wird, erhalten werden. Es gibt eine Zunahme der Empfindlichkeit
gegenüber der Zahl der Phosphatgruppen zu Lasten der Empfindlichkeit
gegenüber der beteiligten Base.
-
19 zeigt
eine isokratische Elution von Nukleotiden in ERLIC mit einer mobilen
Phase von 80 mM TEAP, pH 3,0, 84% Acetonitril.
-
20 ist
eine schematische Darstellung der Orientierung von Aminosäuren
in ERLIC. Mit Phosphat als Gegenion liefert dessen potentielle zweite
negative Ladung ein Mittel für die Anziehung von basischen
Aminosäuren an die Oberfläche.
-
21 ist
eine schematische Gegenüberstellung der Orientierung von
AMP und ATP. Die Phosphatgruppe von AMP, die ziemlich hydrophil
ist, ist auf die stationäre Phase hin ausgerichtet, obwohl
sie von dieser abgestoßen wird. Im Fall von ATP reicht
die elektrostatische Abstoßung zwischen den drei Phosphatgruppen und
der Oberfläche aus, um die Phosphatgruppen von der Oberfläche
weg auszurichten.
-
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
-
Die
vorliegende Erfindung führt eine neue Strategie zur Durchführung
einer Chromatographie zur Trennung von Mischungen mit stark geladenen
gelösten Stoffen, die bei einer HILIC entweder zu schlecht
oder zu bereitwillig zurückgehalten werden, ein. Die Strategie
beinhaltet die Kombination der Prinzipien des Ionentauschs und der
hydrophilen Interaktion. Anhand der Verfahren der vorliegenden Erfindung
können Aminosäuren, Peptide, Nukleinsäuren
oder Nukleotide, die durch die stationäre Phase in HILIC
oder Ionentausch-Chromatographie entweder nicht zurückgehalten
würden oder zu stark zurückgehalten würden,
wirksam in einem vernünftigen Zeitrahmen getrennt werden.
Die Verfahren legen die Trennkraft sowohl der hydrophilen Interaktion
als auch der elektrostatischen Interaktion übereinander,
wodurch die Rückhaltungsextreme, auf die man in jedem Verfahren
allein stößt, einander jeweils entgegenwirken.
Durch Eliminierung sowohl langer als auch kurzer Rückhaltezeiten
für bestimmte gelöste Stoffe ermöglichen
die Verfahren die isokratische Auflösung heterogener Mischungen,
die andernfalls eine Elution mit komplexem Gradienten erfordern
würde. Diese neue Kombination von Chromatographieprinzipien
wird elektrostatische Abstoßungs-/hydrophile Interaktionschromatographie
(ERLIC) genannt.
-
Das
ERLIC-Verfahren beinhaltet die Abstimmung der geeigneten mobilen
Phase auf die stationäre Phase und die zu trennende oder
zu analysierende Probe, um die Probe isokratisch und schnell aufzulösen. ERLIC
wendet die folgenden zwei Prinzipien an, um dieses Ergebnis zu erreichen:
(1) Die stationäre Phase sollte die gleiche Polarität
der Ladung aufweisen wie die Mehrheit der Verbindungen in der Probe.
Dies sorgt für eine elektrostatische Abstoßung,
um eine unangemessene Rückhaltung von stark geladenen gelösten
Stoffen, die durch hydrophile Interaktion von der stationären
Phase stark zurückgehalten werden, zu verhindern. (2) Falls
die elektrostatische Abstoßung eines oder mehrerer gelöster
Stoffe zu stark ist, was bewirkt, dass diese zu früh eluieren
(z. B. vor dem Hohlraumvolumen), dann sollte der Gehalt an organischem
Lösungsmittel der mobilen Phase erhöht werden.
Dies führt dazu, dass die Rückhaltezeit von schnell
eluierenden gelösten Stoffen, z. B. solchen mit mehreren
Ladungen der gleichen Polarität wie die stationäre
Phase, durch Erhöhen der Stärke der hydrophilen
Interaktionen verlängert wird. Dies kann beispielsweise
dadurch erreicht werden, dass die Konzentration von Acetonitril
oder Propanol in der mobilen Phase erhöht wird. Die Rückhaltezeit
solcher gelöster Stoffe kann über einen großen
Bereich verlängert werden. Vorzugsweise wird die Rückhaltezeit verkürzt,
um die Gesamt-Elutionsdauer für eine Probe zu verkürzen,
oder verlängert, um die Fähigkeit des Verfahrens,
die Komponenten in der Probe isokratisch aufzulösen, zu
verbessern. Am stärksten bevorzugt wird die Rückhaltezeit
von mehrfach geladenen gelösten Stoffen verkürzt,
um ihre Elution im gleichen Zeitrahmen wie die anderen Verbindungen
in der Probe zu bewirken.
-
Allgemeine Anwendungen der
ERLIC
-
Unter
Verwendung von allgemein isokratischen Bedingungen ist ERLIC in
der Lage, für eine Trennung oder Analyse einer Reihe kleiner
Moleküle oder Makromoleküle zu sorgen, die normalerweise
Gradienten benötigen würden. ERLIC kann allgemein
auf jede Verbindung mit einer Polarität, die ausreicht,
um von der stationären Phase unter HILIC- Bedingungen zurückgehalten
zu werden, angewendet werden (z. B. unter Verwendung einer mobilen
Phase, die 10 Vol.-%–40 Vol.-% Wasser enthält,
und eines stationären Materials, das polarer ist als die
mobile Phase, so dass die Verbindung mit einem größeren
Volumen als das Hohlraumvolumen eluiert). ERLIC eignet sich ebenso
gut für die Analyse von einzelnen Verbindungen und für
die Trennung von Verbindungen aus einer Mischung. Im analytischen
Modus kann eine Verbindung auf der Basis ihrer Elutionsposition
im Vergleich zu einem Standard identifiziert werden, oder die Reinheit
und Zusammensetzung einer Mischung aus Verbindungen kann durch das
Gesamtelutionsprofil der Mischung festgestellt werden. Im präparativen
Modus kann ERLIC auf die Isolierung oder Reinigung einer bestimmten
Verbindung aus einer Mischung durch physikalische Trennung einzelner
Verbindungen, die unterschiedlichen Peaks im Elutionsprofil entsprechen,
während sie aus der Säule eluieren, angewendet
werden. ERLIC kann auf die Trennung oder Analyse von Mischungen
von Aminosäuren, Peptiden, Polypeptiden, Proteinen, Nukleotiden,
Oligonukleotiden oder Polynukleotiden angewendet werden.
-
Das
ERLIC-Verfahren kann dadurch, dass es die isokratische Durchführung
vieler HILIC-Trennungen ermöglicht, die Entwicklung von
chromatographischen Trennungen erheblich vereinfachen. Nicht alle
Mischungen eignen sich jedoch für eine solche Behandlung.
Komplexe Mischungen, die große Zahlen individueller Moleküle
enthalten, z. B. ein Proteinverdau, der mehr als 50 Peptide enthält,
können wahrscheinlich anhand eines einzelnen isokratischen
Verfahrens nicht vollständig getrennt werden. Jedoch ist
eine vollständige Trennung nicht immer notwendig, insbesondere
nicht im analytischen Modus. Wenn beispielsweise ein Massenspektrometer
als Detektor verwendet wird, ist es nur nötig, die Zahl
der Peptide, die als einzelner Peak oder als nicht-aufgelöste
Gruppe von Peaks gemeinsam eluieren, in dem Maße aufzulösen,
dass die Ionisierung der einzelnen Peptide nicht durch die Anwesenheit
anderer Peptide gestört wird. Ein automatischer Probeninjektor kann
verwendet werden, um schnell eine große Zahl von Proben
zu analysieren, wobei jede Probe nach dem ERLIC-Elutionsfenster
der vorangehenden Probe injiziert wird. Die Anwendung einer isokratischen
Elution vereinfacht auch die Ausrüstungserfordernisse,
da eine Gradientenelution üblicherweise eine zusätzliche
Pumpen- und Gradientenbildungseinrichtung verlangt. Außerdem
kann ERLIC nützlich sein für Trennungen, die auf einem
Silizium-Wafer oder -Chip durchgeführt werden, in dem viele
Proben gleichzeitig im winzigen Maßstab in separaten Kanälen
analysiert werden könnten. Strömungsraten solcher
Anwendungen können in der Größenordnung
von Nanolitern pro Minute liegen. Die Ausrüstung, die für
solche Trennungen nötig ist, würde sehr vereinfacht
werden, wenn diese isokratisch durchgeführt werden könnten.
-
Auswahl der stationären
Phase
-
Wie
bei der HILIC besteht bei der ERLIC die stationäre Phase
aus einem hydrophilen Material. Außerdem muss bei der ERLIC
das Material der stationären Phase beim pH der mobilen
Phase auch entweder positiv oder negativ geladen sein. Spezifische
Beispiele werden in den Beispielen angegeben.
-
Auswahl der mobilen Phase
-
Wie
bei der HILIC ist die mobile Phase bei der ERLIC weniger polar (stärker
hydrophob) als die stationäre Phase. Die mobile Phase sollte
mindestens 2 Vol.-% Wasser enthalten, so dass das Material der stationären
Phase eine stagnierende Schicht gebundenen Wassers bilden kann,
die hilfreich ist, um stärker polare gelöste Stoffe
länger zurückzuhalten als weniger polare. Im Allgemeinen
enthält die mobile Phase etwa 40 Vol.-% bis 90 Vol.-% an
organischem Lösungsmittel wie Acetonitril, Methanol, Propanol
oder einem anderen Lösungsmittel mit ähnlicher
Polarität, das mit Wasser mischbar ist. Die Konzentration
an organischem Lösungsmittel kann nach Wunsch angepasst
werden, um die Rückhaltung einer betrachteten Verbindung
zu ändern. Der pH der mobilen Phase ist ein wichtiger Faktor
bei der Anpassung der Nettoladung der stationären Phase
und der gelösten Stoffe, die auch die Rückhaltung
einer betrachteten Verbindung beeinflusst.
-
Strategien für die
Anpassung der Elution einer Verbindung in ERLIC
-
Das
ERLIC-Verfahren eignet sich besonders gut für den Umgang
mit mehreren Rückhaltungsextremen, auf die man bei der
HILIC stößt. Wie oben im Allgemeinen beschrieben
wurde, kann die HILIC-Komponente der ERLIC früh eluierende
molekulare Spezies auf einen späteren Elutionszeitpunkt
verschieben, was zu einer besseren Auflösung führt.
Mit geeigneten Anpassungen der mobilen Phase kann die elektrostatische Abstoßungskomponente
der ERLIC auch bewirken, dass spät eluierende molekulare
Spezies früher eluieren, was die Laufzeit mit nur wenig
oder gar keiner Auswirkung auf die Auflösung verkürzt.
Die folgenden Fälle werden als Erläuterungen angegeben.
-
Späte Elution von
sehr sauren Peptiden durch elektrostatische Anziehung
-
Stark
saure Peptide können während einer Anionentausch-Chromatographie
unter Verwendung von HILIC aufgrund einer elektrostatischen Anziehung
an die stationäre Phase zu stark zurückgehalten
werden. Eine Lösung dieses Problems besteht darin, eine
mobile Phase mit einem pH zu verwenden, der ausreichend niedrig
ist, um Aspartat- und Glutamatreste zu entladen, wodurch die meisten
Peptide neutral oder basisch werden. Unter Verwendung der isokratischen
Verfahren der vorliegenden Erfindung kann der Gehalt an organischem
Lösungsmittel der mobilen Phase auf ein solches Niveau
angehoben werden, dass die hydrophile Interaktion die Chromatographie
dominiert und eine Rückhaltung der sauren Peptide trotz
der fehlenden elektrostatischen Anziehung gewährleistet.
-
Späte Elution sehr
basischer Peptide durch hydrophile Interaktion
-
Stark
basische Peptide eluieren im HILIC-Modus spät aus polaren
Säulen. Die Anwendung einer elektrostatischen Abstoßung
durch die stationäre Phase, d. h. des ERLIC-Verfahrens,
würde es ermöglichen, dass solche Peptide im gleichen
Zeitrahmen eluieren wie neutrale oder mäßig saure
Peptide. Diese Wirkung wäre der eines immobilisierten Salzgradienten
analog.
-
Elution
von basischen Peptiden vor dem Hohlraumvolumen durch elektrostatische
Abstoßung
-
Wenn
Peptide im AEX-Modus anhand einer positiv geladenen stationären
Phase getrennt werden, eluieren basische Peptide aufgrund von elektrostatischen
Abstoßungswirkungen im oder vor dem Hohlraumvolumen (siehe 1).
Dies führt zu einem engen Fraktionierungsbereich, der von
begrenztem Nutzen ist. Wenn jedoch ausreichend organisches Lö sungsmittel
in der mobilen Phase enthalten ist, ist die hydrophile Interaktion
stark genug, um die elektrostatische Abstoßungswirkung
zu überwinden, was zu längeren, angemesseneren
Rückhaltezeiten und verbesserter Auflösung führt.
-
Saure
Aminosäuren eluieren vor dem Hohlraumvolumen einer Kationentauschersäule,
da sie durch elektrostatische Abstoßung an einem Zugang
zum vollen Porenvolumen der stationären Phase gehindert
werden. Wenn die mobile Phase jedoch > 60% organisches Lösungsmittel
enthält, dann werden saure Aminosäuren durch eine
polare Kationentauschersäule fast ebenso gut zurückgehalten
wie durch eine polare neutrale Säule [1]. Diese anscheinende
Regelwidrigkeit reflektiert die Tatsache, dass die hydrophile Interaktion
von elektrostatischen Wirkungen unabhängig ist. Mit ausreichend
organischem Lösungsmittel in der hydrophilen Phase dominiert
die hydrophile Interaktion die Chromatographie. Somit vermindern
Phosphatgruppen die Rückhaltung von basischen Histonproteinen
auf einer Kationentauschersäule in Abwesenheit von organischem
Lösungsmittel, aber führen zu einer Nettozunahme
der Retention bzw. Rückhaltung, wenn die mobile Phase 70%
ACN enthält [32]. Unter diesen Bedingungen ist die hydrophile
Interaktion, die von den Phosphatgruppen beigetragen wird, stärker
als ihre elektrostatische Abstoßung durch die stationäre
Phase.
-
Dieses
Phänomen hat wichtige Implikationen. Basische gelöste
Stoffe werden bei der HILIC normalerweise am besten zurückgehalten,
gefolgt von den phosphorylierten [1]. Ein Gradient ist nötig,
wenn Proben sehr basische Peptide oder Nuldeotide, wie ATP, enthalten.
In extremen Fällen ist ein Gradient mit sowohl abnehmenden
organischen als auch zunehmenden Salzkonzentrationen nötig
[8]. Im Fall von Peptiden wäre dies jedoch offensichtlich
unnötig, falls eine Anionentauschersäule für
die HILIC verwendet würde. Diese Kombination würde
die folgenden drei Rückhaltungsextreme bewältigen:
(1) Späte Elution sehr saurer Peptide durch elektrostatische
Anziehung: diese könnte durch die Verwendung von mobilen
Phasen mit einem pH, der niedrig genug ist, um Aspartat- und Glutamatreste
zu entladen, wodurch die meisten Peptide neutral oder basisch würden,
gemäßigt werden. Tatsächlich wurde ein
abnehmender pH-Gradient mit Anionentauscherkartuschen verwendet,
um eingefangene saure Peptide freizusetzen [41] und um Proteine
zu entsalzen [42]. (2) Späte Elution von sehr basischen
Peptiden durch hydrophile Interaktion: elektrostatische Abstoßung
durch die stationäre Phase würde solche Peptide
wieder in den Elutionszeitrah men neutraler oder moderat saurer Peptide
zurückwerfen. Die Wirkung wäre analog zum Vorhandensein
eines immobilisierten Salzgradienten; (3) Elution von basischen
Peptiden vor dem Hohlraumvolumen durch elektrostatische Abstoßung:
wie bei den sauren Aminosäuren werden basische Peptide
in Abwesenheit eines hohen Niveaus an organischem Lösungsmittel
vom Porenvolumen einer Säule der gleichen Ladung ausgeschlossen
(1). Dies ist eine Version von Ionenausschluss-Chromatographie
[43–45], einer Technik von begrenztem Nutzen aufgrund ihres
engen Fraktionierungsbereichs. Jedoch könnte man genug
organisches Lösungsmittel in der mobilen Phase einschließen,
um eine hydrophile Interaktion zu erzeugen, die für eine
angemessene Rückhaltung solcher Peptide ausreicht.
-
Unter
diesen Bedingungen würden alle Peptide in einer Mischung
durch hydrophile Interaktion zurückgehalten, obwohl sie
in gewissem Maß durch die stationäre Phase abgestoßen
werden (abgesehen von neutralen Peptiden). Die Abkürzung
ERLIC wird für diese Kombination vorgeschlagen und steht
für Elektrostatische Abstoßungs-/Hydrophile Interaktions-Chromatographie.
Da die beiden übereinander gelegten Moden ihren gegenseitigen
Rückhaltungsextreme entgegenwirken, kann eine isokratische
Auflösung heterogener Peptidmischungen praktikabel sein.
-
Peptide,
die Phosphat- oder Sulfatgruppen enthielten, würden eine
gewisse negative Ladung auch bei einem pH behalten, der niedrig
genug ist, um Asp- und Glu-Reste zu entladen. Solche Peptide würden
eine gewisse elektrostatische Anziehung an die stationäre
Phase, die für die ERLIC verwendet wird, zeigen. Dies wäre
eher von Vor- als von Nachteil; zahlreiche Anwendungen der Biochemie
würden von einem Verfahren profitieren, das die selektive
Isolierung von Phosphopeptiden aus einem Verdau ermöglicht.
Dabei stellt ERLIC eine Alternative zur Immobilisierten Metallamnitäts-Chromatographie
(IMAC) und zu Lewis-Säuren, wie Titanoxid, Zirkonoxid oder
Aluminiumoxid, dar. In Fällen, wo ein Peptid mehr als eine
Phosphat- oder Sulfatgruppe enthält, kann trotzdem noch
eine Elution mit einem Salzgradienten nötig sein.
-
Außer
auf Peptide könnte ERLIC im Prinzip auf andere gelöste
Stoffe mit ausreichender Ladung, ob nun positiv oder negativ, angewendet
werden. Diese Studie erforscht die Eigenschaften und die Nützlichkeit von
ERLIC, die auf Peptide, Aminosäuren, Nukleotide und Oligonukleotide
angewendet wird.
-
Materialien und Methoden
-
Alle
Säulen waren Produkte von PolyLC Inc. (Columbia, MD), wenn
nicht anders angegeben. PolyWAX LPTM, ein
schwaches Anionentauschermaterial, wurde mit Peptiden und Aminosäuren
verwendet. Für Peptide waren die Säulen entweder
1) 100 × 4,6 mm, 5 μm Teilchendurchmesser, 300 Å Porendurchmesser (Artikel
Nr. 104WX0503) oder 2) 200 × 4,6 mm, 5 μm, 300 Å (Artikel
Nr. 204WX0503). Für Aminosäuren war die Säule
200 × 4,6 mm, 5 μm, 100 Å (Artikel Nr.
204WX0501). Für ERLIC von Nukleotiden wurde eine 200 × 4,6
mm-Säule des starken Kationentauschermaterials PolySULFOETHYL
AspartamideTM (PolySULFOETHYL ATM)
[46] verwendet; 5 μm, 300 Å (Artikel Nr. 204SE0503).
HILIC-Daten für Peptide (2 und 4),
Nukleotide und Nukleinsäuren wurden mit einer 200 × 4,6
mm-Säule von PolyHYDROXYETHYL AspartamideTM (PolyHYDROXYETHYL
ATM) [1]; 5 μm, 300 Å (Artikel
Nr. 204HY0503) erhalten. HILIC-Daten für Aminosäuren
wurden mit einer 200 × 4,6 mm-Säule von 5 μm,
100 Å PolyHYDROXYETHYL ATM (Artikel
Nr. 204HY0501) erhalten.
-
Ausrüstung:
Es wurde ein Scientific Systems Inc./Lab Alliance (State College,
PA) Essence HPLC-System verwendet.
-
Reagenzien:
Peptidstandards 1–20 wurden von Bachem (Torrence, CA) erworben,
mit den folgenden Ausnahmen: 9 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO);
15, 16 (Peninsula Laborstories, Belmont, CA) und 13, 18–20
(California Peptide Research, Napa, CA). Aminosäure-, Nukleotid-
und Nukleinsäurestandards waren von Sigma. Phosphorsäure
und Acetonitril (ACN) [beide von HPLC-Güte] waren von Fisher
Scientific (Pittsburgh, PA). Triethylamin (99,5%) war von Aldrich
Chemical Co. (Milwaukee, WI). Methylphosphonsäure war von
Alfa Aesar/Lancaster Synthesis (Ward Hill, MA). Es wurde Wasser
von HPLC-Güte verwendet.
-
0,5
M-Stammlösungen von Triethylaminphosphat(TEAP)-Puffern
wurden wie folgt hergestellt: 14,4 g 85%-ige Phosphorsäure
wurden in ein Becherglas gewogen, und 150 ml Wasser wurden langsam
unter Rühren zugegeben. Triethylamin wurde (in einer Glocke)
zugegeben, bis der gewünschte pH erreicht war. Die Lösung
wurde auf 250 ml verdünnt und gefiltert (0,45 μm-Filter).
Methylphosphonat-Stammlösungen wurden anhand des gleichen
Verfahrens hergestellt, unter Zugabe von entweder Triethylamin-
oder NaOH-Lösung. Mobile Phasen wurden aus Wasser, ACN
und Aliquoten der gleichen Stammlösungen hergestellt. Der
pH der mobilen Phasen wurde weder gemessen noch angepasst, da sich
Dissoziationskonstanten in vorherrschend organischer Lösung
verschieben [47], sondern wurde einfach mit dem pH der Stammlösung
bezeichnet, die zu deren Herstellung verwendet worden war.
-
Peptidstandards:
-
-
-
-
-
DSIP-ARTIGE
TRYPTISCHE MODELLPEPTIDE
-
ERLIC VON PEPTIDEN
-
A. Standardauswahl
-
- 1) Tryptische Peptide. Mit der Ausnahme von
solchen, die His-Reste oder fehlende Abspaltungen enthalten, enthalten
tryptische Peptide nur zwei basische Gruppen, den N-Terminus und
den C-terminalen Arg- oder Lys-Rest. Dies würde die Analyse
vereinfachen, da keine unangemessen basischen Peptide anwesend wären.
Daher wurden eine Reihe von tryptischen Peptiden in die Standards
eingeschlossen, um eine gewisse Vorstellung vom Bereich der Elutionszeiten
zu bekommen, die zu erwarten waren. Standards 1–5 sind
gewöhnliche Sequenzen mit 0 oder 1 Säurerest.
Standard 6 ist eine ungewöhnlich saure tryptische Sequenz.
Standards 18–20 sind tryptische Sequenzen, die mit einem
Asp-, IsoAsp- oder phosphoSer-Rest an einer Position substituiert
sind; dieser Probensatz erlaubt die Feststellung der Auswirkungen
dieser Reste auf die Rückhaltung.
- 2) Saure Peptide. Standards 7–9 sind saure Peptide
ohne basische Gruppen, abgesehen vom N-Terminus. Standard 10 ist
ein ungewöhnlich saures Phosphopeptid, wie es häufig
bei Se quenzen in der Umgebung von phosphoTyr-Resten der Fall ist.
Standards 11–13, die DSIP-Peptide, weisen die gleichen
Sequenzen auf wie die Standards 18–20, abgesehen von der
Substitution eines Glu-Rests für den C-terminalen Lys-Rest.
Dies erlaubt die Feststellung der Auswirkungen der Ersetzung eines
Asp- durch einen isoAsp- oder phosphoSer-Rest, wenn auch in einer
weniger gut gesteuerten Art als mit den Standards 18–20,
da der ausgetauschte Rest nicht der einzige saure Rest im Peptid
ist.
- 3) Basische Peptide. Standards 15–17 sind ungewöhnlich
basische Peptide. Standard 14, ACTH, weist fast ebenso viele saure
wie basische Reste auf. Dies könnte bei der Feststellung
der relativen Wichtigkeit solcher Reste für die Gesamtrückhaltung
eines Peptids nützlich sein.
-
Tabelle 1
| | Rückhaltedauer
(min) in der angegebenen mobilen Phase |
| STANDARD | 20
mM TEAP | 50
mM TEAP | 20
mM Na-MePO4 | 50
mM Na-MePO4 |
| 1 | 3,5 | 4,6 | 2,3 | 2,8 |
| 2 | 2,7 | 3,2 | 2,1 | 2,4 |
| 3 | 2,4 | 2,7 | 1,8 | 2,0 |
| 4 | 2,3 | 2,6 | 1,8 | 1,9 |
| 5 | 2,6 | 3,1 | 2,0 | 2,1 |
| 6 | 4,3 | 5,4 | 3,4 | 3,8 |
| 7 | 3,2 | 3,2 | 3,6 | 3,4 |
| 8 | 3,2 | 3,4 | 3,4 | 3,2 |
| 9 | 3,5 | 3,7 | 3,9 | 3,9 |
| 10 | 10,5 | 6,0 | 64,0 | 24,5 |
| 11 | 3,1 | 3,2 | 3,4 | 3,1 |
| 12 | 3,5 | 3,4 | 5,1 | 4,0 |
| 13 | 6,5 | 4,7 | 19,0 | 11,2 |
| 14 | (lang) | (lang) | 1,7 | 1,9 |
| 15 | (lang) | (lang) | 2,3 | 3,4 |
| 16 | 16,5 | 17,4 | 2,1 | 3,1 |
| 17 | 6,9 | 22,6 | 1,8 | 2,3 |
-
B. Auswahl von mobilen Phasen
-
Tabelle
1 zeigt einen vorläufigen Vergleich der Rückhaltezeiten
mit TEAP- gegen Natriummethylphosphonat (Na-MePO4)-Puffer.
Mit TEAP-Puffern war die Rückhaltung von sauren Phosphopeptiden
(Standards 10 und 13) nicht bemerkenswert größer
als die anderer Peptide, während die Rückhaltung
der basischen Standards 13–17 größer
war als die der meisten anderen. Diese Selektivität, die
charakteristisch ist für gewöhnliche HILIC, war
das Gegenteil von dem, was erwünscht war. Im Gegensatz
dazu zeigte die Selektivität von Na-MePO4-Puffern
die Eigenschaften, die für ERLIC gewünscht waren,
mit schneller Elution von basischen Peptiden und verzögerter
Elution von Phosphopeptiden. Demgemäß wurden Na-MePO4-Puffer für die ausführliche
Untersuchung der ERLIC von Peptiden ausgewählt.
-
C. Auswirkung der % organisches Lösungsmittel;
HILIC versus ERLIC
-
2 zeigt
die Auswirkung der % ACN auf die isokratische Rückhaltung
der Peptidstandards 1–20 bei der HILIC. Basische Peptide
(Standards 14–17 werden bei weitem am besten zurückgehalten.
Alle anderen, einschließlich der Phosphopeptide, eluieren
ungefähr im gleichen Zeitrahmen. 3 zeigt
die gleichen Standards unter ERLIC-Bedingungen.
-
Aufgrund
der elektrostatischen Abstoßung eluieren basische Peptide
nun im gleichen Zeitrahmen wie die anderen Peptide bei ACN-Niveaus
von 70% oder weniger. Dieser Unterschied zwischen HILIC und ERLIC manifestiert
sich in 4, wo Chromatogramme eines Peptidstandards,
der in beiden Moden ausgeführt wird, verglichen werden.
Im HILIC-Modus liefert ein ACN-Niveau, das zu einer isokratischen
Elution der basischen Standards 15 und 17 in weniger als 100 min
führt, zu einer unangemessenen Rückhaltung der
sauren und neutralen Standards. Im ERLIC-Modus ermöglicht
die elektrostatische Abstoßung von 15 und 17 nun die Erhöhung
der ACN-Konzentration auf ein Niveau, das eine angemessene Rückhaltung
und eine isokratische Elution für alle Standards in diesem
Beispiel innerhalb von 50 min leistet.
-
Offensichtlich
reichen Konzentration und pH der mobilen Phase in 3 aus,
um die Ionisierung von Carboxylgruppen zu unterdrücken,
da die sauren Standards 7–9 und 11 im gleichen Zeitrahmen
eluieren wie die neutralen tryptischen Peptide. Das saure tryptische
Peptid 6 wird erheblich länger zurückgehalten
als andere tryptische Peptide. Wenn man 1 betrachtet,
reflektiert dies seine Hydrophilie ebenso wie seinen Säuregrad.
IsoAsp-haltige Peptide eluieren etwas später als ihre Asp-haltigen
Analoga (z. B. 12 gegenüber 11). Zwischen 65–70%
ACN ist der phosphorylierte Standard 20 das letzte oder fast das
letzte tryptische Peptid, das eluiert. Saures Phosphopeptid 13 eluiert
unter diesen Bedingungen viel später als die anderen Standards, während
der noch stärker saure Phosphopeptidstandard 10 in einem
angemessenen Zeitrahmen überhaupt nicht eluiert. Dies betont
die Bedeutung der Rolle, die vom zweiten basischen Rest in einem
tryptischen Fragment gespielt wird, und die der damit zusammenhängenden
elektrostatischen Abstoßung bei der Sicherstellung einer
Elution in einem angemessenen Zeitrahmen in der ERLIC ohne die Verwendung
eines hohen Salzanteils. Die bedeutende Zunahme der Rückhaltung
von Phosphopeptiden bei hohen ACN-Niveaus reflektiert die große
Hydrophilie von Phosphatgruppen, die über deren elektrostatische
Anziehung gelegt wird. Jedoch werden bei ACN-Niveaus von über
70% die hydrophilen Interaktionen so stark, dass einige basische
Standards (15 und 16) trotz ihrer elektrostatischen Abstoßung
wiederum zu den am besten zurückgehaltenen Peptiden werden.
Dies scheint das Fenster der ACN-Konzentration für die
selektive Isolierung von Phosphopeptiden aus Verdaus zu definieren.
Natürlich weisen in tryptischen Verdaus ohne fehlenden
Abspaltungen keine Peptide große Zahlen von basischen Resten
auf, solange sie nicht mit His vernetzt sind oder dieses enthalten.
-
3 legt
nahe, dass es möglich ist, ein gut definiertes Fenster
für die isokratische Elution aller Peptide in einer Mischung
einzurichten. Die Breite des Fensters kann in gewissem Maß durch
Variieren der % organisches Lösungsmittel angepasst werden.
Die Zusammensetzung der Peptide ist unwichtig, solange keines von
ihnen besonders basisch ist oder Phosphatgruppen enthält.
-
D. Auswirkungen des pH in ERLIC
-
5 zeigt
die Auswirkung des pH auf die Rückhaltung in ERLIC. Da
Carboxylgruppen bei pH 2,0 im Wesentlichen nicht ionisiert sind,
sind die am besten zurückgehaltenen Peptide Phosphopeptid
13 und in mäßigem Umfang tryptisches Phosphopeptid
20. Da Carboxylgruppen bei höheren pH-Werten ionisieren,
reflektiert jedoch die Rückhaltung die Gesamtzahl der sauren
Gruppen aller Arten, und die Selektivität für
Phosphopeptide geht verloren. Diese Bedingungen nähern
sich denen der normalen Anionentausch-Chromatographie an. Neutrale
tryptische Peptide werden fast vollständig durch hydrophile
Interaktionen zurückgehalten. Ihre Rückhaltung
wird durch den pH nur wenig beeinflusst, solange die mobile Phase
eine angemessene Salzkonzentration enthält. Die Rückhaltung
von sauren Peptide erreicht bei pH 5,0 ein Maximum und fällt
dann bei höheren pH-Werten ab. Dies reflektiert eine Abnahme
der Ladungsdichte des schwachen Anionentauscher(WAX)-Materials.
Titrationskurven von Suspensionen solcher Materialien offenbaren
eine kontinuierliche Zunahme der Ladungsdichte von pH 9,5 auf pH
5,0 [48].
-
E. Auswirkung der Salzkonzentration in
ERLIC
-
6 zeigt
die Bedeutung dieser Variable bei der Bestimmung der Selektivität.
Die Erhöhung der Salzanteile schirmt gelöste Stoffe
von allen elektrostatischen Wirkungen ab, sowohl von anziehenden
als auch von abstoßenden, und die Selektivität
nähert sich der von HILIC an. Somit nimmt die Rückhaltung
für saure Peptide ab und nimmt für basische Peptide
zu, bis zu dem Punkt, dass basische Peptide bei hohen Salzanteilen
wiederum die am besten zurückgehaltenen werden. Es besteht
ein mäßiger Anstieg der Rückhaltung neutraler tryptischer
Peptide mit zunehmendem Salz. Dies reflektiert vermutlich die abnehmende
Abstoßung ihrer N-Termini und der basischen Reste an ihren
C-Termini.
-
Diese
Daten ergänzen die von 3 bei der
Einrichtung von Bedingungen für ein gut definiertes Elutionsfenster
aller Peptide in einer Mischung. Mit genügend Salz in der
mobilen Phase eluieren auch Peptide mit zahlreichen basischen oder
Phosphatgruppen in einem gut definierten Zeitrahmen.
-
F. Selektive Isolierung von Phosphopeptiden
-
Die
vorausgehenden Daten legten nahe, dass Peptide mit einer einzigen
Phosphatgruppe wahrscheinlich die letzen der Peptide oder mit die
letzten Peptide sind, die eluieren, wenn ein tryptischer Verdau mit
20 mM Na-MePO4, pH 2,0, der 70% ACN enthält,
eluiert wird. Tryptische Peptide mit mehr als einer Phosphatgruppe
zeigten, dass sie eine Gradientenelution benötigen. Ein
Gradient wurde ausgewählt, der die Erhöhung der
Salz- und die mäßige Senkung der ACN-Konzentration
beinhaltete. Das Salz, das für den Gradienten gewählt
wurde, war TEAP, das für die Eluierung von Phosphopeptiden
wirksamer ist als Na-MePO4 (Tabelle 1).
-
7 zeigt
den tryptischen Verdau des Proteins beta-Casein, das etwa 14 Fragmente
enthält. Eines dieser Peptide weist eine Phosphatgruppe
auf und das andere weist vier auf. Das obere Chromatogramm zeigt den
Verdau, der auf einer PolyWAX LPTM-Säule
(einem Anionentauschermaterial) bei pH 2,0 ausgeführt wird. Unter
diesen Bedingungen haben Carboxylgruppen in den Peptiden ihre negative
Ladung verloren. Es besteht eine elektrostatische Anziehung zwischen
dem positiv geladenen Säulenmaterial und den negativ geladenen Phosphatgruppen
in den beiden Polypeptiden. Es besteht auch eine elektrostatische
Abstoßung zwischen dem Säulenmaterial und dem
positiv geladenen Aminoterminus und dem Lysin- oder Argininrest
am C-Terminus aller tryptischen Peptide (Trypsin spaltet auf der
C-terminalen Seite von Arginin- oder Lysinresten).
-
Normalerweise
würde die elektrostatische Abstoßung die elektrostatische
Anziehung von Peptiden mit nur einer Phosphatgruppe überwiegen.
Dies wurde hier durch die Aufnahme von gerade genug organischem Lösungsmittel
in die mobile Phase kompensiert, so dass die hydrophile Interaktion
der basischen Gruppen mit der stationären Phase die elektrostatische
Abstoßung ziemlich gut ausgleicht. Infolgedessen eluieren
tryptische Peptide, denen eine Phosphatgruppe fehlt, im oder unmittelbar
nach dem Hohlraumvolumen, während tryptische Peptide mit
Phosphatgruppen viel besser zurückgehalten werden, da sie
die zusätzliche elektrostatische Anziehung an die stationäre
Phase aufweisen. Während Peptide mit einem einzigen Phosphatgruppe innerhalb
einer angemessenen Zeit isokratische eluiert werden können,
trifft dies auf Peptide mit mehrere Phosphatgruppen nicht zu. Somit
wurden standardisierte Bedingungen angewendet, die einen Gradienten
mit zunehmender Salzkonzentration (20–200 mM) und leicht
abnehmender Konzentration an organischem Lösungsmittel
(70–60%) beinhaltete. Es gibt auch einen Salzwechsel während
des Gradienten von Natriummethylphosphonat, einem Salz, das die
Rückhaltung von Phosphopeptiden fördert, zu TEAP,
einem Salz, das deren Elution fördert. Phosphopeptid-Peaks
wurden nach der Elution gesammelt und die Phosphopeptide wurden über
Massenspektrometrie identifiziert.
-
Das
obere Chromatogramm zeigt die beiden erwarteten Phosphopeptide im
Verdau. Die Peptidsequenzen wurden mit den Einbuchstaben-Codes für
Aminosäuren bezeichnet. Ein fett geschriebenes „S"
bezeichnet einen Serinrest mit einer Phosphatgruppe Das in diesem
Verdau normal aufgeführte Tetraphosphopeptid ist eine Sequenz
mit fehlender Abspaltung; die N-terminale Aminosäure von
beta-Casein ist Arginin und Trypsin spaltet im Allgemeinen keine
basischen Reste an dieser Position ab. Jedoch ist aus 7 auch
das korrekt abgespaltene Tetraphosphopeptid zu sehen, in einem 1:6-Verhältnis
zum Fragment mit der fehlenden Abspaltung. Beide Tetraphosphopeptide
sind auch im kommerziellen Standard sichtbar (Chromatogramm Nr. 2).
Der kommerzielle Standard des Monophosphopeptids (Chromatogramm
Nr. 3) eluierte gemeinsam mit dem entsprechenden Peak im gesamten
Verdau (oben).
-
Das
Chromatogramm unten in 7 zeigt den Verdau nach der
Behandlung mit alkalischer Phosphatase, die Phosphatgruppen aus
Proteinen und Peptiden heraus hydrolysiert. Alle drei Peaks, die
hier als Phosphopeptide identifiziert wurden, verschwanden aus der
Region der zurückgehaltenen gelösten Stoffe, während mehrere
neue Peaks zu Beginn in der Nicht-Phosphopeptid-Region erschienen.
Dies bestätigt ihre Identität vor Phosphatasebehandlung
als Phosphopeptide.
-
8 zeigt
den tryptischen Verdau von beta-Casein. Dies stellt die Migration
von Phosphopeptiden auf einer Anionentauschersäule (der
gleichen wie in 7) im ERLIC-Modus der Migration
auf der gleichen Säule, die im gewöhnlichen Anionentausch
(AEX)-Modus verwendet wird, gegenüber. Die Bedingungen
waren identisch, außer dass beide mobilen AEX-Phasen nur
10% Acetonitril enthielten, nicht annähernd genug, um eine hydrophile
Interaktion für die Chromatographie zu bewirken. Obwohl
Tetraphosphopeptide immer noch gut zurückgehalten wurden,
eluiert das Monophosphopeptid nun viel früher, unter den
Nicht-Phosphopeptiden. Es ist klar, dass im AEX-Modus die elektrostatische
Abstoßung der beiden basischen Gruppen im Peptid stärker
ist als die Anziehung der einzelnen Phosphatgruppe. Wiederum wird
die Identifizierung der Phosphopeptid-Peaks durch Behandeln des
Verdaus mit alkalischer Phosphatase und die Ausführung
sowohl im ERLIC- als auch im AEX-Modus bestätigt. Diese
Daten sind ein klares Beispiele dafür, dass AEX sich nicht
für die Isolierung von einzeln phosphorylierten Peptiden
aus einem tryptischen Verdau eignet, ERLIC hingegen schon.
-
9 zeigt
synthetische Polypeptide. Dies ist ein Satz von synthetischen Peptiden
mit der gleichen Aminosäuresequenz. Sie unterscheiden sich
darin, dass sie 0, 1, 2, 3 oder 4 Phosphatgruppen auf ihren Serinresten
aufweisen. Das Insert zeigt auch die Trennung von Positionsvarianten:
zwei Peptide mit der gleichen Zahl von Phosphaten (2), aber auf
unterschiedlichen Serinresten. Die Elutionsbedingungen waren die
gleichen wie auf den Trägern 1 und 2. Alle Peptide wurden
im ERLIC-Modus zurückgehalten und aufgelöst, wobei
die Phosphopeptide viel besser zurückgehalten wurden als
das Nicht-Phosphopeptid. Im Anionentausch (AEX)-Modus eluieren wiederum
die Peptide mit 0 oder 1 Phosphat im oder nahe dem Hohlraumvolumen,
wobei sie schlecht getrennt sind.
-
Die
Doubletten, die für einige der Peaks betrachtet wurden,
reflektieren möglicherweise die Trennung der cis/frans-konformativen
Isomere um den einzelnen Prolinrest. Die gegenseitige Umwandlung
zwischen solchen Konformeren kann im Verhältnis zur Zeitskala
der Chromatographie langsam sein und wird hin und wieder in der
Literatur erwähnt. Das Chromatogramm unten, mit nur den
B- und D-Standards, zeigt einen Peak für D, der demjenigen,
der in der Literatur für einen reduzierenden Zucker oder
ein Oligosaccharid wiedergegeben wird [11], stark ähnelt.
In dem Fall entsprechen die beiden Peaks den alpha- und beta-Anomeren
der Zucker, mit einem Kontinuum zwischen ihnen, das den Molekülen
entspricht, die während der Migration durch die HPLC-Säule
zwischen den beiden Formen wechseln.
-
Die
Daten zeigen den Nutzen von ERLIC für die Trennung von
Nicht-Phosphopeptiden von Phosphopeptiden, auch solchen mit nur
einer Phosphatgruppe. Im Gegensatz dazu kann zwar ein Anionentausch (AEX)
verwendet werden, um Peptide mit mehr als einer Phosphatgruppe zu
isolieren, aber er ist nicht allgemein für Peptide mit
nur einem Phosphat geeignet. Solche Peptide machen die überwiegende
Mehrzahl der Peptide in tryptischen Verdaus aus. Somit ist ERLIC
vielversprechend für die Proteomikforschung, wo ein anhaltendes
Interesse an der Isolierung von Phosphopeptiden besteht.
-
II. ERLIC VON AMINOSÄUREN
-
A. Auswirkung von Salzidentität
und -konzentration auf die Selektivität
-
Die
Ergebnisse von 10 lassen sich gut mit denen
für Peptide in 6 vergleichen; mit TEA-MePO4, ebenso wie mit Na-MePO4 besteht
eine deutliche Rückhaltung von sauren und eine vergleichbar frühe
Elution von basischen Aminosäuren. Eine zunehmende Salzkonzentration
unterdrückt sowohl elektrostatische Abstoßung
als auch Anziehung, was zu einer früheren Elution von sauren
und einer späteren Elution von basischen Aminosäuren
führt. Es besteht eine leichte Abnahme der Rückhaltung
von neutralen Aminosäuren mit zunehmendem Salz. Dies reflektiert,
dass sowohl ERLIC als auch HILIC Varianten der Normalphasen-Chromatographie
sind; die Erhöhung der Polarität der mobilen Phase
fördert die Elution. Anders als neutrale tryptische Peptide
haben neutrale Aminosäuren außerdem keine deutliche
elektrostatische Abstoßung, die von den höheren
Salzniveaus abgeschirmt würde. Die Ergebnisse mit TEAP
(11) lassen sich gut mit denen für Peptide
in Tabelle 1 vergleichen; eine starke Rückhaltung von basischen
und eine vergleichsweise schwache Rückhaltung von sauren
Aminosäuren. Jedoch sind Salzkonzentrationen von unter
20 mM offensichtlich zu niedrig, um eine Gegenionenschicht aufrechtzuerhalten
oder eine elektrische Doppelschicht, welche die darunter liegende
stationäre Phase wirksam abschirmt. Die Folge ist, dass
gelöste Stoffe der positiven Ladung der stationären
Phase stärker ausgesetzt sind, so dass basische Aminosäuren
stärker elektrostatisch abgestoßen werden und
früher eluieren, während saure Aminosäuren
angezogen werden und später eluieren. Dies ermöglicht
die isokratische Elution von sowohl sauren als auch basischen Aminosäuren
im gleichen Zeitrahmen (12). Die
Rückhaltezeiten von basischen und sauren Aminosäuren sind äußerst
empfindlich gegenüber der Elektrolytkonzentration innerhalb
eines Bereichs von 10–20 mM; höhere Salzniveaus
schirmen basische Aminosäuren gegen elektrostatische Abstoßung
ab und bewirken, dass sie später eluieren, während die
Abschirmung die elektrostatische Anziehung von sauren Aminosäuren
senkt und bewirkt, dass diese früher eluieren. Die Rückhaltezeiten
von neutralen Aminosäuren werden in diesem Bereich nur
wenig beeinflusst. Unter diesen Bedingungen wurden Phe-, Trp- und
Tyr- von Leu-, Ile- und Val- nur unvollständig aufgelöst
und wurden somit aus der Mischung weggelassen. Es sei darauf hingewiesen,
dass Gin- bei pH 2,0 zu Pyroglutaminsäure umgewandelt wird,
mit einer Halbwertszeit der Umwandlung von 24 Stunden.
-
Normalerweise
würde man erwarten, dass Asp- als letztes aus einer Anionentauschersäule
eluiert, die im HILIC-Modus gefahren wird, was sowohl seine Ladung
als auch den hydrophilen Charakter reflektieren würde,
der den von Glu- und Cysteinsäure übertrifft.
Ein pH von 2,0 ist niedrig genug, um seine funktionelle Gruppe im
Wesentlichen zu entladen, wodurch seine Elution im gleichen Zeitrahmen
wie die anderen Aminosäuren möglich ist (solange
nicht das falsche Salz verwendet wird, siehe 10). Bei
pH 4,0 eluiert Asp tatsächlich erheblich früher
als die anderen Aminosäuren, solange die elektrostatischen
Wirkungen nicht durch die Zugabe von mehr Salz zur mobilen Phase
abgeschwächt werden (12). Pyroglutaminsäure
hat bei pH 4,0 auch eine negative Ladung, und ihre Rückhaltezeit
sinkt auch erheblich (von 9 min auf 6 min), wenn die Salzkonzentration
von 10 auf 20 mM steigt.
-
Wenn
die ACN-Konzentration in der mobilen Phase von 65 auf 70% erhöht
wird, nehmen die Rückhaltezeiten aller Aminosäuren
mit der Zunahme der Stärke der hydrophilen Interaktion
zu (13) zu. Die deutlichste Wirkung ist die Zunahme
der Rückhaltung der basischen Aminosäuren – von
allen die am stärksten hydrophilen – bis zu dem
Punkt, dass sie nicht mehr im gleichen Zeitrahmen eluieren wie die
anderen Aminosäuren, auch wenn sie und das Material der
polaren Säule die gleiche Ladung tragen. Die Rückhaltung
von Cysteinsäure bleibt durch diese Änderung der
ACN-Konzentration bemerkenswert unbeeinflusst. Cysteinsäure, die
hierin als Standard anstelle von Cystein verwendet wird, scheint
eine der starker hydrophoben Aminosäuren zu sein, deren
Rückhaltung hier fast ganz auf elektrostatische Anziehung
zurückgeht. Sie behält ihre negative Ladung selbst
bei einem pH von 2,0 (pK1 ~ 1,3). Bei pH
4,0 ist die Disparität der Ladung im Verhältnis zu
Glu und Asp deutlich geringer.
-
Es
ist lehrreich, Aminosäuren auf einer PolyHYDROXYETHYL ATM-Säule unter den gleichen Bedingungen
laufen zu lassen. Die kovalent gebundene Beschichtung ist Poly(2-hydroxyethylaspartamid),
ein neutrales Peptid mit freien N- und C-Termini. Somit weist die
Beschichtung potenziell eine gewisse positive und negative Ladung
auf, wenn auch in einem wesentlich geringeren Maß als ein
reguläres Ionentauschermaterial. Bei einem pH von 4,4 sind
diese Ladungen ausgeglichen, und die Beschichtung ist effektiv ein
neutrales Zwitterion. Oberhalb dieses pH ist die Nettoladung negativ;
darunter positiv. Bei pH 2,0, wo die Beschichtung eine insgesamt
mäßige positive Ladung hat, führt eine
Erhöhung der Salzkonzentration in der mobilen Phase zu einer
Verstärkung der Rückhaltung von basischen Aminosäuren
und einer Schwächung der Rückhaltung von sauren
Aminosäuren (14), wie bei der PolyWAX LPTM-Säule. Bei pH 4,0 ist die Beschichtung
jedoch fast neutral, und ein zunehmender Anteil an Salz senkt die
Rückhaltung von sowohl basischen als auch sauren Aminosäuren
(mit der Ausnahme einer mäßigen Zunahme der Rückhaltung
von His). Wiederum verstärkt die Erhöhung des
ACN-Niveaus die hydrophile Interaktion und Rückhaltung
für alle Aminosäuren, besonders aber die der basischen
(14).
-
Die
Verwendung von nicht-flüchtigen Salzen in mobilen HILIC-Phasen
ist lediglich eine Sache der Zweckmäßigkeit, da
Salze wie Triethylaminphosphat und Natriummethylphosphonat die Verwendung
einer Extinktionserfassung bei niedrigen Wellenlängen ermöglichen
und bei zweckmäßigen pH-Bereichen Puffern. Wie bei
anderen im Wesentlichen neutralen stationären Phasen kann
PolyHYDROXYETHYL ATM mit flüchtigen Salzen
oder ungepufferten Säuren als Elektrolytadditiven oder
sogar ohne Additiv verwendet werden, wenn eine gelöster
Stoff kein Elektrolyt ist.
-
III. ERLIC von Nukleotiden und Nukleinsäuren
-
A. HILIC versus ERLIC
-
Nukleotide
und Nukleinsäuren besitzen negativ geladene Phosphatgruppen.
Daher wurde die ERLIC dieser Verbindungen mit einer Kationentauschersäule
durchgeführt. 15 vergleicht die Ergebnisse
mit der HILIC dieser Verbindungen auf einer Säule aus einem
neutralen Material, PolyHYDROXYETHYL ATM.
Bei niedrigen ACN-Konzentrationen, wo hydrophile Interaktionen zu
vernachlässigen sind, eluiert ADP aufgrund seiner stärkeren
elektrostatischen Abstoßung früher als AMP aus
der Kationentauschersäule. Bei höheren ACN-Niveaus,
wo hydrophile Interaktionen mit den Phosphatgruppen an Bedeutung
gewinnen, ist ihre Elutionsreihenfolge umgekehrt. Man würde
erwarten, dass ATP bei niedrigen ACN-Niveaus früher eluiert
als ADP. Seine stärkere Rückhaltung, die anscheinend
regelwidrig ist, wird später erörtert. Mit der
neutralen Säule ist der Unterschied in der Rückhaltung
zwischen AMP, ADP und ATP viel größer, und zwar
aufgrund des Fehlens einer elektrostatischen Abstoßung
und der starken Polarität der Phosphatgruppen. Dies trifft
besonders auf ADP zu (ATP eluierte unter diesen Bedingungen in keiner
angemessenen Zeit aus der neutralen Säule).
-
B. Auswirkung des pH in ERLIC
-
Bei
pH 6, wo Phosphatgruppen beginne, ihre zweite negative Ladung zu
erwerben, ist die elektrostatische Abstoßung so groß,
dass kein Nukleotid oder Oligonukleotid zurückgehalten
wird (16). Die Rückhaltung
nimmt mit sinkendem pH ab, insbesondere unterhalb eines pH von 3,4,
wo die Phosphatgruppen beginnen, ihre einzelne negative Ladung zu
verlieren. Diese Wirkung ist besonders ausgeprägt bei den
gelösten Stoffen, welche die meisten Phosphate enthalten,
ATP und d(A)5. Mit den weniger phosphorylierten
gelösten Stoffen ist es schwierig, die Wirkung der sinkenden
negativen Ladung auf die Phosphatgruppen von derjenigen der zunehmenden
positiven Ladung (+1 → +2) auf die Adeninringe zu trennen
(pKa bei 3,6–4,0, abhängig vom Nukleotid).
-
C. Auswirkung der Salzkonzentration und
-identität auf die Selektivität
-
17 zeigt,
dass die Wirkung der Base auf die Rückhaltung bei der ERLIC
U T < A < G < C ist. Bei den
hier verwendeten ACN-Niveaus fördert die Phosphorylierung
die Rückhaltung in jedem Fall. Die Salzerhöhung
verstärkt die Rückhaltung von UMP, AMP und GMP
(aber nicht von CMP), was anzeigt, dass die elektrostatische Rückhaltung
ein bedeutender Faktor bei deren Rückhaltung über
den gesamten Bereich ist. Im Gegensatz dazu nimmt die Rückhaltung
von Di- und Triphosphonukleotiden bei 40 mM Salz auf ein Maximum zu
und fällt dann ab. Eine mögliche Erklärung
ist, dass 40 mM Salz ausreicht, um die meisten Abstoßungswirkungen
abzuschirmen, während höhere Konzentrationen die
elektrostatische Anziehung der positiv geladenen Basis auf die stationäre
Phase abschirmen. Der Mechanismus dieser Wirkung wird später
erörtert.
-
18 zeigt
die Ergebnisse, die mit TEA-MePO4, das TEAP
ersetzt, erzielt werden. Es besteht eine Zunahme der Empfindlichkeit
gegenüber der Zahl der Phosphatgruppen zu Lasten der Empfindlichkeit
gegenüber der beteiligten Base. Somit besteht eine erhebliche
Zunahme der Rückhaltung der Triphosphonuldeotide im Verhältnis
zur Rückhaltung der Mono- und Diphosphonukleotide. Der
Mechanismus dieser Änderung wird später aufgegriffen.
TEAP ist im Hinblick auf die isokratische Elution aller gemeinsamen
Nukleotide im gleichen Zeitrahmen das bessere der beiden Salze (19).
-
A. Einige Anwendungsgebiete für
ERLIC
-
Unter
Verwendung von allgemeinen isokratischen Bedingungen ist die ERLIC
in der Lage, Trennungen von Elektrolytmischungen, die normalerweise
Gradienten benötigen würden, zu erreichen. Der
einzige andere Chromatographiemodus, der routinemäßig
Trennungen isokratisch unter standardisierten Ausführungsbedingungen
durchführt, ist die Größenausschluss-Chromatographie
(Size Exclusion Chromatography, SEC). Die Auflösung von
SEC ist auf die Zahl der Peaks begrenzt, die in den Bereich zwischen
Vo und Vt passen. Diese Beschränkung trifft auf ERLIC nicht
zu; das Elutionsfenster kann verbreitert werden, indem man einfach
die Menge an organischem Lösungsmittel in der mobilen Phase
erhöht. Dies beeinflusst die Selektivität, da
Polaritätseffekte dann im Vergleich zu elektrostatischen
Effekten eine größere Bedeutung gewinnen, so dass
der Nutzen dieses Ansatzes von Fall zu Fall bewertet werden sollte.
Trotzdem scheinen bestimmte allgemeine Durchführungsbedingungen
für einen großen Bereich von gelösten
Stoffen ausreichend zu sein. Dies sollte die Entwicklung von Verfahren
erheblich vereinfachen. Nicht alle Mischungen eignen sich für
eine solche Behandlung. Kein Chromatographieverfahren leistet eine
vollständige Trennung aller Komponenten beispielsweise
in einem Proteinverdau, der über 50 Peptide enthält.
Jedoch ist nicht in jedem Fall eine vollständige Trennung nötig.
Wenn beispielsweise ein Massenspektrometer als Detektor verwendet
wird, ist es nur nötig, die Zahl der Peptide, die gemeinsam
eluieren, so weit zu verringern, dass sie ihre gegenseitige Ionisierung
nicht stören. In diesem Fall könnte man einen
automatischen Probeninjektor verwenden, um eine große Zahl
von Proben schnell zu analysieren, wobei dieser die einzelnen Proben
jeweils nach dem ERLIC-Fenster der Elution der vorangehenden Probe
einspritzt. Die Verwendung einer isokratischen Elution würde
die benötigte Ausrüstung vereinfachen. ERLIC könnte
für Trennungen von Nutzen sein, die auf einem Siliziumdioxid-Wafer
oder -Chip durchgeführt werden, in dem viele Proben gleichzeitig
in zahlreichen Kanälen im Minutenmaßstab analysiert werden
könnten. Strömungsraten für solche Anwendungen
würden in der Größenordnung von Nanolitem
pro Minute liegen. Es würde die für diese Trennungen
benötigte Ausrüstung stark vereinfachen, wenn
diese isokratisch durchgeführt werden könnten.
Schließlich hat die Entstehung der Bottom-Up- oder Shotgun-Proteomik den
Bedarf an alternativen Möglichkeiten, komplexe Mischungen
von Peptiden in multidimensionalen Ansätzen zu fraktionieren,
erhöht. ERLIC ist eine vielversprechende Ergänzung
zu derzeitigen Chromatographiemoden.
-
Die
Erfassung mit Massenspektrometrie oder einem evaporativen Lichtstreuungsdetektor
erfordert die Entwicklung von mobilen ERLIC-Phasen auf der Basis
von flüchtigen Salzen. Die ausgeprägten Wirkungen von
Gegenionen auf die Rückhaltung bei der ERLIC macht jeden
Versuch, flüchtige Salze für nicht-flüchtige Salze
in der mobilen Phase einzutauschen, kompliziert. Die Beibehaltung
einer bestimmten Selektivitätskombination kann eine sorgfältige
Abstimmung von Polarität und sterischer Hinderung der Ionen
erfordern. Ammoniumacetat oder Ammoniumpropionat kann sich als geeigneter
Ersatz für Natriummethylphosphonat erweisen, solange ein
pH über 3 für eine Anwendung ausreicht, während
Triethylaminformiat ein zufriedenstellender Ersatz für
Triethylaminphosphat sein kann.
-
B. Mechanismus von Selektivitätswirkungen
-
Die
Wahl des Salzes in der ERLIC kann einen dramatischen Effekt auf
die Selektivität haben. Dies kann erklärt werden,
wenn man annimmt, dass diese gelösten Stoffe zwar klein
sind, aber trotzdem während ihrer Wanderung durch die HPLC-Kolonne
auf starre Weise ausgerichtet werden können. Dies wurde
bereits für Disaccharide in HILIC demonstriert, beispielsweise
[11]. 20 ist ein Schema der Ausrichtung
von Aminosäuren bei der ERLIC. Mit Phosphat als dem Gegenion
liefert seine potentielle zweite negative Ladung ein Mittel für
die Anziehung von basischen Aminosäuren an die Oberfläche.
Das Potential für die Induzierung einer zweiten zugänglichen
negativen Ladung im Methylphosphonation ist bedeutend geringer.
Dies würde die Beobachtung erklären, dass die
basischen Aminosäuren und Peptide in ERLIC mit Phosphat
als Gegenion besser zurückgehalten werden als mit Methylphosphonat.
Im Gegensatz dazu würden saure Aminosäuren durch die
negativ geladene Schicht der Phosphationen an der Oberfläche
der stationären Phase abgestoßen werden und daher
mit TEAP-Puffern schneller eluieren, solange die TEAP-Konzentration
nicht zu niedrig ist, um eine vollständige Abdeckung der
Oberfläche zu leisten. 12 legt
nahe, dass dies unter 20 mM TEAP der Fall ist.
-
Ausrichtungswirkungen
mit Nuldeotiden scheinen kompliziert zu sein. 21 ist
ein Schema, das die Ausrichtungen von AMP und ATP einander gegenüber
stellt. Die Phosphatgruppe von AMP, die ziemlich hydrophil ist,
ist auf die stationäre Phase hin ausgerichtet, wird aber
von dieser abgestoßen. Die Erhöhung der Salzkonzentrationen
unterdrückt die Abstoßung und erhöht
die Anziehung von AMP. Die Natur des Gegenions, das mit der positiv
geladenen Base assoziiert ist, hat nur wenig Einfluss auf die Rückhaltung.
Mit ATP ist die Abstoßung der drei Phosphatgruppen durch
die stationäre Phase so stark, dass sie von dieser weg
ausgerichtet werden. Da die Base nunmehr auf die stationäre
Phase gerichtet ist, wird die Rückhaltung stark von der Natur
des Gegenions beeinflusst, wie in 17. Diese
umgekehrte Ausrichtung ist auch für die Rückhaltung von
ATP auf einer Kationentauschersäule in Abwesenheit von
ACN und hydrophiler Interaktion verantwortlich (15).
ADP, dessen Base nicht so starr auf die stationäre Phase
hin ausgerichtet ist, eluiert unter diesen Bedingungen im Hohlraumvolumen.
Mit ausreichend ACN ist die Hydrophilie der Phosphatgruppen so,
dass sie keine Nettorückhaltung an einem Molekül
beitragen, egal was ihre Ausrichtung ist.
-
Ein ähnlicher
Erklärungsansatz kann auf die Ausrichtung von Peptiden
bei der ERLIC angewendet werden. Basische Reste werden sich wahrscheinlich
von der stationären Phase weg ausrichten, auch wenn sie
die Nettorückhaltung der Peptide unterstützen.
Dies würde die Selektivität für neutrale
und saure Reste verstärken. Somit sollte ERLIC in der Lage
sein, Trennungen, die in anderen Chromatographiemoden, einschließlich
von HILIC, schwer zu erreichen wären, zu leisten. Es sei
vorsorglich darauf hingewiesen, dass ERLIC nicht funktioniert, wenn
ein gelöster Stoff keine Orientierung aufweist oder eine
Domäne, die von der stationären Phase nicht abgestoßen
wird.
-
Es
sei klargestellt, dass die Erfindung zwar im Zusammenhang mit bestimmten
Ausführungsformen beschrieben wurde, dass aber die obige
Beschreibung und die Beispiele der Erläuterung dienen und
nicht den Bereich der Erfindung einschränken sollen. Andere
Aspekte, Vorteile und Modifikationen werden dem Fachmann auf dem
Gebiet, auf welches sich die Erfindung bezieht, offenbar werden,
und diese Aspekte und Modifikationen liegen im Bereich der Erfindung,
wie er hierin beschrieben und beansprucht wird.
-
LITERATURSTELLEN
-
- 1. A. J. Alpert, J. Chromatogr. 499
(1990) 177.
- 2. J. C. Linden und C. L. Lawhead, J. Chromatogr. 105
(1975) 125.
- 3. J. K. Plamer, Anal. Lett. 8 (1975) 215.
- 4. T. Wieland und H. Determann, J. Chromatogr. 28 (1967)
2.
- 5. J. Zhang und D. I. C. Wang, J. Chromatogr. B, 712
(1998) 73.
- 6. K. M. Swiderek, T. D. Lee und J. E. Shively, Meth.
Enzymol. 271 (1996) 68.
- 7. K. Furuya, K. M. Schegg, H. Wang, D. S. King und
D. A. Schooley, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 12323.
- 8. J. A. Boutin, A.-P. Ernould, G. Ferry, A. Genton
und A. J. Alpert, J. Chromatogr. 583 (1992) 137.
- 9. K. F. Faull, G. J. Feistner, K. Conklin, P. Roepstorff
und P. C. Andrews, Neuropeptides 32 (1998) 339.
- 10. P. Kulanthaivel et al., J. Biol. Chem. 279 (2004)
36250.
- 11. A. J. Alpert, M. Shukia, A. K. Shukla, L. R. Zieske,
S. W. Vuen, M. A. J. Ferguson, A. Mehlert, M. Pauly und R. Orlando,
J. Chromatogr. A, 676 (1994) 191.
- 12. P. Jenö, P. E. Scherer, U. Manning-Krieg
und M. Horst, Anal. Biochem. 215 (1993) 292.
- 13. M. J. Schmerr, R. C. Cutlip und A. Jenny, J. Chromatogr.
A, 802 (1998) 135.
- 14. M. J. Schmerr und A. Alpert, in Prions and Mad Cow
Disease (B. K. Nunnally und I. S. Krull, Hsg.), Marcel Dekker, 2004,
S. 359-377.
- 15. J. Carroll, I. M. Fearnley und J. E. Walker, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006) 16170.
- 16. M. A. Strege, Anal. Chem. 70 (1998) 2439.
- 17. M. A. Strege, Amer. Pharm. Rev. 2 (Nr. 3, 1999)
53.
- 18. S. Soltysik, D. A. Bedore und C. R. Kensil, Ann.
NYAcad. Sci. 690 (1993) 392.
- 19. Ph. Dallet, L. Labat, E. Kummer und J. P. Dubost,
J. Chromatogr. B, 742 (2000) 447.
- 20. M. McGrane, H. J. Keukens, M. O'Keeffe, J. A. van
Rhijn und M. R. Smyth, EuroResidue IV (L. A. van Ginkel und A. Ruiter
Hsg.) 2000, S. 765–770.
- 21. J. K. Troyer, K. K. Stephenson und J. W. Fahey,
J. Chromatogr. A, 919 (2001) 299.
- 22. Y.-J. Chef, D. R. Wing, G. R. Guile, R. A. Dwek,
D. J. Harvey und S. Zamze, Eur. J. Biochem. 251 (1998) 691.
- 23. E. S. M. Ng, F. Yang, A. Kameyama, M. M. Palcic,
O. Hindsgaul und D. C. Schreimer, Anal. Chem. 77 (2005) 6125.
- 24. G. Karlsson, A.-C. Hinz und S. Winge, J. Chromatogr.
Sci. 42 (2004) 361.
- 25. S. D. Garbis, A. Melse-Boonstra, C. E. West und
R. B. van Breemen, Anal. Chem. 73 (2001) 5358.
- 26. T. P. Moyer, J. R. Charlson, R. J. Enger, L. C.
Dale, J. O. Ebbert, D. R. Schroeder und R. D. Hurt, Clin. Chem.
48 (2002) 1460.
- 27. B. Zywicki, G. Catchpole, J. Draper und O. Fiehn,
Anal. Biochem. 336 (2005) 178.
- 28. T. Yoshida, Anal. Chem. 69 (1997) 3038
- 29. T. Yoshida, J. Chromatogr. A, 808 (1998) 105.
- 30. T. Yoshida, J. Biochem. Biophys. Methods 60 (2004)
265.
- 31. P. Hemström und K. Irgum, J. Sep. Sci.
29 (2006) 1784.
- 32. H. Lindner, B. Sarg und W. Helliger, J. Chromatogr.
A, 782 (1997) 55.
- 33. H. Lindner, B. Sarg, B. Hoertnagl und W. Helliger,
J. Biol. Chem. 273 (1998) 1332324.
- 34. C. A. Mizzen, A. J. Alpert, L. Levesque, T. P. A.
Kruck und D. R. McLachlan, J. Chromatogr. B, 744 (2000) 33.
- 35. B. Sarg, A. Green, P. Söderkvist, W. Helliger,
I. Rundquist und H. H. Lindner, FEBS J. 272 (2005) 3673.
- 36. B. Sarg, W. Helliger, H. Talasz, B. Förg
und H. H. Lindner, J. Biol. Chem. 281 (2006) 6573.
- 37. J. Pesavento, C. A. Mizzen und N. L. Kelleher, Anal.
Chem. 78 (2006) 4271.
- 38. C. T. Mant, L. H. Kondejewski, P. J. Cachia, O.
D. Monera und R. S. Hodges, Meth. Enzymol. 289 (1997) 462–467.
- 39. C. T. Mant, J. R. Litowski und R. S. Hodges, J.
Chromatogr. A, 816 (1998) 65
- 40. C. T. Mant, L. H. Kondejewski und R. S. Hodges,
J. Chromatogr. A, 816 (1998) 79.
- 41. A. J. Oosterkamp, E. Gelpi und J. Abian, J. Mass
Spectrom. 33 (1998) 976.
- 42. Y.-M. Zhang, M. W. Frank, K. G. Virga, R. E. Lee,
C. O. Rock und S. Jackowski, J. Biol. Chem. 279 (2004) 50969.
- 43. H. D. Crone, J. Chromatogr. 107 (1975) 25.
- 44. A. Trifiro, G. Saccani, S. Gherardi, E. Vicini,
E. Spotti, M. P. Previdi, M. Ndagimimana, S. Cavalli und C. Reschiotto,
J. Chromatogr. A, 770 (1997) 243.
- 45. L. Roden, M. Roden, H. Yu, J. Jin und J. Greenshields,
J. Chromatogr. 638 (1993) 29.
- 46. A. J. Alpert und P. C. Andrews, J. Chromatogr. 443
(1988) 85.
- 47. E. Bosch, P. Bou, H. Allemann und M. Roses, Anal.
Chem. 68 (1996) 3651.
- 48. A. J. Alpert und F. E. Regnier, J. Chromatogr. 185
(1979) 375.
- 49. A. J. Alpert, zur Veröffentlichung eingereicht.
- 50. A. J. Alpert, in Column Handbook for Size Exclusion
Chromatography (C.-S. Wu, Hsg.), Academic Press, 1999, S. 249-266 [8.7]
- 51. T. J. Higley und T. Yoshida, LCGC Application Notebook,
Juni 2003, 20–21
- 52. Y. Guo und S. Gaiki, J. Chromatogr. A, 1074 (2005)
71.
- 53. Tabelle 8.8, Lange's Handbook of Chemistry 15. Ausg.
(John A. Dean, Hsg), Mc-Graw-Hill, Inc., 1999.
- 54. V. I. Teichberg, D. Aberdam, U. Erez und E. Pinellig,
J. Biol. Chem. 263 (1988) 14086.
- 55. R. Nogueira, M. Lämmerhofer und W. Lindner,
J. Chromatogr. A, 1089 (2005) 158.
- 56. S.-M., Linu, L. Xu, C.-T. Wu und Y.-Q. Feng, Talanta
64 (2004) 929.
- 57. W. Jiang, G. Fischer, Y. Girmay und K. Irgum, J.
Chromatogr. A 1127 (2006) 82.
-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
-
Diese Liste
der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert
erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information
des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen
Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt
keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
-
Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- - A. J. Alpert,
J. Chromatogr. 499 (1990) 177 [0082]
- - J. C. Linden und C. L. Lawhead, J. Chromatogr. 105 (1975)
125 [0082]
- - J. K. Plamer, Anal. Lett. 8 (1975) 215 [0082]
- - T. Wieland und H. Determann, J. Chromatogr. 28 (1967) 2 [0082]
- - J. Zhang und D. I. C. Wang, J. Chromatogr. B, 712 (1998) 73 [0082]
- - K. M. Swiderek, T. D. Lee und J. E. Shively, Meth. Enzymol.
271 (1996) 68 [0082]
- - K. Furuya, K. M. Schegg, H. Wang, D. S. King und D. A. Schooley,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 12323 [0082]
- - J. A. Boutin, A.-P. Ernould, G. Ferry, A. Genton und A. J.
Alpert, J. Chromatogr. 583 (1992) 137 [0082]
- - K. F. Faull, G. J. Feistner, K. Conklin, P. Roepstorff und
P. C. Andrews, Neuropeptides 32 (1998) 339 [0082]
- - P. Kulanthaivel et al., J. Biol. Chem. 279 (2004) 36250 [0082]
- - A. J. Alpert, M. Shukia, A. K. Shukla, L. R. Zieske, S. W.
Vuen, M. A. J. Ferguson, A. Mehlert, M. Pauly und R. Orlando, J.
Chromatogr. A, 676 (1994) 191 [0082]
- - P. Jenö, P. E. Scherer, U. Manning-Krieg und M. Horst,
Anal. Biochem. 215 (1993) 292 [0082]
- - M. J. Schmerr, R. C. Cutlip und A. Jenny, J. Chromatogr. A,
802 (1998) 135 [0082]
- - M. J. Schmerr und A. Alpert, in Prions and Mad Cow Disease
(B. K. Nunnally und I. S. Krull, Hsg.), Marcel Dekker, 2004, S.
359-377 [0082]
- - J. Carroll, I. M. Fearnley und J. E. Walker, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 103 (2006) 16170 [0082]
- - M. A. Strege, Anal. Chem. 70 (1998) 2439 [0082]
- - M. A. Strege, Amer. Pharm. Rev. 2 (Nr. 3, 1999) 53 [0082]
- - S. Soltysik, D. A. Bedore und C. R. Kensil, Ann. NYAcad. Sci.
690 (1993) 392 [0082]
- - Ph. Dallet, L. Labat, E. Kummer und J. P. Dubost, J. Chromatogr.
B, 742 (2000) 447 [0082]
- - M. McGrane, H. J. Keukens, M. O'Keeffe, J. A. van Rhijn und
M. R. Smyth, EuroResidue IV (L. A. van Ginkel und A. Ruiter Hsg.)
2000, S. 765–770 [0082]
- - J. K. Troyer, K. K. Stephenson und J. W. Fahey, J. Chromatogr.
A, 919 (2001) 299 [0082]
- - Y.-J. Chef, D. R. Wing, G. R. Guile, R. A. Dwek, D. J. Harvey
und S. Zamze, Eur. J. Biochem. 251 (1998) 691 [0082]
- - E. S. M. Ng, F. Yang, A. Kameyama, M. M. Palcic, O. Hindsgaul
und D. C. Schreimer, Anal. Chem. 77 (2005) 6125 [0082]
- - G. Karlsson, A.-C. Hinz und S. Winge, J. Chromatogr. Sci.
42 (2004) 361 [0082]
- - S. D. Garbis, A. Melse-Boonstra, C. E. West und R. B. van
Breemen, Anal. Chem. 73 (2001) 5358 [0082]
- - T. P. Moyer, J. R. Charlson, R. J. Enger, L. C. Dale, J. O.
Ebbert, D. R. Schroeder und R. D. Hurt, Clin. Chem. 48 (2002) 1460 [0082]
- - B. Zywicki, G. Catchpole, J. Draper und O. Fiehn, Anal. Biochem.
336 (2005) 178 [0082]
- - T. Yoshida, Anal. Chem. 69 (1997) 3038 [0082]
- - T. Yoshida, J. Chromatogr. A, 808 (1998) 105 [0082]
- - T. Yoshida, J. Biochem. Biophys. Methods 60 (2004) 265 [0082]
- - P. Hemström und K. Irgum, J. Sep. Sci. 29 (2006)
1784 [0082]
- - H. Lindner, B. Sarg und W. Helliger, J. Chromatogr. A, 782
(1997) 55 [0082]
- - H. Lindner, B. Sarg, B. Hoertnagl und W. Helliger, J. Biol.
Chem. 273 (1998) 1332324 [0082]
- - C. A. Mizzen, A. J. Alpert, L. Levesque, T. P. A. Kruck und
D. R. McLachlan, J. Chromatogr. B, 744 (2000) 33 [0082]
- - B. Sarg, A. Green, P. Söderkvist, W. Helliger, I.
Rundquist und H. H. Lindner, FEBS J. 272 (2005) 3673 [0082]
- - B. Sarg, W. Helliger, H. Talasz, B. Förg und H. H.
Lindner, J. Biol. Chem. 281 (2006) 6573 [0082]
- - J. Pesavento, C. A. Mizzen und N. L. Kelleher, Anal. Chem.
78 (2006) 4271 [0082]
- - C. T. Mant, L. H. Kondejewski, P. J. Cachia, O. D. Monera
und R. S. Hodges, Meth. Enzymol. 289 (1997) 462–467 [0082]
- - C. T. Mant, J. R. Litowski und R. S. Hodges, J. Chromatogr.
A, 816 (1998) 65 [0082]
- - C. T. Mant, L. H. Kondejewski und R. S. Hodges, J. Chromatogr.
A, 816 (1998) 79 [0082]
- - A. J. Oosterkamp, E. Gelpi und J. Abian, J. Mass Spectrom.
33 (1998) 976 [0082]
- - Y.-M. Zhang, M. W. Frank, K. G. Virga, R. E. Lee, C. O. Rock
und S. Jackowski, J. Biol. Chem. 279 (2004) 50969 [0082]
- - H. D. Crone, J. Chromatogr. 107 (1975) 25 [0082]
- - A. Trifiro, G. Saccani, S. Gherardi, E. Vicini, E. Spotti,
M. P. Previdi, M. Ndagimimana, S. Cavalli und C. Reschiotto, J.
Chromatogr. A, 770 (1997) 243 [0082]
- - L. Roden, M. Roden, H. Yu, J. Jin und J. Greenshields, J.
Chromatogr. 638 (1993) 29 [0082]
- - A. J. Alpert und P. C. Andrews, J. Chromatogr. 443 (1988)
85 [0082]
- - E. Bosch, P. Bou, H. Allemann und M. Roses, Anal. Chem. 68
(1996) 3651 [0082]
- - A. J. Alpert und F. E. Regnier, J. Chromatogr. 185 (1979)
375 [0082]
- - A. J. Alpert, zur Veröffentlichung eingereicht [0082]
- - A. J. Alpert, in Column Handbook for Size Exclusion Chromatography
(C.-S. Wu, Hsg.), Academic Press, 1999, S. 249-266 [0082]
- - T. J. Higley und T. Yoshida, LCGC Application Notebook, Juni
2003, 20–21 [0082]
- - Y. Guo und S. Gaiki, J. Chromatogr. A, 1074 (2005) 71 [0082]
- - Tabelle 8.8, Lange's Handbook of Chemistry 15. Ausg. (John
A. Dean, Hsg), Mc-Graw-Hill, Inc., 1999 [0082]
- - V. I. Teichberg, D. Aberdam, U. Erez und E. Pinellig, J. Biol.
Chem. 263 (1988) 14086 [0082]
- - R. Nogueira, M. Lämmerhofer und W. Lindner, J. Chromatogr.
A, 1089 (2005) 158 [0082]
- - S.-M., Linu, L. Xu, C.-T. Wu und Y.-Q. Feng, Talanta 64 (2004)
929 [0082]
- - W. Jiang, G. Fischer, Y. Girmay und K. Irgum, J. Chromatogr.
A 1127 (2006) 82 [0082]