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DE1767748A1 - Mittel zur Bestimmung der weiblichen Fruchtbarkeitsperiode - Google Patents

Mittel zur Bestimmung der weiblichen Fruchtbarkeitsperiode

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DE1767748A1
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DE
Germany
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saliva
peroxide
determining
peroxidase
color
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Application number
DE19681767748
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English (en)
Inventor
Foster Raymond O
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WESTON LAB Inc
Original Assignee
WESTON LAB Inc
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Publication date
Application filed by WESTON LAB Inc filed Critical WESTON LAB Inc
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Pending legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase
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    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
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Description

Periode
Die Erfindung betrifft eine verbesserte und neue Vorrichtung zur Bestimmung des Anstiegs bestimmter Enzymaktivitäten (Peroxidaseaktivität) die mit der fruchtbaren Periode der Frau zusammenfällt, sowie ein neues Verfahren zur Bestimmung dieses Enzymaktivitätsanstiegs und damit der Fruchtbarkeitsperiode·
Es wurde bereits vorgeschlagen« die Gegenwart des Enzymsferoxydaee im weibliohen Speichel su analysieren. Der analytische Test wird als richtig und brauchbar angesehen, well die Peroxydasekonzentration im Speichel während
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des Menstruationzyklus schwankt und unmittelbar vor der Ovulation ein T^ximi« erreicht·
Die Möglichkeit, die Zeit zu bestimmen, wenn die Ovulation bei der Frau ungefähr bevorsteht, ist sowohl für das Wahrnehmen der fruchtbaren Periode als auch zu deren Vermeidung von Wichtigkeit· Versuche, die fruchtbare Periode ausgehend vom Einsetzen der Menstruation und durch Aufzeichnen der Temperaturen zu berechnen und ähnliche Verfahren sind bereits mit grossem Aufwand durchgeführt worden. Die erste Methode ist η it einem Uhgenauigkeitsfaktor behaftet, da die Frau zu verschiedenen und unvorheraehbaren Zeiten ovulieren kann· Andererseits sind mechanische Methoden wie das Messen und Aufzeichnen von Temperaturen entschieden unbequem und können eine erhebliche übung beim Beobachten und Deuten der Verte erfordern· Daa Auffinden einer Koordinierung zwischen dem Einsetzen der Ovulation und einer hohen Peroxydaseaktivität im Speiohel wurde daher mit groasem Interesse aufgenommen. Sa wurden Verfahren und Mittel ausgearbeitet, diese erhöhte Aktivität zu messen, und auch bestimmte Erfolge erzielt· In vielen Fällen war es möglich, durch eine Testvorrichtung (einen Verauohsstrelfen), der in Gegenwart grösserer Peroxydaaemengen im Speiohel eine erkennbare Färbung entwickelt, eine gute Korelatlon zwischen diesem Seat und den bisherigen Standards zu erzielen, nämlich der Srundkörpertemperatur (das Ansprechen auf eine
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Temperatursteuerung)· Unglücklicherweise sprach der Test nicht mit gleicher Zuverlässigkeit bei allen frauen an· Das Ausmaee der Farbreaktion schwankte von ^craoa ku Person und trote der entschiedenen Brauchbarkelt für viele Personen erforderte der bisher bekannte Streifen Yorver-BUehe und eine sorgfältige individuelle Auswertung« bevor der Test absolut zuverlässig war«
Es wurde ein Teststreifen und ein Verfahren gefunden, das zur Bestimmung der Gegenwart und der Menge von Peroxydase im Speichel wesentlich zuverlässig/ist, sowie eine Vorrichtung zu diesem Zweck« die durch eine ausgeprägte Farbänderung gekennzeichnet ist« die leicht rfelbst vom ungeübten Beobachter festgestellt werden kann und Im wesentlichen für alle Personen einheitlieh 1st»
Die erfindungsgemässe Vorrichtung xur Bestimmung der weiblichen Fruchtbarkeitsperiode durch eine Peroxydasebestimmung im Speichel 1st gekennzeichnet durch einen Träger aus Fasermaterial, der nit (a) Natriumpyruvat, (b) einem Mannit-Ieroxyd-Komplex und (c) einer organischen Verbindung imprägniert ist« die ein gefärbtes Oxydationsprodukt in Gegenwart von aus Peroxyd freigesetzte« Sauerstoff bildet· Eine brauohbar· Torsralierung sur Herstellung -der Bestimmung»·· vorrichtung wird la folgenden angegeben*
Die Erfindung kann, ohne dass man sich auf Theorien auf diesem weltgehend unbekannten Gebiet festlegt, etwa wie
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folgt erläutert werden· Im Speiohel liegt ein Enzym, nämlich Peroxydase vor· Die Peroxydasekonzentration la Speiohel schwankt zeitlich und von Pereon zu Person, wobei bei dar Frau die Peroxydaaekonzentratlon unmittelbar vor dar Ovulation grosser wird· Sa ist daher BOgIiOh9 daa liaaeteen der Ovulation durch Bestimmung der relativen Peroxydaaemenge im Speichel zu bestimmen·
Im Speichel liegt ebenfalls eine Substanz vor, die ala DPN H(Diphosphopyrldinnucleiid in reduzierter form) bekannt ist und die eine Inhibierungswirkung auf die Peroxydase dahingehend ausübt, dass diese aus einem Peroxyd keinen Sauerstoff mehr entwickelt· Die Menge von D P I H im Speichel schwankt ebenfalls in siemlioh weItan Oraiizen* was praktisch eine Deutung der Wirkung auf dia Aktivität von Peroxydase unmöglich maoht·
Ausserdem liegt im Speiohel gewöhnliob eine weitere Substanz vor, nämlich Milchaäuredehydrogenaae (L D H)9 dia die folgende Reaktion aktiviertt
Natriumlactart +DPI IDE i DPIH *
Es wurde gefunden, dass duroh Zugabe voa atrl^ayruvat die Reaktion in Richtung dar Bildung voa latrlualaotat und DPI (Diphoaphopyridinnuoleltid) wie folgt gezwungen wird ι
DPNH + Natriumpyruvat LDHv Hatriumlaotat +DPI
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— 5 —
DPK inhibiert die PeroxydaeeaJrtivität nicht, wohl aber DPHH. Durch Zugabe von ffatrluapyrurat zum Reaktionsgemiscb wird daher dit inhibierende Substana D P M H zugunsten einer nicht inhibierenden Substanz, D P If, verdrängt·
In der beigefügten figur 1 ist graphisch die Wirkung der Zugabe von Ratriunpyruvat auf die Farbbildung eines Indikatorsystems des im folgenden genannten Typus erläutert· Insbesondere zeigt Fig.1 die Wirkung der Zugabe von Katriumpyruvat auf die Farbintensität, die durch die Reaktion gebildet wird, in der Peroxydase au« dem Speichel Sauerstoff aus einem Peroxyd freisetzt-und dass der Sauerstoff einen Farbindikator oxydiert (Guajaoonsitare)· Wi· aus Fig«1 entnommen werden kann, entwickelt die Tergleiohslösung, die kein Hatriumpyruvat enthält, ein· optisch· Dichte von O908 innerhalb von 1 Min·, nachdem dl· Reaktionsteilnehmer zusan-r mengebracht sind· Die Peroxydase Im Speichel bildet weiter Sauerstoff aus einer Peroxydquellt, wobei dieser Sauerstoff die Ouajaconsäure waiter Bit fortschreitender Zeit von 1 Min· bis 10 Hill· oxydiert* Die Jarbinteneität, ausgedruckt duroh optische Dioht·, wird fortschreitend stärker, jedoch Bit langsamer Geschwindigkeit· Aa Bad· von 10 Min« hat sich die optische Dichte nur leicht bis oberhalb 0,2 erhöht, Während
ί ι
in einige» JaMlen diese Färbintensität »ufritdenetellend sein kann# wird der hohe Zurerllesifktitegrad und die Jtntwicklunf einer tiefen Färbung nicht erreicht, die für den ungeübten Beobachter so wichtig sind«
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Venn anderereeita gemäaa fig#1 0,01 Mol Ifatriumpyruvat zum Reaktionagemiaoh zugegeben wird, wird die farbintensitat la Verlaufe der Zeit atark erhöbt und nach einer Entwicklungszeit von 10 Min· erreicht die durch die optlache Dichte gemessene Färbung den Wert 0,45 oder mehr ale daa Zweifache der VergleiohslOsung· Die Verdoppelung der farbinteneität erleichtert die Beobachtung und Zuverlässigkeit, die für den ungeübten Beobachter gewünscht wird«
Sin noch besseres Absprechen kann dadurch erreicht werden, dass mehr Yatriumpyruvat zugesetzt wird· Genäse Pig.1 wird beim Zusatz von O90167 Mol VatriumpyruTat zum Reaktionsgemisch die optische Dichte naoh 10 Min· einen Wert von etwa O9 6 oder dem beinahe Dreifachen der Vergleichelösung erreicht haben· Die Bildung einer intensiven färbung ist durch den Anstieg von der optischem Dichte O9I bei 1 Min· bis fast O16 nach 10 Min· sehr ausgeprägt· Duroh eine derart ausgeprägte Entwicklung der färbung wird ein hoher Zuverlässigkeitsgrad erreicht und aelbat der nicht eingeweihte Beobachter kann diese färbung Ieloht erkennen·
•Der ala flüssiges Medium b«l daa la fig.1 erläuterten Versuchen verwendete Speiohel enthält aitjrt mr die natürlich auftretende Peroxydasβt sondern avoa daa natürlloh auftretende D Γ 1 H. Via der Vergleichstest IBfIH9 Mlgt DfIH eine Wirkung in Richtung auf dia tfhterdrttckung dar farbbildenden Reaktion zwischen dar Perojqrdaa·*
und Guajaconaäure· Durch Zugab· τοη Hatriumpyruvat wird die Wirkung dee D P I H inhibiert und die Möglichkeit einer echten farbreaktion geschaffen, die durch Pt-oxydase, Peroxyd und Indlkatorsystem ermöglicht wird«
Die Lösungen der in 7ig«1 .erläuterten Versuche sind gemäeθ der folgenden Rezeptur hergestellt:
Reagenzien: Guajacol
Wasserstoffperoxid
Phosphatpuffar
Hatriumpyruvat -
Speichel
Merck IT·?· oder Gtaajacoasäure - 2 ml auf 500 ml mit destilliertem Wasser verdünnt - 0*358 molare orundlösung
1 ft*· ig« (Jr und lösung
Hatriumdihydrogenphosphat, Iatriomhydrcgenphoaphat O1Si1 pfi - 7,4., ,
Sigma Ohemioal type VL - 0»1-molare Grundlösung in Wasser
tlbsrstehende flUesigkeit nach dem Zentri fugieren bei 4500 üpm.
Terfahreni Zn tin·» ^MiaxikuTette τοη 3»5 ml wurden folgend· Be-
•taaataiia T«raiechti 0,3 ml 5p«rc^el, 1,1 ml Pufferlösung,
1»P ml öuajaool-&ruadlö>«m4 und 0,5 Ü destillierte« Was··». line YergleichskuYett· mit den gleichen Reagenziem wurde hergerichtet. Zu der Tergletohskurette wurde 1 tropfen Was··»
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BAD ORiQiNAL
zugegeben. Bei der Zeit O wurden 0,05 ml 3 jt-iges Wasserstoffperoxid zur Probenkuvette zugegeben· Die Reaktion ward« in Intervallen von 1 Mn. bis zu 10 Min. bei 447*u beobachtet·
Die Probe wurde wiederholt, wobei jedoch anstelle des Waasers Natriumpyruvat zugegeben wurde, so dass die Endkonzentration 0,0067 m, 0,01 m bzw· 0,0167 α betrug.
Die Vorrichtung gemäss der Erfindung oder das Testpapier, das durch die Erfindung vorgesehen ist, wird als bevorzugte Ausführungsform im folgenden geschildert. Das Te st papier ist vorzugsweise ein absorbierendes Papier, z.B. ohemisch reines Filterpapier oder dgl. Tuchstreifen oder poröse und absorbierende Holzstreifen können ebenfalls verwendet werden. Das Versuchapapier wird mit einer Lösung des aktiven Bestandteils imprägniert und dann zur Verdampfung des Lösungsmittels getrocknet, wobei die aktiven Bestandteile auf dem Papier zurückbleiben. ·
In einer bevorzugten Formulierung werden 3,45 g Methooel, ein Methyloelluloseprodukt, in 220 oom destilliertem Wasser gelöst und 50 ο cm Äthylalkohol und 50 oom Propylalkohol zur Lösung zugesetzt. Sine zweite Lösung wird hergestellt duroh Auflösen von 15 g Mannit in 100 oom J jt-lgea Wasserstoffperoiyd.
109836/0426 bad original
Ss wird eine dritte Losung hergestellt» 11· 3»75 g Tween 80 enthält ( ein Polyoxyäthylenderivat von Sorbit)» das in 60 com Ithylalkohol gelöst wird. 1,8 g Guajaconsäure (hochrein) wird ebenfalls im Äthylalkohol gelöst. Sine vierte Lösung wird hergestellt durch Lösen von 5»O g Natriumcitrat, 50 mg Zitronensäure und 2^5 g Hatriumpyravat In 60 ecm destilliertem Wasser. Die UatriumpyruvatÄenge kann schwanken, sollte jedoch ausreichen, die Bildung de* Färbung durch das Indikatorsystem zu fördern· G-emäss Fig.1 sollte die Natriumpyruvatmenge auereichen, dass sie wenigstens in einer Konzentration von 0,005 m im Speichel beim Versuch vorliegt·
Die genannten vier Lösungen werden kombiniert (dit korn- ■ binierte Lösung hat einen pH-Wert 6,6) und groase Blätter chemieoh reine« Filterpapier werten mit der gemischten Lösung imprägniert und anschließend an der Luft getrocknet.
Das Versuchepapier oder der so hergestellte Versuche-Streifen wurden in kliniaohen Versuchen untersucht» um die Genauigkeit de· Streifen· zur Bestimmung der Truohtbarkelteperiode der Frau festzustellen, duroh Untersuchung dee Speichels. Verglichen mit den bisherigen Methoden, nämlich Me ·- eung der Körpertemperatur (Inspreohen duroh Temperaturänderung) wurde gefunden,, dass die genannten Versuoheetreifen eine β ehr zuverlässige Kons 1ation ergaben. Der grosee Vorzug und die leichte Durchführung die··· oralen Versuchs let augenscheinlich.
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Sie Frau berührt einfach das Vereuchepapier mit der Zunge und befeuchtet ee und wartet einige Minuten, ob festzustellen, ob sich auf dem Versuchepapier eine farbänderung entwickelt. Das Ergebnis wird leicht beobachtet und erfordert nicht das Messen und Auswerten von Werten über eine lange Zeitperiode· Jeder Versuch ist an sich vollständig. Der Test ist zuverlässig und einfach, sowie bequem und relativ billig. Wenn der Peroxydaeegehalt im Speichel hoch ist, d.h. wenn die Ovulation nahe bevorsteht, entwickelt der erfindungegeoäeee Teststreifen eine leicht erkennbare blaue Färbung. Andererseits ändert der Teststreifen in der nioht fruchtbaren Periode des Zyklus bei niedrigem Peroxydmsegehalt bei der Berührung mit Speichel die Farbe nicht oder die Farbentwicklung ist so eohwach, dass der Beobachter leicht den Unterschied zwi-8ohen der fruohtbaren und unfruchtbaren Periode feststellen kann.
Wasβerstoffperoxyd ist als instabil unter den Bedinungen bekannt, die gewöhnlich bei der Herstellung und Verwendung der beschriebenen Vorrichtung herrschen. Si war daher überraschend und überaus brauohbar, die itabllität de· Komplexes zwisohen Wasserst of f per ozyd und Mannit la diesem Medium aufzufinden. Andere stabil· und oral nioht toxisohe erganisohe Komplexe von Wasserstoffperoxid, Al· fänlg sind Sauerstoff bei Berührung alt ieroxydase freisusetsen, sind erfindungsgsmä·· ebenfall· brauohbar.
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le 1st zwar bevorzugt, eine hochgereinigte Form von Guajacol zu verwenden, jedooh können auch andere organisch· Verbindungen, die gefärbte Oxydatloneprodukte In Gegenwart . von aus Peroxyd freigesetztem Sauerstoff bilden, verwendet werden. Da es eioh um einen oralen Test handelt, 1st es natürlich wichtig, eine organische -Verbindung oder einen farbstoff zu verwenden, die Is wesentlichen unter den Ver-B uo ha bed ing ung en nicht t ex ie oh ist. Ifypitohe .Beispiele sind Benzidin, o-Iolidin, Eianisidin, Phenylendiamin und 2,7-Diaminfluoren-dlhydrochlorid.
Bei den vorstehenden theoretischen Erörterungen wurde auf die Reaktion unter Beteiligung von Milohsäuredehydrogenase Bezug genommen· Wird latriempyruvat erfindungegemä·· zugesetzt, wird die Beaktion in BioJrkung tee nicht inhibierenden DfI gezwungen· Is wurte gefunden, 4s>S8 Ipfelsäuredehy&rogenaae (die ebenfalls la tfeiehel auftritt) den gleichen Iffekt wie Hilchsaoredekydrogenas· auf DfHH ausübt. Xm 7all der Ipfelsfturedehydregenase sieht die Erfindung jedoch vor, dass öxalessigsäure anstelle 70η Vatriuapyruvat verwendet wird· In manohen fällen kann es daher erwünscht sein, sowohl Hatriumpyruvat wie tealessigsäur· Im Yereuohsstreifen. zu Erzielung des günstigsten Ansprechen· zuzusetzen.
Bas erfindungegemässe Tersuohsverfahren und der Ver- . suohsstreifen sind in erster Linie fttr frauen von Bedeutung, jedoch ist der Versuch auch auf weibliche Tiere anzuwenden
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und kann von erheblicher Bedeutung sein· Das Ansprechen der erfindungsgemässen Tersuchsvorrichtung kann auch dadurch gezeigt werden, dass man eine nahe verwandte Körperflüssigkeit nämlich Halsschleim mit der Torrichtung in Berührung bringt·
Es ist klar, dass die Bestandteile, di· bei der Vor» richtung gemäss der Erfindung verwendet werden, im dem Fachmann zugänglichen Rahmen geändert werden können«
Pat entansprüohe
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Claims (2)

  1. 3ο ο September 197ο
    Patentansprüche
    Io Vorrichtung zur Bestimmung der weibliohen Fruchtbarkeitsperiode durch Peroxydasebestimmung im Speichel, gekennzeichnet durch einen Träger aus Pasermaterial, der mit (a) Hatriumpyruvat, (b) einem Mannit-peroxyd-Komplex und (c) einem im wesentlichen nicht toxischen organischen Indikator imprägniert ist, der ein gefärbtes Oxydationsprodukt in Gegenwart von aus Peroxyd freigesetztem Sauerstoff bildet.
  2. 2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich-, net, daß der Indikator Guajaconsäure iste
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    L e e r s e i t
DE19681767748 1967-06-12 1968-06-12 Mittel zur Bestimmung der weiblichen Fruchtbarkeitsperiode Pending DE1767748A1 (de)

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US64524667A 1967-06-12 1967-06-12
FR157304 1968-06-28

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