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Reinigung und Trennung von Vitaminen der Bl2-Gruppe durch Adsorptionschromatographie
Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung und Trennung von Komponenten
(Faktoren) der Vitamin-Bl2-Gruppe mit Hilfe der chromatographischen Methode.
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Zur Gewinnung von kristallisiertem Vitamin B12 aus bereits hochgereinigten
Lösungen, und zwar vor allem zur Beseitigung kristallisationsstörender Verunreinigungen,
hat man sich mit gutem Erfolg der Gegenstromverteilung und der chromatographischen
Adsorption bedient.
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Die Anwendung der chromatographischen Methode zur Reinigung von Vitamin
B12 wurde bereits mehrfach beschrieben. So wurde z. B. eine Säule von Aluminiumoxyd
zur Adsorption und Methanol zur Elution von Vitamin B12 verwendet. Ähnlich wird
an anderer Stelle vorgegangen, wobei als Elutionsmittel Methanol mit maximal 10%
Wasser Verwendung findet. Es ist auch bekannt, unter Verwendung von Aluminiumoxyd
als Adsorptionsmittel als Elutionsmittel z. B. wäßriges Aceton oder Dioxan zu benutzen,
wobei man die Adsorptionssäule zunächst mit den reinen organischen Flüssigkeiten
durchwäscht und anschließend den Wassergehalt der Elutionsmittel auf das zur Entwicklung
des Chromatogramms erforderliche Maß steigert (bei Aceton auf 30°/O, bei Dioxan
auf IO °/o),
Die angeführten chromatographischen Methoden können
ihren Zweck durchaus erfüllen, wenn sie zur Reinigung solcher Vitamin-B,2-Konzentrate
dienen sollen, die aus Leber oder Streptomyces-Arten bzw. sonstigen einheitlichen
Mikroorganismen Kulturen, alsb »1Mono-Kulturen«, stammen, da solche Konzentrate
im Hinblick auf ihren Vitamin-B,2-Gehalt relativ -einheitlich sind und überwiegend
nur eine Komponente der Vitamin-B,2-Gruppe enthalten, also vor allem solche Verbindungen
; die sich mittels Cyaniden leicht in Cyanocobalamin oder Pseudo-Cyanocobalamin
überführen lassen.
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Wenn man aber die oben angeführten bekannten chromatographischen
Verfahren zur Auftrennung komplizierter Gemische der Vitamine der Bl2-Gruppe anzuwenden
sucht, so versagen sie völlig, und es gelingt nicht oder nur sehr mangelhaft, mit
ihrer Hilfe zu kristallisierten Vitamin-Bl2-Komponenten zu gelangen. Solche Gemische
verschiedener Vitamine der Bl2-Gruppe liegen z. B. in den Konzentraten vor, die
gemäß Patent 922 126 und Zusatzpatent 94in50 erhalten werden. Derartige Konzentrate.
enthalten je nach der Herkunft des Faulschlammes, aus dem sie gewonnen werden, vier
oder mehr Vitamin-Bl2-Komponenten in verschiedenen Mengenverhältnissen. Sie können
mit Hilfe der bisher beschriebenen chromatographischen Methoden nicht oder nur sehr
unvollständig voneinander getrennt werden. Die in der üblichen Weise gewonnenen
Fraktionen sind daher nur teilweise oder überhaupt nicht kristallisierbar.
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Gemäß vorliegender Erfindung -lassen sich die verschiedenen Komponenten
mittels der chromatographischen Methode erfolgreich trennen, wenn in Gegenwart einer
geringen Menge an Cyaniden chromatographiert wird. Wie die nähere Untersuchung ergab,
findet diese Trennungsmöglichkeit in gewissen Eigenschaften von in den erwähnten
Gemischen vorhandenen Komponenten der Vitamin-B,2-Gruppe ihre Erklärung. Diese besonderen
Eigenschaften, durch die sich die betreffenden Komponenten von den bisher bekannten
Bestandteilen der Vitamin-B,2-Gruppe unterscheiden und die eine Abtrennung ermöglichen,
bestehen darin, daß der Cyankomplex der einen Komponente besonders leicht und der
Cyankomplex einer anderen Komponente besonders schwer eluierbar ist, während die
sonstigen Vitamin-B,2-Komponenten in ihrer Elutionsfähigkeit von geringen Mengen
an Cyanid praktisch unabhängig sind. Das geschilderte charakteristische Verhalten
der neuen Vitamin-Bl2-Komponenten kommt also nur in Gegenwart von Cyanidionen zur
Geltung. Dieses Verhalten der neuen Vitamin-Bl2-Komponenten hängt damit zusammen,
daß sie die Cyangruppe weitaus leichter abspalten als die bisher bekanntgewordenen
Vitamin-B,2-Komponenten. Aus diesem Grund muß stets für einen Überschuß an Cyanidionen
gesorgt werden. Die diesbezüglichen Verhältnisse ergeben sich aus der untenstehenden
Beschreibung der zumeist vorhandenen Komponenten der zu trennenden Gemische.
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Die Möglichkeit zur Trennung komplizierter Gemische der Vitamin-Bl2-Gruppe
mittels des geschilderten Verfahrens war durchaus nicht vorauszusehen, da die betreffenden
Verbindungen bzw. deren für das Trennungsverfahren maßgeblichen Eigenschaften bisher
noch unbekannt gewesen sind. So haben z. B.
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Ford et al. (Nature I7I [I953], 5. I50) darauf hingewiesen, daß es
auch durch wiederholte Chromatographie nicht möglich sei, Gemische, die mehrere
Komponenten der Vitamin-B,2-Gruppe enthalten, in die einzelnen Bestandteile zu zerlegen.
Dies gelang den genannten Autoren vielmehr erst durch Papier-Elektrophorese. Durch
diese Feststellung wird bestätigt, daß die Chromatographietechnik nach dem bisherigen
Stand zur Trennung komplizierter Gemische der Vitamin-Bl2-Gruppe ungeeignet ist.
Andererseits ist aber die Papier-Elektrophorese, die nur ein Arbeiten mit kleinsten
Mengen gestattet, keine technisch brauchbare Methode zur Trennung einer größeren
Menge solcher Gemische der Vitamin-B,zGruppe.
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Abgesehen. davon, daß die betreffenden Vitamin-Bl2-Komponenten selbst
oder deren für das Verfahren maßgebenden Eigenschaften bisher unbekannt waren, mögen
zur Klarstellung des Sachverhaltes und zum Nachweis der Neuheit des der vorliegenden
Erfindung zugrunde liegenden Verfahrens noch folgende Ausführungen dienen.
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Es wurde bereits vorgeschlagen, von der Elution eines Adsorbates
von Vitamin B12 an Montmorilloniten mittels eines rein wäßrigen cyanidhaltigen Elutionsmittels
Gebrauch zu machen. Dieses Vorgehen hat mit dem erfindungsgemäßen Prozeß nichts
zu tun, da es sich hier lediglich um einen einfachen Elutionsprozeß und nicht wie
bei der vorliegenden Erfindung um eine Adsorptionschromatographie und eine damit
verbundene Trennung verschiedener Vitamin-B,2-artiger Substanzen handelt.
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Nach der Entdeckung, daß das Vitamin B12 ein Cyanokomplex ist, dessen
Cyangruppe durch Belichtung bei tieferen pE-Werten unter Bildung eines Hydroxo-
bzw. Aquokomplexes abgespalten werden kann, wurden des öfteren bei der Papierchromatographie
und bei der Verteilung unter Benutzung von feuchtem Silicagel Cyanide zum Entwicklungsmittel
zugesetzt. In der Literatur finden sich einige hierauf bezügliche Angaben. Nachdem
Wo odruff und Foster (J. Biol. Chem. I83 [I950], S. 569) beobachtet hatten, daß
bei der Papierchromatographie von Vitamin-Bl2-Lösungen stets etwa In 01, in Vitamin
B12, umgewandelt werden, empfahl Patte (Ann. pharm. franc. g [I95I], S. 747), die
Papierchromatographie in einer blausäurehaltigen Atmosphäre durchzuführen, um diese
Umwandlung zu verhindern. Andere Autoren haben sodann Papierchromatogramme auch
mit cyanidhaltigen Lösungsmitteln entwickelt. In allen diesen Fällen hat das Cyanid
lediglich den - Zweck, eine Umwandlung des Cyanocobalamins in das weniger beständige
Hydroxo- bzw. Aquocobalamin zu verhindern.
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Ferner findet sich in der Veröffentlichung von Ford und Porter (Biochem.
J. 5I [1952], Proc. V) eine Angabe, daß gereinigte Extrakte. von Kalbsfäzes der
Verteilungschromatographie an feuchtem Silicagel unterworfen werden, wobei die Entwicklung
mit wassergesättigtem sekundärem Butanol, das eine Spur Cyanid entält. vorgenommen
wird. Dabei konnte
allerdings nur eine aus der »Fraktion B« und
Vitamin B12 bestehende Mischfraktion von einer Fraktion A« getrennt werden, wahrend
eine weitere Auftrennung der Mischfraktion mit Hilfe dieser Methode nicht gelang.
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Zur Abgrenzung der vorliegenden Erfindung gegenüber den bereits bekannten
Prozessen muß darauf hingewiesen werden, daß die Papierchromatographie sowie die
Verteilungschromatographie an feuchtem Silicagel nicht in das Gebiet des Adsorptionschromatographie
gehören. Diese Methoden sind vielmehr als Verteilung zwischen zwei nicht mischbaren
flüssigen Phasen aufzufassen. Die Bezeichnung »Chromatographie«, die ursprünglich
nur für die Adsorptionschromatographie galt, wurde auf diese Weise auf ein völlig
anderes Gebiet übertragen, was durch die zum Teil ähnliche Arbeitsweise verursacht
worden ist. Dies ist beispielsweise aus der Stellungnahme von F. Cr am er (Papierchromatographie,
2. Auflage, S. 22/23, Ins2) -aus dem deutschen Patent 859 325 sowie aus der Untersuchung
von Horn er et al. (Z. Elektrochem. 56 [1952], S. 987) über den Mechanismus der
Papierchromatographie eindeutig ersichtlich. Bei det vorliegenden Erfindung liegt
dagegen ein ganz anderer Prozeß vor, und zugleich hat das Cyanid eine ganz andere
Funktion, nämlich einerseits die Komponente I rasch eluierbar zu machen und andererseits
eine vorzeitige Elution der Komponente V zu verhindern und schließlich die Komponenten
II, III und IV so weit zu reinigen bzw. voneinander zu trennen, daß sie kristallisierbar
werden. Dieser Effekt war keineswegs zu erwarten, da die betreffenden Vitamin-Bl2-Komponenten
selbst oder die für das Verfahren maßgebenden Eigenschaften bisher unbekannt waren.
Über die Anwendung von Cyaniden im Sinne der vorliegenden Erfindung zur Trennung
von Gemischen von Vitaminen der B,2-Gruppe unter Anwendung der Adsorptionschromatographie
ist bisher noch nichts bekanntgeworden.
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Die Vorteile der aufgefundenen Methode ergeben sich aus nachfolgender
Beschreibung der zumeist vorhandenen Komponenten des zu trennenden Gemisches.
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Zugleich gibt die Beschreibung der Eigenschaften dieser Komponenten
eine Erklärung für die Möglichkeit zu deren Trennung mit Hilfe des beschriebenen
Verfahrens. Die Komponenten werden in der Reihenfolge angeführt, in der sie bei
der Chromatographie an einer Aluminiumoxydsäule unter Verwendung von Aceton-Wasser-Cyanid
als Entwicklungsmittel im Eluat erscheinen. Diese Komponenten, die alle zur Vitamin-Bl2-Gruppe
gehören, werden nachfolgend willkürlich mit den Zahlen I bis V bezeichnet, da noch
nicht alle von ihnen identifiziert sind.
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Komponente list bei einem Überschuß von Cyanidionen violett gefärbt.
Die Substanz besitzt die Cyangruppe in einer lockeren Bindung und verliert sieauch
ohne Belichtung - bei der Destillation ihrer Lösung, und zwar um so leichter, je
tiefer der PH Wert ist. Bei der ValruumdestilLtion bei pH 4,5 und einer Wasserbadtemperatur
v 30 bis 40° wird die Cyangruppe praktisch völl abgespalten, und die Substanz behält
auch nach dem Abneutralisieren auf PlI 7 eine orangegelbe Farbe. Wenn jedoch die
Blausäure bei tieferem PH nicht restlos abdestilliert worden war, so kehrt die violette
Farbe nach dem Abneutralisieren wieder teilweise zurück. Diese Verhältnisse können
mit Hilfe folgender Gleichung veranschaulicht werden, wobei K das Koordinationszentrum
bedeutet:
| H' + H,O t [K...CN] 3 [K...H,O]' f HCN |
| violett orangegelb |
| (I) |
Aus der Gleichung ist zu ersehen, daß durch Zusatz eines Wasserstoff-Ionen-Donators
die Bildung von undissoziierter Blausäure und des orangegelben cyanfreien Komplexes
gefördert wird auf Kosten des violetten Cyankomplexes. Dieses Verhalten läßt sich
durch die Annahme erklären, daß in der orangegelben Modifikation an Stelle der Cyangruppe
eine Molekel Wasser im Komplex koordinativ gebunden ist.
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Bei der Chromatographie mit einem cyanidhaltigen Elutionsmittel bildet
die Komponente I eine schnell wandernde geschlossene Bande, die vor der Bande II
die Säule restlos verläßt. Wenn Blausäure im Entwicklungsmittel fehlt, verhält sich
die Bande I uneinheitlich und läuft zum Teil viel, langsamer, so daß sie die Säule
gemeinsam mit den Banden II, III und IV verläßt. Das chromatographische Verhalten
der Komponente I bei einem Überschuß an Cyanidionen ist aus der Fig. I zu ersehen.
Fig. 2 zeigt den Verlauf des gleichen Chromatogramms wie in der Fig. I, nur mit
dem Unterschied, daß hier kein Cyanid zum Entwickler zugegeben wurde. Die Cyanoform
verläßt hier die Säule gleich mit der ersten Menge des Elutionsmittels, die verbliebene
cyanfreie Form verläßt die Säule nur zögernd. Nach Zusatz von Cyanid zum Elutionsmittel
erscheint eine kräftige violette Bande, und die Reste der Komponente I verlassen
nun geschlossen die Säule.
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Weitere Eigenschaften der Komponente I können aus der Tabelle I sowie
aus der Fig. g entnommen werden. Die Substanz wandert bei der Papierchromatographie
unter Verwendung von wassergesättigtem sekundärem Butanol als Entwickler schneller
als die anderen Komponenten. Beim Zusatz von Cyanid zum Entwickler bildet die Substanz
einen Fleck, bei Abwesenheit von Cyanid mindestens zwei Flecke.
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Sehr charakteristisch für die Komponente I ist ihr Verhalten bei
der Verteilung zwischen n-Butanol und einer wäßrigen Ammoniumsulfatlösung. Der Verteilungskoeffizient,
der für die cyanfreie Form bei 40 Olo Ammoniumsulfat etwa I beträgt, hat bei Cyanidüberschuß
den gleichen Wert bereits bei 160/o Ammoniumsulfat. Dies bedingt eine leichte Extrahierbarkeit
der Komponente I mit n-Butanol aus wäßrigen Lösungen, die neben Ammoniumsulfat Spuren
von Cyanid enthalten. Die cyanfreie Komponente I läßt sich aus wäßrigen Lösungen,
die nur wenig Ammoniumsulfat enthalten, nicht extrahieren. Auf Grund dieser Eigenschaft
kann man ohne weiteres die beiden Formen der Komponente I voneinander trennen, was
dank der unterschiedlichen Färbung leicht visuell verfolgt werden kann. Die unterschiedliche
Färbung der beiden Formen kann zugleich als außerordentlich empfind-
liche
Methode zum Nachweis von Cyanidionen benutzt werden.
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Die Komponente 1 fördert das Wachstum von B. coli (Davis-Mutante),
wie aus Fig. I ersichtlich ist.
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Das Absorptionsspektrum ist in Fig. 7 wiedergegeben.
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Komponente II ist gemäß ihrem Absorptionsspektrum, ihrer mikrobiologischen
Aktivität, ihrer antiperniciösen Wirksamkeit, ihrem Vérteilungskoeffizienten sowie
ihrem papierchromatographischen Verhalten identisch mit Cyanocobalamin aus Leber
(vgl. Tabelle I und Fig. 9).
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Komponente III ist nach ihrem Absorptionsspektrum, ihrer mikrobiologischen
Aktivität sowie der Beschaffenheit der Kristalle analog dem Cyanocobalamin aus Leber;
gemäß ihrem Verteilungskoeffizienten sowie ihrem papierchwmafographischen Verhalten
unterscheidet sie sich aber vom Vitamin B12 aus Leber. Beim Verteilen zwischen n-Butanol
und einer wäßrigen 23,50/,igen Ammoniumsulfatlösung, wobei sich die Komponente II
im Verhältnis I : I verteilt, bleibt die Komponente III zu 75 0/ in der wäßrigen
Phase zurück. Im Papierchromatogramm wandert die Komponente III langsamer als II
(s. Tabelle I und Fig. 9).
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Komponente IV unterscheidet sich von den Komponenten II und III durch
den Verteilungskoeffizienten und durch ihr papierchromatographisches Verhalten.
Beim Verteilen zwischen n-Butanol und einer wäßrigen 380/0igen Ammoniumsulfatlösung
(wobei die Komponente III einen Verteilungskoeffizienten von I,78 hat) verteilt
sich die Komponente IV im Verhältnis 1: I. Im Papierchromatogramm mit wassergesättigtem
sekundärem Butanol als Entwickler läuft die Komponente IV langsamer als die Komponente
III (vgl. Tabelle I und Fig. 9).
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Komponente V ist ähnlich wie Komponente I bei einem Überschuß an
Cyanidionen violett, in cyanfreiem Zustand orangegelb bis orangerot gefärbt. Auch
bei dieser Komponente ist die- Cyangruppe nur locker gebunden. Die Farbe ist - ebenfalls
im Sinne der Gleichung (I) - von der Wasserstoff- und Cyanidionenkonzentration abhängig.
Auch diese Komponente erweist sich - ähnlich wie die Komponente 1 -chromatographisch
im allgemeinen einheitlich, wenn mit Aceton-Wasser-Cyanid unter Verwendung einer
Aluminiumoxydsäule entwickelt wird. Unter diesen Bedingungen bleibt die Komponente
V am obersten Teil der Aluminiumoxydsäule zurück und wandert mit nennenswerter Geschwindigkeit
erst dann, wenn das Elutionsmittel 30 bis 60 oto Wasser enthält. Zu diesem Zeitpunkt
haben natürlich alle anderen Komponenten die Säule bereits verlassen. Beim Fehlen
von Cyanid im Entwickler bildet die Komponente V keine einheitliche Bande mehr,
und Teile davon wandern bereits bei einem Gehalt von IO bis 150/0 Wasser im Entwickler,
so daß sie sich mit den übrigen Komponenten vermischen. Die Komponente V besitzt
eine nur schwache mikrobiologische Aktivität. Ihr Absorptionsspektrum ist in Fig.
8 wiedergegeben (vgl. ferner Tabelle I und Fig. 9).
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Ein Vergleich der Komponenten I bis V aus verschiedenen Kläranlagen
untereinander sowie mit Vitamin B12 aus Leber ist aus Tabelle I und Fig. g ersichtlich.
Danach sind die Komponenten II sämtlicher untersuchter Faulschlämme identisch mit
Vitamin B12 aus Leber. Die Komponenten III der verschiedenen Faulschlämme sind eindeutig
von Vit; amin B12 aus Leber verschieden, untereinander aber gleich. Die Komponente
IV scheint mit Pseudovitamin B12 identisch zu sein.
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Die Aufzählung dieser Komponenten hat keinen Anspruch auf Vollständigkeit.
So befinden sich in der Nachbarschaft der Komponente V auf der Aluminiumoxydsäule
meist noch mehrere schwache Banden, die auf die Anwesenheit weiterer Vitamine der
Bl2-Gruppe hindeuten.
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Als Quelle der Cyanidionen im Entwickler können wäßrige Lösungen
von Metallcyaniden oder von Blausäure dienen, die vor der Verwendung neutralisiert,
also am besten auf einen pE-Wert zwischen 6 und 8 eingestellt werden.- Die Cyanidionenkonzentration
im Entwickler soll im allgemeinen nicht höher sein als ilooo molar, um die eventuelle
Bildung von Dicyankomplexen und damit weitere Komplikationen zu vermeiden. Als untere
Grenze kommt eine Cyanidionenkonzentration von 1Iooo molar in Betracht.
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Bei derDurchführung der Chromatographie muß auf eine sehr exakte
Chromatographiertechnik geachtet werden. Hierbei benutzt man eine mit Hahn versehene,
genau vertikal stehende Chromatographiersäule. Dieselbe wird im untersten schmalen
Teil mit einem kleinen Wattebausch oder mit einer Glassinterplatte versehen. Diese
Säule wird zunächst bei geschlossenem Hahn mit Aceton gefüllt. Sodann wird eine
entsprechende Menge Aluminiumoxyd nach Brockmann, Firma Merck, mit etwas cyanidhaltigem
Aceton zu einem Brei verrührt und durch einen Trichter, der mit einem engen Auslauf
versehen ist, in die Säule eingefüllt. Während sich das Aluminiumoxyd langsam und
gleichmäßig durch die hohe Acetonschicht absetzt, wird die Säule von allen Seiten
leicht angestoßen, damit eventuelle Ungleichmäßigkeiten beim Absetzen des Aluminiumoxyds
sogleich ausgeglichen werden. Es ist unbedingt notwendig, daß die sich bildende
Aluminiiimoxydfläche stets horizontal ist, da sonst die Gefahr besteht, daß bei
einem nicht horizontalen Absetzen des Aluminiumoxyds schräg liegende Zonen im Chromatogramm
ausgebildet werden. Zugleich bezweckt das Durchlaufenlassen des Aluminiumoxyds durch
eine relativ nohe Acetonschicht eine möglichst gründliche Entlüftung des Adsorptionsmittels.
Mitgerissene und in der Säule verbleibende Luftmengen sammeln sich sonst später
zu größeren Luftbläschen und zerstören so das Chromatogramm. Gleich nach Beginn
der Einfüllung von Aluminiumoxyd wird der Hahn leicht geöffnet und Aceton langsam,
tropfenweise ausfließen gelassen, um Stauungen von Spuren mitgerissener Luft in
der Säule zu vermeiden. Nachdem die Aluminiumoxydsäule eine bestimmte Höhe (etwa
4,5 cm) erreicht hat, wird das Einfüllen des Adsorptionsmittels beendet.
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Nach völliger Klärung des Acetons durch Absetzen des Aluminiumoxyds
wird ein Vitamin-B12-Konzentrat aufgetragen.
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Als Vitamin-B12-Konzentrat benutzt man erfindungsgemäß ein Kieselgur-
oder Cellulosepulver-
präparat, auf dem die Vitamine der B12-Gruppe
niedergeschlagen sind. Ein derartiges Vitamin-Bl2-Konzentrat wird in pulverförmigem
Zustand auf die Aluminiumoxydsäule aufgetragen, die mit einer ausreichend hohen
Acetonschicht bedeckt ist. Sodann wäscht man die ganze Säule mit cyanidhaltigem
Aceton durch und entwickelt anschließend erfindungsgemäß mit einem Gemisch von Aceton-Wasser-Cyanid,
wobei die Konzentration an Wasser im Entwickler allmählich erhöht wird.
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Die Anwendung eines Vitamin-Bl2-Konzentrates der geschilderten Art
bietet besondere Vorteile. Es wird dadurch erreicht, daß bei der Entwicklung scharf
getrennte Zonen entstehen, während sich sehr deformierte unscharfe Zonen bilden,
wenn ein Konzentrat der Vitamine der Bl2-Gruppe in Form einer Lösung aufgetragen
wird. Die geschilderte Art der Auftragung von Vitamin-Bl2-Konzentraten im gegebenen
Zusammenhang ist neuartig und stellt einen wesentlichen Fortschritt dar.
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Die Verteilungskoeffizienten werden auf folgende Weise bestimmt:
In Reagenzgläser wird Ammoniumsulfat eingewogen, dann werden 3 ccm einer Lösung
der zu untersuchenden Vitamin-B12-Komponente in Wasser von PH 6,5 bis 7, enthaltend
0,01% Natriumcyanid und 3 ccm n-Butanol (»für Chromatographie« der Firma Riedel-de
Haen), eingefüllt. Nach kräftigem Schütteln werden die Reagenzgläser in ein Wasserbad
von 21,6° gebracht und dann während 2 Stunden immer wieder geschüttelt. Nach Trennung
der Phasen werden 2 ccm der unteren Phase mit etwas Ammoniumsulfat versetzt, dreimal
mit n-Butanol extrahiert und dann mit n-Butanol, das vorher mit einer 30%igen wäßrigen
Ammoniumsulfatlösung geschüttelt worden war, auf 6 ccm aufgefüllt. 2 ccm der oberen
Phase werden mit n-Butanol, das vorher mit 300iger wäßriger Ammoniumsulfatlösung
geschüttelt worden war, auf 6 ccm aufgefüllt. In beiden Lösungen wird anschließend
Vitamin B12 mit Hilfe des Spektralphotometer nach Beckman bestimmt. Der Verteilungskoeffizient
(K) wird nach folgender Gleichung ermittelt: K Vitamin-Bl2-Konzentration in der
oberen Phase Vitamin-Bl2 Konzentration in der unteren Phase Die folgenden Ausführungsbeispiele
erläutern die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens und dessen Nützlichkeit.
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Beispiel I Auf einer Aluminiumoxydsäule, die in der oben beschriebenen
Weise vorbereitet worden ist, wird ein Konzentrat der Vitamine der Bl2-Gruppe (gewonnen
aus 201 Faulschlamm der Kläranlage A) in Form eines Kieselgurkonzentrates aufgetragen.
Es wird zunächst mit einer Entwicklerlösung vom p-Wert 7, bestehend aus go0 Aceton
und 10% Wasser, mit einem Gehalt von l/looo Mol Natriumcyanid eluiert.
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Der Gehalt an Wasser wird allmählich auf 300/0 gesteigert. Der Verlauf
der Chromatographie ist aus der Fig. 3 ersichtlich. Die Komponente I wird praktisch
vollständig von den anderen Komponenten getrennt und verläßt die Säule bei einem
Gehalt von IO bis 150/0 Wasser im Elutionsmittel als einheitliche Bande. Die Komponente
V wird gleichfalls vollständig abgetrennt, wie der Verlauf des Fraktionsdiagramms
zeigt. Die Trennung der Komponenten II und III voneinander ist gegebenenfalls weniger
vollständig. Trotzdem gelingt es, die Komponenten II und III nach der Chromatographie
auf die übliche Art zur Kristallisation zu bringen. Die übrigen Komponenten kristallisieren
nicht.
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Wenn die Chromatographie der gleichen Probe ohne Zusatz von Cyanid
durchgeführt wird, erhält man ein ganz anderes Bild. Der Verlauf der Chromatographie
unter diesen Bedingungen ist zum Vergleich in Fig. 4 wiedergegeben. Wie aus dem
Diagramm zu ersehen ist, kann die Komponente I in diesem Fall nicht vollständig
von den anderen Komponenten getrennt werden. Die Komponente II kristallisiert nur
schwach und die Komponente III überhaupt nicht. Aus dem Verlauf der Chromatographie
ist die Überlegenheit der erfindungsgemäßen Methode eindeutig erersichtlich Beispiel
2 Auf eine Aluminiumoxydsäule von 25,5 mm Durchmesser und 45 mm Höhe, die in der
gleichen Weise, wie oben beschrieben, vorbereitet wurde, wird ein Konzentrat der
Vitamine der Bl2-Gruppe (gewonnen aus 301 Faulschlamm der Kläranlage B), niedergeschlagen
auf Kieselgur, aufgetragen. Die Entwicklung des Chromatogramms erfolgt, wie bereits
beschrieben, in Gegenwart von 1/looo molarem Natriumcyanid im Entwickler (pz = 7).
Die Komponente I verläßt die Säule bei einem Wassergehalt von 150/0 im Entwickler,
Komponente 11 bei 20 bis 250/0, die anderen Komponenten bei 25 bis 300/0 Wasser.
Der Verlauf der Chromatographie ist aus der Fig. 5 zu ersehen. Im Gegensatz zum
Beispiel I bildet hier nicht die Komponente III, sondern die Komponente II die stärkste
Bande. Die Komponenten II und III können völlig zur Kristallisation gebracht werden.
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Die Komponente IV war in diesem Fall nicht vorhanden.
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Beispiel 3 Auf eine Aluminiumoxydsäule der gleichen Dimensionen wie
im Beispiel 2 wird in der bereits beschriebenen Weise ein Konzentrat der Vitamine
der Bla Gruppe in Form des bereits beschriebenen Kieselgurpräparates (gewonnen aus
28 1 Faulschlamm der Kläranlage C), aufgetragen und, wie oben beschrieben, unter
Verwendung von 1/1000 molarem Natriumcyanid entwickelt (PH=7). Der Verlauf der Chromatographie
ist in Fig. 6 wiedergegeben. Die Komponente I und V bildet in diesem Fall sehr starke
Banden, Der Anteil an Komponente II ist verhältnismäßig gering, die Bande der Komponente
IV erheblich stärker. Aus den gesondert aufgefangenen Fraktionen der einzelnen Banden
werden die Komponenten II und IV zur Kristallisation gebracht.
| Verteilungskoeffizient zwwischen |
| Farbe bei pu7 Rf-Werte; Entwickler1) |
| n-Butanol und Wasser |
| sek, Butanol, |
| + Ammoniumsulfat bei PH 7 |
| Lösungsmittel gesättigt mit Wasser und 21,6"C |
| Komponente Schleicher- CN-freie |
| l(Faktor) mit Schüll-Papier Whatman bei CN'-Überschuß Substanz |
| geringem ohne CN' 2045b 1 Papier ohne CN' |
| CN' |
| CN' im Entweickler ; Prozent an Ammoniumsulfat2) |
| Überschuß |
| mit ohne mit ohne 16,0 23,5 34,0 38,0 40 |
| 1 ................................ blauviolett orange 0,2 0,14
o, 25 0,207 etwa etwa 1,0 |
| o,I6 0,235 1,0 2,6 |
| II, kristallin rot rot 0,13 0,13 0,199 0,199 0,31 1,05 6,o |
| III, kristallin rot rot o, I3 0,13 0,25 1,04 1,78 |
| IV, kristallin ........................... rot rot 0,081 0,081
etwa |
| 1,0 |
| #A.............................. blauviolett organge 0,055
0,034 |
| | B blauviolett orange 0,055 0,085 |
| 0,073 |
| V*) # 0,158 |
| C............................... blauviolett orange 0,115 0,066 |
| 0,134 0,125 |
| krist. B12 aus |
| Leber rot rot 0,192 0,192 0,31 I,05 5,9 |
| krist. Pseudo |
| B12**) ............................... rot rot 0,079 0,079 |
3 bei 23° und aufsteigender Papierchromatograpbie, 2) g Ammoniumsulfat auf 100 ccm
Wasser *) die Buchstaben A, B und C bezeichnen Produkte verschiedener Herkunft,
**) der Firma Paske, Davis & Co., Detroit, USA.
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Zeichnungsbeschreibung Fig. I. Verlauf der Chromatographie der Komponente
I an Aluminiumoxyd unter Benutzung eines Entwicklers, der 90 ccm Aceton, 7,5 ccm
Wasser und 2,5 ccm einer 1125 molaren Lösung von Natriumcyanid von PH 7 enthält,
Extinktion der einzelnen Fraktionen bei 368 mµ Mikrobiologische Aktivität der Fraktion
gegen B. coli.
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Fig. 2. Verlauf der Chromatographie der Komponente I an Aluminiumoxyd
unter Benutzung eines Entwicklers, der 90 ccm Aceton und 10 ccm Wasser enthält.
Nach Zusatz von Cyanid zum Elutionsmittel verläßt die Komponente I geschlossen die
Säule, Extinktion der einzelnen Fraktionen bei 368 m, u, - - - - - - - Extinktion
der einzelnen Fraktionen bei 354 mµ.
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Fig. 3. Verlauf der Chromatographie einer Mischung von Vitaminen
der Bl2-Gruppe aus der Kläranlage A an Aluminiumoxyd unter Benutzung eines Entwicklers,
der aus Aceton und steigenden Mengen Wassers stets in Gegenwart von 1/1000 molarem
Natriumcyanid besteht, --Extinktion der einzelnen Fraktionen bei 36I mµ, - - - -
- - - Extinktion der einzelnen Fraktionen bei 362 bzw. 368 mµ.
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Fig. 4. Verlauf der Chromatographie der gleichen Mischung von Vitaminen
der Bl2-Gruppe wie in Fig. 3, aber unter Benutzung eines Entwicklers, der kein Natriumcyanid
enthält, Extinktion der einzelnen Fraktionen bei 361 mµ, - - - - - - - Extinktion
der einzelnen Fraktionen bei 355 bzw. 361 mµ.
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Fig. 5. Verlauf der Chromatographie einer Mischung von Vitaminen
der B12-Gruppe aus der Kläranlage B, im übrigen genau sowie in Fig. 3, Extinktionswerte
der einzelnen Fraktionen bei 361 m, - - - - - - - Extinktionswerte der einzelnen
Fraktionen bei 366 bzw. 368 met.
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Fig. 6. Verlauf der Chromatographie der Mischung von Vitaminen der
Bl2-Gruppe aus der Kläranlage C, im übrigen analog der Fig. 3,
Extinktion
der einzelnen Fraktionen bei 361 mµ, - - - - - - - Extinktion der einzelnen Fraktionen
bei 367 bzw. 368 mµ.
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Fig. 7. Absorptionsspektrum der Komponente I in Wasser bei PH 6,8,
- - - - - - - mit Überschuß an Cyanid, nach Abdestillation von Blausäure bei PH
4,5 und PH-einstellungauf 6,8.
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Fig. 8. Absorptionsspektrum der Komponente V in Wasser bei pH 6,8,
- - - - - - - mit Überschuß an Cyanid, - nach Abdestillation von Blausäure bei p,
4,5 und PH-einstellung auf 6,8.
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Fig. 9. Papierchromatographie der Vitamine der Bl2-Gruppe, die aus
verschiedenen Faulschlämmen gewonnen wurden. Papier: Whatman I, Temperatur 23°,
aufsteigend. Entwickler: sekundäres Butanol, gesättigt mit IT2O. Chromatogramme
1 bis g mit Zusatz von Cyanid, ChromatogrammIo ohne CN'-Zusatz zum Entwickler (s.
auch Tabelle I).
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Nr. Ib bis Iob: Vitamin Bl2 aus Leber, Nr. 1 a: Komponente II aus
Faulschlamm der Kläranlage A Nr. 2 a: Komponente III aus Faulschlamm der Kläranlage
A Nr. 3 a: Komponente II aus Faulschlamm der Kläranlage B Nr. 4a : Komponente III
aus Faulschlamm der Kläranlage B Nr. 5 ba : Komponente II aus-Faulschlamm der Kläranlage
C Nr. 6 a: Komponente III und IV aus Faulschlamm der Kläranlage C Nr. 7 a: Komponente
II aus Faulschlamm der Kläranlage D Nr. 8a: Komponente III aus Faulschlamm der Kläranlage
D Nr. 9a: Komponente 1 aus Faulschlamm der Kläranlage A Nr. Ioa: Komponente I aus
Faulschlamm der Kläranlage A.