DE1620547C

DE1620547C - Verfahren zur Herstellung von 5-Ribonucleotiden

Info

Publication number: DE1620547C
Authority: DE
Inventors: Mikio Takatsuki; Masuda Toni Nishinomiya; Imai Kinichi Takatsuki; Fujii Shoichiro Kyoto; Takanohashi Kunio Suita; Honjo (Japan)
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Publication date: 1972-07-27

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung /on 5'-Ribonucleotiden durch Umsetzung von Riboiucleosiden mit einem speziellen Phosphorylierungs-.nittel in Gegenwart von bestimmten Phenolen und anschließende Hydrolyse.

Ribonucleoside haben drei Hydroxylgruppen in 2'-, Y- und 5'-Stellung an ihrer Ribosekomponente. Wenn Ribonucleoside direkt "der Phosphorylierung unter- -vorfen werden, entsteht ein Gemisch von Riboiucleosid-2',5'-diphosphat und -3',5'-diphosphat. Zur clektiven Herstellung von 5'-Ribonucleotic!en aus !em entsprechenden Ribonucleosid war es daher notwendig, die Hydroxylgruppen in der 2'- und 3'-Stel!ung nit geeigneten Substituenten zu schützen, bevor die Phosphorylierung in der 5'-Stellung vorgenommen //urde. .

Die bisher bekannten Verfahren zur Herstellung /on 5'-Ribonucleotid aus dem entsprechenden Ribolucieosid bestehen darin, daß man die 2'- und 3'-Hyiroxylgruppen an der Ribosekomponente mit einem Acylrcst (z. B. mit einem Acetylrest oder Bcnzoylrest) ider einer Isopropylidengruppe schützt und anchließend die freie 5'-Hydroxylgruppe durch geeignete vlittel phosphoryliert, worauf die schützenden Grupjen entfernt werden, oder aber daß man in Gegenwart on Ketonen arbeitet.

Es wurde nun überschaschenderweise gefunden, daß iur eine OH-Gruppe in der 5'-Stellung des Riboiucleosids selektiv phosphoryliert wird, ohne daß ein ichutz der Hydroxylgruppen in der 2'- und 3'-Stellung /or der Phosphorylierung erforderlich ist, wenn las Ribonucleosid mit einem Phosphorylierungsnittel in Gegenwart von bestimmten Phenolen umgesetzt wird.

Gegenstand der Erfindung ist demgemäß ein Ver-.ihren zur Herstellung von 5'-RibonucIeosiden durch elektive Phosphorylierung von Ribonucleosiden in /-Stellung mit Pyrophcsphoryltetrachlorid oder Phos- >horoxychlorid, das auch teilhydratisiert bzw. -alkohoisiert sein kann und anschließender Hydrolyse des uräerst erhaltenen Phosphorylierungsproduktes, das iadurch gekennzeichnet ist, daß man die Phosphoryerung in Phenol, Chlorphenol, Kresol und/oder {ylenol als Lösungsmittel durchführt, ohne die Hy-Iroxylgruppen in 2'-, 3'-Stellung vorher besonders zu chützen.

Beim Verfahren der Erfindung werden die 5'-Riboiucleotide in guter Ausbeute in einfacher Weise eralten.

Für die Zwecke der Erfindung kommen natürliche ;nd synthetische Ribonucleotise in Frage, die eine 'urinbase (z. B. Adenin, Hypoxanthin, Guanin), eine 'yrimidinbase (z. B. Cytosin, Uracil, Thymin) und ine Pyridinbase (z. B. Nikotinamid) enthalten.

In das Verfahren der Erfindung werden Phenol, -Chlorphenol, Kresol (o-, m-, p-Kresol oder deren Jemische) und Xylenol als Lösungsmittel eingesetzt.

Als Phosphorylierungsmitte! werden Pyrophosphoyltetrachlorid, Phosphoroxychlorid, teilweise hydroysiertes oder teilweise alkoholisiertes Phosphoroxyhlorid in das Verfahren c'er Erfindung eingesetzt. )iese Verbindungen werden allein oder in Kombination erwenc'et.

Die obergenannten Ribonucleoside, Phenole oder hosphorylierungsmittel müssen nicht unbedingt in jiner Form verwendet werden.

Die verwendeten Mengen der Phenole und des Phoshorylicrungsmittcls sind verschieden, je nach der Art des Ribonucleosids, der Phenole oder Phosphorylierungsmittel. Das Phosphorylierungsmittel wird in einer Menge von etwa 1 bis 30 Mol, vorzugsweise von etwa 2 bis 15 Mol, bezogen auf das Ribonucleosid, verwendet. Die verwendete Phenolmenge beträgt wenigstens etwa 10 Mol, bezogen auf das Ribonucleosid. Die Phenole werden in einer Menge von etwa 10 bis ICO, vorzugsweise von etwa 15 bis 50 Mol pro Mol Ribonucleosid verwendet.

Die Reaktion läuft bei Raumtemperatur ab. Gegebenenfalls kann während der Reaktion erhitzt oder gekühlt werden.

Da die Phenole als Lösungsmittel wirken, ist kein weiteres Lösungsmittel für die Reaktion erforderlich. Gegebenenfalls kann jedoch ein geeignetes Lösungsmittel (z. B. Benzol, Xylol, Dioxan) zusammen mit den Phenolen verwendet werden, solange es die Reaktion nicht hemmt. Insbesondere kann bei Verwendung von Benzol zusammen mit den Phenolen als Lösungsmittel die Menge der Phenole verringert werden.

Die Hydrolyse wird in an sich bekannter Weise durchgeführt, indem beispielsweise das Produkt in "Wasser gegossen wird oder indem der pH-Wert des in der ersten Stufe erhaltenen Reaktionsgemisches auf einen Wert im schwach sauren Bereich zweckmäßig auf etwa 1 bis 2 eingestellt wird, indem eine Alkaliverbindung (z. B. Natriumhydroxyd, Kaliumhydroxyd, Natriumcarbonat, Kaliumcarbonat) zugesetzt wird. Hierbei wird das gewünschte 5'-Ribonucleotid gebildet.

So lassen sich gemäß der Erfindung 5'-Ribonucleotide im Vergleich zu bekannten Verfahren, z. B. dem der französischen Patentschrift 1 369 079, unter milderen Bedingungen in kürzerer Reaktionszeit und höherer Ausbeute herstellen.

Beispiel 1

Zu einer Suspension von 196 g Inosin in 3,8 1 m-Kresol wurden 380 g Pyrophosphoryltetrachlorid bei 10⁰C gegeben. Das Gemisch wurde 2,5 Stunden bei dieser Temperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in 13,6 1 Eiswasser gegossen, worauf das Gemisch mit 21 Benzol geschüttelt wurde, um das m-Kresol in die Benzolschicht zu überführen. Die Benzolschicht wurde zweimal mit 4,5 1 Wasser gewaschen. Die mit der Waschflüssigkeit vereinigte wäßrige Schicht wurde mit Benzol geschüttelt. Dann wurde die wäßrige Schicht abgetrennt und mit wäßriger 5 n-Natriumhydroxydlösung auf den pH-Wert 1 eingestellt.

D.'e Analyse der eingestellten Lösung durch Papierelektrophorese (Boratpuffer, ρH-Wert 9,2) ergab, daß Inosin-5'-monophosphat in quantitativer Ausbeute gebildet worden war.

Die Lösung wurde mit Wasser auf ein Volumen von 50 1 gebracht und an einer Säule adsorbiert, die mit 2 kg Aktivkohle gefüllt war. Die Säule wurde mit Wasser gewaschen und mit einer 0,7%igen wäßrigen Natriumhydroxydlösung eluiert. Das Eluat wurde auf pH-Wert 8,6 eingestellt und eingeengt, wobei 240 g Kristalle des Dinatriumsalzes von Inosin-5'-monophosphat (gerechnet als Anhydrid) erhalten wurden. Die Ausbeute betrug 83,5%.

Beispiel 2

Ein Gemisch von 60 ml m-Kresol und 2,7 g Inosin wurde eine Stunde bei 40 bis 50⁰C gerührt, wobei sich

eine homogene Lösung bildete. Nach Kühlung der Lösung auf 5°C wurden 20 ml Pyrophosphoryltetrachlorid zugesetzt und das Gemisch 2 Stunden gerührt. Die Aufarbeitung des Reaktionsgemisches auf die im Beispiel 1 angegebene Weise ergab 3,3 g Kristalle des Dinatriumsalzes von Inosin-S'-monophosphat. Die Ausbeute betrug 85%.

Das erhaltene Produkt wurde durch Papierelektrophorese (1. Boratpuffer, pH 9,2; 2. Citratpuffer, pH 5,8) und . Papierchromatcgraphie (aufsteigende Methode unter Verwendung von 1. Isobuttersäure:: wäßrigem 0,5 n-Ammoniak = 10: 6 und 2. gesättigtem Ammoniumsulfat : Isopropanol: Wasser = 79 : 2 :19) analysiert. Durch die Wanderungsstrecke und den Rf-Wert wurde das Produkt als Inosin-5'-monophosphat identifiziert. Die Perjodsäure-Bcnzol-Reaktion des Produkts war positiv. Es wurde durch 5'-NucIeotidase aus Stiersamen vollständig dephosphoryliert.

Beispiel 3

Zu einer Suspension von 3,9 g Adenosin in 76 ml m-Kresol wurden 7,6 g Pyrophosphoryltetrachlorid bei 10° C gegeben. Das Gemisch wurde 2 Stunden bei dieser Temperatur gerührt. Durch Aufarbeitung des Reaktionpgemisches auf die im Beispiel 1 angegebene Weise wurden 3,3 g Kristalle des Dinatriumsalzes von Adenosin-5'-monophosphat (gerechnet als Anhydrid) erhalten. Die Ausbeute betrug 75%.

B e i s ρ i c I 4

Zu einer Suspension von 3,9 g Inosin in 76 ml m-Kresol wurden 13,8 g rohes Pyrophosphoryltetrachlorid, das 55 Gewichtsprozent Pyrophosphoryltetrachlorid und 45 Gewichtsprozent Phosphoroxychlorid enthielt, bei 1O⁰C gegeben. Das Gemisch wurde bei dieser Temperatur 2 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise aufgearbeitet, wobei 4,8 g Kristalle des Dinatriumsalzes von ,Inosin-S'-monophosphat erhalten wurden. Die Ausbeute betrug 84%.

Beispiel5

Zu einer Suspension von 1,9 g Inosin in 56 ml einer Mischung aus 31 Gewichtsprozent Phenol, ^Gewichtsprozent o-Kresol, 38 Gewichtsprozent m-p-Kresol, 19 Gewichtsprozent Xylenol wurden 5,6 g Pyrophosphoryltctrachlorid bei 10°C gegeben. Das Gemisch wurde bei dieser Temperatur 2 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde auf die im Beispiel 1 angegebene Weise aufgearbeitet, wobei 2,35 g Kristalle des Dinatriumsalzes von Inosin-5'-monophosphat erhalten wurden. Die Ausbeute betrug 85%.

Beispiel 6

Zu einer Suspension von 1,97 g Guanosin in 36 ml m-Kresol wurden 5,4 g Pyrophosphoryltetrachlorid bei 10⁰C gegeben. Das Gemisch wurde bei dieser Temperatur 4 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde auf die im Beispiel 1 angegebene Weise aufgearbeitet, wobei 2,0 g Kristalle des Dinatriumsalzes von Guanosm-5'-monophosphat (gerechnet als Anhydrid) erhalten wurden. Die Ausbeute betrug 70%.

Be i spi e 1 7 ■ ■ ■ '■

Zu 600 ml o-Chlorphenol wurden 2,7 g Inosin gegeben. Das Gemisch wurde 0,5 Stunden bei 4O⁰C gerührt. Nach Abkühlung der Lösung auf 5°C wurden 20 ml Pyrophosphoryltetrachlorid zugesetzt. Das Gemisch wurde 2 Stunden gerührt. Durch Aufarbeitung des Reaktionsgemisches auf die im Beispiel 1 angegebene Weise wurden 3,3 g Kristalle des Dinatriumsalzes von Inosin-5'-monophosphat erhalten. Die Ausbeute betrug 85%.

Beispiel 8

Zu einer Lösung von 4,9 g Uridin in 210 ml m-Krcsol wurden 7 ml Pyrophosphoryltetrachlorid bei 5°C

ίο gegeben. Das Gemisch wurde bei dieser Temperatur 2 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde auf die im Beispiel 1 angegebene Weise aufgearbeitet, wobei 5,9 g Kristalle des Dinatriumsalzes von Uridin-5'-monophosphat (gerechnet als Anhydrid) erhalten wurden. Die Ausbeute betrug 80%· Das Ultraviolett-Absorptionsverhältnis des Produkts in Wasser von 290 μ/260 μ, 280 μ/260 μ und 250 μ/260 μ wurde mit 0,04, 0,38 und 0,74 bestimmt. Das Produkt wurde durch 5'-NucIeotidase aus Stiersamen vollständig

ao dephosphoryliert.

Beispiel 9

Zu einer Lösung von 3,4 g Cytidin in 300 ml m-Kresol wurden 10 ml Pyrophosphoryltetrachlorid bei 5°C

as gegeben. Das Gemisch wurde bei dieser Temperatur 2 Stunden gerührt, wobei eine Reaktion stattfand. Durch Aufarbeitung auf die im Beispiel 1 angegebene Weise wurden 4,5 g Kristalle des Dinatriumsalzes von Cytidin-5'-monophosphat (gerechnet als Anhydrid) erhalten. Ausbeute 87%.

Das Produkt wurde durch 5'-Nucleotidase aus Stiersamen vollständig dephosphoryliert.

Beispiel 10

0,98 g Inosin wurden bei 25°C in einer Lösung von 10 g Dioxan in 20 g m-Xylenol suspendiert. Nach Zutropfen von 3,8 g Pyrophosphoryltetrachlorid wurde das Inosin unter Bildung einer homogenen Lösung gelöst. Das Gemisch wurde bei 25°C gehalten, wobei eine Reaktion stattfand. Das Reaktionsgemisch wurde auf die im Beispiel 1 angegebene Weise aufgearbeitet, wobei 1,2 g Kristalle des Dinatriumsalzes von Inosin-S'-monophosphat (gerechnet als Anhydrid) erhalten wurden. Ausbeute 83,8%.

Beispiel 11

0,98 g Inosin wurden bei 25° C in einer Lösung von 10 g Benzol in 20 g m-Xylenol suspendiert. Nach Zutropfen von 3,8 g Pyrophosphoryltetrachlorid wurde das Inosin unter Bildung einer homogenen Lösung gelöst. Die Lösung wurde bei 25⁰C gerührt, wobei eine Reaktion stattfand. Das Reaktionsgemisch wurde auf die im Beispiel 1 angegebene Weise aufgearbeitet, wobei 1,18 g Kristalle des Dinatriumsalzes von Inosin-5'-monophosphat (gerechnet als Anhydrid) erhalten wurden. Ausbeute 82,5%.

Beispiel 12

20 g Phenol wurden exotherm in 3,8 g Pyrophosphoryltetrachlorid gelöst. Nach Abkühlung der Lösung auf 3O⁰C wurden 0,98 g Inosin zugesetzt. Das Gemisch wurde bei der gleichen Temperatur 30 Minuten gerührt, wobei eine Reaktion stattfand. Das· Reaktionsgemisch wurde auf die im Beispiel 1 angegebene Weise aufgearbeitet, wobei 1,12 g Kristalle des Dinatriumsalzes von Inosin-5'-monophosphat (gerechnet als Anhydrid) erhalten wurden. Ausbeute 78,3%.

' 5 ■ 6

R i η i e 1 13 chlorid gegeben, das durch Mischen von 4,5 ml Phos-

phoroxycnlorid und 0,01 ml Wasser erhallen worden

17 g Phosphoroxychlorid wurden mit 17 g Xylol war. Das Gemisch wurde 7,5 Stunden bei 5 bis 10^uC

gemischt. Nach Abkühlung des Gemisches wurde gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in 100 nil Äther

1 g Wasser zugerührt. Das Gemisch wurde 5 Stunden 5 gegossen, wobei weilie Kristalle gebildet wurden, die

bei 90 bis 95" C gerührt. Nach Auflösung von 20 g abgetrennt und zur Hydrolyse in Eiswasser gegossen

Phenol wurden 1,96 g Inosin zugesetzt. Nach 2 Stun- wurden.

den wurde das Reaktionsgemisch auf die im Beispiel 1 Die hydrolysierte Lösung wurde auf die im Beispiel

angegebene Weise aufgearbeitet, wobei 2,38 g Kristalle 16 angegebene Weise behandelt, wobei 600 mg des Di-

des Dinatriumsulzes von lnosin-5'-monophosphat (ge- 10 natriumsalzes von lnosin-5'-monophosphat erhalten

rechnet als Anhydrid) erhalten wurden. Ausbeute wurden. Die Ausbeute betrug 77,4^u/₀ (gerechnet als

83,1 ⁰I₀. Anhydrid).

Beispiel 14 Beispiel 18

0,98 g Inosin wurden in einer Lösung von 5 g Benzol 15 Zu einer Suspension von 560 mg Guanosin in in 10 g hhenol suspendiert. Bei Zugabe von 3,8 g Pyro- 7,5 ml m-Kresol wurde teilweise alkoholisches Phosphospuoryltetraclilorid bei 20" C loste sich aas Inosin phoroxychlorid gegeben, das durch Mischen von schnell unter Bildung einer homogenen Lösung. Das 4,5 ml Fhosphoroxychlorid und 0,2 ml t-Butylalkohol Gemisch wurde 1 Stunde beider gieicl.en lemperatur erhalten worden war. Das Gemisch wurde 8 Stunden gehalten, wobei eine Reaktion stattfand. Das Reaktions- 20 bei 5 bis 10" C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde gemisch wurde auf die im Beispiel 1 angegebene Weise in 100 ml Äther gegossen, wobei weiLe Kristalle geaul'gearbeitet, wobei 1,21 g Kristalle ues Dinatrium- bildet wuraen, die abgetrennt und zur Hydrolyse in salzes von lnosin-5'-monophosphat (gerechnet als Eiswasser gegossen wurden.

Anhydrid) erhalten wurden. Ausbeute 84,5%· Die Analyse des Hydrolysats durch Papierelektro-

25 phorese ergab, daß Guanosin-5'-monopnosphat in

.·■;■·· B e i s p i e 1 15 einer Ausbeute von 81 ^u/₀ gebildet worden war. Durch

Behandlung der hydrolysieren Lösung auf die im Bei-

Zu einer Suspension von 2 g Inosin in einem Ge- spiel 16 angegebene Weise wurden 61umg (Ausbeute: misch von 20 g m-Kresol und 12 g Benzol wurden 76^ü/₀) des Dinatriumsalzes von Guanosin-5'-mono-2,8 g Pyrophosphoryltetrachlorid bei 10" C gegeben. 30 phosphat erhalten.
Das Gemisch wurde 4 Stunden bei dieser lemperatur

gehalten, wobei eine Reaktion stattfand. Die Auf- Beispiel 19

arbeitung des Gemisches auf die im Beispiel 1 angegebene Weise ergab das als Dinatriumsalz vor- Zu einer Suspension von 534 mg Adenosin in 7,5 ml hegence Inosin-5'-monophosphat (gerechnet als An- 35 m-Kresol wurae teilweise alkoholisches Phosphoroxyhydrid) in einer Ausbeute von 82,2 ^u/₀. chlorid gegeben, das durch Mischen von 4,5 ml Phos-. . phoroxycnlorid und 0,2 ml t-Butylalkohol erhalten Beispiel 16 worden war. Das Gemisch wurde 7,5 Stunden bei 5 bis

Zu einer Suspension von 504 mg Inosin in 7,5 ml 10° C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in 100 ml m-Kresol wurde teilweise alkoholisches Phosphoroxy- 40 Äther gegossen, wobei weite Kristalle erhalten wurden, chlorid gegeben, das durch Mischen von 4,5 ml Phos- die abgetrennt und zur Hydrolyse in Eiswasser gephoroxychlorid und 0,2 ml t-Butylalkohol erhalten gössen wurden.

worden war. Das Gemisch wurde 8 Stunden bei 5 bis Die Analyse des Hydrolysats durch Papierelektro-

10°C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurce in 100 ml phorese ergab, dall Adenosin-5'-monopiiosphat in Äther gegossen, wobei weihe Kristalle gebildet wurden, 45 einer Ausbeute von 88^υ/₀ gebildet worden war. Die die abgetrennt und zur Hydrolyse in hiswasscr gc- Behandlung der hydrolysierten Lösung auf die im gössen wurden. Beispiel 16 angegebene Weise ergab 680 mg (Aus-

Die hydrolysierte Lösung wurde in eine mit Ionen- beute: 86,7%) Dinatriumsalz von Adcnosin-5'-monoaustauschharz gefüllte Säule gegossen, an dem das phosphat.

Produkt adsorbiert wurce. Als Austauschharz wurae 50 B e i s ρ i e 1 20

ein gclförmiges primär, sekundär und tertiär alipha-

tiscl.es Amin-Pl.enol-Formaldehyd-Polykondensat in Zu einer Suspension von 534 mg Adenosin in 7,5 ml

der HO-Form verwendet. Die Säule wurde mit 30 ml m-Kresol wuroe teilweise hydrolysates Phosphoroxy-Wasser gewaschen und mit wäLriger ln-Ammoniak- Chlorid gegeben, das durch Miscncn von 4,5 ml Phoslcsung eluiert. Das hluat wurde eingeengt und mit 55 phoroxycnlorid und 0,02 ml Wasser erhalten worden einem gelförmigcn Polystyrol, das als aktive Gruppen war. Das Gemisch wurde 8 Stunden bei 5 bis 10⁰C die bestandteile C₀H₄SO₃H aufweist, in der Natrium- gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in 100 ml salzform behandelt, wodurch das l^Jrodukt in das ent- Äther gegossen, wobei wen.e Kristalle gebildet wurden, sprechende Natriumsalz umgewandelt wurde. Die so die abgetrennt und zur Hydrolyse in Eiswasser gebchandelte Losung wurde auf 4 ml eingeengt und mit 60 gössen wurden.

4 ml Methanol versetzt, wobei 620 mg Kristalle des Die Analyse des Hydrolysats durch Papicrclektro-

Dinatriumsalzcs von lnosin-5'-monophosphat erhalten phorese ergab, daß AdcnosinrS'-monophospliat in wurden. Die Ausbeute betrug 84,2^u/₀ (gerechnet als einer Ausbeute von 87^U/_O gebildet worden war. Die Anhydrid). ' hydrolysierte Lösung wurde auf pH-Wert 1,5 bis 2 cin-

Uc j spiel 17 ^6s gestellt und auf 2 ml eingeengt. Zu dem so behandelten

Kondensat wurden 8 ml Methanol bzw. 8 ml Aceton

Zu einer Suspension von 530 mg Inosin in 7,5 ml gegeben, wobei 510 mg (Ausbeute: 74¹V₀) Kristalle von m-Kresol wurde teilweise hydrolysates Phosphoroxy- Aucnosin-S'-monophosphat erhalten wurden.

Claims

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Patentanspruch: und anschließender Hydrolyse des zunächst erhal-

_v„r. u . „ ^lcnen Phosphorylierungsproduktes, dadurch

Verfahre^ zur Herstellung von S'-Ribonücleo- g _e k e η η ζ e i c h^n e t, daß man die Phosphory-

tiden durch selekt.ve Phosphorylierung von licrung in Phenol, Chlorphenol, Kresol und/oder

nloSt?ä?^en-HⁱⁿH S⁶¹¹T ^{mit P}y^r°P^hos- ⁵ Xy'enol als Lösungsmittel durchführt, ohne die

ΪΑ?!"· ?i^er ^Pho,^sPhoroxychlorid, das Hydroxylgruppen in 2\3'-Ste!lung vorher beson-

auch te.lhydrat.siert bzw. -alkoholisiert sein kann, ders zu schützen