DE2448371C2

DE2448371C2 - Verfahren zur Isolierung der Transferrine aus biologischem Material

Info

Publication number: DE2448371C2
Application number: DE2448371A
Authority: DE
Inventors: Eraldo Roma Antonini
Original assignee: Recordati Industria Chimica e Farmaceutica SpA
Current assignee: Recordati Industria Chimica e Farmaceutica SpA
Priority date: 1973-10-31
Filing date: 1974-10-10
Publication date: 1982-07-01
Also published as: DE2448371A1; IT1048150B; US3959249A; GB1463327A; JPS5082213A; JPS5747919B2

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung der Transferrine, insbesondere des Conalbumines, aus biologischem Material in reinem Zustand.

Bekanntlich enthalten viele biologische Flüssigkeiten, WiP Blut- und Milchserum, eiweißähnliche als Transferrine bezeichnete Proteine, die einander ähnlich sind und die Eigenschaft haben, bestimmte Metalle, wie Eisen und Kupfer, fest zu binden.

Es ist auch bekannt, daß das Eiweiß beträchtliche Mengen eines Transferrines, das unter der Bezeichnung Conalbumin bekannt ist, enthält. Die Isolierung von großen Mengen von reinem Conalbumin im negativen Zustand bedeutet einen beträchtlichen Vorteil für alle gewerblichen Anwendungsmöglichkeiten des Proteines und für alle Forschungszwecke, bei welchen dieses Protein gebraucht wird.

Die zur Isolierung der Transferrine, insbesondere des Conalbumines, aus Eiweiß bekannten Verfahren, beruhen auf einer fraktionierten Fällung mittels Salze oder organischer Lösungsmittel und/oder auf einer Chromatographie an Ionenaustauscherharzen. Diese bekannten Verfahren weisen jedoch Mängel, wie die Notwendigkeit von zahlreichen Durchgangsstufen, eines großen Aufwandes an Zeit, Apparaturen und teuren Reaktionsstoffen, auf.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein besseres Verfahren zur Isolierung der Transferrine, insbesondere des Conalbumines, in reinem Zustand aus biologischem Material, durch welches diese in kurzer Zeit und einfach in höchstem Reinheitsgrad und mit einer geringsten Anzahl von Durchgängen, und zwar bei Raumtemperatur und mit einer weniger aufwendigen Apparatur als bei den bekannten Verfahren erhalten werden können, zu schaffen.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Isolierung der Transferrine, insbesondere des Conalbumines, in reinem Zustand aus biologischem Material durch Chromatographien unter Verwendung von lonenaustauscherharzen und Abtrenr.cn des reinen Transferrines durch Entziehen derjenigen Bestandteile, welche ein geringeres Molekulargewicht als die Transferrine aufweisen, durch deren Abscheiden, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß das biologische Material auf einen pH-Wert zwischen 5 und 5,5 gebracht und durch eine solche feste Materialmasse, welche aus einem festen Träger besteht, der chelatbildende Gruppen enthält, die Metallionen der Übergangselementengruppen zugeordnet sind, in Gegenwart einer Pufferlösung mit einem pH-Wert zwischen 5 und 5,5

ίο ohne chelatbildende Eigenschaften geführt wird, daß danach durch diese Masse eine Eluierlösung geleitet wird, welche einen Bestandteil aufweist, der Affinität zum Transferrin-Metallkomplex besitzt, und daß darauffolgend aus der Lösung, welche durch die Masse geleitet worden ist, die Abtrennung des reinen Transferrines durchgeführt wird.

Das Prinzip der Isolierung der Transferier·* nach dem erfindungsgemäßen Verfahren beruht auf der spezifischen Eigenschaft der Transferrine, insbesondere des Conalbumines, sich mit organischen chelatbildenden Stoffen und anorganischen Verbindungen des Eisens sowie Kupfers und anderer Metalle der Übergangselementgruppe des Periodensystemes zu verbinden. Wenn die chelatbildenden Gruppen an ein in wäßrigen Lösungsmittels unlösliches Material gebunden sind und ein Metall der Übergangselementengruppe des Periodensystemes zugeben ist, bleiben die Transferrine auf dem festen Träger adsorbiert, während die anderen gegebenenfalls vorhandenen Proteine im biologischen Ausgangsmaterial keine Neigung haben, mit dem festen System Metall/Träger/chelatbildender Stoff beziehungsweise chelatbildende Gruppe zusammenzuwirken. Zweckmäßig werden aus dem biologischen Material vor seinem Leiten durch die feste Materialmasse die chelatbildende Eigenschaften aufweisenden Substanzen entfernt. Nach einer Ausführungsform kann die Entfernung der chelatbildenden Eigenschaften aufweisenden Substanzen aus dem biologischen Material mittels Aussetzen des Materiales einer Mischung von Ionenaustauscherharzen mit Anionen und Kationen durchgeführt werden. Nach anderen Ausführungsformen kann sie mittels Dialyse oder mittels sonstiger bekannter Verfahren zur Entfernung von gelösten Stoffen mit Molekulargewichten unter 10 000 durchgeführt werden.

Als festes Material zur Adsorption der Transferrine kann jede beliebige polymere Substanz, welche in wäßrigen Lösungsmitteln unlöslich ist und Gruppen, welche mit Ionen der Metalle der Übr "gangselementengruppe des Periodensystemes, wie Eisen und Kupferionen, Chelate bilden können, beispielsweise Carboxylgruppen, aufweisen, dienen, und zwar wegen seiner leichten Zugänglichkeit und der geringen Kosten mit ihm. Dabei kann es in der üblicherweise für die Chromatographie benutzten Form eingesetzt werden. Insbesondere wird als feste Materialmasse ein Carboxylgruppen aufweisendes Polymerharz verwendet.

Es ist günstig, als Metallionen Eisenionen zu

6Q verwenden,

Die Sättigung des chelatbildenden festen Materiales mit Ionen von Metallen der Übergangselementengruppe des Periodensystems, wie Fe^{+ +} + -Ionen, wird nach allgemein bekannten Verfahren durchgeführt. Die

Gegenwart von Ionen von Metallen der Übergangselementengruppe, wie Fe⁺ ♦ +-Ionen, im festen Material ist für die Adsorption des Conalbumines im erfindungsgemäßen Verfahren unerläßlich; unter den spezifischen

Bedingungen dieses Verfahrens, beispielsweise mit einem 0,1 m Acetatpuffer mit einem pH-Wert von 5,5, erfolgt keine wesentliche Adsorption an Carboxymethylcellulose, die keine Metallionen enthält

Die spezifische Adsorption der Transferrine, insbesondere der Conalbumine, an Carboxymethylcellulose mit einem Gehalt an chelierten Eisenionen wird unter den Bedingungen der Zusammenstellung des Mittels wie oben dargelegt vorgenommen, insbesondere was den pH-Wert anbelangt Die Adsorption ist vor allem in Puffern wirksam, beispielsweise solchen aus Essigsäure und Natriumacetat mit einem pH-Wert zwischen 5 und 5,5 und einer Molarität von 0,1 oder darunter. Es ist nämlich aus Gründen der Stabilität zu vermeiden, die Transferrine pH-Werten unter 4,0 auszusetzen.

Insbesondere wird als Pufferlösung zur Adsorption der Transferrine an der festen Materialmasse ein zwischen 0,01 bis 0,2 m Acetatpuffer verwendet

Das Eluieren der Transferrine aus der festen Materialmasse fcaan durch Lösungen, welche einen pH-Wert und eine lonenstärke, weiche von den anfänglichen verschieden sind, durchgeführt werden. Nach einer zweckmäßigen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird daher als Eluierlösung zum Eluieren der Transferrine aus dem festen Träger eine Pufferlösung mit pH-Werten zwischen 6 und 11, die zweckmäßig 0,1- bis 0,2-molar ist verwendet

Insbesondere kann das Eluieren der Transferrine aus der festen Materialniasse auch mit Lösungen, welche mit Ionen der Metalle der Übergangselementengruppe des Periodensystem zs, insbesondere Eisenionen, Chelate zu bilden vermögen, 'idem 'ie chelatbildende Substanzen in einer über 10-³-molaren Konzentration, enthalten, erfolgen. Die Natriumci'-atkonzentration kann beispielsweise auch dieselbe wie die zweckmäßige Konzentration der nach der erstgenannten Ausführungsform verwendeten Pufferlösung, das heißt 0,1- bis 0,2-molar, sein. Die genügende Konzentration der chelatbildenden Substanzen kann gegebenenfalls mittels Versuche bestimmt werden. Nach einer anderen zweckmäßigen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird daher als Eluierlösung zum Eluieren der Transferrine aus dem festen Träger eine Pufferlösung mit pH-Werten zwischen 3 und 6 mit einem Gehalt an chelatbildenden Substanzen in einer über 10-³-molaren Konzentration verwendet. Dabei wird als chelatbildende Substanz zweckmäßig Natriumcitrat verwendet.

Das Adsorbieren und Eluieren im erfindungsgemäßen Verfahren kann durch Verwendung von gewöhnlich für chromatographische Verfahren benutzten Kolonnen durchgeführt werden. Transferrine werden aus der festen Materialmasse zum großen Teil in Form von Komplexen mit Eisen beziehungsweise anderen Übergangsmetallen eluiert; zur Erzielung der eisenfreien beziehungsweise von anderen Übergangsmetallen freien Proteine wird das Metall gemäß einem der hierfür bekannten Verfahren ausgeschieden.

Nach dem Eluieren des Transferrines, wie Conalbumines, kann die Säule mittels des ersten Puffers erneut bis so zum Erreichen des Gleichgewichtes behandelt werden und das Adsorptions- und Eluierverfahren kann mit dem bereits zuvor verwendeten Harz wiederholt werden.

Zur praktischen Verwendung können die Transferrine, insbesondere das Conalbumin, lyophilisiert werden, um Präparate, welche bei ihrer Aufbewahrung bei Raumtemperatur lange Zeit (auch monatelang) ihre chemisch-physikalischen und biologischen Eigenschaften behalten, zu erhalten.

Das erfindungsgemäße Verfahren bringt folgende erhebliche Vorteile mit sich:

a) die Adsorption des Conalbumines an der Säule unter den festgelegten Bedingungen ist sehr spezifisch. Mittels Elektrophorese auf Gel kann nachgewiesen werden, daß andere Proteine (beispielsweise die im Ausgangsrohmaterial vorhandenen) nicht absorbiert werden und daß das adsorbierte und danach aus der Säule eluierte Protein aus reinem Conalbumin besteht

b) Beim Durchgang durch die Säule der Fe+ + +-Carboxymethylcellulose wandelt sich das gegebenenfalls im Ausgangsrohmaterial vorhandene Apoconalbumin zu Conalbumin um, das aus der Kolonne eluierte Protein erweist sich also stets als Komplex des Conalbumines mit Eisen beziehungsweise dem anderen verwendeten Übergangsmetall.

c) Die Fähigkeit des Harzes, das Conalbumin unter den festgelegten Bedingungen zu adsorbieren, hängt spezifisch von der Gegenwart des an die Carboxymethylcellulose gebundenen Metalles ab. Eine Carboxymethylcellulosesäule ohne Eisen oder anderes Übergangsmetall, welche mit einem 0,1 m Acetatpuffer bis zur Erreichung des Gleichgewichtes auf einem pH-Wert von 5,5 behandelt worden ist hält nämlich im Gegensatz beispielsweise zu einer Säule von Fe⁺+ +-Carboxymethylcellulose unter den gleichen Bedingungen keine merkliche Conalbuminmengs zurück.

d) Auch wenn das erfindungsgemäße Verfahren auf unreine Proteinpräparate oder sogar auf Eiweiß von Eiern angewandt wird, wird maßgeblich das Conalbumin in reinem Zustand erhalten.

Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

Zunächst wurde ein Fe+ + ⁺-Carbox>rnethylcellulose-Komplex hergestellt:

Zur Herstellung dieses Komplexes wurden 1,5 kg Carboxymethylcellulose in destilliertem Wasser aufgeschwemmt, mit 4 bis 5 Volumina (etwa 101) einer wäßrigen 0,5 m Lösung von FeCb versetzt und 4 Stunden lang gerührt. Dann wurde der entstandene Komplex Fe⁺+ +-Carboxymethylcellulose auf einem Büchner-Trichter filtriert und die Harzschicht wurde mit destilliertem Wasser bis zum Verschwinden der Reaktion der Fe⁺+ +-Ionen im Filtrat gewaschen. Danach wurde das Harz in einen geeigneten Behälter geschüttet und mit 4 bis 5 Volumina einer m Ammoniumhydroxydlösung (etwa 8 I) behandelt und 4 Stunden lang umgerührt. Es wurde auf einem Büchner-Trichter filtriert und dann mit destilliertem Wasser gewaschen, bis das Filtrat einen pH-Wert zwischen 7 und 8 aufwies. Anschließend wurde das Harz in einen entsprechenden Behälter umgeschüttet und unter Umrühren mindestens 30 Minuten lang mit 3 bis 4 Volumina eines 0,1 m Acetatpuffers mit einem pH-Wert von 5 behandelt und erforderlichenfalls der pH-Wert auf 5 eingestellt.

Es wurden 10 kg Eier-Eiweiß (integrales Eiweiß) mittels aus Kationen-Anionen gemischter Ionenaustauscherharze (chargenweises Umrühren) entionisiert.

Das so entionisierte Eiweiß wurde zur Entfernung der Fällung mittels Mulle filtriert, der pH-Wert des Filtrates wurde auf 5 eingestellt und es wurde durch ein Papierfaltenfilter erneut filtriert. Der pH-Wert des

erhaltenen Filtrates, das völlig klar war, wurde erneut kontrolliert (der pH-Wert von 5 mußte erhalten bleiben) und gegebenenfalls neu eingestellt, worauf >/io seines Volumens eines 0,1 m Acetatpuffers mit einem pH-Wert von 5 zugesetzt und einige Minuten lang umgerührt wurde. Die so erhaltene Flüssigkeit wurde durch den wie vorstehend beschrieben hergestellten und auf einen mit besonderer Filterpappe versehenen Büchner-Trichter geschichteten Fe+^-Carboxymethylcelluloseharz-Komplex geleitet Die fortschreitende Adsorption des Conalbumines konnte am Fortschreiten einer hellbraunen Farbschicht auf der ursprünglichen dunkelbraunen Schicht des Fe⁺⁺ⁱ--Carboxymethylcelluloseharz-Komplexes sichtbar verfolgt werden. Nachdem die gesamte Flüssigkeit durchgesickert war, wurde mittels eines 0,1 m Acetatpuffers mit einem pH-Wert von 5, gewaschen, bis das Filtrat keine Gegenwart von Protein mehr zeigte, worauf das Conalbumin unter Verwendung eines 0,1 m Acetatpuffers mit einem pH-Wert von 5 mit einem Gehalt an 2 · 10~³ MoI Natriumeitrat (0,2 cm³ einer m Natriumcitratlösung in 100 cm³ -sines 0,1m Acetatpuffers mit einem pH-Wert von 5,5) als Eluiermittel eluiert wurde.

Die so erhaltene Lösung von Conalbumin wurde in bekannter Weise enteisent, beispielsweise in der Weise, daß der pH-Wert der Lösung mit fester Citronensäure auf 4,7 gebracht wurde und sie wiederholt unter Umrühren im Behälter mit starken Kationenharzen behandelt wurde, wie mit handelsüblichen Kationenharzen jeweils während 25 bis 30 Minuten mit jeweiligem Filtrieren und Überwachen der Beibehaltung de* pH-Wertes von 4,7. Die eisenfreie Flüssigkeit, die mittels konzentrierter Natronlauge auf einen pH-Wert von 6,5 gebracht wurde, wurde einer Dialyse in kaltem destilliertem Wasser (3 bis 4° C) bei häufigem Wechsel der Dialyseflüssigkeit während mindestens 48 Stunden unterworfen. Das Dialyseprodukt wurde nach dem Filtrieren durch Filterpapier lyophilisiert. Das erhaltene Produkt wurde spektrophotometrischen Kontrollen (bei 278 nm im UV-Licht in einer 0,02 m HCl und bei 470 und 480 nm im sichtbaren Licht als Apoconalbumin) und elektrophoretischen Kontrollen unterzogen, wobei es sich als maßgeblich reines Apoconalbumin erwies.

Die Ausbeute betrug etwa 10 g Apoconalbumin je kg Albumin.

Das lyophilisierte Apoconalbumin erwies sich a!s 6 Monate lang die Eigenschaften unverändert behaltend, wenn es bei Raumtemperatur oder darunter aufbewahrt wurde. Die nach der Konservierung beobachteten Eigenschaften waren unter anderem wie folgt:

a) Bindefähigkeit für Eisenionen in stöchiometrischen Mengen.

b) Beweglichkeit bei Elektrophorese auf Gel.

c) Fähigkeit zur Verhinderung des Bakterienwachstumes.

Beispiel 2

Zunächst wurde ein Fe+^-Carboxymethylcellulose-Komplex hergestellt:

Zur Herstellung dieses Komplexes wurden 50 g Carboxymethylcellulose in für die Chromatographie üblicher Form in 250 cm³ einer m Lösung von FeCIj aufgeschwemmt und die Aufschwemmung wurde 3 Stunden lang gerührt. Danach wurde das Harz auf ein Filter gebracht und mit Wasser solange gewaschen, bis der Obefschuß an Fe++ +-Ionen beseitigt war. Darauffolgend wurde das Harz in 500 cm³ einer m Ammoniumhydroxydlösung aufgeschwemmt und 12 Stunden lang in diesem Mittel gelassen. Dann wurde die Schwemme filtriert und das Harz auf dem Filter mit Wasser bis zur Entfernung des Ammoniumhydroxydüberschusses gewaschen. Danach wurde das Harz in Wasser aufgeschwemmt und so kalt (bei +5° C) stehengelassen. Mit dem wie vorstehend beschrieben erhaltenen Fe+ + +- Carboxymethylcelluloseharz wurden je 15 cm³ der Aufschwemmung enthaltende Chromatographiersäulen mit einem Durchmesser von 0,7 cm bereitet Dann wurden die Säulen mit einer 0,05 m Acetatpufferlösung mit einem pH-Wert von 5,5 bis zur Erreichung des Gleichgewichtes behandelt

Es wurde eine mit 0,2 cm³ einer m Natriumcitratlösung in 100 cm³ eines 0,1 m Acetatpuffers versetzten Lösung mit einem Gehalt an etwa 50 mg Conalbumin und einem pH-Wert von 5,5 sowie einer Molarität von 0,05 m auf die Säulen gegeben. Dann wurde das Waschen der Säulen mit der für die ersto Behandlung bis zur Erreichung des Gleichgewichtes verwendeten Pufferlösung durchgeführt

Das Eluierprodukt wurde in Fraktionen von 2 cm³ aufgt.'angen. Es wurde die optische Dichte der Fraktionen bei 280 nm bestimmt Dann wurde den Fraktionen festes Natriumbicarbonat zugesetzt (Endkonzentration etwa 0,2 molar) >ind es wurde die optische Dichte bei 470 nm bestimmt Mit diesen Vorgängen wurde der Gehalt an Proteinen und an Conalbumin der Fraktionen im Eluierprodukt der Säulen gemessen.

Das Eluierprodukt das mit einem 0,05 m Acetatpuffer mit einem pH-Wert von 53 erhalten wurde, enthielt weitere Proteine, jedoch nur unerhebliche Mengen von Conalbumin.

Dann wurde das Eluieren mit einem 0,05 m Natriumboratpuffer mit einem pH-Wert von 9,2 forcgesetzt. Dieses zweite Eluat enthielt Conalbumin, das maßgeblieh von allen anderen Proteinen, die anfangs im Ausgangsmaterial vorhanden waren, befreit war.

Es wurden auch zahlreiche Versuche unter Änderung der oben beschriebenen Versuchsbedingungen durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Versuche sind wie folgt:

Wenn das Conalbumin oder Apoconalbumin enthaltende Material auf die mittels Puffer, beispielsweise mit Kaliumphosphat, mit über 7 liegendem pH-Wert und einer Molarität von 0,05 bis 0,2 bis zur Erreichung des Gleichgewichtes behandelte Kolonne aufgegeben wurde und mit dem gleichen Puffer eluiert wurde, wurde das Conalbumin nicht in der Säule zurückgehalten und trat in der Eluierfront aus.

'Venn dagegen der Puffer, mit dem die Säule bis zur Erreichung des Gleichgewichtes behandelt und eluiert wurde, einen pH Wert zwischen 5 und 5,5 aufwies und 0,01 bis 0,2 molar war, wurden sowohl das Conalbumin als auch das Apoconalbumin absorbiert und in der Kolonne zurückgehalten.

Das adsorbiei te Conalbumin konnte aus der Kolonne durch Verändern der Waschflüssigkeit eluiert werden. Die letztere konnte aus einem 0,1 bist 0,2 m Puffer mit einem pH-Wert über 6 bestehen. Das Eluieren der Proteine konnte auch mittels eines Puffers, dessen pH-Wert unter 6 lag, jedoch Natriumeitrat gleicher

Konzentration oder einer über 10~³ m enthielt, erhalten werden.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Isolierung der Transferrine, insbesondere des Conalbumines, in reinem Zustand aus biologischem Material durch Chromatographieren unter Verwendung von Ionenaustauscherharzen und Abtrennen des reinen Transferrines durch Entziehen derjenigen Bestandteile, welche ein geringeres Molekulargewicht als die Traniferrine aufweisen, durch deren Abscheiden, dadurch gekennzeichnet, daß man das biologische Material auf einen pH-Wert zwischen 5 und 5,5 bringt und durch eine solche feste Materialmasse, welche aus einem festen Träger besteht, der chelatbildende Gruppen enthält, die Metallionen der Übergangselementengruppen zugeordnet sind, in Gegenwart einer Pufferlösung mit einem pH-Wert zwischen 5 und 5,5 ohne chelatbildende Eigenschaften führt, daß man danach durch diese Masse eine Eluierlösung leitet, welche einen Bestandteil aufweist, der Affinität zum Transterrin-Metaiikompiex besitzt, und daß man darauffolgend aus der Lösung, welche durch die Masse geleitet worden ist, die Abtrennung des reinen Transferrines durchführt.